CN115572761A - 基因与基因型评价摄碘能力的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物基因组学领域，具体涉及基因与基因型评价摄碘能力的应用。本发明提供用作摄碘能力评价指标的基因和/或基因型，还提供基于评价指标的基因和/或基因型的摄碘能力的检测试剂和评价方法，诊断和/或监测个性化的摄碘水平，为摄碘水平提供一种新的具有参考价值的评价体系，为临床摄碘相关的临床诊疗方案的判断提供科学依据，保证临床诊疗方案的有效性、安全性与及时性，为临床医学发展提供新的解决方案。

Description

基因与基因型评价摄碘能力的应用
技术领域
本发明属于药物基因组学领域，具体涉及基因与基因型评价摄碘能力的应用，通过研究基因组在药物反应中的作用，探索患者的遗传背景对药物等具有诊疗效果的物质在吸收、代谢等方面的影响因素。
背景技术
当前甲状腺癌发病率呈逐年增高趋势，我国2020年甲状腺癌新发病例数预计高达20万人。甲状腺癌中以起源于甲状腺滤泡细胞的分化型甲状腺癌最为常见，约占其90％以上，主要包括甲状腺乳头状癌与甲状腺滤泡癌。分化型甲状腺癌因部分保留甲状腺滤泡细胞的摄碘功能，使得放射性碘-131可有效作用于具有较好摄碘功能的分化型甲状腺癌细胞，从而降低复发与死亡风险。
但其中约7％的患者在治疗过程中会发生肿瘤细胞学的改变，患者的甲状腺癌细胞或逐渐、或迅速的出现无法摄入碘-131的情况，最终发展成为碘治疗抵抗。此类患者的生存期因此大大缩短，平均生存期降为3-5年。然而，目前对于碘难治性甲状腺癌的识别主要是基于放射性碘治疗后显像的图像表现、疗效反应，而非病理学诊断，尚不能达到在实施碘-131治疗前即可预估其治疗疗效，从而导致碘难治患者不必要的辐射暴露、延误治疗时机。
本发明的目的是使用基因组学的方法，探索患者的摄碘能力与基因型的潜在关系，为规范我国甲状腺癌诊疗体系提供循证医学证据。实现患者在接受治疗之前，对其自身的摄碘能力进行科学预测，为评估摄碘相关的诊疗方案的潜在效益提供具有参考价值度的评估指标，有效评估摄碘相关的诊疗方案的预期效益，避免延误重要的诊疗时机。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明提供作为摄碘能力评价指标的基因和/或基因型，预测个性化的摄碘水平，为个性化的摄碘能力提供可靠的评估方案，进而实现摄碘相关诊疗方案的预期效果，提高临床诊疗的及时性、有效性及安全性。
本发明研究同摄碘能力相关的基因包括但不限于以下任意的一种或组合：ALK、NTRK3、PAX8、NRAS、TERT、BRAF、RET、MTOR、EIF1AX、IDH1、CDC73、HRAS、CTNNB1、PIK3CA、DICER1、TP53、GNAS、AKT1、PTEN、TSHR、KRAS、NTRK2、MEN1、NTRK1、CDKN1B、CDA、SLC28A3、CBR3、CYP19A1，基因型多态性位点包括但不限于以下位点中任意的一种或组合：rs8133052、rs2032582、rs1801133、rs1650723、rs717620、rs11615、rs25487、rs13181、rs1695、rs2227310、rs2740574、rs151264360、rs1800566、rs1801159、rs1801265、rs3918290、rs2279343、rs3745274、rs4880、rs1042858、rs2072671、rs4646、rs2234693、rs34743033、rs9679162、rs1142345、rs2228001、rs1042522、rs3212986、rs1799793、rs3892097、rs4148323、rs3064744、rs2291075、rs1045642、rs716274、rs10276036、rs1805087、rs11572080、rs7853758、rs88500。其中，同摄碘能力具有显著相关性的基因与基因型包括但不限于：CDA基因的rs2072671位点多态性、和/或SLC28A3基因的rs7853758位点多态性、和/或CBR3基因的rs8133052位点多态性、和/或CYP19A1基因的rs4646位点多态性。如，CYP19A1基因的rs4646位点多态性同摄碘能力间显著性极强。
本发明提供用作摄碘评价指标的基因和/或基因型。基因和/或基因型间接和/或直接影响个体的摄碘水平，基因型包括但不限于DNA片段长度多态性、和/或DNA重复序列多态性、和/或单核苷酸多态性。如本发明具体实施方式的方案，选用同摄碘能力相关用作评价指标的CDA基因的rs2072671位点多态性、和/或SLC28A3基因的rs7853758位点多态性、和/或CBR3基因的rs8133052位点多态性、和/或CYP19A1基因的rs4646位点多态性，如作为摄碘评价指标的CYP19A1基因的rs4646位点多态性包括但不限于G/G、T/G以及T/T等。
本发明还提供用作摄碘评价指标的基因和/或基因型在评价摄碘能力方面的应用。预测个性化的摄碘水平，为摄碘相关的个性化的临床诊疗方案提供参考依据。如本发明具体实施方式的方案，选用CDA基因的rs2072671位点多态性、和/或SLC28A3基因的rs7853758位点多态性、和/或CBR3基因的rs8133052位点多态性、和/或CYP19A1基因的rs4646位点多态性用于评价个体化的摄碘能力；如优选CYP19A1基因的rs4646位点多态性用于评价个性化的摄碘能力，为甲状腺癌患者的碘-131临床放射性治疗提供有效依据。
本发明还提供用作摄碘评价指标的基因和/或基因型的检测用组合物。该检测用组合物用于摄碘评价指标的基因和/或基因型的检测和诊断，排除检测过程中假阳性、假阴性及各种干扰因素的影响，提高检测灵敏度，简化操作步骤，降低检测条件，提高检测结果的准确性、可靠性，降低成本，节约资源。如本发明具体实施方式的方案，实现25个常见甲状腺癌相关基因及41个常见化疗相关位点检测的检测用组合物，尤其是CDA基因的rs2072671位点多态性、SLC28A3基因的rs7853758位点多态性、CBR3基因的rs8133052位点多态性、及CYP19A1基因的rs4646位点多态性的检测用组合物。
为便于检测用组合物的生产、储存、运输及使用，保证其安全性、稳定性、可靠性，本发明用作摄碘评价指标的基因和/或基因型的检测用组合物可制备成医药学上可接受的任意形式，并可含有医药学上可接受的具有辅助作用的成分或载体。
本发明用作摄碘评价指标的基因和/或基因型的检测用组合物包括但不限于采样、和/或基因提取与纯化、和/或基因扩增、和/或基因测序等检测步骤所需物质。
本发明还提供用作摄碘评价指标的基因和/或基因型的检测方法，使用上述基因和/或基因型检测用组合物，采用基因测序技术，检测影响摄碘的基因和/或基因型。所属基因测序技术包括但不限于第一代测序技术、第二代测序技术及第三代测序技术。如本发明具体实施方式的方案，采用第二代测序技术检测25个常见甲状腺癌相关基因及41个常见化疗相关位点，尤其是CDA基因的rs2072671位点、SLC28A3基因的rs7853758位点、CBR3基因的rs8133052、及CYP19A1基因的rs4646位点。
所述影响摄碘的基因源于提取自人体样本的包括但不限于的人全基因组、特定染色体基因组等，并在基因测序技术检测前进行纯化、和/或扩增等处理。人体样本有血液、唾液、组织或细胞等。
本发明用作摄碘评价指标的基因和/或基因型检测用组合物可用于制备评价摄碘能力的检测试剂。便于个体化的摄碘能力检测试剂的产业化和市场化。
本发明还提供评价摄碘能力的检测试剂，评估个体化的摄碘水平，含有用作摄碘评价指标的基因和/或基因型的检测用组合物。用作摄碘评价指标的基因和/或基因型的检测用组合物，用于检测个体中影响摄碘的基因和/或基因型，如本发明具体实施方式，含有检测25个常见甲状腺癌相关基因及41个常见化疗相关位点的检测用组合物，尤其是含有CDA基因的rs2072671位点多态性检测用组合物、和/或SLC28A3基因的rs7853758位点多态性检测用组合物、和/或CBR3基因的rs8133052位点多态性检测用组合物、和/或CYP19A1基因的rs4646位点多态性检测用组合物，检测影响放射性碘-131摄入的CDA基因的rs2072671位点多态性、SLC28A3基因的rs7853758位点多态性、CBR3基因的rs8133052位点多态性、CYP19A1基因的rs4646位点多态性。
本发明该摄碘能力的检测试剂，还含有生理病理指标检测用组合物、和/或促进摄碘药物的筛选用组合物。生理病理指标检测用组合物用于检测影响摄碘的生理和/或病理指标，如甲状腺功能检测指标，和/或血液碘运输功能指标，和/或可能对摄碘产生影响的性别、年龄、体重、身体健康状况、既往病史等其他参考指标。促进摄碘药物的筛选用组合物用于检测影响摄碘的药物、和/或人体对该药物的耐受程度、和/或人体对该药物的代谢反应、和/或人体对该药物的过敏和/或毒副反应等指标。
本发明该摄碘能力的检测试剂，可制备成具有诊断和/或监测功能的医药学上可接受的任意形式，可含有任意一种或多种医药学上可接受的具有辅助作用的成分或载体。
本发明还提供摄碘能力的评价方法，以含有用作摄碘评价指标的基因和/或基因型的指标体系评价个体的摄碘能力。保证个体的摄碘能力评价体系可靠、稳定。
本发明该评价摄碘能力的指标体系中还含有生理和/或病理指标、和/或促进摄碘药物的筛选指标。多指标评价体系的建立，进一步降低单一指标评价体系的风险，使其评价体系更具科学性及价值度。
相对于现有技术，本发明具有以下优点：本发明以临床诊疗患者为受试人群，实时采集临床诊疗数据，采用药物基因组学方法，基于回顾性分析研究，探索影响摄碘能力的基因和/或基因型，明确摄碘能力与基因和/或基因型的潜在关系，为摄碘水平提供一种新的具有参考价值的评价指标，为临床患者摄碘能力相关的临床诊疗方案的判断提供科学依据，保证临床诊疗方案的有效性、及时性与安全性，避免延误诊疗时机，为临床医学发展提供新的解决方案。
当前国内甲状腺癌的发病率呈每年增高的趋势，且晚期甲状腺癌患者比例增高，2020年甲状腺癌新发病例数预计达20万，约有1.4万的放射性碘治疗抵抗人群。本发明可使患者在接受治疗之前，预先知晓放射性碘治疗的潜在效益，对于预期效益较小的患者，采取其他治疗手段，避免不必要的辐射暴露、贻误重要的治疗时机，有助于早期识别碘治疗抵抗人群，完善甲状腺癌术后诊疗体系。
附图说明
图1是rs4646位点各基因型摄碘能力的分布情况图。其中，1-初始即不摄碘：放疗开始时，所有病灶初始即表现不摄碘；2-逐渐不摄碘：放疗开始后一段时间，病灶逐渐出现不摄碘特征；3-部分病灶不摄碘，4-摄碘但碘难治：病灶虽然摄碘，但甲状腺癌依然进展。
具体实施方式
本发明以临床诊疗的患者作为受试人群，连续收集受试人群在临床诊疗过程中的碘摄能力变化、病灶变化、诊疗效果变化等临床数据信息，根据摄碘能力、生理病理机理，排除摄碘能力不明确受试者的同时，对剩余受试人群进行分组，通过基因组学分析，及回顾性研究，探索基因和/或基因型对患者摄碘能力的影响，为个性化的摄碘能力提供一种新的评价思路，为摄碘相关的临床诊疗方案提供新的参考依据，提高摄碘相关的诊疗效果与安全性，节约临床诊疗资源。
本发明研究同摄碘能力相关的基因有：ALK、NTRK3、PAX8、NRAS、TERT、BRAF、RET、MTOR、EIF1AX、IDH1、CDC73、HRAS、CTNNB1、PIK3CA、DICER1、TP53、GNAS、AKT1、PTEN、TSHR、KRAS、NTRK2、MEN1、NTRK1、CDKN1B，多态性位点有：rs8133052、rs2032582、rs1801133、rs1650723、rs717620、rs11615、rs25487、rs13181、rs1695、rs2227310、rs2740574、rs151264360、rs1800566、rs1801159、rs1801265、rs3918290、rs2279343、rs3745274、rs4880、rs1042858、rs2072671、rs4646、rs2234693、rs34743033、rs9679162、rs1142345、rs2228001、rs1042522、rs3212986、rs1799793、rs3892097、rs4148323、rs3064744、rs2291075、rs1045642、rs716274、rs10276036、rs1805087、rs11572080、rs7853758、rs88500。其中，CDA基因的rs2072671位点、SLC28A3基因的rs7853758位点、CBR3基因的rs8133052位点、及CYP19A1基因的rs4646位点的多态性同摄碘能力间有显著的相关性。
根据本发明研究结果，探索用作患者摄碘评价指标的基因和/或基因型，诊断和/或监测患者个性化的摄碘水平，评价患者个性化的摄碘能力。
本发明所称作为评价指标的基因型包括但不限于DNA片段长度多态性、DNA重复序列多态性及单核苷酸多态性，其临床效果可表现为促进摄碘(如保持平稳摄碘或逐步增加摄碘)、阻碍摄碘(如无摄碘或逐步降低摄碘)、局部病灶摄碘、摄碘后无诊疗效果等。这些基因多态性引发的错义突变、无义突变、同义突变、移码突变及剪接异常等，影响着人体对疾病、微生物、药物的耐受性与临床表现，以及临床诊疗的适用性与反应性等。
根据本发明研究结果，影响用作摄碘评价指标的基因和/或基因型检测用组合物可用于制备评价患者个性化摄碘能力的检测试剂。基因和/或基因型检测用组合物包括但不限于采样、基因提取与纯化、基因扩增、基因测序等检测步骤所需物质，根据基因和/或基因型检测目标适用基因印迹法、和/或聚合酶链反应、和/或扩增片段长度多态性分析法、和/或等位基因特异寡核苷酸探针诊断法、和/或单链构象多态性诊断法等基因诊断技术。
评价患者个性化摄碘能力的检测试剂，还含有生理病理指标检测用组合物、和/或促进摄碘药物的筛选用组合物。生理病理指标检测用组合物包括但不限于甲状腺功能检测用物质、和/或血液碘运输功能检测用物质等。
评价患者个性化摄碘能力的检测试剂，可制备成具有诊断和/或监测功能的医药学上可接受的任意形式，可含有任意一种或多种医药学上可接受的具有辅助作用的成分或载体。如基因和/或其基因检测用的芯片、微孔板等，适用于各种基因检测用系统。所称“医药学上可接受”指在生产、储存、运输及使用等过程中避免污染、变质等影响，满足医疗领域对稳定性、安全性、有效性、准确性等的质量要求。
基因和/或基因型检测用组合物、和/或生理病理指标检测用组合物、和/或促进摄碘药物的筛选用组合物，根据检测目标及各自所使用的组合物，配合选用的基因和/或基因型检测方法、生理病理指标检测方法、促进摄碘药物的筛选方法，保证各自的检测结果排除假阳性、假阴性及各种干扰因素的影响，提高检测灵敏度，简化操作步骤，降低检测条件，保证基因和/或基因型、生理病理指标、促进摄碘药物的筛选结果的准确性、可靠性，并降低成本，节约资源。
基因和/或基因型检测结果、和/或生理病理指标检测结果、和/或促进摄碘药物的筛选结果的结合，进一步保证患者个性化摄碘能力评价结果的科学性、准确性、及参考价值度。
本发明所称基因和/或基因型检测方法，指使用基因和/或基因型检测用组合物，采用基因测序技术，检测影响摄碘的基因和/或基因型。所称基因测序技术包括但不限于第一代测序技术：桑格-毛细管电泳测序法，第二代测序技术：焦磷酸测序法、可逆链终止物和合成测序法、连接测序法、单分子合成测序法，第三代测序技术：实时单分子DNA测序法、复合探针锚杂交和连接技术、合成测序法、纳米孔外切酶测序法。所称目标基因源于包括但不限于的人全基因组、特定染色体基因组等。
所称目标基因提取自人体样本，并在基因测序技术检测前进行纯化、和/或扩增处理。目标基因的提取、和/或纯化、和/或扩增均按照本领域常规方法及试剂盒规范进行操作。人体样本有血液、唾液、组织、或细胞等。
根据本发明研究结果，还提供患者个性化摄碘能力的评价方法，以含有摄碘评价指标的基因和/或基因型的指标体系评价患者个性化摄碘能力，为患者个性化的摄碘水平提供一种新的评价途径，且结果科学、可靠、重现性好。
该患者个性化摄碘能力的指标体系中还含有生理和/或病理指标、和/或促进摄碘药物的筛选指标，多指标评价体系的建立，降低单一指标评价体系的风险，使其评价体系更具科学性及价值度，为临床医学提供新的可靠的解决方案。
本发明所称生理和/或病理指标包括但不限于甲状腺功能检测指标，和/或血液碘运输功能指标，和/或可能对摄碘产生影响的性别、年龄、体重、身体健康状况、既往病史等其他参考指标。
本发明所称促进摄碘药物的筛选指标包括但不限于药物对摄碘的影响、人体对该药物的耐受程度、人体对该药物的代谢反应、人体对该药物的过敏和/或毒副反应等。
为更好地理解本发明，下面结合具体实施例进一步示例性地详细说明本发明，需要说明的是，这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但不构成对本发明的限定。
本发明基于一项北京协和医院的回顾性研究，该研究共纳入甲状腺癌患者106人。其中，所有碘难治患者(55人)均按照摄碘能力进行分组，共分为四组：1)放疗开始时，所有病灶初始即表现不摄碘情况(26人)；2)放疗开始后一段时间，病灶逐渐出现不摄碘特征(17人)；3)部分病灶不摄碘(9人)；4)病灶虽然摄碘，但甲状腺癌依然进展(3人)。所有患者均使用ThyroLeadTM基因芯片进行检测，该芯片包含25个常见甲状腺癌相关基因以及41个常见化疗相关位点，具体基因及位点信息如下：
基因25个：
ALK，NTRK3，PAX8，NRAS，TERT，BRAF，RET，MTOR，EIF1AX，IDH1，CDC73，HRAS，CTNNB1，PIK3CA，DICER1，TP53，GNAS，AKT1，PTEN，TSHR，KRAS，NTRK2，MEN1，NTRK1，CDKN1B；
位点41个：
rs8133052，rs2032582，rs1801133，rs1650723，rs717620，rs11615，rs25487，rs13181，rs1695，rs2227310，rs2740574，rs151264360，rs1800566，rs1801159，rs1801265，rs3918290，rs2279343，rs3745274，rs4880，rs1042858，rs2072671，rs4646，rs2234693，rs34743033，rs9679162，rs1142345，rs2228001，rs1042522，rs3212986，rs1799793，rs3892097，rs4148323，rs3064744，rs2291075，rs1045642，rs716274，rs10276036，rs1805087，rs11572080，rs7853758，rs88500。
所有患者的手术、穿刺样本首先进行抽提实验，样本类型包括但不限于新鲜组织、石蜡包裹组织、血液、口腔上皮细胞。以石蜡包裹组织为例，需取出足够的石蜡组织切片，并完成脱蜡操作。抽提所用试剂包括但不限于凯杰DNA抽提试剂。抽提完成后，需使用质谱仪对DNA浓度、纯度进行测量以保证DNA质量。随后，将抽提出的DNA进行打断、末端修复、并连上测序接头。随后进行磁珠纯化以及目前片段PCR扩增，以扩增出目标区域的序列。最后将扩增完成的文库送至测序仪进行二代测序，测序仪有：因美纳平台、华大平台。
测序完成后，首先对测序数据进行清理，将接头序列、低质量测序序列去除；随后将测序数据比对至人类参考基因组之上，并对PCR重复序列进行识别及过滤。最后，对覆盖的所有位点进行SNP突变检测，以确定41个化疗相关位点的基因型，检测软件包括但不限于GATK、VarScan、FreeBayes、Strelka。
所有摄碘能力不明确的患者均从本研究中剔除(51人)。所有样本均保证在化疗相关位点中，去重后至少有30x的覆盖度。所有统计学分析均使用R 3.6.1完成。在41个化疗相关位点之中，有36个位点含有两个及其以上基因型，初步卡方检验显示，多个位点的不同基因型与患者摄碘能力在p值＝0.05的阈值下具有显著差异。如：rs2072671(p值＝0.009)、rs7853758(p值＝0.03)、rs8133052(p值＝0.03)等。随后使用邦费罗尼校正p值，在41个位点当中，我们仅发现位点rs4646与摄碘能力分组具有极强显著性差异(p值＝7.8×10-6)。如图1所示，该位点共有三种常见基因型：G/G、T/G以及T/T。其中，具有G/G与T/G基因型的患者，相比于T/T基因型的患者，在摄碘能力弱的亚组中分布较多(1组中为17人(G/G)和9人(T/G)；2组中分别为11人(G/G)和6人(T/G))。

Claims (10)

1.用作摄碘的评价指标的基因和/或基因型。
2.权利要求1所述用作摄碘评价指标的基因包括但不限于ALK、NTRK3、PAX8、NRAS、TERT、BRAF、RET、MTOR、EIF1AX、IDH1、CDC73、HRAS、CTNNB1、PIK3CA、DICER1、TP53、GNAS、AKT1、PTEN、TSHR、KRAS、NTRK2、MEN1、NTRK1、CDKN1B、CDA、SLC28A3、CBR3、CYP19A1中任意的一种或组合，基因型包括但不限于DNA片段长度多态性、DNA重复序列多态性及单核苷酸多态性中任意的一种或组合。
3.权利要求2所述用作摄碘评价指标的基因型为单核苷酸多态性，多态性位点包括但不限于rs8133052、rs2032582、rs1801133、rs1650723、rs717620、rs11615、rs25487、rs13181、rs1695、rs2227310、rs2740574、rs151264360、rs1800566、rs1801159、rs1801265、rs3918290、rs2279343、rs3745274、rs4880、rs1042858、rs2072671、rs4646、rs2234693、rs34743033、rs9679162、rs1142345、rs2228001、rs1042522、rs3212986、rs1799793、rs3892097、rs4148323、rs3064744、rs2291075、rs1045642、rs716274、rs10276036、rs1805087、rs11572080、rs7853758、rs88500中任意的一种或组合。
4.用作摄碘评价指标的基因和/或基因型在评价摄碘能力方面的应用。
5.用作摄碘评价指标的基因和/或基因型的检测用组合物，检测影响摄碘的基因和/或基因型。
6.用作摄碘评价指标的基因和/或基因型的检测方法，其特征在于，使用权利要求5所述的基因和/或基因型检测用组合物，采用基因测序技术，检测影响摄碘的基因和/或基因型。
7.权利要求5所述的用作摄碘评价指标的基因和/或基因型的检测用组合物用于制备评价摄碘能力的检测试剂。
8.评价摄碘能力的检测试剂，其特征在于，含有权利要求5所述的用作摄碘评价指标的基因和/或基因型的检测用组合物。
9.评价摄碘能力的评价方法，其特征在于，以含有用作摄碘评价指标的基因和/或基因型的指标体系评价摄碘能力。
10.权利要求9所述的评价方法，其特征在于，评价摄碘能力的指标体系中还含有生理和/或病理指标、和/或促进摄碘药物的筛选指标。
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