CN115148283B - 基于一线治疗中期外周血ctDNA预测DLBCL患者预后的装置及计算机可读存储介质 - Google Patents

基于一线治疗中期外周血ctDNA预测DLBCL患者预后的装置及计算机可读存储介质 Download PDF

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Abstract

本发明公开了诊断领域中基于一线治疗中期外周血ctDNA预测DLBCL患者预后的装置及计算机可读存储介质。本发明通过采用包含188个淋巴瘤相关基因的靶向NGS基因panel测序的方法，通过检测DLBCL初治患者治疗前基线原发肿瘤组织和/或基线外周血血浆中的基线突变，以及一线标准治疗四个周期后外周血血浆治疗中期ctDNA突变，根据治疗四个周期外周血血浆中期ctDNA突变中的基线突变的检出情况并结合PET‑CT评估预测DLBCL患者接受一线标准治疗的预后。该方法可以作为目前临床常规PET‑CT评估方法的有效补充，更好的对DLBCL患者进行中期评估和预后预测，以实现更精准的疾病管理。

Description

基于一线治疗中期外周血ctDNA预测DLBCL患者预后的装置及 计算机可读存储介质
技术领域
本发明涉及诊断领域，具体涉及基于一线治疗中期外周血ctDNA预测DLBCL患者预后的装置及计算机可读存储介质。
背景技术
弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（NHL）最常见的亚型，在临床和生物学上具有高度异质性。随着标准R-CHOP（利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松）治疗方案的应用，DLBCL患者的生存率在过去20年中显著提高。尽管如此，30%~40%的患者仍经历复发或难治。如何识别不太可能通过一线R-CHOP治疗达到治愈的高危患者并制定个性化的治疗策略对于患者预后的改善是非常重要的。中期评估对于淋巴瘤的治疗指导和疾病管理具有重要的临床意义，PET-CT检查是目前DLBCL患者中期评估的主要手段，通常在患者完成3~4个化疗周期后进行。根据中期疗效评价的结果，可指导患者及时进行治疗策略的调整；同时中期评估结果可以预测患者的预后，对患者的复发风险进行进一步的分层，为疾病监测及干预提供参考信息。但是基于PET-CT的中期评估方法具有准确性低，难以发现微小残留病灶，而且具有辐射暴露风险等等缺陷。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何有效且无辐射暴露风险的预测接受一线标准方案治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的疗效和/或预后。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了预测或辅助预测接受一线标准方案治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的预后的装置。所述装置包括数据接收模块和数据处理模块。所述数据接收模块用于接收待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者在接受一线标准治疗前的基线外周血血浆中cfDNA的测序数据或/和原发肿瘤组织样本DNA的测序数据、所述患者在接受一线标准治疗中期外周血血浆cfDNA的测序数据、所述患者的外周血分离白细胞的基因组DNA测序数据，以及所述患者在接受一线标准治疗中期的PET-CT评估结果数据；所述数据处理模块用于根据所述测序数据获得所述患者在接受一线标准治疗前的基线突变和所述患者在接受一线标准治疗中期的外周血血浆中的中期ctDNA突变，通过比较所述中期ctDNA突变和所述基线突变获得所述患者的中期血浆ctDNA突变的阴阳性结果，根据所述中期血浆ctDNA突变的阴阳性结果和所述PET-CT评估结果预测所述患者在接受一线标准治疗的预后。
上述装置中，所述一线标准治疗中期可为待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者在接受一线标准治疗方案治疗4周期后。所述中期血浆ctDNA突变的阴阳性结果可为中期血浆ctDNA突变阴性或中期血浆ctDNA突变阳性。
上文所述装置中，所述测序数据可为panel测序数据。所述panel可为所述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关基因的靶向panel。所述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关基因可为人类基因组中的188个与弥漫性大B细胞淋巴瘤相关的基因。所述188个与弥漫性大B细胞淋巴瘤相关的基因可如图5中所示。
所述装置还可包括数据输出模块，所述数据输出模块用于输出待测接受一线标准方案治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的预后结果。
所述中期血浆ctDNA突变阳性和/或所述PET-CT评估结果阳性的待测接受一线标准方案治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的预后结果输出为预后不良。
所述中期血浆ctDNA突变阴性且所述PET-CT评估结果阴性的待测接受一线标准方案治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的预后结果输出为预后良好。
所述中期血浆ctDNA突变结果阳性为所述患者的所述中期血浆ctDNA中存在大于等于1个所述基线突变。所述中期血浆ctDNA突变阴性为所述患者的所述中期血浆ctDNA中不存在所述基线突变。
所述PET-CT评估结果阳性为所述患者的PET-CT疗效评价未达到完全缓解。所述PET-CT评估结果阴性为所述患者的PET-CT疗效评价为完全缓解。
所述白细胞可为所述患者的基线外周血分离得到白细胞或所述患者在接受一线标准治疗中期的外周血分离得到的白细胞。
所述PET-CT的评估或疗效评价可参考 Lugano 淋巴瘤疗效评价标准2014年修订版进行。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了预测或辅助预测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者接受一线标准治疗预后的装置。所述装置可包括数据接收模块和数据处理模块；所述数据接收模块用于接收待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者在接受一线标准治疗前的基线外周血血浆中cfDNA的测序数据或/和原发肿瘤组织样本DNA的测序数据、所述患者在接受一线标准治疗中期外周血血浆cfDNA的测序数据、所述患者的外周血分离得到的白细胞的基因组DNA测序数据；所述数据处理模块用于根据所述测序数据获得所述患者在接受一线标准治疗前的基线突变和所述患者在接受一线标准治疗中期的外周血血浆中的中期ctDNA突变，通过比较所述中期ctDNA突变和所述基线突变获得所述患者的中期血浆ctDNA突变的阴阳性结果，根据中期血浆ctDNA突变的阴阳性结果预测所述患者在接受一线标准治疗的预后。
上述装置中，所述中期血浆ctDNA突变的阴阳性结果可包括突变阳性和突变阴性；所述突变阳性可为所述患者的所述中期ctDNA中存在大于等于1个所述基线突变；所述突变阴性可为所述患者的所述中期ctDNA中不存在所述基线突变。
上述装置还可包括数据输出模块，所述数据输出模块用于输出待测接受一线标准方案治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的预后结果。
所述中期血浆ctDNA突变阳性的待测接受一线标准方案治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的预后结果输出为预后不良。
所述中期血浆ctDNA突变阴性的待测接受一线标准方案治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的预后结果输出为预后良好。
所述白细胞可为所述患者的基线外周血分离的白细胞或所述患者在接受一线标准治疗中期的外周血分离的白细胞。
上文所述装置中，所述测序数据可为panel测序数据。所述panel可为所述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关基因的靶向panel。所述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关基因可为人类基因组中的188个与弥漫性大B细胞淋巴瘤相关的基因。所述188个与弥漫性大B细胞淋巴瘤相关的基因可如图5中所示。
上述装置中，所述一线标准治疗中期可为待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者在接受一线标准治疗方案治疗4周期后。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种存储有计算机程序的计算机可读存储介质，所述计算机程序使计算机运行如下步骤：
C1）向计算机输入待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者在接受一线标准治疗前的基线外周血血浆cfDNA或/和原发肿瘤样本DNA的测序数据、所述患者在接受一线标准治疗中期外周血血浆cfDNA的测序数据、所述患者外周血白细胞的DNA测序数据、以及所述患者在接受一线标准治疗中期的PET-CT的评估结果；
C2）使计算机计算获得患者在接受一线标准治疗前的基线突变和所述患者在接受一线标准治疗中期外周血血浆中的中期ctDNA突变，比较所述基线突变和所述中期ctDNA突变获得所述患者的中期ctDNA突变的阴阳性结果，根据所述突变的阴阳性结果和所述PET-CT评估结果预测所述患者在接受一线标准治疗的预后。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种存储有计算机程序的计算机可读存储介质，所述计算机程序使计算机运行如下步骤：
D1）向计算机输入待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者在接受一线标准治疗前的基线外周血血浆cfDNA或/和原发肿瘤样本DNA的测序数据、所述患者在接受一线标准治疗中期外周血血浆cfDNA的测序数据以及所述患者外周血白细胞的DNA测序数据；
D2）使计算机计算获得患者在接受一线标准治疗前的基线突变和所述患者在接受一线标准治疗中期外周血血浆中的中期ctDNA突变，比较所述基线突变和所述中期ctDNA突变获得所述患者的中期血浆ctDNA突变的阴阳性结果，根据所述中期血浆ctDNA突变的阴阳性结果预测所述患者在接受一线标准治疗的预后。
上文所述的计算机可读存储介质中，上文所述计算机可读存储介质中，所述计算机程序还可使计算机运行如下步骤：输出待测接受一线标准方案治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的预后结果。
所述中期ctDNA突变结果阳性和/或所述PET-CT评估结果阳性的待测接受一线标准方案治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的预后结果输出为预后不良。
所述中期ctDNA突变结果阴性且所述PET-CT评估结果阴性的待测接受一线标准方案治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的预后结果输出为预后良好。
所述中期ctDNA突变结果阳性为所述患者的所述中期ctDNA中存在大于等于1个所述基线突变。
所述中期ctDNA突变结果阴性为所述患者的所述中期ctDNA中不存在所述基线突变。
所述PET-CT评估结果阳性为所述患者的PET-CT疗效评价未达到完全缓解。所述PET-CT评估结果阴性为所述患者的PET-CT疗效评价为完全缓解。
所述PET-CT的评估或疗效评价可参考 Lugano 淋巴瘤疗效评价标准2014年修订版进行。
所述白细胞可为所述患者的基线外周血分离的白细胞或所述患者在接受一线标准治疗中期的外周血分离的白细胞。
上文所述计算机可读存储介质中，所述测序数据可为panel测序数据。所述panel可为所述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关基因的靶向panel。所述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关基因可为人类基因组中的188个与弥漫性大B细胞淋巴瘤相关的基因。所述188个与弥漫性大B细胞淋巴瘤相关的基因可如图5中所示。
上文所述一线标准治疗中期可为待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者在接受一线标准治疗方案治疗4周期后。
上文所述计算机可读存储介质中，所述计算机程序还可使计算机运行如下步骤：输出待测接受一线标准方案治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的预后结果。
所述中期ctDNA突变阳性的待测接受一线标准方案治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的预后结果输出为预后不良。
所述中期ctDNA突变阴性的待测接受一线标准方案治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的预后结果输出为预后良好。
所述中期ctDNA突变阳性为所述患者的所述中期ctDNA中存在大于等于1个所述基线突变；
所述中期ctDNA突变阴性为所述患者的所述中期ctDNA中不存在所述基线突变。
所述白细胞可为所述患者的基线外周血分离的白细胞或所述患者在接受一线标准治疗中期的外周血分离的白细胞。
外周血样本具有取样便捷、微创的优势，外周血来源的循环肿瘤DNA被证实是一种肿瘤特异的生物标志物。基于外周血样本的ctDNA检测在很多实体瘤的研究中被证明是一种很有前景的疗效评价和预后预测的方法。在淋巴瘤领域，ctDNA已被证明可以替代组织活检样本进行肿瘤体细胞突变的检测，为患者提供更全面的分子变异信息。本发明则是基于目前DLBCL中期评估方法的缺陷不足现状以及ctDNA的理论研究基础，提出了一种新的有效的中期评估方法。本发明首次发现在治疗中期通过外周血ctDNA的检测可以媲美传统PET-CT影像学的评估手段对患者进行疗效评估和预后预测，且中期ctDNA检测与PET-CT检查相结合的方法更能改善中期评估的预后预测功能，为临床提供了一种更准确和便捷的中期评估手段。
本发明通过采用包含188个淋巴瘤相关基因的靶向NGS基因panel测序的方法，通过检测DLBCL初治患者治疗前基线原发肿瘤组织或基线外周血血浆以及化疗治疗4个周期后外周血血浆的体细胞突变情况，评估治疗前后DLBCL患者肿瘤体细胞突变的变化情况，从而对患者进行疗效评估和预后预测。
所述的评估方法具体指：将基线肿瘤组织样本或/和基线血浆样本中检测到的体细胞突变作为疾病监测的标志物，接受一线标准化疗方案治疗4周期后，外周血血浆样本中检测不到基线组织或基线血浆样本的突变，即ctDNA阴性，表明患者的预后较好；反之，化疗4周期后，患者的血浆中仍能检测到基线样本中的任一突变，即ctDNA阳性，表明患者的预后较差。另外联合ctDNA检测与PET-CT的临床疗效评估数据结果，可以进一步改善预后预测效果，即ctDNA和PET-CT双阳性的患者预后最差，双阴性的患者预后最好，ctDNA阳性PET-CT阴性或者ctDNA阴性而PET-CT阳性的患者预后居于二者之间。
本发明由于采取以上技术方案，与现有技术相比，其具有以下优点：
相比传统PET-CT中期评估手段，中期血浆ctDNA的检测结果可以从分子层面评估中期治疗效果，且能够对患者的PFS和OS进行较好的分层，较好的应用于预测接受一线治疗的DLBCL患者的预后，进而指导患者的后续治疗和复发监测。
将中期ctDNA检测与PET-CT检查相联合的评估方法，可以弥补目前临床上PET-CT的不足，更好的对患者进行中期评估，以实现更精准的疾病管理。
本发明基于同一个NGS靶向panel对原发肿瘤组织和治疗前后血浆ctDNA样本同步开展检测和突变的追踪分析，检测流程便捷，一共检测与淋巴瘤密切相关的188个基因的变异，覆盖基因较多，能够为患者提供较为全面的分子变异信息。且相对传统中期评估手段PET-CT而言，该方法的检测样本需求为治疗前的外周血样本和/或诊断时的肿瘤组织样本以及治疗期间的外周血样本，取样方法便捷，且无辐射暴露风险，可作为传统PET-CT的有效补充。
附图说明
图1为根据治疗4周期后中期血浆ctDNA突变的阴阳性状态对DLBCL患者总体生存期和无进展生存期进行分层的生存曲线图以及预测患者复发或进展以及死亡性能的ROC曲线图。A为根据中期ctDNA的检出状态进行分层评估ctDNA阳性的和阴性的患者其无进展生存期（PFS）的曲线图；纵坐标为无进展生存率。B为根据中期ctDNA的检出状态进行分层评估ctDNA阳性的和阴性的患者其总生存期（OS）的曲线图；纵坐标为总生存率（%）。C为根据中期ctDNA的检出状态预测患者出现复发或疾病进展的ROC曲线图，横坐标代表预测的特异性（Specificity表示），纵坐标代表预测的灵敏性（Sensitivity）。D为根据中期ctDNA的检出状态预测患者出现死亡的ROC曲线图，横坐标代表预测的特异性（Specificity表示），纵坐标代表预测的灵敏性（Sensitivity）。
图2为PFS和OS的多因素连续变量（变量包括中期ctDNA状态以及中期PET-CT疗效评估结果）的回归分析模型图。A为PFS的多因素连续变量的回归分析模型图。B为OS的多因素连续变量的回归分析模型图；“**”代表P＜0.01，差异极显著。
图3为联合中期PET-CT疗效评估结果和血浆ctDNA的结果进行DLBCL患者的PFS和OS的分层评估。A为患者PFS的分层评估曲线图；纵坐标为无进展生存率。B为患者OS的分层评估曲线图；纵坐标为总生存率。
图4为DLBCL患者的样本收集情况及生存信息。
图5为Onco-LymScan Panel包含的基因列表。
图6为38例DLBCL患者基线样本以及治疗4周期后的血浆ctDNA的突变检出情况。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中的部分定义或术语如下：
cfDNA（circulating free DNA）：简称循环游离DNA或者细胞游离DNA，是指循环血中游离于细胞外的DNA。正常生理情况下，cfDNA主要来源于衰老凋亡细胞基因组DNA的降解，当机体发生疾病时，如恶性肿瘤、外伤、器官移植排异、组织器官衰竭和感染重大疾病等，异常坏死细胞会释放大量DNA进入血液循环。
ctDNA（Circulating tumor DNA）：循环肿瘤DNA片段，来源于坏死及凋亡的肿瘤细胞、循环肿瘤细胞以及肿瘤细胞分泌的外排体，是肿瘤组织释放到血液循环系统中的DNA片段，属于cfDNA的一种类型，仅为cfDNA很小的一部分，ctDNA片段携带肿瘤基因组特征（包括突变、缺失、插入、重排、拷贝数异常、甲基化等）。肿瘤细胞均有机会将遗传信息释放到病人的血液当中，在多种类型肿瘤病人血液中均可检测到ctDNA。
Panel：Panel是指在基因检测中不只是检测一个位点、一个基因。而是同时检测多个基因、多个位点。这些位点和基因需要按照一个标准进行选择和组合，从而构成一个检测Panel。
PET-CT（positron emission tomography and computed tomography，PET-CT）：正电子发射断层 /计算机断层扫描技术是将功能显像（PET）与解剖形态显像（CT）相互结合的一种综合性分子影像手段，能够同时提供恶性肿瘤的代谢活性及解剖位置双重信息，具有较高的灵敏度和特异度，已作为淋巴瘤分期、疗效判定及预后评价的主要手段。
PFS（progression-free survival , PFS）：定义为从一线治疗开始到进展、最后一次随访或因任何原因死亡的时间。
OS（overall survival, OS）：从诊断之日起至因任何原因或最后随访而计算的时间。
PFS（%）：无进展生存率，为以治疗点为随访开始时间，至末次随访时无疾病进展患者占全部患者的比例。
OS（%）总生存率，为以治疗点为随访开始时间，至末次随访时生存患者占全部患者的比例。
实施例1、基于一线治疗中期外周血循环肿瘤DNA（ctDNA）检测预测DLBCL患者预后的方法的建立。
1.治疗前血浆ctDNA突变、肿瘤组织突变和治疗后血浆ctDNA突变检测。
1.1样本采集。
收集就诊于北京肿瘤医院淋巴瘤科的38位初诊弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者的原发肿瘤组织样本和/或治疗前的外周血样本作为患者的基线样本；同时采集患者在接受一线标准化疗方案治疗4周期后中期评估时的外周血样本。
肿瘤组织样本包括冰冻存储的新鲜活检组织样本或者石蜡包埋的FFPE样本，外周血样本在采集后立即进行低温离心处理分离血浆和白细胞并冻存处理。
最终获得基线外周血血浆样本31例，基线肿瘤组织样本20例，一线治疗完成4周期后中期（下文简称治疗中期）外周血血浆样本38例。同时收集患者治疗4周期后的中期PET-CT的疗效评价（参考 Lugano 淋巴瘤疗效评价标准2014年修订版）结果，以及生存时间和生存状态等临床信息资料。患者的样本收集情况以及临床信息汇总见图4。该研究已经获得北京大学肿瘤医院与研究所伦理委员会通过。
1.2 DNA提取、测序、及生物信息学分析。
1.2.1 肿瘤组织和白细胞对照样本gDNA和外周血血浆cfDNA提取。
使用ctDNA Streck专用管常温（6-37℃）采集外周血10mL，轻轻混匀，在采集后6小时内采用两步离心法分离血浆样本和白细胞样本。第一步先将Streck管保存的外周血置于4℃离心机中2000g离心10min，取上层澄清血浆（勿吸入中间白细胞层），分装至无菌的1.5ml EP管中。第二步将Streck管中的剩余样本再次置于4℃离心机中16000g离心10min，取澄清的上层血浆（勿吸入中间白细胞层）继续分装至无菌的1.5mL EP管中，同时用移液枪小心的将中间层的白细胞（勿吸入底层红细胞）分离出来，分装至无菌的1.5mL EP管中。分离的血浆样本和白细胞标记清楚后及时冻存至-80℃冰箱中。
使用MagMAX™游离DNA提取试剂盒（赛默飞科学，美国）对每个患者的血浆样本（包括基线血浆和治疗中期血浆）进行总游离DNA（cfDNA）的提取，使用QIAamp组织&血液提取试剂盒（Qiagen，美国）对分离的白细胞样本（正常白细胞样本，来源于基线外周血或中期外周血离心分离）以及原发肿瘤组织样本进行gDNA的提取。最后使用Qubit2.0荧光试剂盒（life，美国）对所有分离的DNA进行定量。
1.2.2 DNA文库构建及Panel测序。
采用Focused-ultrasonicator™（Covaris，美国）将gDNA进行片段化，并筛选150~200bp之间的片段。使用KAPA文库制备试剂盒（Kapa Biosystems，美国）对筛选得到的基因组DNA片段和cfDNA进行文库构建。
随后使用包含了淋巴瘤相关的188基因的Panel Onco-LymScan（泛生子，中国）进行靶向捕获（188基因列表见图5）。然后通过 Illumina PE150 NGS平台（Illumina，美国）对gDNA（包括基线外周血分离的白细胞或治疗中期外周血分离的白细胞gDNA和原发肿瘤组织样本gDNA）和血浆cfDNA（包括基线血浆cfDNA和治疗中期血浆cfDNA）进行测序，分别得到每位患者基线外周血血浆cfDNA和/或原发肿瘤组织样本gDNA以及治疗中期外周血血浆cfDNA的原始下机数据以及白细胞gDNA样本的原始下机数据。
1.2.3 生物信息学分析。
利用trimmomatic（http://www.usadellab.org/cms/）软件分别对原始下机数据（包括患者基线血浆cfDNA和/或原发肿瘤组织gDNA样本的测序数据、治疗中期血浆cfDNA的测序数据以及患者的白细胞gDNA的测序数据）进行质控处理（质量控制筛选条件为：每条read的平均碱基测序质量不低于15；去除每条read中碱基测序质量低于3或为“N”的碱基；每条read的最短长度大于等于36bp），去除接头序列和过滤低质量序列获得处理后的序列数据。利用bwa（http://bio-bwa.sourceforge.net/）软件将处理后的序列数据与人hg19参考基因组（https://data.broadinstitute.org/snowman/hg19/Homo_sapiens_assembly19.fasta）进行比对，得到bam格式比对文件。
使用 picard（https://broadinstitute.github.io/picard/）软件对比对文件进行处理，去除PCR产生的重复序列，统计去重结果，分别得到淋巴瘤血浆cfDNA、白细胞gDNA和原发肿瘤组织样本gDNA的去重后文件。然后使用GATK软件（https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us）工具包中的IndelRealignerr对已建立的indel区域序列进行reads重比对，以降低indel区域附近的假阳性，重比对后获得bam格式的重比对文件。
然后采用Samtools（v0.1.1722，http://www.htslib.org/）对重比对文件进行变异查找操作，包括SNV/Indel（单核苷酸变异/缺失插入变异）的变异类型，得到淋巴瘤患者治疗前的基线突变（包括基线血浆中cfDNA的体细胞突变或/和原发肿瘤组织样本gDNA的体细胞突变）；以及治疗中期血浆cfDNA的体细胞突变（中期ctDNA突变）。同时采用Vep（https://asia.ensembl.org/info/docs/tools/vep/index.html）软件对得到的基因突变进行突变注释和功能注释，得到VCF格式变异文件。
变异文件中的所有变异均根据dbNSFP（http://database.liulab.science/dbNSFP#database）和ExAC数据库（https://exac.broadinstitute.org/）进行单核苷酸多态性（SNP）位点的过滤；同时采用Integrative Genomics Viewer软件（IGV, BroadInstitute, 美国，https://software.broadinstitute.org/software/igv/download）进行变异真实性的检查；并以每个患者的白细胞样本（来源于基线血浆或治疗中期血浆均可）的测序数据作为正常对照过滤血浆cfDNA（包括基线血浆cfDNA和治疗中期血浆cfDNA）或肿瘤组织样本gDNA中的胚系变异。
判断肿瘤组织样本gDNA的体细胞突变标准为变异等位基因频率（Variant AlleleFrequency，VAF。计算方法为：突变的位点对应的reads数目占该位点所有read数目的比例）≥1%，且至少有7条突变reads支持；判断血浆ctDNA突变的标准为变异等位基因频率≥0.1%，且至少有3条突变reads支持；不满足以上条件的突变位点则被过滤去除。最终得到每个患者的基线样本的基线突变（包括基线血浆cfDNA的体细胞突变和/或原发肿瘤组织的体细胞突变数据）和中期ctDNA突变（治疗中期外周血血浆cfDNA的体细胞突变数据）。
上述操作均按照所使用的设备、软件和试剂盒的说明书进行。至此，得到38位DLBCL受试者的基线突变和中期ctDNA突变。
2.中期血浆ctDNA突变检出情况与预后的相关性。
2.1突变检测结果。
以患者的基线样本（即治疗前的肿瘤组织样本和/或血浆样本）中检测到的突变（即基线突变）为标志物，追踪DLBCL患者一线治疗完成4周期后中期（治疗中期）血浆样本中基线突变的检出情况，检出结果以及同期PET-CT的评估结果如图6。中期血浆ctDNA阳性被定义为中期ctDNA突变检测到至少1个（大于等于1个）基线突变（即中期血浆样本检测到的突变与基线样本中突变至少有1个一致）；中期血浆ctDNA阴性则被定义为中期ctDNA突变检测不到任何基线突变。
38位患者的治疗中期血浆样本中一共有10例患者中期ctDNA突变检测到了至少1个基线样本中的突变，结果为ctDNA阳性；28例患者中期ctDNA突变未检测到基线样本中的突变，结果为ctDNA阴性。
在一线治疗完成4周期后的中期PET-CT的疗效评价（参考 Lugano 淋巴瘤疗效评价标准2014年修订版）结果中，38位患者中有18位患者中期评估为完全缓解（CR），即阴性，20例患者未达到CR，即阳性。
2.2.统计分析。
将表格3中的治疗中期血浆ctDNA检测结果与患者的生存信息进行关联性分析。根据ctDNA检测结果的阴性和阳性将38位患者分成2组，用GraphPad Prism（version 8.02）软件中的“survival”分析工具绘制生存曲线。发现，中期血浆ctDNA阴性的患者的PFS和OS均显著优于ctDNA阳性的患者，可以将患者的预后进行较好的区分（p值分别为0.0033和0.016）。生存曲线图见图1中A（PFS：p=0.0033；HR，3.65（95% CI，1.452 to 9.178））和图1中B（OS：p=0.016；HR，3.536（95% CI，1.192 to 10.49））。即治疗中期血浆ctDNA阴性的患者治疗后预后较好（预后良好），治疗中期血浆ctDNA阳性的患者治疗后预后较差（预后不良）。ROC曲线分析结果（如图1中C和D所示）表明，中期ctDNA突变的阴阳性结果预测患者出现复发或疾病进展的AUC值为0.658，灵敏度（TPR）为0.42，特异性（TPR）为0.89，p值为0.011；预测患者出现死亡的AUC值为0.631，灵敏度为0.43，特异性为0.83，p值为0.048。
采用“survival”R软件包（https://CRAN.R-project.org/package=survival），建立PFS和OS的多因素cox比例风险模型如图2中A和B。ctDNA阳性的患者（图2中ctDNA阳性所代表）相对于阴性的患者（图2中ctDNA阴性所代表）出现疾病进展或死亡的风险均较高，HR值分别为4.7和5.3。 PET-CT评估结果阳性（图2中PET-CT 阳性所代表）的患者相对于PET-CT评估阴性（图2中PET-CT 阴性所代表）的患者出现疾病进展或死亡的风险也均较高，HR值分别为4.7和12.1。说明治疗中期血浆ctDNA检测可以作为中期PET-CT评估方法的有效补充或可替代方法。
此外根据治疗中期血浆ctDNA与PET-CT的联合检测结果，将38个患者分为PET-CT和ctDNA结果双阳性、单阳性、双阴性三组，同样用GraphPad Prism（version 8.02）“survival”R软件包中的“survival”（https://CRAN.R-project.org/package=survival）分析工具绘制生存曲线。结果发现双阳性组的患者预后最差，单阳性组次之，双阴性组患者的预后最好。即治疗中期血浆ctDNA与PET-CT的联合检测结果为双阴性组患者的预后相对良好（预后良好）；治疗中期血浆ctDNA与PET-CT的联合检测结果为双阳性或单阳性的预后相对较差（预后不良）。PFS和OS的生存曲线图分别见图3中A（p＜0.0001）和图3中B（p＜0.0001）。该结果进一步表明，采用治疗中期血浆ctDNA检测和PET-CT评估结合的手段可以更好的评估患者的治疗效果以及预测患者的预后，具有较大的临床应用价值。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (5)

1.预测或辅助预测接受一线标准方案治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的预后的装置，其特征在于：
所述装置包括数据接收模块和数据处理模块；所述数据接收模块用于接收待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者在接受一线标准治疗前的基线外周血血浆中cfDNA的测序数据或原发肿瘤组织样本DNA的测序数据、所述患者在接受一线标准治疗中期外周血血浆cfDNA的测序数据、所述患者的外周血白细胞的基因组DNA测序数据，以及所述患者在接受一线标准治疗中期的PET-CT评估结果数据；所述数据处理模块用于根据所述测序数据获得所述患者在接受一线标准治疗前的基线突变和所述患者在接受一线标准治疗中期的外周血血浆中的中期ctDNA突变，通过比较所述中期ctDNA突变和所述基线突变获得所述患者的中期ctDNA突变的阴阳性结果，根据所述突变阴阳性结果和所述PET-CT评估结果预测所述患者在接受一线标准治疗的预后；
所述一线标准治疗中期为待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者在接受一线标准治疗方案治疗4周期后；
所述测序数据为panel测序数据，所述panel为所述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关基因的靶向panel，所述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关基因为人类基因组中的188个与弥漫性大B细胞淋巴瘤相关的基因，所述188个与弥漫性大B细胞淋巴瘤相关的基因如下信息所示；
Figure FDA0003939232620000011
Figure FDA0003939232620000021
Figure FDA0003939232620000031
所述中期ctDNA突变的阴阳性结果包括中期ctDNA突变阳性和中期ctDNA突变阴性；所述装置还包括数据输出模块，所述数据输出模块用于输出待测接受一线标准方案治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的预后结果；
所述中期ctDNA突变阳性和/或所述PET-CT评估结果阳性的待测接受一线标准方案治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的预后结果输出为预后不良；
所述中期ctDNA突变阴性且所述PET-CT评估结果阴性的待测接受一线标准方案治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的预后结果输出为预后良好；
所述中期ctDNA突变阳性为所述患者的所述中期ctDNA中存在大于等于1个所述基线突变；
所述中期ctDNA突变阴性为所述患者的所述中期ctDNA中不存在所述基线突变；所述PET-CT评估结果阳性为所述患者的PET-CT疗效评价未达到完全缓解；所述PET-CT评估结果阴性为所述患者的PET-CT疗效评价为完全缓解。
2.预测或辅助预测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者接受一线标准治疗预后的装置，其特征在于：
所述装置包括数据接收模块和数据处理模块；所述数据接收模块用于接收待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者在接受一线标准治疗前的基线外周血血浆中cfDNA的测序数据或原发肿瘤组织样本DNA的测序数据、所述患者在接受一线标准治疗中期外周血血浆cfDNA的测序数据、所述患者的外周血白细胞的基因组DNA测序数据；所述数据处理模块用于根据所述测序数据获得所述患者在接受一线标准治疗前的基线突变和所述患者在接受一线标准治疗中期的外周血血浆中的中期ctDNA突变，通过比较所述中期ctDNA突变和所述基线突变获得所述患者的中期ctDNA突变的阴阳性结果，根据所述中期ctDNA突变的阴阳性结果预测所述患者在接受一线标准治疗的预后；
所述一线标准治疗中期为待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者在接受一线标准治疗方案治疗4周期后；
所述测序数据为panel测序数据，所述panel为所述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关基因的靶向panel，所述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关基因为人类基因组中的188个与弥漫性大B细胞淋巴瘤相关的基因，所述188个与弥漫性大B细胞淋巴瘤相关的基因如下信息所示；
Figure FDA0003939232620000041
Figure FDA0003939232620000051
所述中期ctDNA突变的阴阳性结果包括中期ctDNA突变阳性和中期ctDNA突变阴性；
所述中期ctDNA突变阳性为所述患者的所述中期ctDNA中存在大于等于1个所述基线突变；
所述中期ctDNA突变阴性为所述患者的所述中期ctDNA中不存在所述基线突变。
3.一种存储有计算机程序的计算机可读存储介质，所述计算机程序使计算机运行如下步骤：
C1)向计算机输入待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者在接受一线标准治疗前的基线外周血血浆cfDNA或/和原发肿瘤样本DNA的测序数据、所述患者在接受一线标准治疗中期外周血血浆cfDNA的测序数据、所述患者外周血白细胞的DNA测序数据、以及所述患者在接受一线标准治疗中期的PET-CT的评估结果；所述测序数据为panel测序数据，所述panel为所述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关基因的靶向panel，所述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关基因为人类基因组中的188个与弥漫性大B细胞淋巴瘤相关的基因，所述188个与弥漫性大B细胞淋巴瘤相关的基因如下信息所示；
Figure FDA0003939232620000061
Figure FDA0003939232620000071
C2)使计算机计算获得患者在接受一线标准治疗前的基线突变和所述患者在接受一线标准治疗中期外周血血浆中的中期ctDNA突变，比较所述基线突变和所述中期ctDNA突变获得所述患者的中期ctDNA突变的阴阳性结果，根据所述突变的阴阳性结果和所述PET-CT评估结果预测所述患者在接受一线标准治疗的预后；所述一线标准治疗中期为待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者在接受一线标准治疗方案治疗4周期后；
所述中期ctDNA突变的阴阳性结果包括中期ctDNA突变阳性和中期ctDNA突变阴性；
所述中期ctDNA突变阳性和/或所述PET-CT评估结果阳性的待测接受一线标准方案治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的预后结果输出为预后不良；
所述中期ctDNA突变阴性且所述PET-CT评估结果阴性的待测接受一线标准方案治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的预后结果输出为预后良好；
所述中期ctDNA突变阳性为所述患者的所述中期ctDNA中存在大于等于1个所述基线突变；
所述中期ctDNA突变阴性为所述患者的所述中期ctDNA中不存在所述基线突变；所述PET-CT评估结果阳性为所述患者的PET-CT疗效评价未达到完全缓解；所述PET-CT评估结果阴性为所述患者的PET-CT疗效评价为完全缓解。
4.一种存储有计算机程序的计算机可读存储介质，所述计算机程序使计算机运行如下步骤：
D1)向计算机输入待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者在接受一线标准治疗前的基线外周血血浆cfDNA和/或原发肿瘤样本DNA的测序数据、所述患者在接受一线标准治疗中期外周血血浆cfDNA的测序数据以及所述患者外周血白细胞的DNA测序数据；所述测序数据为panel测序数据，所述panel为所述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关基因的靶向panel，所述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关基因为人类基因组中的188个与弥漫性大B细胞淋巴瘤相关的基因，所述188个与弥漫性大B细胞淋巴瘤相关的基因如下信息所示；
Figure FDA0003939232620000081
Figure FDA0003939232620000091
D2)使计算机计算获得患者在接受一线标准治疗前的基线突变和所述患者在接受一线标准治疗中期外周血血浆中的中期ctDNA突变，比较所述基线突变和所述中期ctDNA突变获得所述患者的中期ctDNA突变的阴阳性结果，根据所述突变的阴阳性结果预测所述患者在接受一线标准治疗的预后；
所述一线标准治疗中期为待测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者在接受一线标准治疗方案治疗4周期后；
所述中期ctDNA突变的阴阳性结果包括中期ctDNA突变阳性和中期ctDNA突变阴性；
所述中期ctDNA突变阳性为所述患者的所述中期ctDNA中存在大于等于1个所述基线突变；
所述中期ctDNA突变阴性为所述患者的所述中期ctDNA中不存在所述基线突变。
5.权利要求1或2中所述的中期ctDNA突变作为生物标志物在制备预测或辅助预测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者接受一线标准治疗预后的产品中的应用。
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