CN114058706A - 用游离dna检测肺癌基因的检测引物及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用游离DNA检测肺癌基因的检测引物及其试剂盒，包括分别检测EGFR、ALK、ERBB2、BRAF、MET、PIK3CA、KRAS和RET基因突变的正向捕获引物和反向捕获引物；所述正向捕获引物由5’端的测序文库read1的公共序列和3’端的特异性正向引物序列组成，所述反向捕获引物由5’端的测序文库read2的公共序列、8个碱基的随机序列和3’端的特异性反向引物序列组成。本发明的用游离DNA检测肺癌基因的检测引物及其试剂盒快速，高灵敏，检测突变频率的检测下线低。

Description

用游离DNA检测肺癌基因的检测引物及其试剂盒
技术领域
本发明涉及一种基因检测产品，属于生物技术领域。
背景技术
肺癌是最常见的恶性肿瘤，每年年超过210万新病例产生，每年估计有160万人死亡于癌症，是全球因癌症死亡的主要原因，超过18％。由于死亡率高，肺癌仍然是一个重要的普遍公共卫生问题。非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)是肺癌的两种组织学亚型。非小细胞肺癌(NSCLC)是主要的亚型，约占肺癌总数的85％，进一步分为腺癌(LAD)、鳞状细胞(SQCC)和大细胞癌(LCC)。与大多数癌症类型相比，癌症治疗的进展并没有显著影响患者的生存期，部分原因是诊断发现较晚。大多数肺癌相关的死亡是由肺癌晚期转移引起的，其中大脑是最常见的转移部位。由于诊断发现的晚，肺癌的5年总生存率从IA期(85％)显著下降到IV期疾病(6％)。因此肺癌的早期精准诊断，精准治疗在防治肺癌种显得尤为重要。
传统上，活检是用来确定肺结节的恶性肿瘤。这种方法有重大的局限性，首先这种检测相对滞后，再者这种检测存在创伤，不适合患者连续实时的进行跟踪检测。基因型导向的靶向治疗正在彻底改变癌症诊疗。EGFR、ALK、KRAS和BRAF等基因的基因组改变已被证明是非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌和黑色素瘤管理中强有力的预测生物标志物；NCCN非小细胞肺癌指南(NSCLC)建议测量7个不同基因(EGFR、ALK、ERBB2、BRAF、MET、KRAS和RET)的基因组改变，以指导12种不同的匹配治疗方案，现在测试这些基因突变已经作为个性化治疗决策的标准。实体肿瘤组织的下一代测序(NGS)提高了穿刺活检样本和病理切片样本越来越多的靶向基因突变进行多重测试的能力。然而，使用NGS对常规的组织活检进行肿瘤基因分型存在不足，包括获得足够的活检标本，缓慢的周转时间，以及在出现耐药性后需要重复活检，无法做到实时动态检测基因型的变化。相比于组织活检，液体活检，肿瘤血浆DNA(ctDNA)基因分型则具备更便捷、更快的潜力，同时也允许在治疗耐药性发展过程中对基因型进行实时系列评估。
在大多数早期和许多晚期实体肿瘤中，ctDNA水平非常低且是高度片段化的片段。在检测过程种易造成DNA损失降低样本的丰富程度，由于肿瘤血浆DNA(ctDNA)分布于血浆游离DNA(cfDNA)中的含量极少，比例可能低于0.01％，且通常扩增体系和测序平台测序误差达到1％。因此，为了更好检测ctDNA的突变信息，需要更灵敏的建库和分析方法来保证检测结果的准确，本发明就是用于解决这一问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有快速，高灵敏，检测突变频率的检测下线低的用游离DNA检测肺癌基因的检测引物，以及试剂盒。
本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种用游离DNA检测肺癌基因的检测引物，包括分别检测EGFR、ALK、ERBB2、BRAF、MET、PIK3CA、KRAS和RET基因突变的正向捕获引物和反向捕获引物；所述正向捕获引物由5’端的测序文库read1的公共序列和3’端的特异性正向引物序列组成，所述反向捕获引物由5’端的测序文库read2的公共序列、8个碱基的随机序列和3’端的特异性反向引物序列组成。
检测ALK基因突变的正向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示；检测ALK基因突变的反向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.40～41所示；
检测EGFR基因突变的正向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5～11所示；检测EGFR基因突变的反向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.44～50所示；
检测ERBB2基因突变的正向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12～14所示；检测ERBB2基因突变的反向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.51～53所示；
检测KRAS基因突变的正向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15～17所示；检测KRAS基因突变的反向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.54～56所示；
检测MET基因突变的正向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.18～23所示；检测MET基因突变的反向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.57～62所示；
检测PIK3CA基因突变的正向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.24～34所示；检测PIK3CA基因突变的反向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.63～73所示；
检测RET基因突变的正向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.35～39所示；检测RET基因突变的反向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.74～78所示。
根据权利要求3所述的用游离DNA检测肺癌基因的检测引物，其特征在于：所述正向捕获引物和反向捕获引物的使用浓度为10nM。
还包括正向通用引物和反向通用引物，正向通用引物的3’端连接有测序文库read1的公共序列，反向通用引物的3’端连接有测序文库read2的公共序列。
上述正向通用引物和反向通用引物的使用浓度为20uM。
本发明为解决上述技术问题还提出的一种技术方案是：一种采用上述检测引物的用游离DNA检测肺癌基因的试剂盒用血浆游离DNA作为样本。
本发明具有积极的效果：
(1)本发明的用游离DNA检测肺癌基因的试剂盒所用于捕获特定区域的引物由本公司技术人员自行设计，不同于传统引物；捕获的基因由EGFR、ALK、ERBB2、BRAF、MET、KRAS和RET共肺癌相关的7个基因组成，可对肺癌发生发展过程中进行更加全面的跟踪监测。
(2)本发明的用游离DNA检测肺癌基因的试剂盒建库步骤只需一步PCR反应，省去了传统的片段化、加A、连接、捕获、多步扩增过程中对微量血浆DNA的损失，大大提高了血浆DNA的利用率。
(3)本发明的用游离DNA检测肺癌基因的试剂盒建库步骤只需一步PCR反应，省去了传统的片段化、加A、连接、捕获、多步扩增过程中，更加方便简洁，大大节省了人力和试剂成本。
(4)本发明的用游离DNA检测肺癌基因的试剂盒建库步骤只需一步PCR反应，省去了传统的片段化、加A、连接、捕获、多步扩增过程中，更加快速，大大节省了检测过程的时间，更有利于临床的应用。
(5)本发明的用游离DNA检测肺癌基因的试剂盒文库加入单分子标签(UMI)，在UMI处理过程中，实验过程中引入的假阳性突变被去除，提高检测灵敏度，降低检测下线，使得后续生物信息学分析过程中，低频突变可准确检出。其UMI加在特异性引物的反向引物R5的5’端，共8个碱基序列，相比于传统的的UMI加在文库的两端，简化了文库建构，使其后的数据分析更加的简单。
(6)本发明的用游离DNA检测肺癌基因的试剂盒文库加入单分子标签(UMI)，大大的提高检测的灵敏度，降低检测的下限，更有利于低频ctDNA中突变的检出。
附图说明
图1是本发明实施例的建库及分析流程示意图；
图2是本发明实施例的cfDNA的核酸质控图；
图3是本发明实施例样本测序显示EGFR基因L858R突变的数据图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
主要试剂：
本专利内容涉及所有实验所用试剂耗材均从正规试剂耗材生产厂商购买，用到主要试剂有(少数通用常规试剂不再列举)：QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(50)(55114，Qiagen公司)、QubitTMdsDNA HS Assay Kit(Q32854)、TaKaRa Taq Hot StartVersion(R007A)、Agencourt AMPure XP Reagent(BECKMAN A63880)、LibraryQuantification Kit(Illumina/Universal)(KAPA KK4824)等。
主要仪器：
DynaMag-2 Magnet 12321D磁力架(ThermoFisher 12321D)、漩涡震荡仪、
Figure BDA0003385290630000041
3.0荧光定量仪、高速离心机、MiniAmp PCR仪(厂家：Applied Biosystems)、生物安全柜、水浴锅、移液枪、Agilent 2100生物分析仪(安捷伦)、NovaSeq6000(illumina)等。
实施例
一、试剂盒的组成
本实施例的用游离DNA检测肺癌基因的试剂盒包括分别用于检测EGFR、ALK、ERBB2、BRAF、MET、PIK3CA、KRAS和RET基因突变的正向捕获引物和反向捕获引物。
本实施例中涉及的引物和质粒的设计均有普瑞斯新(上海)生物医疗科技有限公司实验室技术人员自行设计，合成单位是南京金斯瑞生物科技有限公司完成，引物的核苷酸序列如表1所示。
表1引物序列特征表
Figure BDA0003385290630000051
Figure BDA0003385290630000061
引物结构如下：
正向捕获引物F7的结构：
ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(illumina测序文库read1的公共序列)+特异性正向引物序列。
反向捕获引物R5的结构：
TCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(illumina测序文库read2的公共序列)+NNNNNNN(UMI)+特异性反向引物序列。
反向引物R5中的N代表随机的四种单核苷酸(A、T、C、G),连续八个单核苷酸序列可随机产48＝65536种随机引物，以P7和P5序列来自于Illumina公司测序的公共测序序列。
特异性正反向引物的5’端带有illumina测序文库的部分公共序列，用于文库的放大和测序。文库UMI位于特异性引物的反向引物R5的5’端，连接部分illumina测序文库的read2序列；文库捕获的正向引物F7的5’端,连接部分illumina测序文库的read1序列。
正向通用引物P7(illumina官方序列)：
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC+[i7]+ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG。
反向通用引物P5(illumina官方序列)：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC+[i5]+ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT。
其中[i7]和[i5]分别代表文库P7、P5端用于识别不同样本的可变序列结构。
本实施例中用到的野生型扩增模板采用的是非肿瘤患者健康人游离DNA(cfDNA)，突变型扩增模板采用的是实验室人工构建的质粒，该质粒经过内切酶酶切处理成线性结构。
二、试剂盒的使用方法
本实施例的用游离DNA检测肺癌基因的试剂盒挑选已知通过ddPCR热点验证过的含有突变频率0.01％的EGFR基因L858R突变的血浆作为实施验证样本，进行建库、测序和后续单分子(UMI)策略突变分析的验证。试剂盒的使用方法如下：
1.样本抽提
血浆抽提使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(50)(55114，Qiagen公司)试剂盒进行，具体操作步骤可以参考该试剂盒的产品说明。
2.血浆游离DNA(cfDNA)浓度测定
1)取3支定量管，向其中加入1ul Qubit dsDNA HS Reagent，其中1管加入199ulQubit dsDNA HS buffer,其中剩下管加入189ul Qubit dsDNA HS buffer漩涡混匀，作为标准品定量管；
2)分别向两支标准品定量管中，加入10ul的标准品1和标准品2，再向另一样品管中加入1ul的cfDNA，吹打混匀；
3)所有管在室温避光孵育2分钟；
4)选择
Figure BDA0003385290630000071
3.0仪的，dsDNA High Sensitivity分析模式，先分别测定两标准品的荧光值；
5)将样本管放入定量仪，定量样本，记录样本浓度。
6)取1ul cfDNA核酸溶液用Agilent 2100生物分析仪质控，观察样本核酸降解情况，如图2所示。
3.肺癌7个基因Panel的准备
将所有合成的F7和R5引物混合液用1×TE溶解稀释到100uM，每管引物取1ul加入到一新的EP管中，再补入11ul 1×TE，振荡混匀，得到单条引物浓度为1uM的引物混合液panel1(P1)，将取1ul的P1加入99ul的1×TE中，振荡混匀，得到10nM的P1工作液；将P7和P5引物序列用1×TE溶解稀释到100uM，取10ul加入到40ul的1×TE中，得到20uM的P7和P5工作液。
4.一步式建库
1)取一个PCR反应管，加入表2所示成分，混匀。
表2建库反应体系组分表
Figure BDA0003385290630000081
在MiniAmp PCR仪(厂家：Applied Biosystems)反应28各循环。
表3为qPCR的反应程序
Figure BDA0003385290630000082
Figure BDA0003385290630000091
说明：一步式建库，PCR共分两部分，第一部分退火和延伸65℃，2min，此阶段，体系中含量极少特异性引物发生特异性捕获反应；第二部分退火60℃，30s，特异性引物消耗完，通用引物P7&P5继而反应形成完整文库。
2)文库纯化回收
a)将50μl的产物加入50ul dH2O，体积调整到100ul；
b)向EP管中加入80ul AMPure XP Beads吹打7-8次混匀，静置5min；
c)将EP管至于磁力架上10min，至磁珠分离，弃溶液；
d)加入200μl新鲜配制的80％乙醇，弃液体，晾干；
e)重复上一步操作；
f)晾干后，50μl去离子水洗脱磁珠，静置5min，置于磁力架，待磁珠分离；
g)回收纯化后的文库。
3)文库质控
使用Agilent 2100生物分析仪质控，并
Figure BDA0003385290630000092
3.0仪定量文库浓度。
4)上机测序
上机测序参照NovaSeq6000(illumina)标准上机流程。
5)下机数据预处理
下机原始数据质控保留测序质量达到Q30的序列，使用Trimmomaitic对原始数据进行处理，根据单分子标签(UMI)进行聚类分析，每一小类单分子标签数据纯度在90％的数据进行保留并选定强势数据作为最终数据。
6)生信分析
分析过程中，涉及的日常生物信息处理软件有：使用去bwa进行数据比对，参考基因组选择人类基因组hg19版本，samtools对比对数据进行处理，GATKtools对bam数据进行矫正和突变分析，使用oncotator软件对突变进行注释。
本实施例样本建库测序后突变分析结果如图3所示，可准确检测出突变频率为0.0001的EGFR基因L858R突变。实验过程简洁、高效、灵敏度高，检测结果准确，周期短成本低。
本发明实施例的建库分析流程如图1所示。
本发明提供一种基于illumina二代测序(NGS)平台使用的血浆游离DNA(cfDNA)快速高灵敏检测肺癌相关7种基因(EGFR、ALK、ERBB2、BRAF、MET、KRAS和RET)体系，单分子标签文库构建方案；一步法快速建库方法；高灵敏度单分子分析流程，减少实验过程误差，使检测突变频率的检测下线达到0.01％；为肺癌临床治疗方案的制定和调整提供基因分析支持。建库方案为自行开发，高效便捷；测序文库包含单分子标签，测序数据灵敏度高，优化体系进行试剂盒的开发。
本发明自行设计一套同时包含肺癌发生发展紧密相关的7种基因(EGFR、ALK、ERBB2、BRAF、MET、PIK3CA、KRAS和RET)的多重引物。在各扩增子引物的反向引物端加上8碱基的随机序列作为扩增产物的单分子标签(UMI),用于文库扩增后的独立标记。其中UMI有8个随机合成的碱基序列组成，其理论上组成碱基序列组合类型有48＝65536种可能性，用于在文库数据分析单分子识别。将illumina文库的部分公共序列连接于扩增引物的两端，结构如(F7,F5)，将illumina测序文库的样本文库识别标签(index)和P5和P7序列部分连接于公共文库扩增引物上(P7，P5)，将引物同时至于统一多重PCR反应管中进行两步PCR反应，第一部分退火和延伸共65℃，2min，此阶段，体系中含量极少特异性引物发生特异性捕获反应；第二部分退火60℃，30s，延伸，特异性引物消耗完,通用引物P7&P5继而反应形成完整文库。共31个循环即可生成带有样本标签(i7，i5)和单分子标签(UMI)的文库结构。测序文库于illumina测序仪Novaseq6000系统上机测序。测序下机数据先进行原始数据质控，保留原始测序质量在Q30的测序数据，根据单分子标签(UMI)进行聚类分析，每一小类单分子标签数据纯度大于90％的数据集将进行保留并选定强势数据作为最终数据。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
序列表
<110> 普瑞斯新（上海）生物医疗科技有限公司
<120> 用游离DNA检测肺癌基因的检测引物及其试剂盒
<130> 无
<160> 78
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 1
atctcgtatg ccgtcttctg cttgtctctc ggaggaagga cttgag 46
<210> 2
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 2
atctcgtatg ccgtcttctg cttgacaggg taccaggaga tgatgtaag 49
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 3
atctcgtatg ccgtcttctg cttgcatact taccatgcca ctttccctt 49
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 4
atctcgtatg ccgtcttctg cttgccacaa aatggatcca gacaactgt 49
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 5
atctcgtatg ccgtcttctg cttgcctcat tgccctcaac acagt 45
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 6
atctcgtatg ccgtcttctg cttgcaccac gtaccagatg gatgt 45
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 7
atctcgtatg ccgtcttctg cttgagacat gcatgaacat ttttctccac 50
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 8
atctcgtatg ccgtcttctg cttgtgtgga gcctcttaca ccca 44
<210> 9
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 9
atctcgtatg ccgtcttctg cttgacgtct tccttctctc tctgtca 47
<210> 10
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 10
atctcgtatg ccgtcttctg cttggactat gtccgggaac acaaaga 47
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 11
atctcgtatg ccgtcttctg cttgcgcagc atgtcaagat cacagat 47
<210> 12
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 12
atctcgtatg ccgtcttctg cttggaatgt gaaaattcca gtggccatc 49
<210> 13
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 13
atctcgtatg ccgtcttctg cttggggtgt gtggtctccc atac 44
<210> 14
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 14
atctcgtatg ccgtcttctg cttgggatga gctacctgga ggatgt 46
<210> 15
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 15
atctcgtatg ccgtcttctg cttgcaaaga atggtcctgc accagtaata t 51
<210> 16
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 16
atctcgtatg ccgtcttctg cttgtcctca tgtactggtc cctcatt 47
<210> 17
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 17
atctcgtatg ccgtcttctg cttgcagatc tgtatttatt tcagtgttac ttacct 56
<210> 18
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 18
atctcgtatg ccgtcttctg cttgctgaca tacagtcgga ggttcac 47
<210> 19
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 19
atctcgtatg ccgtcttctg cttgcaaata ggagccagcc tgaatgat 48
<210> 20
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 20
atctcgtatg ccgtcttctg cttgcatgtc aacatcgctc taattcagag a 51
<210> 21
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 21
atctcgtatg ccgtcttctg cttgcccatg atagccgtct ttaacaag 48
<210> 22
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 22
atctcgtatg ccgtcttctg cttgtgttac gcagtgctaa ccaagtt 47
<210> 23
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 23
atctcgtatg ccgtcttctg cttggctgat tttggtcttg ccagag 46
<210> 24
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 24
atctcgtatg ccgtcttctg cttgccataa agcatgaact atttaaagaa gcaaga 56
<210> 25
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 25
atctcgtatg ccgtcttctg cttgtggaat gccagaacta caatcttttg at 52
<210> 26
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 26
atctcgtatg ccgtcttctg cttgtggatc ttccacacaa ttaaacagca t 51
<210> 27
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 27
atctcgtatg ccgtcttctg cttgcccttt ttaaaagtaa ttgaaccagt aggc 54
<210> 28
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 28
atctcgtatg ccgtcttctg cttggacgca tttccacagc tacac 45
<210> 29
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 29
atctcgtatg ccgtcttctg cttgcatagg tggaatgaat ggctgaatta tg 52
<210> 30
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 30
atctcgtatg ccgtcttctg cttgtcccat tattatagag atgattgttg aattttcct 59
<210> 31
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 31
atctcgtatg ccgtcttctg cttggctttg aatctttggc cagtacct 48
<210> 32
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 32
atctcgtatg ccgtcttctg cttgcagagt aacagactag ctagagacaa tga 53
<210> 33
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 33
atctcgtatg ccgtcttctg cttgcacgat tcttttagat ctgagatgca ca 52
<210> 34
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 34
atctcgtatg ccgtcttctg cttggatgca gccattgacc tgtttac 47
<210> 35
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 35
atctcgtatg ccgtcttctg cttggggatt aaagctggct atggca 46
<210> 36
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 36
atctcgtatg ccgtcttctg cttgagcata cgcagcctgt acc 43
<210> 37
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 37
atctcgtatg ccgtcttctg cttggcttcc aggagcgatc gttt 44
<210> 38
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 38
atctcgtatg ccgtcttctg cttgagctcg ttcatcggga cttg 44
<210> 39
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<400> 39
atctcgtatg ccgtcttctg cttgctggtt actgaaagct cagggat 47
<210> 40
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 40
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnngcccaga ctcagctcag ttaat 55
<210> 41
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 41
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnnggaagag tggccaagat tgga 54
<210> 42
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 42
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnntttcttt ttctgtttgg cttgacttga 60
<210> 43
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 43
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnngcttgct ctgataggaa aatgagatct 60
a 61
<210> 44
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 44
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnntcagtcc ggttttattt gcatcatagt 60
t 61
<210> 45
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 45
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnncccaaag actctccaag atgggata 58
<210> 46
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 46
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnntccagac cagggtgttg ttttc 55
<210> 47
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 47
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnngtgccag ggaccttacc ttatac 56
<210> 48
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 48
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnnctgaggt tcagagccat gga 53
<210> 49
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 49
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnnccccatg gcaaactctt gcta 54
<210> 50
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 50
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnngcatgtg ttaaacaata cagctagtg 59
<210> 51
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 51
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnngtcatat ctccccaaac cccaat 56
<210> 52
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 52
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnngccatag ggcataagct gtgtc 55
<210> 53
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 53
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnnccttggt ccttcaccta accttg 56
<210> 54
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 54
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnnaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa 60
<210> 55
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 55
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnngtaaaag gtgcactgta ataatccaga 60
ct 62
<210> 56
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 56
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnngactctg aagatgtacc tatggtccta 60
<210> 57
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 57
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnnagaagtt gatgaaccgg tccttt 56
<210> 58
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 58
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnnggagaca tctcacattg tttttgttga 60
<210> 59
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 59
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnngcttttc aaaaggctta aacacaggat 60
<210> 60
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 60
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnncggtagt ctacagattc atttgaaacc 60
at 62
<210> 61
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 61
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnngcaaacc acaaaagtat actccatggt 60
<210> 62
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 62
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnntctgact tggtggtaaa cttttgagtt 60
<210> 63
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 63
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnnggttgaa aaagccgaag gtcac 55
<210> 64
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 64
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnngtggaag atccaatcca tttttgttgt 60
c 61
<210> 65
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 65
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnntgctgtt catggattgt gcaattc 57
<210> 66
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 66
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnntttaaga ttacgaaggt attggtttag 60
acagaa 66
<210> 67
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 67
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnnagcatca gcatttgact ttaccttatc 60
a 61
<210> 68
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 68
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnntcaatca gcggtataat caggagtttt 60
t 61
<210> 69
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 69
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnncaaacaa gtttatattt ccccatgcca 60
<210> 70
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 70
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnncataaga gagaaggttt gactgccata 60
<210> 71
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 71
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnngcactta cctgtgactc catagaaa 58
<210> 72
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 72
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnnccttttg tgtttcatcc ttcttctcct 60
g 61
<210> 73
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 73
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnnagaaaac cattacttgt ccatcgtct 59
<210> 74
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 74
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnnccttgtt gggacctcag atgt 54
<210> 75
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 75
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnngtggtag cagtggatgc agaa 54
<210> 76
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 76
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnnaggcccc atacaatttg atgaca 56
<210> 77
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 77
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnnccatggt gcacctggga t 51
<210> 78
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(无)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 78
tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnnactttgc gtggtgtaga tatgatcaa 59

Claims (6)

1.一种用游离DNA检测肺癌基因的检测引物，其特征在于：包括分别检测EGFR 、ALK、ERBB2、BRAF、MET、PIK3CA、KRAS和RET基因突变的正向捕获引物和反向捕获引物；所述正向捕获引物由5’端的测序文库read1的公共序列和3’端的特异性正向引物序列组成，所述反向捕获引物由5’端的测序文库read2的公共序列、8个碱基的随机序列和3’端的特异性反向引物序列组成。
2.根据权利要求1所述的用游离DNA检测肺癌基因的检测引物，其特征在于：
检测ALK基因突变的正向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示；检测ALK基因突变的反向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.40～41所示；
检测EGFR基因突变的正向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5～11所示；检测EGFR基因突变的反向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.44～50所示；
检测ERBB2基因突变的正向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12～14所示；检测ERBB2基因突变的反向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.51～53所示；
检测KRAS基因突变的正向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15～17所示；检测KRAS基因突变的反向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.54～56所示；
检测MET基因突变的正向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.18～23所示；检测MET基因突变的反向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.57～62所示；
检测PIK3CA基因突变的正向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.24～34所示；检测PIK3CA基因突变的反向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.63～73所示；
检测RET基因突变的正向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.35～39所示；检测RET基因突变的反向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.74～78所示。
3.根据权利要求3所述的用游离DNA检测肺癌基因的检测引物，其特征在于：所述正向捕获引物和反向捕获引物的使用浓度为10nM。
4.根据权利要求2所述的用游离DNA检测肺癌基因的检测引物，其特征在于：还包括正向通用引物和反向通用引物，正向通用引物的3’端连接有测序文库read1的公共序列，反向通用引物的3’端连接有测序文库read2的公共序列。
5.根据权利要求4所述的用游离DNA检测肺癌基因的检测引物，其特征在于：所述正向通用引物和反向通用引物的使用浓度为20uM。
6.一种采用如权利要求1所述的检测引物的用游离DNA检测肺癌基因的试剂盒，其特征在于：用血浆游离DNA作为样本。
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CN115058490A (zh) * 2022-06-28 2022-09-16 广州市金圻睿生物科技有限责任公司 一种用于构建微生物靶向测序文库的引物组合及其应用

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