CN111575373B - 基于多重pcr的靶向高通量测序的急性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于多重PCR的靶向高通量测序的急性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒及其检测方法。所述的试剂盒用于检测急性淋巴细胞白血病相关的19种基因的多个外显子区域。所述的试剂盒包括检测相关基因突变的引物工作液，PCR混合液、PCR反应液、消化液、接头P5及接头P7。该试剂盒是基于多重PCR的靶向高通量测序技术进行的检测，具有高准确性、高灵敏度及高通量的优势，能快速高效对19种急性淋巴细胞白血病(ALL)相关基因进行标准化的定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种基于多重PCR的靶向高通量测序的急性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒及方法。
背景技术
白血病是由于造血干或前体细胞基因异常，导致细胞增殖、分化或凋亡异常，是一类具有高度异质性的恶性血疾病，其诊疗需要从形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学进行综合分析。白血病中最常见的分子生物学异常主要包括：基因突变、融合基因、基因表达，而基因突变中又以点突变、基因片段插入或缺失为主。
急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种起源于淋巴细胞的B系或T系细胞在骨髓内异常增生的恶性肿瘤疾病。主要发生在儿童和成人中，其发病率在2至5岁之间达到高峰，主要临床表现为贫血、发热、感染、出血和器官浸润，患者的正常造血功能受到抑制，严重者累积淋巴、脑膜和肝脏等，可致患者死亡。根据白血病细胞的分子生物学特性和对治疗的反应，儿童急性淋巴细胞白血病的存活率已提高到约90％。然而，需要创新的分子生物学方法来进一步提高生存率，同时减少不利影响。婴儿和成人的急性淋巴细胞白血病(ALL)预后仍然很差。随着分子生物学测序技术的不断发展，大量与急性淋巴细胞白血病密切相关的分子生物学标记被发掘出来。白血病细胞DNA分析已经发现了新的亚微观结构遗传变化和序列变异，微观结构遗传变化主要包括：染色体数目和结构的易位、倒位、缺失和重复等；基因序列变异包括：点突变、基因片段插入或缺失等变异。它们影响着白血病的发生、定义新的疾病亚型以及影响治疗的反应性。2018年的国内专家共识---《二代测序技术在血液肿瘤中的应用中国专家共识》中指出基因突变的检测在血液肿瘤诊疗中的应用价值，明确了ALL的必要检测基因来辅助预后判断和治疗指导，并建议检测与ALL相关基因，为临床诊断分型、预后判断、治疗指导、微小残留病灶(MRD)监测以及克隆演变提供参考。
利用高通量测序技术对基因组学的研究，极大地促进了我们对急性淋巴细胞白血病(ALL)分子发病机制的了解。ALL与大多数其他癌症相似，其特征是个体获得性突变，不同个体间出现基因突变的差异较大。本发明专利中涉及到的ALL中具有明确临床意义的19种基因按功能分类，可以分为染色质修饰的基因，如EP300；信号传导通路的基因，如FBXW7、FLT3、IL7R、JAK1、JAK2、JAK3、KRAS、NOTCH1、NRAS、PTEN和SH2B3；细胞代谢基因，如NT5C2；转录因子基因，如ETV6、GATA3、PAX5和RUNX1；抑癌基因，如WT1和TP53。这些基因发生突变如果在疾病的早期出现，通常与血液肿瘤的克隆演变相关；也可以随着年龄增长发生突变，伴随着造血克隆性扩张，这就增加了血液肿瘤的发生风险。此外，这些突变可能在治疗后持续存在，在血液学缓解期间会再次导致克隆扩增或伴随新克隆的出现，最终导致疾病复发。因此，对这些基因进行系统性的检测有助于ALL血液肿瘤微小残留病灶(MRD)监测和预后治疗指导。基于微小残留病灶(MRD)的基因突变负荷水平有助于血液肿瘤患者改善风险分层和缓解后治疗的选择，疾病等位基因的突变检测将指导新型分子靶向治疗的开发和应用。
目前，分子生物学中基因突变检测的方法主要有一代测序(Sanger)、高通量测序技术(NGS)、实时荧光PCR(RQ-PCR)、数字PCR等，而高通量靶向测序技术主流的又以多重PCR的靶向测序和捕获探针的靶向测序为主。与一代(Sanger)测序技术相比，多重PCR的靶向测序技术具有更高的灵敏度，并且能够定量检测出基因突变负荷率；与捕获探针的靶向测序相比，多重PCR的靶向测序技术文库构建流程更加简单，能提供更经济、快速的测序方案，而实时荧光PCR(RQ-PCR)及数字PCR大多数是针对基因中已知突变位点的进行检测，并且实验过程中引物探针费用较高，做多基因突变筛查可行性较差。
本发明专利中多重PCR的靶向测序技术是一种将多重PCR技术与高通量测序技术结合的一种靶向捕获测序技术，该技术是一种在同一PCR反应体系里加上多对引物，各对引物分别结合在模板的相应位置，同时扩增出多个核酸片段，再通过PCR反应将高通量测序所用的接头序列(index)引入到核酸片段的两侧，最终得到核酸文库进行高通量测序和生信流程分析来获取目标区域的序列信息，该技术具特异性强、实验周期短及DNA低起始量等优势，可用于血液、口腔拭子及FFPE等多种复杂样本。利用该技术对血液肿瘤相关基因的突变检测已经得到越来越广泛的应用。
发明内容
本发明的主要目的在于，克服现有的基因检测技术中存在的缺陷，而提供一种新的基于多重PCR的靶向高通量测序的急性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒及检测方法，所要解决的技术问题是使其高效快速且易于操作，从而更加适于实用，且具有产业上的利用价值。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明的一个方面提供了一种基于多重PCR的靶向高通量测序的急性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒，
所示的试剂盒用于检测以下基因的突变：EP300第23-30号外显子、ETV6第1-8号外显子、FBXW7第9-12号外显子、FLT3第14-16、20号外显子、GATA3第4-5号外显子、IL7R第6号外显子、JAK1第14、17-19号外显子、JAK2第12、14、16、20、21号外显子、JAK3第11-16号外显子、KRAS第2-5号外显子、NOTCH1第26-28、34号外显子、NRAS第2-5号外显子、NT5C2第11、15号外显子、PAX5第1-10号外显子、PTEN第5-8号外显子、RUNX1第2-9号外显子、SH2B3第2号外显子、TP53第3-11号外显子、WT1第7-10号外显子；
所示的试剂盒至少包括以下引物序列：
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒包括独立包装的各组引物对，或包括配置好的含有各组引物对的PCR引物混合液。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括引物工作液、PCR混合液、PCR反应液、消化液、接头P5及接头P7。
在本发明的一些实施方案中，所述PCR混合液包含Buffer、dNTP、Mg2+；所述PCR反应液包括DNA聚合酶；所述消化液包括虾碱酶及外切酶。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒中的主要组成成分及其规格为：PCR混合液5μl，PCR反应液1μl，正向引物1μl，反向引物1μl，接头P5 1μl及接头P7 1μl。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括阴性对照，所述的阴性对照是体积为2μl的RNase-Free ddH2O。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括阳性对照，所述的阳性对照是含有ALL19种基因突变类型质粒的混合液。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
本发明的另一个方面还提供了一种用于急性淋巴白血病基因突变的检测方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)DNA提取：获取待测样品的DNA，DNA的提取采用TheBlood DNA Kit，购于北京全式金生物技术有限公司，检测DNA的浓度和完整性；
(2)多重PCR扩增：采用本发明所述的试剂盒，以步骤(1)中获取的DNA为模板，进行PCR扩增，并收集扩增子产物；
PCR扩增的体系为：5μl PCR混合液；1μl PCR反应液；25ng DNA；上游引物下游引物各1ul，用Nuclease-Free Water补足体系至10ul；
PCR的反应条件为：预变性95℃15min，再进行95℃30s，60℃90s，72℃90s共24个循环，72℃10min，4℃暂存；
(3)扩增子产物的纯化：加入消化液去除扩增杂质，PCR仪上运行程序：37℃30min，80℃10min，通过纯化磁珠回收扩增子产物，洗涤去除反应中的其他成分，得到纯化的扩增子产物；
(4)将纯化后的扩增子产物作为模板，加入高通量测序所需的接头引物P5和P7，通过加入PCR混合液以及PCR反应液进行PCR反应得到扩增子文库，利用纯化磁珠回收扩增子文库，洗涤去除反应中的其他成分，得到纯化的扩增子文库；
(5)结果的检测。
在本发明的一些实施方案中，所述步骤(2)中所述上游引物的5’端均带有一段相同的通用序列T1，所述下游引物的5’端均带有一段相同的通用序列T2。
在本发明的一些实施方案中，所述步骤(3)中所述P5为通用性接头，所述P7为识别样本的一段特殊序列，所述P5和P7接头引物分别与扩增子产物两侧T1序列和T2序列互补配对。
借由上述技术方案，本发明的有益效果至少包括以下几个方面：
(1)本发明利用多重PCR靶向高通量测序技术快速高效、高准确率、高覆盖度、高检出率筛查ALL中基因变异情况，给出准确、权威的医学解读报告，为ALL患者的疾病诊断、预后分层和靶向治疗提供指导。
(2)与一代测序相比，本发明采用多重PCR靶向检测技术具有更高的检出率，一代测序因受灵敏度(10％～15％)及方法学的限制，低于10％～15％的基因变异情况直接判读为阴性，并且所检出样本的结果无法对基因突变负荷率进行定量，多重PCR灵敏度可达1％以上，对所有检出的基因突变均能给出定量结果。
(3)本发明涉及检测技术具有高准确性、高灵敏度及高通量的优势，能快速高效对19种急性淋巴细胞白血病(ALL)基因进行标准化的定量检测。
综上所述，本发明特殊的试剂盒及其检测方法，准确率高且检测速度快。其具有上述诸多的优点及实用价值，并在同类产品中未见有类似的设计公开发表或使用而确属创新，其不论在产品结构上或功能上皆有较大的改进，在技术上有较大的进步，并产生了好用及实用的效果，且较现有的技术具有增进的多项功效，从而更加适于实用，而具有产业的广泛利用价值，诚为一新颖、进步、实用的新设计。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
本发明的具体实施方法由以下实施例及其附图详细给出。
附图说明
图1示出了本发明的基于多重PCR靶向高通量测序技术的检测技术原理；
图2示出了本发明的多重PCR靶向高通量测序技术对文库的检测结果图；
图3示出了对比实施例1的一代测序技术验证峰图，具体的基因位点为：FBXW7(NM_033632)c.1513C>T；p.R505C(杂合)。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的试剂盒及其检测方法其具体实施方式、步骤、结构、特征及其功效，详细说明如后。
本发明的一个实施方式提供了一种基于多重PCR靶向高通量测序技术对急性淋巴细胞白血病基因突变的检测试剂盒。该试剂盒主要检测在急性淋巴细胞白血病(ALL)中具有明确临床意义的19种基因突变的检测，具体包括以下19个基因：EP300、ETV6、FBXW7、FLT3、GATA3、IL7R、JAK1、JAK2、JAK3、KRAS、NOTCH1、NRAS、NT5C2、PAX5、PTEN、RUNX1、SH2B3、TP53、WT1。具体地，该试剂盒是一种用于筛查ALL中具有明确临床意义的19种基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括以上19个基因检测用的多重PCR引物。
在本发明的一些具体的实施方案中，本发明是基于最新版WHO 2016版指南、NCCN2019版指南、血液肿瘤中国专家共识以及血液肿瘤相关基因数据库，设计了用于检测急性淋巴细胞白血病(ALL)19种基因多个外显子的引物序列。本发明涉及检测技术具有高准确性、高灵敏度及高通量的优势，能快速高效对19种急性淋巴细胞白血病(ALL)基因进行标准化的定量检测。
在本发明的一些具体的实施方案中，本发明基于2016年版更新的WHO血液肿瘤分类标准、NCCN 2019版指南、2018年血液肿瘤中国专家共识及相关权威文献整理出与急性淋巴细胞白血病(ALL)相关的19种基因，并在数据库Genbank中对19种基因进行序列对比分析设计了多重引物。本发明涉及急性淋巴细胞白血病(ALL)相关的19种基因经典转录本如下：EP300(NM_001429.4)、ETV6(NM_001987.4)、FBXW7(NM_033632.3)、FLT3(NM_004119.2)、GATA3(NM_001002295.1)、IL7R(NM_002185.3)、JAK1(NM_002227.4)、JAK2(NM_004972.3)、JAK3(NM_000215.3)、KRAS(NM_033360.3)、NOTCH1(NM_017617.3)、NRAS(NM_002524.4)、NT5C2(NM_012229.4)、PAX5(NM_016734.2)、PTEN(NM_000314.4)、RUNX1(NM_001754.4)、SH2B3(NM_005475.2)、TP53(NM_000546.5)、WT1(NM_024426.4)。
在本发明的一些实施方案中，检测到的部分重要突变基因，经过COSMIC数据库、ClinVar数据库、NCCN指南及血液肿瘤国内专家共识等的医学解读，具体的临床意义如下：
EP300的体细胞基因突变主要见于DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)和FL(滤泡性淋巴瘤)中，导致P53和BCL6乙酰化异常，促进肿瘤的发生。EP300的胚系突变可导致常染色体显性遗传的Rubinstein-Taybi综合征(RSTS)，与淋巴瘤易感相关。
ETV6基因突变见于12％的成人ETP-ALL，这些患者伴CD34、胞浆CD3、髓系相关抗原CD33表达，而不伴CD4、CD8表达。约80％ETV6突变的ETP-ALL患者同时有NOTCH1突变。ETV6基因突变还见于约2.7％的初诊AML患者和MDS患者。
ETV6突变主要是由于位于N端的序列缺失或插入导致的移码突变，少部分为C端的截短型突变，大多数为杂合型突变。2019年NCCN《骨髓增生异常综合征临床实践指南》中指出ETV6基因突变有时以胚系突变形式出现，可转化为髓系恶性肿瘤或急性淋巴细胞白血病ALL。2016年WHO《髓样肿瘤和白血病分类》中指出，ETV6基因的胚系突变在部分髓系肿瘤和淋巴瘤患者中存在，增加患病风险，且存在血小板相关病史。
FBXW7基因在淋巴细胞肿瘤中，FBXW7突变常与NOTCH1突变同时存在。NOTCH1/FBXW7突变且无RAS/PTEN突变的成人T-ALL预后较好；NOTCH1/FBXW7突变且ERG/BAALC低表达的患者预后较好。
GATA3突变主要见于约9％的ETP-ALL。GATA3基因的胚系突变可导致Barakat综合征。
IL7R基因突变主要见于T-ALL和BCR-ABL1样ALL。BCR-ABL1样ALL中常伴CRLF2表达，预后差。异常表达CRLF2的B-ALL中，6％有IL7R突变；而不伴CRLF2异常表达的患者中，几乎无IL7R突变。约10.5％的T-ALL患者有IL7R基因突变，IL7R突变的T-ALL患者总体更年轻，并且初诊时白细胞计数更高。IL7R在B-ALL中的突变约90％为位于Exon6的插入或缺失突变，10％为位于Exon5的胞外结构域的S185C突变；在T-ALL中的突变几乎全部为Exon6的插入或缺失突变。
JAK1突变见于18％的T-ALL，以V658、R879位点突变相对多见，JAK1突变的T-ALL患者初诊年龄较大，对治疗反应差、总体生存率低。B-ALL中JAK1突变主要见于高危的BCR-ABL1样ALL中，预后不良。JAK1突变的ALL患者对JAK1/2激酶抑制剂可能有效。
JAK3突变见于49％的T系幼淋巴细胞白血病(T-PLL)和约11％的ETP-ALL。T-ALL中JAK3 M511突变最多见(约占突变比例的57％)，其次为发生于R657-V687位的假性激酶区突变。JAK3活化突变对JAK抑制剂托法替尼敏感。
KRAS基因突变可见于AML、ALL、MDS、JMML、CMML等多种髓系和淋系血液肿瘤中。
NRAS基因突变可见于AML、ALL、MDS、JMML、CMML等多种髓系和淋系血液肿瘤中。
NOTCH1体细胞突变主要见于T-ALL，也可见于CLL和MCL。在T-ALL中，伴NOTCH1和/或FBXW7突变而不伴RAS和/或PTEN突变的成人患者预后较好。在CLL和MCL中均提示预后差。
NT5C2体细胞突变在复发的T-ALL中常见，而在复发的B-ALL中发生频率相对较低。该基因突变后导致核酸酶活性增强，对6-MP等巯基嘌呤类化疗药物耐药。NT5C2基因突变在特定的氨基酸位点p.R367Q和p.R238W较常出现。
PAX5体细胞突变主要见于30％的儿童BCP-ALL，突变常导致PAX5转录活化降低，B细胞发育停滞在早期阶段。PAX5胚系突变(如p.G183位点)与B-ALL易感相关。
PTEN体细胞突变可见于多种类型的肿瘤，在血液系统肿瘤中主要见于T-ALL和DLBCL。PTEN基因在不同肿瘤中和遗传病中突变分布特点不同。错义突变主要集中在第5和第6外显子，无义突变集中在第7号外显子，而移码突变主要集中于第8号外显子的多腺苷尾(A)6和磷酸化位点。这些突变影响PTEN蛋白的活化或结合能力，破坏正常信号传导的稳态，促进肿瘤的产生。突变导致PTEN基因功能失活，失去对PI3K/AKT/mTOR信号通路的负性调节。PTEN胚系突变与多种家族性肿瘤和肿瘤易感相关。
RUNX1基因突变可见于多种髓系肿瘤和T-ALL，在T-ALL中常见于ETP-ALL。在正常核型的AML患者中RUNX1突变发生率为16％。2018年NCCN《急性髓细胞白血病临床实践指南》中指出AML患者中RUNX1突变提示预后不良。
在本发明的一些具体的实施方案中，该试剂盒包括扩增引物工作液(浓度为4.0～6.0pmol/ul)、PCR混合液(包含Buffer、dNTP、Mg2+)、PCR反应液(主要成分是DNA聚合酶)、消化液(主要成分为虾碱酶及外切酶等)、接头P5及接头P7、无水乙醇500ml、采购于贝克曼AMPure纯化磁珠及Nuclease-Free Water、提取核酸试剂、阴性对照和阳性对照。
在本发明的一些具体的实施方案中，所设计的引物Tm值在60±2℃，对所设计的引物进行优化测试后合理的分配到4管中，保证引物的特异性以及扩增片段的均一性，降低非目的片段的比例。
在本发明的一些具体实施方案中，基于上述引物设计原则，设计与急性淋巴细胞白血病(ALL)相关的19种基因外显子，尤其重点关注以下热点区域的变异情况，相应的扩增子如下：
在本发明的一些具体实施方案中，基于上述热点扩增子区域，本发明试剂盒重点关注的热点突变位点有79个，所述的79个热点突变及19种基因的对应关系如下表所示：
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在本发明的一些具体实施方案中，根据以上基因外显子设计扩增子引物，由于选用的是高通量测序illumina平台的Novaseq 6000进行测序，采用的测序策略为PE150，故目标区域大小均约为300bp的核苷酸片段。
在本发明的一些具体实施方案中，基于引物设计原则，利用相关引物设计软件本发明设计了与急性淋巴细胞白血病(ALL)相关的19种基因外显子引物，相应的的引物序列如下：
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在本发明的一些具体实施方案中，影响多重PCR引物的关键因素有以下几方面：特异性：特异性若处理不当，可能会导致非目标片段的扩增，严重可影响目标片段扩增失败。一个反应体系里面，引物数量越多，发生非特异扩增的可能性越大。而多重PCR实验中过程中需要确保的是，只有目标片段发生扩增，其它核苷酸片段的不要扩增。二聚体：扩增过程中二聚体的产生会抑制引物扩增目标片段，导致目标片段扩增产量减少甚至扩增失败。在同一反应体系里，引物数量越多，出现二聚体的概率也就越大。均一性：即体现的是引物性质均一情况，除以上因素外，多重PCR体系需要尽量保证引物性质均一，在同一个体系下，所有的引物都具有相同或者相似的热力学稳定性等。因此，为了保证反应体系中的引物都能在同一个反应环境下有效扩增我们进行了多轮测试调整，最终形成本发明。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明试剂盒进行多重PCR靶向测序的时，会包括Nuclease-Free Water阴性对照，保证实验过程不被污染，确保数据结果的准确可靠。以及19种基因突变类型质粒组成的阳性对照，用于实验及试剂的质量控制。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明试剂盒检测使用illumia平台的Novaseq6000仪器上运行，而一代测序的对比验证实验使用的仪器是ABI 3730XL，以上两种检测技术的PCR反应均在BIO-RAD T100上运行。
实施例1
制备基因突变检测试剂盒，具体包括以下步骤：
1、合成引物序列
合成上述的引物序列，其中所有扩增子引物中上游引物的5’端均带上一段相同的通用序列T1；下游引物的5’端均带上另外一种相同的通用序列T2。
2.PCR反应体系的制备
试剂盒各组分按照以下进行配比：
实施例2
用实施例1制备的基因突变检测试剂盒对待测样品进行检测。
一、本实施例中对20例(编号L1～L20)初诊、难治及复发的髓系白血患者样本进行了筛查检测，严格执行下述检测方法的流程，运用自建的生信流程进行分析以及专业遗传咨询解读人员进行解读，具体步骤为：
1.样本DNA的提取
使用DNA提取试剂盒(TheBlood DNA Kit，购自北京全式金生物技术有限公司)提取上述白血病患者的血液样本的基因组DNA，通过质检确保DNA浓度达10ng/ul以上，琼脂糖凝胶电泳检测DNA的电泳条带无明显拖尾以确保DNA的完整性。
2.多重PCR扩增
在本轮多重PCR反应中，采用商业化的PCR试剂盒，将抽提好约25ng(ng为物质的量的单位，即体积与浓度相乘)的完整DNA，5ul的PCR混合液，1ul的PCR反应液，上游引物下游引物各1ul，用Nuclease-Free Water补足体系至10ul，通过运行PCR程序：预变性95℃15min，再进行95℃30s，60℃90s，72℃90s共24个循环，72℃10min，4℃暂存。所有扩增子引物中上游引物的5’端均带上一段相同的通用序列T1；下游引物的5’端均带上另外一种相同的通用序列T2。T1序列通常为P5接头序列3’端的一部分；T2序列为P7接头序列3’端的一部分。故通过本轮多重PCR反应，不仅得到多个目标核苷酸的扩增子产物，同时将通用序列T1和T2分别成功引入到扩增子产物的两侧，为后续PCR反应引入完整的接头序列做好准备。
3.扩增子产物的纯化
将上步得到的扩增子产物进行纯化，PCR反应过程中除了会产生扩增子产物还会有残存的少量酶、引物、dNTP、盐离子、副产物等多种杂质。通过加入消化液能够去除部分扩增杂质，PCR仪上运行程序：37℃30min，80℃10min。但是消化液不能够完全去除扩增引起的双链副产物，因此，需要通过磁珠结合目标片段来回收扩增子产物，洗涤去除反应中的其他成分，得到纯净的扩增子产物。
4.扩增子文库的建立
将纯化后的扩增子产物作为模板，加入高通量测序所需的接头引物P5和P7，P5为通用性接头，P7为识别样本的一段特殊序列，通过加入PCR混合液以及PCR反应液进行PCR反应。P5和P7接头引物分别与扩增子产物两侧T1序列和T2序列互补配对。因此本轮PCR反应结束后，接头序列P5和P7分别被引入到扩增子产物的两侧，得到新的扩增子文库。与第二步磁珠纯化的目的一样，通过磁珠结合目标片段来回收扩增子产物，洗涤去除反应中的其他成分，得到纯净的扩增子文库，经过对文库定量和质检后，便可以上机测序。
5.结果的检测，具体的检测结果见表1和表2。
表1.编号L1～L10的患者多重PCR检测方法结果汇总
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表2.编号L10～L20的患者多重PCR检测方法结果汇总
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二、对20例(编号L1～L20)初诊、难治及复发的急性淋巴细胞白血患者用多重PCR靶向测序检测19个基因阳性率如下表3所示。
表3.多重PCR靶向测序检测19个基因阳性率
| 突变基因 | 突变例数 | 突变比例 | 突变基因 | 突变例数 | 突变比例 |
| EP300 | 3 | 15.00％ | NOTCH1 | 4 | 20.00％ |
| ETV6 | 3 | 15.00％ | NRAS | 1 | 5.00％ |
| FBXW7 | 4 | 20.00％ | NT5C2 | 2 | 10.00％ |
| FLT3 | 1 | 5.00％ | PAX5 | 2 | 10.00％ |
| GATA3 | 2 | 10.00％ | PTEN | 5 | 25.00％ |
| IL7R | 2 | 10.00％ | RUNX1 | 2 | 10.00％ |
| JAK1 | 4 | 20.00％ | SH2B3 | 2 | 10.00％ |
| JAK2 | 0 | 0.00％ | TP53 | 2 | 10.00％ |
| JAK3 | 3 | 15.00％ | WT1 | 2 | 10.00％ |
| KRAS | 2 | 5.00％ |
对比实施例1
一、在与上述实施例相同的条件下，利用一代测序(Sanger)技术对20例(编号L1～L20)待测样本进行检测验证，目前一代测序(Sanger)还是作为基因突变检测的金标准，检测结果如表4和表5所示。
表4.编号L1～L10的患者一代检测方法结果汇总
表5.编号L11～L20的患者一代测序检测方法结果汇总
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二、对20例(编号L1～L20)初诊、难治及复发的急性淋巴细胞白血患者用一代测序检测19个基因阳性率如下表6所示。
表6.一代测序检测19个基因阳性率
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由表1～6的结果可以看出，通过对两种检测方法的结果汇总比较，采用本发明的多重PCR靶向检测技术具有更高的检出率，一代测序因受灵敏度(10％～15％)及方法学的限制，低于10％～15％的基因变异情况直接判读为阴性，并且所检出样本的结果无法对基因突变负荷率进行定量，多重PCR灵敏度可达1％以上，对所有检出的基因突变均能给出定量结果。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110> 南京实践医学检验有限公司
<120> 基于多重PCR的靶向高通量测序的急性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒及方法
<130> 2020.04.26
<160> 280
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccataaaatc atatgctcca ctaacaacc 29
<210> 51
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcaaacagt aaccattaaa aggatgg 27
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tgatcctagt accttccctg caa 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcagtaatta ccctagattc tcaatgtcaa ac 32
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tacagaatat gggtaaagat gatccgaca 29
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<400> 166
acccagccta atcttgtttt tcttatgt 28
<210> 167
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 167
catgagagac caatacatga ggacag 26
<210> 168
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 168
tagatgctta tttaaccttg gcaatagca 29
<210> 169
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 169
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 170
tgcaagagag cttataattt ggattgtgt 29
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 171
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 172
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 176
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 209
tccaatacat ggaaggatga gaatttcaa 29
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 222
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 223
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 224
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 225
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 226
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acttgcatta cttttatttt cctactttct gtt 33
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 235
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 239
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 244
gaagatgtgg cggaggct 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 246
ttccctctgg acactctgtg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 247
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaatcaaccc acagctgcac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 251
tgcttctgac gcacacctat t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 252
gggagcttca tctggacctg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gctgggaccc aatgagatgg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccaacccttg tccttaccag aa 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gctggtctgg tcctttaaaa tatatattat ggt 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 256
gtgaaatatt ctccatccag tggtttct 28
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 257
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 259
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cctcaacaag atgttttgcc aact 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 261
aaagctcctg aggtgtagac g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 262
ctgggcttct tgcattctgg 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 263
ccccggacga tattgaacaa tg 22
<210> 264
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 264
ggcacagacc ctctcactc 19
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 265
ctttctgctc ttgtctttca gacttc 26
<210> 266
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 266
tgtatatact tacttctccc cctcctct 28
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 267
cagccagact gccttccg 18
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 268
caacaacacc agctcctctc c 21
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 269
cgtgtttgtg cctgtcctg 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 270
ggcttctcct ccacctacct 20
<210> 271
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 271
cctcatcttg ggcctgtgtt 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 272
tcagatagcg atggtgagca g 21
<210> 273
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 273
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<211> 29
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 274
gctgactctc tcattcatat tcaacaaca 29
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 275
gcctggaaaa ggagctcttg a 21
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 276
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 277
cctcactgtg cccacattgt ta 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 278
tgttcagtcc tagtaggaga ggttg 25
<210> 279
<211> 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 279
caagacctac gtgaatgttc acatg 25
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 280
cactcgggcc ttgatagttg aa 22
Claims (6)
1.一种基于多重PCR的靶向高通量测序的急性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒，所述的试剂盒用于检测以下基因的突变：EP300第23-30号外显子，ETV6第1-8号外显子，FBXW7第9-12号外显子，FLT3第14-16、20号外显子，GATA3第4-5号外显子，IL7R第6号外显子，JAK1第14、17-19号外显子，JAK2第12、14、16、20、21号外显子，JAK3第11-16号外显子，KRAS第2-5号外显子，NOTCH1第26-28、34号外显子，NRAS第2-5号外显子，NT5C2第11、15号外显子，PAX5第1-10号外显子，PTEN第5-8号外显子，RUNX1第2-9号外显子，SH2B3第2号外显子，TP53第3-11号外显子，WT1第7-10号外显子；
所述的试剂盒包括以下引物序列：
所述试剂盒中的主要组成成分及其规格为：PCR混合液5μl，PCR反应液1μl，正向引物1μl，反向引物1μl，P5接头1μl及P7接头1μl；与急性淋巴细胞白血病相关的19种基因外显子相应的扩增子如下：
试剂盒关注的热点突变位点有79个，所述的79个热点突变及19种基因的对应关系如下表所示：
。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括独立包装的各组引物对，或包括配置好的含有各组引物对的PCR引物混合液。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括引物工作液、PCR混合液、PCR反应液、消化液、接头P5及接头P7。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述PCR混合液包含Buffer、dNTP、Mg2+；所述PCR反应液包括DNA聚合酶；所述消化液包括虾碱酶及外切酶。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括阴性对照，所述的阴性对照是体积为2μl的RNase-Free ddH2O。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括阳性对照，所述的阳性对照是含有ALL19种基因突变类型质粒的混合液。
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