CN107064511A

CN107064511A - 肿瘤标志物tmem170b蛋白及其在制备抑制肿瘤产品中的应用

Info

Publication number: CN107064511A
Application number: CN201710431571.4A
Authority: CN
Inventors: 徐寒梅; 李梦玮
Original assignee: Nanjing Anji Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Anji Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-06-09
Filing date: 2017-06-09
Publication date: 2017-08-18
Anticipated expiration: 2037-06-09
Also published as: CN107064511B

Abstract

本发明公开了一种肿瘤标志物TMEM170B蛋白及其在制备抑制肿瘤产品中的应用，属于肿瘤诊断和分子靶向治疗领域。本发明包括TMEM170B蛋白在如下功能中的应用：(1)作为新的肿瘤标志物用于包括乳腺癌在内的恶性肿瘤的早期诊断及预后效果的判定；(2)抑制肿瘤细胞增殖；(3)抑制肿瘤细胞迁移和侵袭；(4)抑制动物移植瘤模型的生长；(5)通过阻止β‑catenin从细胞质向细胞核的转位调控Wnt信号通路。本发明以TMEM170B作为生物标志物的靶向疗法为乳腺癌等恶性肿瘤的治疗提供了新的思路。

Description

肿瘤标志物TMEM170B蛋白及其在制备抑制肿瘤产品中的应用

技术领域

本发明属于肿瘤诊断和分子靶向治疗领域，更具体地说，涉及一种跨膜蛋白TMEM170B在肿瘤诊断和治疗中的应用。

背景技术

肿瘤(tumor)是目前危害人类健康最严重的一类疾病。研究发现肿瘤的产生是一个由基因突变逐渐积累的复杂过程，现代医学技术和分子生物学的发展，使得肿瘤治疗进入个体化时代，大大增加肿瘤治疗的缓解率。因此找到特异性的靶点对于肿瘤早期诊断、治疗及预后是目前制约肿瘤临床疗效的关键瓶颈。

乳腺癌是女性中一类具有高侵袭性、高致死率的恶性肿瘤。据世界卫生组织(WHO)统计，全球每年约有130万的女性罹患乳腺癌，且其中有超过50万因发生转移复发死亡。目前乳腺癌的治疗手段主要为手术、化疗和放疗相结合，靶向药物研发进展比较缓慢，主要包括针对乳腺癌表面标志物HER2的抗体曲妥珠单抗、帕妥珠单抗，以及拉帕替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂，临床治疗费用高昂且患者收益有限。因此，迫切需要发现新的乳腺癌生物标志物用于早期检测或乳腺癌靶向治疗，降低乳腺癌患者的死亡率，减少副作用。

肺癌是指发生于支气管粘膜上皮的恶性肿瘤，也叫原发性支气管肺癌。非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)是肺癌最常见的组织学类型，约占肺癌总数的80-85％，可进一步分为鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。近年来非小细胞肺癌发病率不断增高，无论是在我国还是全球，都已成为致死率最高的肿瘤。

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤，在我国各种恶性肿瘤中居首位，其发病有明显的地域性差别，在我国的西北与东部沿海地区胃癌发病率比南方地区明显为高。据统计中国每年的死亡人数约有17万，约占全部恶性肿瘤死亡人数的1/4。

肾癌又称肾细胞癌，起源于肾小管上皮细胞，是最常见的肾脏实质恶性肿瘤。全球每年约有208,500的新增病例，在我国发病率约4.5/10万，目前对肾癌的病因了解并不清楚，且临床治疗发现肾癌患者多数对放化疗均不敏感，多依赖于手术切除。因此提高早期诊断的准确性，有助于肾癌患者进行及时治疗。

肿瘤转移侵袭是恶性肿瘤的重要特征，也是引起大多数肿瘤复发的元凶。研究发现肿瘤转移侵袭是一个连续的、由多基因参与的动态过程，其中原癌基因与抑癌基因发挥同等重要的作用。大量原癌基因如PTEN、MYC、RAS、PIK3CA、AKT1在包括乳腺癌在内的恶性肿瘤中的作用被深入揭示，而抑癌基因除TP53以外的研究鲜有报道。借助高通量筛选及大数据分析等生物信息学手段，发现具有重要功能的抑癌基因对揭示肿瘤的发病机制、提出更全面的诊疗方案十分重要。

Wnt信号通路是一类在多细胞真核生物中高度保守的信号通路，主要分为经典Wnt/β-catenin信号通路和非经典Wnt(调控细胞骨架的Wnt/PCP通路，影响Ca²⁺释放的Wnt/Ca²⁺)。经典Wnt/β-catenin信号通路的异常激活与肿瘤发生、肿瘤细胞增殖分化、上皮间质转化等密切相关。β-catenin在核内与转录抑制因子P300等竞争性地与转录因子即T细胞因子/淋巴样增强因子(TCF/LEF)结合，并形成β-catenin/TCF/LEF转录复合体，在有关辅助激活因子的协同作用下，最终激活Wnt信号的有关靶基因CD44、c-myc和cyclin D，参与肿瘤细胞生长、分化、凋亡和转移等。

发明内容

1.要解决的问题

针对现有的乳腺癌等恶性肿瘤缺乏关系密切的标志物，本发明提供一种肿瘤标志物TMEM170B蛋白及其在制备抑制肿瘤产品中的应用，本发明结合生物信息学手段、临床肿瘤样本以及生物功能实验，发现与乳腺癌等恶性肿瘤发生发展、转移有密切关系的新的标志物。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

TMEM170B蛋白在乳腺癌、非小细胞肺癌(鳞癌和腺癌)、胃癌、肾癌组织中的表达水平显著低于正常组织。

更进一步地，所述的肿瘤主要为乳腺癌，所述的肿瘤细胞为乳腺癌细胞。

基于此，本发明提供一种肿瘤的生物标志物，所述的生物标志物为跨膜蛋白TMEM170B，TMEM170B蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列SEQ ID NO.1。

检测生物标志物表达的试剂在制备用于对上述恶性肿瘤进行预后的工具中的用途，所述的生物标志物包括跨膜蛋白TMEM170B，所述的预后的方法包括：

从患有上述肿瘤的对象获得测试样品；

确定所述测试样品中包括跨膜蛋白TMEM170B的生物标志物的表达水平；和

分析所述表达水平以产生风险评分，其中该风险评分可用于提供对象的预后。

更进一步地，所述的测试样品是新鲜的、冷冻的或石蜡固定包埋的细胞。

更进一步地，用于检测生物标志物表达水平的方法是免疫印迹。

抗TMEM170B蛋白抗体用于制备上述肿瘤检测用组合物的用途或制备含有抗TMEM170B蛋白抗体的组合物检测试剂。

促进跨膜蛋白TMEM170B的物质在制备用于治疗肿瘤药物中的用途。

更进一步地，所述的促进跨膜蛋白TMEM170B的表达的物质为如下A或B：

A、一种核苷酸，其核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.2；

B、含有A所述核苷酸的过表达质粒载体、转基因细胞系或慢病毒。

TMEM170B蛋白在制备具有如下至少一种功能产品中的应用：

(1)抑制肿瘤细胞增殖；

(2)抑制肿瘤细胞迁移和侵袭；

(3)抑制肿瘤生长；

(4)阻止β-catenin从细胞质向细胞核的转位；

所述各功能均是通过所述的TMEM170B蛋白抑制β-catenin从细胞质转移到细胞核中实现的。

TMEM170B蛋白在制备筛选抗肿瘤药物、恶性肿瘤诊断中的应用。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明首次发现跨膜蛋白TMEM170B在肿瘤诊断预后和治疗方面具有重要作用，可以作为肿瘤包括乳腺癌的生物标志物；

(2)本发明通过表达谱芯片数据分析和临床样本组织芯片，发现跨膜蛋白TMEM170B在乳腺癌组织的基因和蛋白表达水平显著低于正常组织，且TMEM170B表达高的患者预后显著高于TMEM170B低表达的患者，表明TMEM170B可以作为一种新的乳腺癌标志物，用于早期乳腺癌的辅助诊断和预后效果的判定；

(3)本发明发现跨膜蛋白TMEM170B在乳腺癌细胞中的表达水平显著低于乳腺上皮细胞，TMEM170B缺失表达后能够明显促进乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成，以及体内异种移植小鼠肿瘤模型的肿瘤生长及远端肺转移；反之TMEM170B过表达会显著抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭、克隆形成和体内肿瘤生长，这证明TMEM170B对肿瘤生长和转移的重要性，并提示其作为靶标进行药物设计的潜能，例如促进跨膜蛋白TMEM170B表达的物质(包括针对TMEM170B的过表达质粒载体、转基因细胞系或慢病毒等)可用于制备治疗乳腺癌的药物；

(4)本发明通过实验证明TMEM170B与β-catenin存在相互作用，TMEM170B过表达能阻止β-catenin从细胞质向细胞核的转位，抑制下游靶点的表达，负调控Wnt信号通路肿瘤细胞增殖和转移中的作用；TMEM170B缺失表达会降低β-catenin质核转位，引起下游靶点的表达升高，促进肿瘤细胞增殖和转移；

(5)本发明设计的实验科学合理、可行有效，对TMEM170B的功能研究深入系统；基于以上发现，TMEM170B蛋白表达水平可作为一个新的生物标志物来帮助包括乳腺癌在内的恶性肿瘤的诊断和恶性程度的预测；本发明以TMEM170B作为生物标志物的靶向疗法为肿瘤治疗提供了新的思路。

附图说明

附图1为TMEM170B基因在117对乳腺癌和正常组织中的表达量比较，数据来自TCGA数据库；

附图2为TMEM170B基因在人肿瘤组织和正常组织中的表达量比较，数据来自TCGA数据库；

附图3为TMEM170B的表达与肺鳞癌(图3A)、肺腺癌(图3B)、胃癌(图3C)、腺癌(图3D)患者总生存率之间的相关性示意图，数据来自TCGA数据库；

附图4为TMEM170B基因表达水平与乳腺癌总生存率的关系，数据来自TCGA数据库；

附图5为TMEM170B蛋白在乳腺癌组织和正常组织中的表达量比较；

附图6为TMEM170B基因在乳腺癌细胞和乳腺上皮细胞中的表达量比较；

附图7为TMEM170B蛋白在乳腺癌细胞和乳腺上皮细胞中的表达量比较；

附图8为过表达TMEM170B表达促进乳腺癌细胞中TMEM170B基因和蛋白表达量的影响；

附图9为shRNA干扰TMEM170B抑制乳腺癌细胞MCF7中TMEM170B基因和蛋白表达量的影响；

附图10为干扰TMEM170B表达对乳腺癌细胞增殖能力的影响结果图；

附图11为干扰TMEM170B表达对乳腺癌细胞迁移能力的影响结果图；

附图12为干扰TMEM170B表达对乳腺癌细胞侵袭能力的影响结果图；

附图13为干扰TMEM170B表达对乳腺癌细胞克隆形成数目的影响结果图；

附图14为过表达TMEM170B抑制乳腺癌裸鼠移植瘤的生长结果图；

附图15为TMEM170B过表达能显著抑制MDA-MB-231细胞远端肺转移；

附图16为shRNA干扰TMEM170B促进乳腺癌裸鼠移植瘤的生长；

附图17为shRNA干扰TMEM170B促进MCF7细胞远端肺转移；

附图18为过表达TMEM170B抑制β-catenin质核转位及下游靶点表达；

附图19为shRNA干扰TMEM170B促进β-catenin质核转位及下游靶点表达。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1

人乳腺癌与配对正常组织的表达谱芯片分析

肿瘤基因组图谱(TCGA)计划由美国National Cancer Institute(NCI)和National Human Genome Research Institute(NHGRI)于2006年联合启动的项目，利用大规模测序为主的基因组分析技术，针对36种癌症进行大规模实验，TCGA基因组分析中心(GCC)比对肿瘤和正常组织，寻找与各癌症或者亚型相关的基因突变、扩增或者缺失。为理解癌症的分子机制，提高人们对癌症发病分子基础的科学认识提供帮助。

TCGA标准方法下载117对乳腺癌组织和正常组织的全基因表达谱数据及临床信息，统计分析采用R语言(3.1.1版本)软件，需安装及加载的程序包(heatmap，venndiagram，hist等)，然后用DESeq和edgeR程序包进行分析，找出差异表达的基因。判断标准：(1)癌/癌旁的表达量<-2，(2)P<0.05，(3)在乳腺癌中未被报道。

表1乳腺癌中表达下调的差异基因(n＝117)

结果见表1和图1，芯片分析发现与正常组织比较，在乳腺癌组织中存在多条表达下调的基因。其中TMEM170B在癌组织中表达显著下调，初步推定其可能在人乳腺癌组织中存在特异性表达，本发明通过以下实施例进行验证。

实施例2

TMEM170B mRNA在人肿瘤组织和配对正常组织中的表达水平分析

采用TCGA标准方法下载504例肺鳞癌、585例肺腺癌、443例胃癌和537例肾癌组织样本的表达谱数据及临床信息，统计分析采用R语言(3.1.1版本)软件，用DESeq和edgeR程序包分析TMEM170B基因在上述肿瘤组织和配对正常组织中的表达水平。

结果见图2，芯片分析发现与配对正常组织比较，TMEM170B在非小细胞肺癌(鳞癌和腺癌)、胃癌、肾癌的表达水平显著降低，考虑可作为非小细胞肺癌(鳞癌和腺癌)、胃癌、肾癌的早期诊断指标。

实施例3

TMEM170B mRNA表达水平与非小细胞肺癌、胃癌、腺癌患者总生存率的关系

采用TCGA标准方法下载504例肺鳞癌、585例肺腺癌、443例胃癌和537例肾癌患者的临床随访患者生存信息，采用R语言软件，安装及加载survival程序包，绘制TMEM170BmRNA表达水平与非小细胞肺癌、胃癌、腺癌患者总生存率的关系图。

结果见图3，TMEM170B的表达与肺鳞癌(图3A)、肺腺癌(图3B)、胃癌(图3C)、腺癌(图3D)患者总生存率均存在显著性相关性，TMEM170B表达高的患者总生存率显著高于TMEM170B低表达的患者，由此推断TMEM170B作为非小细胞肺癌、胃癌、腺癌预后的一个良好指标。

实施例4

TMEM170B mRNA表达水平与乳腺癌患者总生存率的关系

采用TCGA标准方法下载1071例乳腺癌组织样本的表达谱芯片数据和临床随访患者生存状态，自行编写python脚本提取TMEM170B的mRNA表达数据，统计分析采用R语言软件，安装及加载survival程序包，绘制TMEM170B mRNA表达水平与乳腺癌患者总生存率的关系图。

结果见图4，TMEM170B的表达与乳腺癌病人的存活率存在相关性，TMEM170B表达高的患者总生存率显著高于TMEM170B低表达的患者，进一步证实TMEM170B作为乳腺癌预后的一个新指标。

实施例5

检测TMEM170B蛋白在乳腺癌组织和正常组织中的表达量

一、材料和方法

1.材料

另外选取45对人乳腺癌的癌组织和配对正常组织，对TMEM170B蛋白的表达差异进行免疫组化验证。

2.方法

将临床新鲜组织样本进行4％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片放置在60℃恒温箱中烘烤120min。依次二甲苯、100-30％梯度乙醇进行脱蜡，自来水和双氧水各1min进行水化。微波修复程序：预热5min，高火4min，中火5min；PBS洗3次各5min，5％BSA封闭30min；滴加一抗TMEM170B，4℃过夜；PBS冲洗3次各5min。滴加二抗，37℃孵育30min；PBS洗3次各5min。DAB显色，自来水充分冲洗；苏木素复染，自来水充分冲洗。脱水、透明各5～10min。中性树脂封片，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干。

结果见图5，TMEM170B蛋白在乳腺癌组织中的表达显著低于正常组织。

实施例6

检测乳腺癌细胞和乳腺上皮细胞中的TMEM170B基因表达--实时定量PCR

一、材料和方法

1.材料

乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435、BT474、MCF7和乳腺上皮细胞MCF10A均购自美国ATCC细胞库。

2.方法

2.1乳腺癌细胞和上皮细胞总RNA的提取

按life公司的Trizol说明书提取乳腺癌细胞和上皮细胞总RNA，再用NanoDropND-1000核酸定量仪定量所提取的RNA的纯度和浓度，琼脂糖质检确保提取RNA的完整性。

2.2对样品RNA进行反转录合成第一链cDNA

采用TaKaRa试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(PerfectReal Time)对提取的总RNA反转录合成cDNA。该试剂盒含gDNAEraser DNase，可有效去除混杂的基因组DNA。

2.3实时定量PCR

根据TMEM170B和β-actin的核酸序列设计特异性引物，采用TaKaRa试剂盒Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)进行PCR反应，TMEM170B的上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，β-actin的上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO5和SEQID NO.6。

反应体系如下表：

表2 PCR反应体系

将上述组份混合均匀后按以下程序：95℃30s预变性，40个循环；95℃5s，60℃30s。

根据熔解曲线判断反应的特异性，由公式2^-ΔΔCt计算TMEM170B的mRNA表达量。结果见图6，与乳腺上皮细胞MCF10A相比，四株乳腺癌细胞中的TMEM170B显著较低，其中具有高迁移能力的MDA-MB-231细胞中的TMEM170B表达量最低。

实施例7

检测乳腺癌细胞和乳腺上皮细胞中TMEM170B蛋白的表达量--免疫印迹

收集80％汇合度时细胞，离心后弃上清，PBS润洗两次，弃上清。加入RIPA裂解液，冰上裂解20min。12000g离心10min收集上清。加入1XSDS上样缓冲液，吹打混匀后煮沸变性5min。10％SDS-PAGE凝胶分离总蛋白，然后转移到PVDF膜。5％BSA室温封闭2h，与TMEM170B抗体(abcam)4℃孵育过夜，TBST洗涤3次。二抗室温孵育1h，TBST洗涤3次。ECL超敏化学发光液显影，经Tannon成像系统成像。以β-actin作为内参比较不同细胞中TMEM170B蛋白的表达水平。

结果见图7，与TMEM170B mRNA表达差异一致，在四种乳腺癌细胞系中TMEM170B蛋白的表达量显著低于乳腺上皮细胞。

实施例8

过表达TMEM170B载体的制备和病毒转染效率检测

同时合成针对TMEM170B的全长cDNA(具体序列见SEQ ID NO.2)，导入pcDNA3.1质粒中。将上述质粒同包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转入293T细胞中以产生病毒，转染48h后，收集细胞的病毒上清，感染MDA-MB-231乳腺癌细胞。感染24h后，加入嘌呤霉素在乳腺癌MDA-MB-231中筛选获得稳定促进TMEM170B基因表达的细胞株。收集MDA-MB-231/pcDNA-TMEM170B细胞和MDA-MB-231/pcDNA-control细胞的总RNA和蛋白，通过qPCR(具体方法同实施例6)和免疫印迹(具体方法同实施例7)的方法，比较MDA-MB-231/pcDNA-TMEM170B细胞和MDA-MB-231/pcDNA-control细胞中TMEM170B基因和蛋白的表达量的变化。

结果见图8，过表达TMEM170B使MDA-MB-231细胞中TMEM170B基因(图8A)和蛋白(图8B)的表达量显著升高。

实施例9

干扰TMEM170B表达的shRNA载体的制备和病毒转染效率检测

按照shRNA的设计规则，设计两条TMEM170B小分子干扰RNA(序列分别为SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8)。将这两个序列导入pGLVH1/GFP-Puro载体中。将上述质粒同包装质粒共转入293T细胞中以产生病毒，转染24h后，收集细胞的病毒上清，感染MCF7乳腺癌细胞。感染48h后，加入嘌呤霉素在乳腺癌MCF7中筛选获得稳定干扰TMEM170B基因表达的细胞株。收集MCF7/shRNA-TMEM170B细胞和MCF7/shRNA-control细胞的总RNA和蛋白，通过qPCR(具体方法同实施例6)和免疫印迹(具体方法同实施例7)的方法，比较MCF7/shRNA-TMEM170B细胞和MCF7/shRNA-control细胞中TMEM170B基因和蛋白的表达量的变化。

结果见图9，干扰TMEM170B能显著降低MCF7细胞中TMEM170B基因(图9A)和蛋白(图9B)的表达量。

实施例10

干扰TMEM170B表达影响乳腺癌细胞增殖能力

MDA-MB-231细胞表达对照pcRNA和pcDNA-TMEM170B；MCF7细胞表达对照shRNA和shRNA-TMEM170B。采用MTT法检测干扰TMEM170B表达对乳腺癌细胞增殖的活性的影响。乳腺癌细胞在37℃、5％CO₂的培养箱中培养至密度90％以上时用胰蛋白酶消化收集，用培养液重悬细胞并在显微镜下计数，将细胞浓度调整为3.0×10⁴个/mL，将细胞悬液接种到96孔板中，每孔100μL，并于37℃，5％CO₂培养箱中培养。分别在培养0h、24h、48h和72h后向96孔板中每孔加入20μL 5mg/mL的MTT，继续培养4h。吸去培养基，每孔加入100μL DMSO溶解。用酶标仪在检测波长为570nm，参比波长为630nm处测定吸光值，并计算生长抑制率(proliferation inhibition，PI)。

试验独立重复3次，试验得到的结果以mean±SD表示，并进行统计T检验，*P＜0.05为显著性差异，**P＜0.01为极显著性差异。

结果发现上调TMEM170B表达后，MDA-MB-231细胞的增殖速度明显减弱(图10A)；沉默TMEM170B会导致MCF7细胞增殖速度加快(图10B)。

实施例11

干扰TMEM170B表达对乳腺癌细胞迁移能力的影响

将乳腺癌细胞接种到transwell小室中，每孔100μL，在transwell下室加入0.6mL含10％FBS的完全培养基刺激细胞迁移，于5％CO₂，37℃培养24h。弃去孔中培液，用90％酒精常温固定30min，0.1％结晶紫常温染色10min，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜下观察并选择四个视野拍照计数。按照公式计算迁移抑制率(migrationinhibition rate，MIR)：

其中N_test为测试组的细胞迁移数，N_control为空白对照组的细胞迁移数。试验独立重复3次，试验得到的结果计算mean±SD，并进行统计t检验，*P＜0.05为显著性差异，**P＜0.01为极显著性差异。

结果发现上调TMEM170B表达后，MDA-MB-231细胞的迁移能力明显减弱(图11A)；沉默TMEM170B会导致MCF7细胞迁移能力增强(图11B)。

实施例12

干扰TMEM170B表达对乳腺癌细胞侵袭能力的影响

将10mg/mL Matrigel用培养基以1:3稀释，涂布于transwell小室膜上，室温风干。将培养到对数生长期的乳腺癌细胞用胰蛋白酶消化，收集，用PBS洗涤两次后用空白培养基重悬。将细胞浓度调整到1×10⁵个/mL。将细胞接种到transwell小室中，每孔100μL，在transwell下室加入0.6mL含10％FBS的完全培养基刺激细胞侵袭，于5％CO₂，37℃培养24h。弃去孔中培液，用90％酒精常温固定30min，0.1％结晶紫常温染色10min，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未发生侵袭的细胞，显微镜下观察并选择四个视野拍照计数。按照公式计算侵袭抑制率(Invasion inhibition rate,IIR)：

其中N_test为测试组的细胞侵袭数，N_control为空白对照组的细胞侵袭数。试验独立重复3次，试验得到的结果计算mean±SD，并进行统计t检验，*P＜0.05为显著性差异，**P＜0.01为极显著性差异。

结果发现上调TMEM170B表达后，MDA-MB-231细胞的侵袭能力明显减弱(图12A)；沉默TMEM170B会导致MCF7细胞侵袭能力增强(图12B)。

实施例13

干扰TMEM170B表达对乳腺癌细胞克隆形成数目的影响

将1.6％低熔点琼脂糖与细胞培养基以1:1的体积比混合制备0.8％的底层琼脂，24孔板中每个孔0.5mL，4℃凝固5min。取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000个/mL，将1.4％低熔点琼脂糖与细胞悬液以1:1的体积比混合，制备0.7％的上层琼脂，每孔加0.5mL(约2500cell/well)，混匀，4℃凝固5min。置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养2-3周，计数直径在50μm以上的克隆，计算细胞集落形成率。

结果发现上调TMEM170B表达后，MDA-MB-231细胞的克隆形成数明显减少(图13A)；沉默TMEM170B会导致MCF7细胞的克隆形成数明显增多(图13B)。

实施例14

过表达TMEM170B抑制乳腺癌体内肿瘤的生长和远端转移

将实施例8得到的2×10⁶MDA-MB-231/pcDNA-TMEM170B细胞和MDA-MB-231/pcDNA-control细胞分别接种到6周龄雌性Balb/c-nu裸鼠的右侧第四个脂肪垫，每隔2天测量肿瘤的直径，第35天结束实验取出肿瘤组织拍照，并解剖主要器官心、肝、脾、肺、肾，进行HE染色观察是否存在病理学变化。

裸鼠移植瘤体积大小见图14A和14B，TMEM170B过表达的MDA-MB-231比对照细胞的肿瘤生长速度更慢，且肿瘤体积明显减小。

HE染色结果(图15)发现TMEM170B过表达能显著抑制MDA-MB-231细胞发生远端肺转移，对其它组织器官没有副作用。

实施例15

shRNA干扰TMEM170B促进乳腺癌体内肿瘤的生长和远端转移

将实施例9得到的5×10⁶MCF7/shRNA-TMEM170B细胞和MCF7/shRNA-control细胞分别接种到6周龄雌性Balb/c-nu裸鼠的右侧第四个脂肪垫，每隔2天测量肿瘤的直径，第35天结束实验取出肿瘤组织拍照，并解剖主要器官心、肝、脾、肺、肾，进行HE染色观察是否存在病理学变化。

裸鼠移植瘤体积大小见图16A和16B，TMEM170B沉默的MCF7细胞比对照细胞的肿瘤生长速度更快，且肿瘤体积明显缩小。

HE染色结果(图17)发现TMEM170B沉默能显著促进MCF7细胞发生远端肺转移，对其它组织器官没有副作用。

实施例16

过表达TMEM170B抑制β-catenin质核转位及下游靶点表达--免疫印迹

收集80％汇合度时细胞，离心后弃上清，PBS润洗两次，弃上清。采用RIPA裂解液收集MDA-MB-231/pcDNA-TMEM170B细胞和MDA-MB-231/pcDNA-control的总蛋白，采用细胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒(碧云天P0028)收集两种细胞中的浆蛋白和核蛋白。加入1×SDS上样缓冲液，吹打混匀后煮沸变性5min。10％SDS-PAGE凝胶分离总蛋白，然后转移到PVDF膜。5％BSA室温封闭2h，分别与一抗(β-catenin、TCF4、CD44、c-myc和cyclin D)4℃孵育过夜，TBST洗涤3次。二抗室温孵育1h，TBST洗涤3次。ECL超敏化学发光液显影，经Tannon成像系统成像。以β-actin作为浆蛋白内参，以Histone H3作为核蛋白内参，比较过表达TMEM170B后对β-catenin质核转位及下游靶点表达的影响。

结果发现过表达TMEM170B后，能显著抑制β-catenin从细胞质转移到细胞核中(图18A)，并能下调TCF4、CD44、c-myc和cyclin D的表达(图18B)。

实施例17

shRNA干扰TMEM170B促进β-catenin质核转位及下游靶点表达--免疫印迹

收集80％汇合度时细胞，离心后弃上清，PBS润洗两次，弃上清。采用RIPA裂解液收集MCF7/shRNA-TMEM170B细胞和MCF7/shRNA-control细胞的总蛋白，采用细胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒(碧云天P0028)收集两种细胞中的浆蛋白和核蛋白。加入1×SDS上样缓冲液，吹打混匀后煮沸变性5min。10％SDS-PAGE凝胶分离总蛋白，然后转移到PVDF膜。5％BSA室温封闭2h，分别与一抗(β-catenin、TCF4、CD44、c-myc和cyclin D)4℃孵育过夜，TBST洗涤3次。二抗室温孵育1h，TBST洗涤3次。ECL超敏化学发光液显影，经Tannon成像系统成像。以β-actin作为浆蛋白内参，以Histone H3作为核蛋白内参，比较shRNA干扰TMEM170B后对β-catenin质核转位及下游靶点表达的影响。

结果发现沉默TMEM170B后，能显著促进β-catenin从细胞质转移到细胞核中(图19A)，并能促进下游靶点TCF4、CD44、c-myc和cyclin D的表达(图19B)。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京安吉生物科技有限公司

<120> 肿瘤标志物TMEM170B蛋白及其在制备抑制肿瘤产品中的应用

<160> 8

<170> Patent In version 3.3

<210> 1

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Ala Glu Gly Gly Asp His Ser Met Ile Asn Leu Ser Val

1 5 10 15

Gln Gln Val Leu Ser Leu Trp Ala His Gly Thr Val Leu Arg Asn

20 25 30

Leu Thr Glu Met Trp Tyr Trp Ile Phe Leu Trp Ala Leu Phe Ser

35 40 45

Ser Leu Phe Val His Gly Ala Ala Gly Val Leu Met Phe Val Met

50 55 60

Leu Gln Arg His Arg Gln Gly Arg Val Ile Ser Val Ile Ala Val

65 70 75

Ser Ile Gly Phe Leu Ala Ser Val Thr Gly Ala Met Ile Thr Ser

80 85 90

Ala Ala Val Ala Gly Ile Tyr Arg Val Ala Gly Lys Asn Met Ala

95 100 105

Pro Leu Glu Ala Leu Val Trp Gly Val Gly Gln Thr Val Leu Thr

110 115 120

Leu Ile Ile Ser Phe Ser Arg Ile Leu Ala Thr Leu

125 130

<210> 2

<211> 139

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgaaggcgg aggggggcga ccactccatg atcaacctgt cggtgcagca ggtcctgagc 60

ctctgggccc acgggacggt gctgaggaac ctcacggaga tgtggtactg gatcttcctc 120

tgggctctct tctcttctct gtttgtccat ggtgctgcag gagtgttgat gtttgtgatg 180

ctgcagaggc ataggcaggg aagagtcatc tctgtcattg cagtcagcat tggatttctg 240

gcttctgtaa ctggagcgat gattaccagt gcagcagtag cgggcattta cagagtagct 300

gggaagaaca tggccccttt ggaagcgctg gtatggggcg ttggacagac tgtactgaca 360

ttaatcatct ccttttcaag gatcctcgct acactttga 399

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggatcctcgc tacactttga g 21

<210> 4

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

tccttatgct ttgacctgct c 21

<210> 5

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

gggaaatcgt gcgtgacatt aag 23

<210> 6

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

gtcaggcagc tcgtagctc t 21

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggcgaccact ccatgatcaa cctgtcggt 29

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tggatttctg gcttctgtaa ctggagcga 29

Claims

1.一种肿瘤的生物标志物，其特征在于：所述的生物标志物为跨膜蛋白TMEM170B，其氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO.1。

2.根据权利要求1所述的一种肿瘤的生物标志物，其特征在于：所述的肿瘤包括乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、肾癌；所述的非小细胞肺癌包括鳞癌和腺癌。

3.检测生物标志物表达的试剂在制备用于对权利要求2所述肿瘤对象进行预后的工具中的用途，所述的生物标志物包括跨膜蛋白TMEM170B，所述的预后的方法包括：

从患有权利要求2中的肿瘤中获得测试样品；

确定所述测试样品中生物标志物的表达水平；和

4.根据权利要求3所述的检测生物标志物表达的试剂在制备用于对权利要求2中肿瘤对象进行预后的工具中的用途，其特征在于：所述的测试样品是新鲜的、冷冻的或石蜡固定包埋的细胞。

5.抗TMEM170B蛋白抗体用于制备权利要求2所述肿瘤检测用试剂或者制备含有抗TMEM170B蛋白抗体的组合物检测试剂。

6.促进跨膜蛋白TMEM170B表达的物质在制备用于治疗肿瘤药物中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述的促进跨膜蛋白TMEM170B表达的物质为如下A或B：

A、一种核苷酸，其核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.2；

8.TMEM170B蛋白在制备具有如下至少一种功能产品中的应用：

(1)抑制肿瘤细胞增殖；

(2)抑制肿瘤细胞迁移和侵袭；

(3)抑制肿瘤生长；

(4)阻止β-catenin从细胞质向细胞核的转位。

9.TMEM170B蛋白在制备筛选抗肿瘤药物、恶性肿瘤诊断中的应用。