CN111850111A - 第150位点发生突变的col5a3突变基因及其检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明首次提供了一种特定的人COL5A3突变基因，该突变基因是由于野生型COL5A3基因发生g.[150insCT]插入突变而形成的，所述突变基因片段序列如Seq ID NO：1所示。携带g.[150insCT]突变的COL5A3突变基因将导致原发性青光眼的发生，且患者常伴随有关节疼痛症状。可以采用SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示序列的引物来对携带g.[150insCT]突变的COL5A3突变基因片段进行扩增。本发明提供的COL5A3特定突变基因可以为原发性青光眼致病机理的解析、致病基因检测、治疗药物的开发以及针对性预防和治疗等提供依据和奠定基础，也可以用于指导生育和辅助第三代试管婴儿技术中对于胚胎的筛选。

Description

第150位点发生突变的COL5A3突变基因及其检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基因及其应用，特别涉及原发性青光眼致病基因即COL5A3突变基因及其检测试剂盒和检测方法。

背景技术

青光眼是全球常见的且不可逆的严重致盲性眼部疾病，以视神经损害为主要特征，表现为与眼内压病理性增高相关的视神经节细胞进行性的凋亡，从而造成视力的逐渐缺失。通常青光眼是一种与年龄相关的疾病，40岁以后发病率显著增高。而原发性青光眼即先天性青光眼（Primary Congenital Glaucoma, PCG，OMIM：231300）是由于胚胎期发育障碍，致使房角结构先天异常或胚胎组织残留，阻塞房水排出通道而导致眼压升高，致使整个眼球不断增大，因此多在出生时已存在眼部异常，大多在儿童期即造成不可逆性的视功能损害，成年以前病情变化显著，严重危害着婴幼儿及青少年的视力发育，这种缺陷可以导致终身视觉残疾。儿童青光眼在一般眼病患者中仅占到0.01％-0.04％，而在盲人中可占到2％-15％，是一种重要的致盲性眼病。

由于PCG发病较早，如不及时察觉，一旦视力损伤则造成不可逆的致盲结果，严重影响患者生活质量。如若及时发现并采取治疗手段，则至少可以保存部分视力，对PCG致病基因和病理机制的深入研究将有助于其早期预防和治疗。PCG病例常呈现家族聚集性，以常染色体隐性遗传最为多见，目前已经揭示出了多种PCG致病相关基因，已知的比较明确的致病基因有2个，分别是CYP1B1和LTBP2基因；TEK基因突变也能够引起常染色体显性遗传型PCG。早期诊断和早期治疗是防治PCG患者视功能进行性损害的有效途径，因此PCG的相关基因检测对其临床诊断、治疗方案制定和预后评估都具有非常重要的意义，而PCG致病基因的全面揭示是基因检测的基础和前提。

本发明申请人从11例原发性青光眼家族聚集性家系相关患者样本的基因测序结果中发现，有5例家系中的PCG患者均出现了COL5A3基因的特定突变，而同时此5例家系中的PCG患者均有不同程度的关节疼痛表征。经进一步扩大病例数验证显示，本发明申请人首次揭示了COL5A3基因为原发性青光眼致病基因并提供了其致病突变形式，在此基础上构建了基于PCR扩增和Sanger测序的突变片段检测试剂盒和检测方法。

发明内容

本发明提供了一种原发性青光眼的致病基因及其致病基因突变形式，并在此基础上构建了致病基因突变的检测试剂盒和对应的检测方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的目的之（1）在于提供一种发生g.[150insCT]突变的COL5A3突变基因，该突变基因序列如SEQ ID NO:1所示；携带g.[150insCT]突变的COL5A3突变基因将导致原发性青光眼的发生，且患者常伴随有关节疼痛症状。SEQ ID NO:1仅展现出g.[150insCT]突变所在的基因片段序列，COL5A3突变基因的其余序列参见NCBI登录号NC_000019.10所示片段中第9959561-10010532范围内的序列。可以采用SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示序列的引物来对携带g.[150insCT]突变的COL5A3突变基因片段进行扩增和检测。

本发明的目的之（2）在于提供一种发生g.[163_166delGACC]突变的COL5A3突变基因，该突变基因序列如SEQ ID NO:2所示；携带g.[163_166delGACC]突变的COL5A3突变基因将导致原发性青光眼的发生，且患者常伴随有关节疼痛症状。SEQ ID NO:2仅展现出g.[163_166delGACC]突变所在的基因片段序列，COL5A3突变基因的其余序列参见NCBI登录号NC_000019.10所示片段中第9959561-10010532范围内的序列。可以采用SEQ ID NO：5和SEQID NO：6所示序列的引物来对携带g.[163_166delGACC]突变的COL5A3突变基因片段进行扩增和检测。

本发明的目的之（3）在于提供一种发生g.[49644_49647delTCTC]突变的COL5A3突变基因，该突变基因序列如SEQ ID NO:3所示；携带g.[49644_49647delTCTC]突变的COL5A3突变基因将导致原发性青光眼的发生，且患者常伴随有关节疼痛症状。SEQ ID NO:3仅展现出g.[49644_49647delTCTC]突变所在的基因片段序列，COL5A3突变基因的其余序列参见NCBI登录号NC_000019.10所示片段中第9959561-10010532范围内的序列。可以采用SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8所示序列的引物来对携带g.[49644_49647delTCTC]突变的COL5A3突变基因片段进行扩增和检测。

本发明的目的之（4）在于提供一种发生g.[49881insACCG]突变的COL5A3突变基因，该突变基因序列如SEQ ID NO:4所示；携带g.[49881insACCG]突变的COL5A3突变基因将导致原发性青光眼的发生，且患者常伴随有关节疼痛症状。SEQ ID NO:4仅展现出g.[49881insACCG]突变所在的基因片段序列，COL5A3突变基因的其余序列参见NCBI登录号NC_000019.10所示片段中第9959561-10010532范围内的序列。可以采用SEQ ID NO：7和SEQID NO：8所示序列的引物来对携带g.[49881insACCG]突变的COL5A3突变基因片段进行扩增和检测。

本发明提供了一种原发性青光眼致病基因COL5A3的4种特定致病突变形式，以及基于PCR扩增和Sanger测序的致病基因检测试剂盒和对应的检测方法，这些可以为其致病机理的解析、致病基因检测、治疗药物的开发以及针对性预防和治疗等提供依据和奠定基础，也可以用于指导生育和辅助第三代试管婴儿技术中的植入前遗传学检测即PGT中对于胚胎的筛选。

附图说明

图1是实施例1中A号PCG家系的遗传图谱。图中正方形表示男性，圆形表示女性；实心（黑色）表示PCG患者，空心（白色）表示非PCG个体,大写字母“C”表示COL5A3突变基因，小写字母“c”表示COL5A3野生型基因，Cc代表杂合基因型，cc代表隐性纯合基因型；图中“+”表示COL5A3基因扩增片段检出g.[150insCT]突变，“-”表示COL5A3基因扩增片段未检出g.[150insCT]突变；I、II和III分别代表第1、第2代和第3代，数字为成员编号，斜向上箭头所示为先证者。

图2是实施例1中B号PCG家系的遗传图谱。图中正方形表示男性，圆形表示女性；实心（黑色）表示PCG患者，空心（白色）表示非PCG个体,大写字母“C”表示COL5A3突变基因，小写字母“c”表示COL5A3野生型基因，Cc代表杂合基因型，cc代表隐性纯合基因型；图中“+”表示COL5A3基因扩增片段检出g.[163_166delGACC]突变，“-”表示COL5A3基因扩增片段未检出g.[163_166delGACC]突变；I和II分别代表第1和第2代，数字为成员编号，斜向上箭头所示为先证者。

图3是实施例1中C号PCG家系的遗传图谱。图中正方形表示男性，圆形表示女性；实心（黑色）表示PCG患者，空心（白色）表示非PCG个体,大写字母“C”表示COL5A3突变基因，小写字母“c”表示COL5A3野生型基因，Cc代表杂合基因型，cc代表隐性纯合基因型；图中“+”表示COL5A3基因扩增片段检出g.[163_166delGACC]突变，“-”表示COL5A3基因扩增片段未检出g.[163_166delGACC]突变；I和II分别代表第1和第2代，数字为成员编号，斜向上箭头所示为先证者。

图4是实施例1中D号PCG家系的遗传图谱。图中正方形表示男性，圆形表示女性；实心（黑色）表示PCG患者，空心（白色）表示非PCG个体,大写字母“C”表示COL5A3突变基因，小写字母“c”表示COL5A3野生型基因，Cc代表杂合基因型，cc代表隐性纯合基因型；图中“+”表示COL5A3基因扩增片段检出g.[49644_49647delTCTC]突变，“-”表示COL5A3基因扩增片段未检出g.[49644_49647delTCTC]突变；I和II分别代表第1和第2代，数字为成员编号，斜向上箭头所示为先证者。

图5是实施例1中E号PCG家系的遗传图谱。图中正方形表示男性，圆形表示女性；实心（黑色）表示PCG患者，空心（白色）表示非PCG个体,大写字母“C”表示COL5A3突变基因，小写字母“c”表示COL5A3野生型基因，Cc代表杂合基因型，cc代表隐性纯合基因型；图中“+”表示COL5A3基因扩增片段检出g.[49881insACCG]突变，“-”表示COL5A3基因扩增片段未检出g.[49881insACCG]突变；I、II和III分别代表第1、第2代和第3代，数字为成员编号，斜向上箭头所示为先证者。

图6是COL5A3基因g.[150insCT]突变所在片段的Sanger测序局部图谱，图中箭头指向处为突变起始位点，此结果对应于实施例1中A号家系的III1先证患者（图1）样本。

图7是COL5A3基因g.[163_166delGACC]突变所在片段的Sanger测序局部图谱，图中箭头指向处为突变起始位点，此结果对应于实施例1中B号家系的II1先证患者（图2）样本。

图8是COL5A3基因g.[49644_49647delTCTC]突变所在片段的Sanger测序局部图谱，图中箭头指向处为突变起始位点，此结果对应于实施例1中D号家系的II1先证患者（图4）样本。

图9是COL5A3基因g.[49881insACCG]突变所在片段的Sanger测序局部图谱，图中箭头指向处为突变起始位点，此结果对应于实施例1中E号家系的III1先证患者（图5）样本。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。

实施例1 PCG致病基因探究

选择经临床检查确诊的11例原发性青光眼患者家系（就诊于福建地区三甲医院，本发明实际涉及的5例PCG家系的具体信息如表1和图1-图5所示），每个家系中至少有2名原发性青光眼患者，在先证患者或其监护人签署知情同意书的情况下，每个家系均只抽取先证者的外周静脉血进行全外显子组捕获测序分析。实施例涉及的原发性青光眼患者的诊断依据的是现有的常规临床标准（参照2013 年原发性先天性青光眼国际诊断标准和2014年我国原发性青光眼诊断和治疗专家共识），至少包括眼压、眼底、视野和前房角等检查指征；此外收集详细的家族病史信息。

（1）原发性青光眼患者致病基因检测

本发明所纳入的原发性青光眼病例均呈家族性聚集爆发现象，很可能是存在遗传性致病基因所致，因此可以通过全外显子组测序在基因组范围内进行致病基因的解析。取原发性青光眼患者家系中先证者的外周静脉抗凝血5ml，利用北京天根公司的血液基因组DNA提取试剂盒提取待测样本基因组DNA，Qubit4.0检测合格后将其送贝瑞和康公司进行全外显子捕获测序。全外显子测序建库采用的是Human All Exon Kit试剂盒（美国Agilent公司），利用Hiseq2500高通量测序仪（美国Illumina公司）进行2×100双端测序，平均测序深度不低于500×。测序原始数据首先去除低质量reads，再使用BWA(Burrows-Wheeler Aligner)软件将clean数据与hg19基因组数据（人类基因组参考数据）进行比对，使用GATK(GenomeAnalysis Toolkit)软件分析所有的变异位点信息。将变异位点与千人基因组数据库、dbSNP数据库、外显子组测序项目数据库ESP6500进行比对分析，并对变异位点的频率等信息进行注释。

全外显子组测序结果（且经Sanger测序验证）显示在11个PCG家系中的5个中均发现了COL5A3（collagen type V alpha 3 chain）基因的特定突变，包括g.[150insCT]、g.[163_166delGACC]、g.[49644_49647delTCTC]和g.[49881insACCG]这4种突变，具体信息如下表1所示。其中，A家系中的III1含有的是g.[150insCT]突变，B家系中的II1和C家系中的II1含有的均是g.[163_166delGACC]突变，D家系的II1和II2含有的是g.[49644_49647delTCTC]突变，E家系的III1含有的是g.[49881insACCG]突变。由于在5个无关联的PCG家系中均检测出COL5A3基因的特定突变，因此推测COL5A3突变基因是原发性青光眼的致病基因。在先证者全外显子组测序筛选出候选致病基因突变的基础上，就可以采用常规分子生物学方法（如PCR和Sanger测序）进一步地对这5个PCG患者家系中所有PCG患者和正常成员（非PCG患者）的COL5A3基因的突变情况进行检测，以判别相应COL5A3突变基因的分布情况和传递规律。

COL5A3基因的g.[150insCT]、g.[163_166delGACC]、g.[49644_49647delTCTC]和g.[49881insACCG]突变分别是指COL5A3基因的150位点处插入了CT核苷酸、第163-第166位点缺失了GACC这4个核苷酸、第49644-第49647位点缺失了TCTC这4个核苷酸以及第49881位点处插入了ACCG这4个核苷酸。

表1 原发性青光眼家系及其COL5A3基因突变信息

（2）致病基因的家系共分离分析

针对（1）中在5个PCG家系中发现的COL5A3基因的4种突变形式，设计PCR引物对突变所在的片段进行扩增和Sanger测序（送上海生工生物工程有限公司进行检测），选择的样本是这5个家系中所有相关的成员，以分析COL5A3突变基因在PCG家系中是否符合基因型和表型的共分离规律，扩增引物以及Sanger测序结果如表1所示，扩增体系和条件（统一条件）如表2所示。

表2 扩增体系（50µl）

经过在NCBI数据库中查询获知NCBI登录号NC_000019.10所示片段中第9959561-10010532范围内的序列为人COL5A3基因参考序列（第9959561位点为COL5A3基因的第一个核苷酸，片段长度共计50972bp）。由于g.[150insCT]突变和g.[163_166delGACC]突变位于同一外显子中且两者相距不足15bp，因此这两种突变所在基因片段均采用SEQ ID:5-SEQID:6所示的引物对进行扩增，经Sanger测序得出g.[150insCT]突变所在基因片段序列如SEQ ID NO：1所示（突变位点处的测序图谱参见图6），g.[163_166delGACC]突变所在基因片段序列如SEQ ID NO：2所示（突变位点处的测序图谱参见图7）；由于g.[49644_49647delTCTC]突变和g.[49881insACCG]突变位于同一外显子中且两者相距不足250bp，因此这两种突变所在基因片段均采用SEQ ID:7-SEQ ID:8所示的引物对进行扩增，经Sanger测序得出g.[49644_49647delTCTC]突变所在基因片段序列如SEQ ID NO：3所示（突变位点处的测序图谱参见图8），g.[49881insACCG]突变所在基因片段序列如SEQ ID NO：4所示（突变位点处的测序图谱参见图9）。

COL5A3基因片段的Sanger测序结果显示，A家系所有PCG患者（图1中III1、II2和I1）均只含有g.[150insCT]突变，B家系所有PCG患者（图2中II1和I2）和C家系所有PCG患者（图3中II1和I1）均只含有g.[163_166delGACC]突变，D家系所有PCG患者（图4中II1、II2和I2）均只含有g.[49644_49647delTCTC]突变，E家系所有PCG患者（图5中III1、II1、II2和I2）均只含有g.[49881insACCG]突变；而A-E这5个家系中的所有正常成员即非青光眼成员均未检出COL5A3基因的相关突变。

此外，从4种突变的Sanger测序图谱即图1-图4中可以看出这4种突变全部是杂合突变，因此可知患者的基因型均为杂合子；而杂合子即表现出疾病表型，可知COL5A3突变基因均为显性致病基因，用C（大写字母）标识，则相对的COL5A3野生型基因为隐性基因，用c（小写字母）标识。由此可知PCG患者的基因型均为Cc，正常成员的基因型为cc。将家系相关成员的基因型标注在家系图中（详见图1-4，Cc代表杂合子基因型，cc代表隐性纯合子基因型）。对于家系A而言，由图1可知致病基因是由I1传递到II2再传递到III1；对于家系B而言，由图2可知致病基因是由I2传递给II1；对于家系C而言，由图3可知致病基因是由I1传递给II1；对于家系D而言，由图4可知致病基因是由I2传递给II1和II2；对于家系E而言，由图5可知致病基因是由I2传递给II1和II2，再由II2传递给III1。

综上可知，COL5A3基因的4种突变形式均只存在于PCG患者中，而非PCG患者均不含COL5A3突变基因（含有的均是COL5A3野生型基因）；COL5A3突变基因在PCG患者家系中的传递均符合基因分离定律，父母携带的突变基因和子女携带的突变基因均完全一致，突变基因均是由父母传递给子女；在此基础上，从Sanger测序结果和家系基因型图谱分析，特定COL5A3突变基因均为PCG的显性致病基因。因此本发明首次揭示了COL5A3特定突变基因是PCG的致病基因，并且提供了4种特定的突变基因形式，同时阐明了COL5A3突变基因在家系中的传递规律。

临床上有一种叫做埃勒斯-丹洛斯综合征的罕见病，该病会导致活动过度、关节不稳、皮肤过度弹性、慢性疼痛、肌肉痉挛、关节和脊柱畸形以及心血管并发症，它是由某些关键基因的突变引起的，这些关键基因控制着对胶原蛋白产生起至关重要作用的蛋白质的表达。COL5A3基因编码一种低丰度纤维胶原的α链，这种纤维胶原分子是三聚体，可以由一种或多种α链组成。目前特定COL5A3突变基因被认为是导致埃勒斯-丹洛斯综合征III型患者亚群症状的原因。然而目前并未有COL5A3特定突变基因与PCG之间存在关联的报道。经过进一步的文献查询和数据库比对发现，COL5A3基因的这4种特定突变及其与PCG的关联为本发明首次报道。在此基础上，经过对这5个家系中的PCG患者疾病表征进一步了解发现，这5个家系中的中年和老年PCG患者（共10名）基本上都伴随有长期的关节疼痛症状（9/10，即90%）。由此可知，相当于在COL5A3基因突变原致病类型的基础上又揭示出新的致病种类。

实施例2 PCG致病基因验证

另外收集PCG患者20例（编号P1-P20），其中有12例患者隶属于5个PCG家系且家系中至少有1名PCG患者出现不同程度的长期的关节疼痛症状，其余8例PCG患者为散发病例但均出现不同程度的长期的关节疼痛症状；此外，收集这20例PCG患者家系中非PCG成员共85例。对于每例样本，参照实施例1中的PCR体系和条件扩增所述的COL5A3基因的4种特定突变片段；扩增产物均进行Sanger测序分析。结果发现了20例PCG患者均检出了COL5A3基因的特定突变，相关数据如表3所示，其中有6例为g.[150insCT]突变，3例为g.[163_166delGACC]突变、4例为g.[49644_49647delTCTC]突变，7例为g.[49881insACCG]突变。由此进一步验证了这4种特定的COL5A3基因突变是PCG的致病突变，且患者常伴随有不同程度的关节疼痛症状。而85例非PCG成员做为正常对照均未检测相关COL5A3基因突变。

表3 20例PCG患者COL5A3基因片段测序结果

样本编号	突变情况	序列	样本编号	突变情况	序列
						P1	g.[49644_49647delTCTC]	SEQ ID NO:3	P11	g.[49881insACCG]	SEQ ID NO:4
P2	g.[163_166delGACC]	SEQ ID NO:2	P12	g.[163_166delGACC]	SEQ ID NO:2
						P3	g.[49881insACCG]	SEQ ID NO:4	P13	g.[150insCT]	SEQ ID NO:1
P4	g.[49881insACCG]	SEQ ID NO:4	P14	g.[150insCT]	SEQ ID NO:1
						P5	g.[49644_49647delTCTC]	SEQ ID NO:3	P15	g.[49881insACCG]	SEQ ID NO:4
P6	g.[150insCT]	SEQ ID NO:1	P16	g.[150insCT]	SEQ ID NO:1
						P7	g.[150insCT]	SEQ ID NO:1	P17	g.[49644_49647delTCTC]	SEQ ID NO:3
P8	g.[49644_49647delTCTC]	SEQ ID NO:3	P18	g.[49881insACCG]	SEQ ID NO:4
						P9	g.[163_166delGACC]	SEQ ID NO:2	P19	g.[150insCT]	SEQ ID NO:1
P10	g.[49881insACCG]	SEQ ID NO:4	P20	g.[49881insACCG]	SEQ ID NO:4

实施例3 PCG致病基因COL5A3的应用

特定类型PCG致病基因的揭示意义重大，可以为其致病机理的解析、致病基因检测、治疗药物的开发以及针对性预防和治疗等提供依据和奠定基础，也可以用于指导生育和辅助第三代试管婴儿技术中的植入前遗传学检测即PGT中对于胚胎的筛选。现就其在生育指导方面的应用示例如下。

有1对PCG患者夫妇，其中男方为轻度PCG患者（31岁，其母亲也为轻度PCG患者）且伴随有长期的关节疼痛，女方正常，婚后1年拟开始生育，到眼科就诊转优生优育科进行生育咨询。经过对男方进行全外显子组测序发现其COL5A3基因发生了g.[163_166delGACC]突变，参照实施例1中的PCR体系和条件扩增夫妻双方和男方母亲样本COL5A3基因g.[163_166delGACC]突变所在片段并进行Sanger测序验证，结果显示男方母亲和男方都含有COL5A3基因的g.[163_166delGACC]杂合突变，符合全外显子组测序的结果，而女方COL5A3基因未发生g.[163_166delGACC]突变。根据实施例1和2可知，男方有50%的概率将COL5A3基因的g.[163_166delGACC]突变传递给子女，因此建议妊娠时行无创产前诊断，抽取母亲外周血送第三方基因公司重点检测胎儿COL5A3基因突变情况。结果显示胎儿未遗传父亲COL5A3基因的g.[163_166delGACC]突变，于是继续妊娠并活产婴儿1个。采集婴儿足跟血提取基因组DNA，参照实施例1中的PCR体系和条件，扩增COL5A3基因g.[163_166delGACC]突变所在片段并进行Sanger测序验证，结果显示婴儿确实不含COL5A3基因的g.[163_166delGACC]突变，出生阶段未见眼睛明显异常，至今生长至近3岁眼睛发育正常，未出现PCG症状。

另有1对PCG患者夫妇，男方为地中海贫血即地贫患者，其中女方为PCG患者（34岁）且伴随有长期的关节疼痛，婚后2年生育一地贫合并PCG的患儿。经过对夫妻双方和患儿进行地贫突变基因和COL5A3基因测序发现，父亲将地贫突变基因传递给患儿；同时女方COL5A3基因发生了g.[49881insACCG]突变，并将该突变传递给患儿。因地贫和PCG遂行第三代试管婴儿技术（即植入前遗传学诊断技术，简称PGD技术），经超促排共获得12个卵子，受精10个，卵裂9个，形成8个优质胚胎进行囊胚培养，最终共获得4枚可用囊胚。经过活检取样和二代测序检测发现其中2枚囊胚染色体正常且不含父亲的地贫突变基因和COL5A3基因的g.[49881insACCG]突变，选择基因检测正常且评分最好的1枚囊胚进行移植，结果成功妊娠，无创产检和羊穿均正常，最终活产一健康婴儿。采集婴儿足跟血提取基因组DNA，参照文献和实施例1中的PCR体系和条件，扩增COL5A3基因g.[49881insACCG]突变所在片段和父亲携带的地贫基因并进行Sanger测序验证，结果显示婴儿确实不含地贫突变基因和COL5A3基因的g.[49881insACCG]突变，发育至今逾2岁未出现地贫和PCG症状。

综上可知，PCG致病基因COL5A3特定突变的揭示对于PCG患者群体及其家系具有重要的意义。

序列表

<110> 苏伟坤

<120> 第150位点发生突变的COL5A3突变基因及其检测试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 412

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

tgcaccgagc ccgagaagtc gccgcgcccc gcagccgccc cgactggttc cccgccttgc 60

ccgtgggccc cgccgggatc tggggaaccg ccgggacctg ggccagccgc gggccggtct 120

ctgcctgctc ctggccgcgc tgcagcttct gccggggacg caggccggtg agccgggagg 180

gaagagatgg gacccagggt ccacgactca gagaggctct aaaagagcga ggggtggagg 240

ggggtggagg ggcgtggagg ggaagggcgt gggcgccgcg tgcggccccg gtgtgatgtg 300

ggcgcatgag tatctgactc tgggtgattt gtgggtgtga cagctcgggg tgggggtggg 360

gatgtgtgag tgcgttttct ggcgagcgcg tgggaatgca tgcaatgtgc ag 412

<210> 2

<211> 406

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

tgcaccgagc ccgagaagtc gccgcgcccc gcagccgccc cgactggttc cccgccttgc 60

ccgtgggccc cgccgggatg gggaaccgcc ggtgggccag ccgcgggccg gtctctgcct 120

gctcctggcc gcgctgcagc ttctgccggg gacgcaggcc ggtgagccgg gagggaagag 180

atgggaccca gggtccacga ctcagagagg ctctaaaaga gcgaggggtg gaggggggtg 240

gaggggcgtg gaggggaagg gcgtgggcgc cgcgtgcggc cccggtgtga tgtgggcgca 300

tgagtatctg actctgggtg atttgtgggt gtgacagctc ggggtggggg tggggatgtg 360

tgagtgcgtt ttctggcgag cgcgtgggaa tgcatgcaat gtgcag 406

<210> 3

<211> 376

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

tggcttctgc agaaagaggc tcatggagcc cctcatcctc tgccttgccc tcctctcacc 60

agtctacgtg gacgccgacg ggtccccagt gaatgtcgtg cagctgaact tcctgaaact 120

gctgagtgcc acagctcgcc agaacttcac ctactcctgc cagaatgcag ctgcctggct 180

ggacgaagcc acgggtgact acagccactc cgcccgcttc cttggcacca atggagagga 240

gctgtctttc aaccagacga cagcagccac tgtcagcgtc ccccaggatg gctgccgggt 300

aagagggtgg ggcagtggcc agctagagag gggaggcaag atgtcggcca ccttcccggt 360

aactcaccgt ctctgt 376

<210> 4

<211> 384

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

tggcttctgc agaaagaggc tcatggagcc cctcatcctc tgccttgccc tcctctcacc 60

agttctccta cgtggacgcc gacgggtccc cagtgaatgt cgtgcagctg aacttcctga 120

aactgctgag tgccacagct cgccagaact tcacctactc ctgccagaat gcagctgcct 180

ggctggacga agccacgggt gactacagcc actccgcccg cttccttggc accaatggag 240

aggagctgtc tttcaaccag acgacagcag ccactgtcag cgtcccccag gatggctgcc 300

accggggtaa gagggtgggg cagtggccag ctagagaggg gaggcaagat gtcggccacc 360

ttcccggtaa ctcaccgtct ctgt 384

Claims (4)

1.一种COL5A3突变基因，其特征在于：COL5A3突变基因是由于野生型COL5A3基因发生g.[150insCT]插入突变而形成的，该g.[150insCT]插入突变所在的基因片段序列如Seq IDNO：1所示；携带g.[150insCT]突变的COL5A3突变基因将导致原发性青光眼的发生，且患者常伴随有关节疼痛症状。

2.如权利要求1所述的COL5A3突变基因在原发性青光眼致病机理的解析、致病基因的检测、治疗药物的开发以及优生优育中的应用。

3.如权利要求1所述的COL5A3突变基因的检测试剂盒，其特征在于：检测试剂盒含有SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示序列的引物，以此来对携带g.[150insCT]突变的COL5A3突变基因片段进行扩增和检测。

4.如权利要求3所述的COL5A3突变基因的检测试剂盒对应的检测方法，其特征在于：采用SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示序列的引物扩增COL5A3突变基因片段的条件为：95℃预变性3min；94℃变性15s，52℃退火20s，72℃延伸40s，循环30次；72℃终延伸5min。

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