CN115148364A - 基于外周血ctDNA水平预测DLBCL初治患者预后的装置及计算机可读存储介质 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了诊断领域基于外周血ctDNA水平预测DLBCL初治患者预后的装置及计算机可读存储介质。本发明采用靶向区域的NGS方法检测DLBCL患者接受一线标准治疗2周期后的外周血ctDNA中188个与淋巴瘤密切相关基因的突变情况，计算出血浆ctDNA的含量，发现治疗2个周期后的血浆ctDNA含量与患者的临床预后显著相关。本发明根据ctDNA含量的高低，可以对患者进行预后分层，建立了一种无创、简便易行的预测DLBCL初治患者预后的装置，可在治疗早期识别出可能不能从一线化疗中获益的患者，为临床医生进行治疗方案的调整提供参考信息，有助于推动恶性淋巴瘤个体化治疗的发展。
Description
技术领域
本发明涉及诊断领域，具体涉及基于外周血ctDNA水平预测DLBCL初治患者预后的装置及计算机可读存储介质。
背景技术
弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（NHL）最常见的亚型，在临床和生物学上具有高度异质性。随着标准R-CHOP（利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松）治疗方案的应用，DLBCL患者的生存率在过去20年中显著提高。尽管如此，30%~40%的患者仍经历复发或难治。因此，对DLBCL患者进行更好的风险分层和预后判定并制定个性化的治疗策略是非常重要的。到目前为止，如何识别高危患者以改善预后仍然是一个挑战，传统的预后分层手段结果都不太令人满意。国际预后指数（IPI）是目前DLBCL患者最常用的预后工具，根据临床参数将患者分为高低不同的风险组，但研究表明并未能有效改善患者的生存，临床实用性受限。据报道，依赖组织活检揭示的分子特征是良好的预后生物标志物，但它具有有创性，且受限于取样偏差。因此，急需新的更准确的预后预测指标或者标志物以弥补现状的不足。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何基于治疗期间外周血循环肿瘤DNA片段（ctDNA）水平预测弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者的预后。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了预测或辅助预测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者预后的装置。所述装置包括数据接收模块和数据处理模块；所述数据接收模块被配置为接收待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者外周血白细胞的基因组DNA的测序数据和外周血血浆中游离DNA（cfDNA）的测序数据及外周血血浆中cfDNA的含量，所述数据处理模块用于将所述测序数据和所述外周血血浆中cfDNA的含量转换为所述待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者预后的风险值，根据所述风险值预测或辅助预测所述待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的预后。
所述风险值可为待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的外周血中循环肿瘤DNA片段（ctDNA）含量。
所述测序数据可为panel测序数据。所述panel可为所述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关基因的靶向panel。所述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关基因可为人类基因组中的188个与弥漫性大B细胞淋巴瘤密切相关的基因。
所述188个与弥漫性大B细胞淋巴瘤密切相关的基因具体可为图3所示的188个基因。
上述装置中，所述外周血可为所述待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者治疗期间的外周血。
所述治疗期间可为弥漫性大B细胞淋巴瘤一线标准治疗方案治疗2周期后。
上述装置中，所述数据处理模块包括如下模块：
A1）cfDNA的体细胞突变数据的获得模块：用于对所述白细胞的测序数据和所述cfDNA的测序数据进行变异分析，获得所述cfDNA的体细胞突变数据；
A2）ctDNA含量计算模块：用于根据所述体细胞突变数据计算得到所述患者血浆体细胞突变的平均突变频率；用所述平均突变频率和所述外周血血浆中cfDNA的含量的乘积除以3.3得到单位体积血浆中的单倍染色体当量值，所述单倍染色体当量值为所述外周血中ctDNA含量。
所述cfDNA的含量可为所述cfDNA在所述外周血血浆中的浓度。所述浓度的单位可为pg/mL外周血血浆，即单位体积外周血血浆提取得到的总游离DNA量。所述单位体积可为每毫升。所述ctDNA含量的单位可为hGE/mL，即每毫升外周血血浆中的单倍染色体当量值。所述测序数据可为原始测序下机数据经过质量控制后获得的质控后的数据。所述平均突变频率可为平均VAF值，可通过外周血血浆中检测到所有体细胞变异等位基因突变频率之和除以突变位点的个数获得。
所述风险值还可为所述ctDNA含量以10为底的对数值（ctDNA水平），计算公式可为如下式2：
ctDNA水平（log hGE/mL）=Log10单倍染色体当量值（hGE/mL） 式2。
上述装置还可包括结果输出模块，当所述待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的治疗期间外周血中的ctDNA水平大于等于0.9 log hGE/mL时，所述结果输出模块的输出结果为预后（包括无进展生存期和总生存期）较差；当所述待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的治疗期间外周血中的ctDNA水平（每毫升血浆中的单倍染色体当量）小于0.9 log hGE/mL时，所述结果输出模块的输出结果为预后（包括无进展生存期和总生存期）较好。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了获取弥漫性大B细胞淋巴瘤患者外周血血浆中ctDNA的含量的方法，所述方法可包括获取待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者外周血白细胞的基因组DNA的测序数据和外周血血浆中cfDNA的测序数据及外周血血浆中cfDNA的含量，对所述白细胞的测序数据和所述cfDNA的测序数据进行变异分析，获得所述cfDNA的体细胞突变数据；根据所述体细胞突变数据计算得到所述患者血浆体细胞突变的平均突变频率；用所述平均突变频率和所述外周血血浆中cfDNA的含量的乘积除以3.3得到单位体积血浆中的单倍染色体当量值，所述单倍染色体当量值为所述外周血中ctDNA含量。
所述测序数据可为panel测序数据。所述panel可为所述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关基因的靶向panel。所述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关基因可为人类基因组中的188个与弥漫性大B细胞淋巴瘤相关的基因。所述cfDNA的含量可为所述cfDNA在所述外周血血浆中的浓度。所述浓度的单位可为pg/mL外周血血浆，即单位体积外周血血浆提取得到的总游离DNA量。所述单位体积可为每毫升。所述ctDNA含量的单位可为hGE/mL，即每毫升外周血血浆中的单倍染色体当量值。所述测序数据可为原始测序下机数据经过质量控制后获得的质控后的数据。
所述单倍染色体当量值的计算公式可为如下式1：
单倍染色体当量值（单位：hGE/mL）=（血浆中检测到所有体细胞变异等位基因突变频率之和÷突变位点的个数）×cfDNA的浓度（pg/mL）÷3.3 式1。
所述平均突变频率可为平均VAF值，可通过外周血血浆中检测到所有体细胞变异等位基因突变频率之和除以突变位点的个数获得。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了存储有计算机程序的计算机可读存储介质。所述计算机程序使计算机执行如下步骤：获取待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者外周血白细胞的基因组DNA的测序数据和外周血血浆中cfDNA的测序数据及外周血血浆中cfDNA的含量，对所述白细胞的测序数据和所述cfDNA的测序数据进行变异分析，获得所述cfDNA的体细胞突变数据；根据所述体细胞突变数据计算得到所述患者血浆体细胞突变的平均突变频率；用所述平均突变频率和所述外周血血浆中cfDNA的含量的乘积除以3.3得到单位体积血浆中的单倍染色体当量值，所述单倍染色体当量值为所述外周血中ctDNA含量。
弥漫性大B细胞淋巴瘤患者治疗期间的外周血中ctDNA作为生物标志物在制备预测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者预后产品中的应用也属于本发明的保护范围。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了检测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者治疗期间的外周血中ctDNA含量的物质在制备预测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者预后产品应用中的应用。
所述产品可以弥漫性大B细胞淋巴瘤患者治疗期间的外周血为检测样本。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了存储有计算机程序的计算机可读存储介质。所述计算机程序使计算机执行如下步骤：获取待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者外周血白细胞的基因组DNA的测序数据和外周血血浆中cfDNA的测序数据及外周血血浆中cfDNA的含量，对所述白细胞的测序数据和所述cfDNA的测序数据进行变异分析，获得所述cfDNA的体细胞突变数据；根据所述体细胞突变数据计算得到所述患者血浆体细胞突变的平均突变频率；用所述平均突变频率和所述外周血血浆中cfDNA的含量的乘积除以3.3得到单位体积血浆中的单倍染色体当量值，所述单倍染色体当量值为所述外周血中ctDNA含量；根据所述ctDNA含量计算ctDNA水平，以所述ctDNA水平作为风险值，将所述风险值与0.9进行比较输出待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的预后。
所述ctDNA水平的计算公式为如下式2：
ctDNA水平（log hGE/mL）=Log10单倍染色体当量值（hGE/mL） 式2。
上文所述预后可为弥漫性大B细胞淋巴瘤的复发、进展和/或导致死亡。
所述外周血可为所述待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者治疗期间的外周血。
本发明的目的在于为解决目前DLBCL患者缺乏较好预后指标的难题，提供一种新的基于治疗期间外周血ctDNA水平测定的预后评估方法。本发明首次发现不依赖治疗前样本的采集，初诊DLBCL患者接受标准一线免疫化疗2周期后的血浆ctDNA的水平可以作为预测DLBCL患者预后的有效指标。本发明通过采用包含188个淋巴瘤相关基因的靶向panel的高通量测序方法，检测DLBCL初治患者接受一线免疫化疗2周期后的血浆ctDNA的体细胞突变情况，并根据突变检测结果计算出血浆中ctDNA的水平，从而预测DLBCL患者的预后。所述的预测具体指：患者接受一线标准化疗2周期后，当外周血血浆ctDNA水平≥0.9 log hGE/mL时，患者的预后可能较差，反之，则较好。
和现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明采用靶向区域的NGS方法检测DLBCL患者外周血ctDNA中188个与淋巴瘤密切相关基因的突变情况，计算出血浆ctDNA的水平，发现治疗2个周期后的血浆ctDNA水平与患者的临床预后显著相关。根据ctDNA水平的高低，可以对患者进行预后分层，在治疗早期识别出可能不能从一线化疗中获益的患者，为临床医生进行治疗方案的调整提供参考信息，有助于推动恶性淋巴瘤个体化精准治疗的发展。
使用本发明的装置或其相关的方法，一次采血即可满足需求，临床可操作性强，可作为DLBCL患者的一种新的、无创且简便易行的预后预测手段。
附图说明
图1为是治疗2周期后血浆ctDNA水平高低对患者总体生存期和无进展生存期的影响分析图。A为根据ctDNA水平进行分层评估ctDNA水平高的和低的患者其无进展生存期（PFS）的差异图；纵坐标为无进展生存率PFS（%）。B为根据ctDNA水平进行分层评估ctDNA水平高的和低的患者其总生存期（OS）的差异图；横纵坐标为总生存率OS（%）。C为无进展生存期（PFS）的多因素连续变量的Cox回归分析模型图，“*”代表p＜0.05。D为总生存期（OS）的多因素连续变量的Cox回归分析模型图，“*”代表p＜0.05。多因素包括：ctDNA水平，年龄、B症状、LDH、IPI指数、COO分型，肿瘤分期、结外受累部位、体能状况评分。E为根据ctDNA水平预测患者复发或进展的ROC曲线图，横坐标代表预测的特异性（Specificity表示），纵坐标代表预测的灵敏性（Sensitivity）。F为根据ctDNA水平预测患者死亡的ROC曲线图，横坐标代表预测的特异性（Specificity表示），纵坐标代表预测的灵敏性（Sensitivity）。
图2为患者临床资料信息表。GCB代表生发中心型，non-GCB代表非生发中心型。B症状中的“B”代表患者存在B症状，“A”代表患者不存在B症状。
图3为Onco-LymScan Panel包含的基因列表。
图4为37例患者治疗2周期后的ctDNA水平。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中的部分定义或术语如下：
cfDNA（circulating free DNA）：简称循环游离DNA或者细胞游离DNA，是指循环血中游离于细胞外的DNA。正常生理情况下，cfDNA主要来源于衰老凋亡细胞基因组DNA的降解，当机体发生疾病时，如恶性肿瘤、外伤、器官移植排异、组织器官衰竭和感染重大疾病等，异常坏死细胞会释放大量DNA进入血液循环。
ctDNA（Circulating tumor DNA）：循环肿瘤DNA片段，来源于坏死及凋亡的肿瘤细胞、循环肿瘤细胞以及肿瘤细胞分泌的外排体，是肿瘤组织释放到血液循环系统中的DNA片段，属于cfDNA的一种类型，仅为cfDNA很小的一部分，ctDNA片段携带肿瘤基因组特征（包括突变、缺失、插入、重排、拷贝数异常、甲基化等）。肿瘤细胞均有机会将遗传信息释放到病人的血液当中，在多种类型肿瘤病人血液中均可检测到ctDNA。
Panel：Panel是指在基因检测中不只是检测一个位点、一个基因。而是同时检测多个基因、多个位点。这些位点和基因需要按照一个标准进行选择和组合，从而构成一个检测Panel。
IPI（International Prognostic Index，IPI）：IPI 是目前公认的DLBCL预后判断指标，为 5 项预后相关因素（患者体能状况、乳酸脱氢酶水平、结外侵犯部位数、年龄和临床分期）的综合评估得分。根据 IPI 评分，可进行 DLBCL 患者的危险度分层：0-1 分者为低危；2 分者为中低危；3 分者为中高危；4-5 分者则为高危。
COO分型（Cell-of-Origin Classification）：随着DNA 微阵列（DNA microarray）技术的出现，依据基因表达模式的不同，将DLBCL分为生发中心B细胞样淋巴瘤（germinalcenter B-cell-like lymphoma）、活化B 细胞样淋巴瘤（activated B-cell-likelymphoma）和第三型DLBCL（Type 3 DLBCL）。
PFS（progression-free survival , PFS）：定义为从一线治疗开始到进展、最后一次随访或因任何原因死亡的时间。
OS（overall survival, OS）：从诊断之日起至因任何原因或最后随访而计算的时间。
PFS（%）：无进展生存率，为以治疗点为随访开始时间，至末次随访时无疾病进展患者占全部患者的比例。
OS（%）总生存率，为以治疗点为随访开始时间，至末次随访时生存患者占全部患者的比例。
实施例1、基于治疗2周期后血浆ctDNA水平评估DLBCL患者接受标准一线治疗的预后。
1.淋巴瘤血浆cfDNA体细胞突变的检测及ctDNA水平测定。
1.1外周血样本采集。
收集北京肿瘤医院淋巴瘤科37例初诊的DLBCL患者在接受一线标准治疗方案2周期后的外周血样本10 mL，并分别分离出血浆和白细胞样本进行存储，采血均在与患者签署知情同意书的前提下进行，且该部分研究方案已经获得该单位伦理委员会通过。同时收集患者的年龄、B症状（发热、盗汗和体重减轻）、LDH、IPI指数、COO分型（Hans方法）、体能状态评分（Eastern Cooperative Oncology Group Performance Status，ECOG PS）、结外受累部位数量等临床特征信息以及生存时间和生存状态等临床资料，收集结果见图2。
1.2 DNA提取、测序、及生信分析。
1.2.1 外周血cfDNA和基因组DNA（gDNA）的提取。
使用ctDNA Streck专用管常温（6-37℃）采集外周血10ml，轻轻混匀，在采集后6小时内采用两步离心法分离血浆样本和白细胞样本。第一步先将Streck管保存的外周血置于4℃离心机中2000g离心10min，取上层澄清血浆（勿吸入中间白细胞层），分装至无菌的1.5ml EP管中。第二步将Streck管中的剩余样本再次置于4℃离心机中16000g离心10min，取澄清的上层血浆（勿吸入中间白细胞层）继续分装至无菌的1.5ml EP管中，同时用移液枪小心的将中间层的白细胞（勿吸入底层红细胞）分离出来，分装至无菌的1.5ml EP管中。分离的血浆样本和白细胞标记清楚后及时冻存至-80℃冰箱中。
使用MagMAX™游离DNA提取试剂盒（赛默飞科学，美国）对每个患者的血浆样本进行血浆总cfDNA的提取，使用QIAamp组织&血液提取试剂盒（Qiagen，美国）对分离的白细胞样本进行gDNA的提取。最后使用Qubit2.0荧光试剂盒（life；美国卡尔斯巴德）对所有分离的DNA进行定量。得到提取的cfDNA总量（pg）后，根据提取使用的血浆体积（mL）计算出每例血浆样本的cfDNA浓度（pg/mL）。
1.2.2 DNA文库构建及高通量测序。
采用Focused-ultrasonicator™（Covaris，美国）将gDNA进行片段化，并筛选150~200bp之间的片段。使用KAPA文库制备试剂盒（Kapa Biosystems，美国）对筛选得到的基因组DNA片段和cfDNA进行文库构建。
随后使用包含了淋巴瘤相关的188基因的Onco-LymScan panel（泛生子，中国）探针进行靶向捕获（188基因列表见图3）。然后通过 Illumina PE150 NGS平台（Illumina，美国）对gDNA和血浆cfDNA进行测序，分别得到血浆cfDNA和白细胞 gDNA的原始下机数据。
1.2.3 生物信息学分析。
利用trimmomatic（http://www.usadellab.org/cms/）软件分别对原始下机数据（包括血浆cfDNA和白细胞gDNA）进行质量控制（质量控制筛选条件为：每条read的平均碱基测序质量不低于15；去除每条read中碱基测序质量低于3或为“N”的碱基；每条read的最短长度大于等于36bp）处理，去除接头序列和过滤低质量序列得到质控后的数据，利用bwa（http://bio-bwa.sourceforge.net/）软件将得到质控后的数据与人hg19参考基因组（https://data.broadinstitute.org/snowman/hg19/Homo_sapiens_assembly19.fasta）进行比对，得到bam格式比对文件。使用 picard（https://broadinstitute.github.io/picard/）软件对比对文件进行处理，去除PCR产生的重复序列，统计去重结果，分别得到淋巴瘤血浆cfDNA和白细胞gDNA的去重后文件，使用GATK（https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us）软件对淋巴瘤血浆cfDNA和白细胞gDNA的去重后文件进行重比对得到重比对文件。
然后采用Samtools v0.1.1722（http://www.htslib.org/）对重比对文件进行变异查找，包括SNV/Indel（单核苷酸变异/缺失插入变异）的变异类型，得到淋巴瘤血浆ctDNA样本所检测基因的体细胞突变结果；同时采用Vep（https://asia.ensembl.org/info/docs/tools/vep/index.html）软件对查找到的体细胞突变进行功能注释，得到VCF格式变异文件。变异文件中的所有变异均根据 dbNSFP（http://database.liulab.science/dbNSFP#database）和ExAC数据库（https://exac.broadinstitute.org/）进行单核苷酸多态性（SNP）位点的过滤，并以白细胞样本的测序结果为正常对照过滤掉胚系变异。然后采用Integrative Genomics Viewer软件 (https://software.broadinstitute.org/software/igv/download) 进行变异真实性的检查，并按照VAF（即VAF，Variant AlleleFrequency，计算公式为该位点突变的reads数目占该位点所有reads数目的比例）≥0.1%且突变的reads支持数≥3的阈值标准对突变进行筛选，最终得到淋巴瘤血浆cfDNA体细胞突变数据。
上述操作均按照所使用的设备、软件和试剂盒的说明书进行。至此，得到37位DLBCL受试者的接受一线标准治疗方案2周期后外周血cfDNA体细胞突变情况。
1.3 循环肿瘤DNA（ctDNA）含量的计算。
参考Scherer et al.之前发表的结果（相关文献：Scherer F, Kurtz DM, NewmanAM, Stehr H, Craig AFM, Esfahani MS, et al. Distinct biological subtypes andpatterns of genome evolution in lymphoma revealed by circulating tumor DNA.Sci Transl Med. 2016;8:364ra155），ctDNA含量定义为每毫升血浆中的单倍染色体当量（hGE/mL），计算方式为淋巴瘤血浆cfDNA中检测到的所有体细胞突变的VAF的平均值（血浆中检测到所有体细胞变异等位基因突变频率之和÷突变位点的个数）乘以cfDNA的浓度（单位mL血浆提取出的总cfDNA的pg数），然后除以3.3即可得到单倍染色体当量值（单位：hGE/mL）。计算公式为：
单倍染色体当量值（单位：hGE/mL）=（血浆中检测到所有体细胞变异等位基因突变频率之和÷突变位点的个数）×cfDNA的浓度（pg/mL）÷3.3 式1。
然后将单倍染色体当量值（单位：hGE/mL）最后采用以10为底的对数（Log10）进行表示得到ctDNA水平（单位：log hGE/mL），计算公式为：
ctDNA水平（log hGE/mL）=Log10单倍染色体当量值（hGE/mL） 式2。
据此，37例患者在接受一线标准治疗方案治疗2周期ctDNA的水平计算结果见图4。
2. 基于ctDNA水平评估DLBCL患者预后。
ctDNA水平与患者的PFS和OS的相关性分析。
将表格2中的接受一线标准治疗方案治疗2周期后DLBCL患者血浆的ctDNA水平与患者的生存信息进行关联性分析。根据ctDNA水平高（大于等于中位值0.9 log hGE/mL）与低（小于0.9 log hGE/mL）将37位DLBCL患者分成2组，采用GraphPad Prism（version 8.02）分析软件中的survival功能绘制生存曲线。
结果如图1中A和B所示。图1中A是DLBCL患者血浆ctDNA水平与患者的无进展生存期（PFS）的关系示意图；图1中B是DLBCL患者血浆ctDNA水平与患者的总生存期（OS）的关系示意图。图1中A和B中的横坐标均为时间，单位为月；纵坐标分别为无复发生存率和总生存率。由图1中A可得知，DLBCL患者接受一线标准治疗方案2周期后，与血浆ctDNA水平较低患者（＜0.9 log hGE/mL，图1中A的低代表）相比，血浆ctDNA水平较高的患者（≥0.9 loghGE/mL，图1中A的“高”代表）的PFS较差，p=0.043，HR=2.604（95% CI，0.996 to 6.807）；图1中B所示的OS的曲线图中也表现出同样的趋势（p=0.086，HR=2.65（95% CI，0.8359 to8.403）；图1中B的“低”代表ctDNA水平较低患者，图1中B的高代表ctDNA水平较高患者），说明DLBCL患者接受2周期一线标准治疗方案后的外周血ctDNA水平可以作为预测患者预后的指标之一，患者治疗期间外周血ctDNA水平的中位值0.9 log hGE/mL可作为判断ctDNA水平高低的阈值，ctDNA水平大于等于0.9 log hGE/mL的患者（即ctDNA水平高的患者）预后（包括无进展生存期和总生存期）较差，ctDNA水平小于0.9 log hGE/mL的患者（即ctDNA水平较低的患者）预后（包括无进展生存期和总生存期）较好。
对患者的PFS和OS采用“survival”R软件包（https://CRAN.R-project.org/package=survival）进行多因素回归分析，结果如图1中C和D所示，除肿瘤分期（图1中C和D的肿瘤分期所代表）之外，只有治疗2周期后的ctDNA水平（图1中C和D的ctDNA水平所代表）是影响患者复发进展或者死亡的显著相关因素（PFS: p=0.019,HR=2.22，95%置信区间为1.14-4.3；OS: p=0.017，HR=2.79, 95%置信区间为1.20-6.5），该值的升高会增加患者复发或死亡的风险。表明DLBCL患者接受2周期一线标准治疗方案后的ctDNA水平在年龄（图1中C和D的年龄所代表）、B症状（图1中C和D的B 症状所代表）、LDH、IPI、COO分型，肿瘤分期等因素的背景下仍具有预后意义，即治疗2周期后的ctDNA水平的高低相比年龄、B症状、LDH、IPI指数、COO分型等传统预后指标能更好的预测患者的PFS和OS。此外，采用ROCplot在线分析工具（https://www.rocplot.org/）绘制ctDNA水平预测复发或疾病进展和死亡的ROC曲线图，如图1中的E和F所示，ctDNA水平预测患者复发或疾病进展的AUC值为0.66，灵敏度（TPR）为0.7，特异性为0.59（TNR），p值为0.039（图1中E）；预测患者出现死亡的AUC值为0.68，灵敏度为0.67，特异性为0.68，p值为0.028（图1中F）。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (9)
1.预测或辅助预测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者预后的装置，其特征在于：
所述装置包括数据接收模块和数据处理模块；所述数据接收模块被配置为接收待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的外周血的白细胞的基因组DNA的测序数据和外周血血浆中cfDNA的测序数据及外周血血浆中cfDNA的含量，所述数据处理模块用于将所述测序数据和所述外周血血浆中cfDNA的含量转换为所述待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者预后的风险值，根据所述风险值预测或辅助预测所述待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的预后；
所述风险值为待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的外周血中ctDNA含量。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于：所述外周血为所述待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者治疗期间的外周血。
3.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于：所述数据处理模块包括如下模块：
A1）cfDNA的体细胞突变数据的获得模块：用于对所述白细胞的测序数据和所述cfDNA的测序数据进行变异分析，获得所述cfDNA的体细胞突变数据；
A2）ctDNA含量计算模块：用于根据所述体细胞突变数据计算得到所述患者血浆体细胞突变的平均突变频率；用所述平均突变频率和所述外周血血浆中cfDNA的含量的乘积除以3.3得到单位体积血浆中的单倍染色体当量值，所述单倍染色体当量值为所述外周血中ctDNA含量。
4.获取弥漫性大B细胞淋巴瘤患者外周血血浆中ctDNA的含量的方法，其特征在于：所述方法包括获取待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者外周血白细胞的基因组DNA的测序数据和外周血血浆中cfDNA的测序数据及外周血血浆中cfDNA的含量，对所述白细胞的测序数据和所述cfDNA的测序数据进行变异分析，获得所述cfDNA的体细胞突变数据；根据所述体细胞突变数据计算得到所述患者血浆体细胞突变的平均突变频率；用所述平均突变频率和所述外周血血浆中cfDNA的含量的乘积除以3.3得到单位体积血浆中的单倍染色体当量值，所述单倍染色体当量值为所述外周血中ctDNA含量。
5.存储有计算机程序的计算机可读存储介质，所述计算机程序使计算机执行如下步骤：获取待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的外周血的白细胞的基因组DNA的测序数据和外周血血浆中cfDNA的测序数据及外周血血浆中cfDNA的含量，对所述白细胞的测序数据和所述cfDNA的测序数据进行变异分析，获得所述cfDNA的体细胞突变数据；根据所述体细胞突变数据计算得到所述患者血浆体细胞突变的平均突变频率；用所述平均突变频率和所述外周血血浆中cfDNA的含量的乘积除以3.3得到单位体积血浆中的单倍染色体当量值，所述单倍染色体当量值为所述外周血中ctDNA含量。
6.弥漫性大B细胞淋巴瘤患者治疗期间的外周血中ctDNA作为生物标志物在制备预测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者预后产品中的应用。
7.检测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者治疗期间的外周血中ctDNA含量的物质在制备预测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者预后产品中的应用。
8.存储有计算机程序的计算机可读存储介质，所述计算机程序使计算机执行如下步骤：获取待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者外周血白细胞的基因组DNA的测序数据和外周血血浆中cfDNA的测序数据及外周血血浆中cfDNA的含量，对所述白细胞的测序数据和所述cfDNA的测序数据进行变异分析，获得所述cfDNA的体细胞突变数据；根据所述体细胞突变数据计算得到所述患者血浆体细胞突变的平均突变频率；用所述平均突变频率和所述外周血血浆中cfDNA的含量的乘积除以3.3得到单位体积血浆中的单倍染色体当量值，所述单倍染色体当量值为所述外周血中ctDNA含量；根据所述ctDNA含量计算ctDNA水平，以所述ctDNA水平作为风险值，将所述风险值与0.9进行比较输出待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的预后；
所述ctDNA水平的计算公式为如下式2：
ctDNA水平（log hGE/mL）=Log10单倍染色体当量值（hGE/mL） 式2。
9.根据权利要求8所述的计算机可读存储介质，其特征在于：所述外周血为所述待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者治疗期间的外周血。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20221004 |
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