CN112011611B - circRNA在诊治胃癌中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了cricRNA在诊治胃癌中的应用。本发明采用组织样本和细胞样本进行QPCR实验，结果表明circ_SMAD4在胃癌组织中的表达上调，故其可作为诊断胃癌的生物标志物，另外生存分析显示circ_SMAD4表达与胃癌患者预后相关，故其也可作为预测胃癌预后的生物标志物。本发明利用体外细胞实验和体内动物实验证明干扰circ_SMAD4表达可抑制癌细胞从而抑制肿瘤生长，故circ_SMAD4可作为胃癌药物开发的靶标。

Description

circRNA在诊治胃癌中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，更具体地，circRNA在诊治胃癌中的应用。

背景技术

环状RNA(circRNA)是最近发现的一类特殊的非编码RNA，它大量存在于真核细胞胞质内，要由mRNA前体(pre-mRNA)通过可变剪切加工产生。

与传统线性RNA不同，circRNA是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(A) 尾巴的闭合环状结构，绝大部分circRNA由外显子序列构成，且在不同的物种中具有一定的保守性。目前circRNA的相关研究已受到越来越多研究者们的关注。

随着对circRNA研究的深入，circRNA与疾病的相关性也越来越多的受到研究者们的关注。肿瘤是一种机体在致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的异常病变。目前，肿瘤是全球疾病致死的重要元凶之一，因此对于其发病机制及治疗的相关研究仍是医学的重大课题之一。

2013年Hansen等研究者已证实circRNAs作为miRNA sponges可与miRNAs 结合并抑制其功能，在Ghosal等人的进一步研究中发现通过circRNA与miRNA 的相互作用可影响大量下游mRNAs的生物学行为，涉及到的相关疾病可能多达 90多种，其中肿瘤相关性疾病所占比例甚高。例如CDR1as可通过调控miR-7 的功能，对miR-7下游的重要肿瘤相关蛋白进行调控影响肿瘤的发生发展，包括表皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor，EGFR)，胰岛素受体底物 -1(Insulin receptor substrate 1，IRS-1)，胰岛素受体底物-2(Insulin receptor substrate 2，IRS-2)，Raf1蛋白激酶，P21蛋白活化激酶1(p21-activated kinase-1，Pak1)，活化CDC42激酶1(Activated CDC42 kinase 1，Ack1)，蛋白酶体激活因子PA28 gama，转录因子Yin-Yang1(YY1)，胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1receptor，IGF1R)，磷脂酰肌醇-3激酶催化亚基δ(phosphoinositide-3 kinase，catalytic subunit delta，PIK3CD)及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)。除此之外，Zheng Q等研究者还发现circHIPK3在乳腺癌、结肠癌、肝癌、胃癌及肾癌等肿瘤组织中表达丰度明显高于其正常组织，且circHIPK3可与miR-124结合从而调控肿瘤的增殖，敲低该circRNA可明显抑制肿瘤细胞的增殖。

基于circRNA肿瘤的重要作用，本申请意在研究胃癌相关circRNA，以便寻找能作为胃癌诊治标志物的circRNA，为临床诊断胃癌以及治疗胃癌提供理论基础。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种circ_SMAD4在制备胃癌诊断产品中的应用。

本发明的目的之二在于提供一种诊断胃癌的试剂盒。

本发明的目的之三在于提供一种治疗胃癌的药物。

本发明的目的之四在于提供一种诊断胃癌的方法。

为了实现上述目的，本发明首先提供了检测circ_SMAD4表达的试剂在制备诊断胃癌或预测胃癌预后的产品中的用途。

circ_SMAD4在胃癌患者中表达上调。

circ_SMAD4表达低的患者预后更好。

进一步，所述产品包括circ_SMAD4的检测试剂。

更进一步，所述试剂包括通过实时荧光定量PCR方法检测circ_SMAD4表达水平使用的试剂。

优选地，所述实时荧光定量PCR方法包括SYBRGreen法和TaqMan探针法。

本发明还提供了一种检测胃癌的试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增 circ_SMAD4的引物。

优选地，引物包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物。

优选地，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、Taq酶、和dNTPs。

优选地，所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照。

本发明还提供了一种治疗胃癌的药物组合物。所述药物组合物包含抑制 circ_SMAD4表达的试剂。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。

本发明的药物组合物可根据需要制备成各种剂型，包括但不限于，片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物组合物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、鼻腔喷雾、口腔喷雾、皮肤局部或全身经皮用药。

本发明的药物组合物还可与其他治疗胃癌的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。

优选地，抑制circ_SMAD4表达的试剂包括针对circ_SMAD4的干扰RNA，包括但不限于siRNA、shRNA。

本发明的抑制circ_SMAD4表达的试剂可以用于抑制内源性的circ_SMAD4 表达，通过降低内源性产物的表达，从而治疗因内源性产物过度表达导致的胃癌。

本发明提供了一种诊断胃癌的方法，所述方法包括检测受试者样品中circ_SMAD4表达水平。

本发明还提供了一种预测胃癌患者预后的方法，所述方法包括检测胃癌患者样品中circ_SMAD4表达水平。

本发明还提供了一种治疗胃癌的方法，所述方法包括抑制circ_SMAD4表达。

本发明还提供了circ_SMAD4在制备治疗胃癌的药物中的应用。

定义

术语“检测”在本文中以最广义使用，包括靶分子的定性和定量测量二者。检测包括仅仅鉴定样品中靶分子的存在以及测定该靶分子是否以可检测水平存在于该样品中。

如本文中使用的术语“生物标志物”指能在样品中检测的指示物，例如预测性，诊断性，和/或预后性的。生物标志物可充当由某些分子，病理学，组织学，和/或临床特征表征的特定亚型的疾病或病症(例如癌症)的指示物。在一些实施方案中，生物标志物是基因。生物标志物包括但不限于多核苷酸(例如DNA和/或 RNA)，多核苷酸拷贝数目改变(例如DNA拷贝数)，多肽，多肽和多核苷酸修饰 (例如翻译后修饰)，碳水化合物，和/或基于糖脂的分子标志物。

术语“表达水平”指生物学样品中生物标志物的量。“表达”一般指信息(例如基因编码的和/或表观遗传的)转化成细胞中存在并运行的结构的过程。因此，如本文中使用的，“表达”可以指转录成多核苷酸，翻译成多肽，或甚至多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)。转录的多核苷酸，翻译的多肽，或多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)的片段也应视为表达的，无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或降解的转录物，或者是源自多肽的翻译后加工，例如通过蛋白水解。

如本文中使用的“扩增”一般指生成想要的序列的多个拷贝的过程。“多个拷贝”指至少两个拷贝。“拷贝”并不必然意味着与模板序列的完全序列互补性或同一性。例如，拷贝可以包括核苷酸类似物诸如脱氧肌苷，有意的序列改变(诸如经由包含与模板可杂交但不互补的序列的引物引入的序列改变)，和/或扩增期间发生的序列错误。

如本文中可互换使用的，“多核苷酸”或“核酸”指任何长度的核苷酸聚合物，而且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸,经过修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或可以由DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和它们的类似物。如果存在的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸的序列可以由非核苷酸构件中断。多核苷酸可以在合成之后进一步修饰，诸如通过与标记物缀合。其它类型的修饰包括例如“帽”，将一个或多个天然发生核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如那些具有不带电荷的连接(例如甲基膦酸酯，磷酸三酯，磷酰胺酯(phosphoamidate)，氨基甲酸酯，等)和具有带电荷的连接(例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，等)的，那些含有悬垂模块(pendantmoiety)诸如例如蛋白质(例如核酸酶，毒素，抗体，信号肽，聚L-赖氨酸，等)的，那些具有嵌入剂(例如吖啶，补骨脂素，等)的，那些含有螯合剂(例如金属，放射性金属，硼，氧化性金属，等)的，那些含有烷化剂的，那些具有经过修饰的连接(例如α端基异构核酸(anomericnucleic acid)，等)的，以及未修饰形式的多核苷酸。而且，通常存在于糖中的任何羟基基团可以用例如膦酸(phosphonate)基团，磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与另外的核苷酸的另外的连接，或者可缀合至固体或半固体支持物。可磷酸化或用胺或1至20个碳原子的有机加帽基团模块取代5’和3’末端OH。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸也可含有本领域普遍知道的糖核糖或脱氧核糖的类似物形式,包括例如2’-O-甲基-，2’-O-烯丙基-，2’-氟-或2’-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-端基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖，木糖或来苏糖，糖吡喃糖，糖呋喃糖，景天庚酮糖，无环类似物和无碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可以用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于如下的实施方案，其中磷酸酯用P(O)S(“硫代酸酯”(thioate))，P(S)S(“二硫代酸酯”(dithioate))，(O)NR₂(“酰胺酯”(amidate))，P(O)R，P(O)OR’，CO或 CH₂(“甲缩醛”(formacetal))替换，其中每一个R或R’独立是H或取代或未取代的烃基(1-20个C)，任选含有醚(-O-)连接，芳基，烯基，环烷基，环烯基或芳烃基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是同一的。前面的描述适用于本文中提到的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

术语“引物”指能够与核酸杂交并容许互补核酸聚合(一般通过提供游离的 3’-OH基团)的单链多核苷酸。

术语“诊断”在本文中用于指对分子或病理学状态,疾病或状况的鉴定或归类。

如本文中使用的,术语“样品”指自感兴趣的受试者和/或个体获得或衍生的组合物，其含有要例如基于物理，生化，化学和/或生理特征表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。例如，短语“疾病样品”或其变型指自感兴趣的受试者获得的任何样品，其预期会或已知含有要表征的细胞和/或分子实体。样品包括但不限于原代或培养的细胞或细胞系，细胞上清液，细胞裂解物，血小板，血清，血浆，玻璃体液，淋巴液，滑液，滤泡液，精液，羊水，乳，全血，血液衍生的细胞，尿液，脑脊髓液，唾液，痰，泪液，汗液，粘液，和组织培养液，组织提取物诸如匀浆化组织，细胞提取物和其组合。

如本文中使用的，“治疗”指试图改变所治疗的个体的自然进程的临床干预，而且可以在临床病理学的进程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发，缓解症状，削弱疾病的任何直接或间接病理学后果，预防转移，减缓疾病进展的速率，改善或减轻疾病状态，和免除或改善预后。

预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能以100％的准确度预测患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本发明而言，本发明中的circ_SMAD4水平降低的患者中，与不显示该特征的人相比，更有可能观察到特定过程或结果。

本发明的circ_SMAD4的序列在公共数据库中能查询到，具体序列如SEQ ID NO.8所示。

附图说明

图1显示利用QPCR检测胃癌组织中circ_SMAD4的表达情况的统计图；

图2显示利用QPCR检测胃癌细胞中circ_SMAD4的表达情况的统计图；

图3显示circ_SMAD4表达与胃癌患者生存期相关分析的结果图；

图4显示利用QPCR检测circ_SMAD4表达抑制情况的统计图，其中A： circ_SMAD4相对表达量；B：SMAD4相对表达量；

图5显示利用菌落形成试验检测circ_SMAD4表达对胃癌细胞增殖影响的结果图，其中A：AGS细胞菌落照片；B：BGC823细胞菌落照片；C：统计图；

图6显示利用EdU法研究circ_SMAD4表达对胃癌细胞增殖影响的结果图，其中A：AGS细胞荧光图；B：BGC823细胞荧光图；C：Edu阳性细胞统计图；

图7显示利用流式细胞仪检测circ_SMAD4表达对胃癌细胞凋亡影响的结果图，其中A：流式图；B：凋亡统计图；

图8显示circ_SMAD4表达对小鼠肿瘤体积和重量影响的统计图，其中A：肿瘤体积；B：肿瘤重量。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本申请使用的统计分析方法：三次独立测定的结果表示成平均值±SD，并输入SPSS 22.0(IBM,Chicago,IL,USA)进行分析。将Kaplan-Meier方法和 log-rank检验用于生存分析。实验变量的差异通过Student's t检验或单因素方差分析确认，P<0.05。

实施例1环状RNA的差异表达

一、组织水平

1、组织样本来源

手术切除后，组织样本在-80℃冷冻。组织的获取取得医院伦理委员会许可，获得患者的书面知情同意。术前无患者接受过化疗或放疗。

2、QPCR检测

用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)分离总RNA，并采用 GoScript反转录系统(Qiagen GmbH,Germany)反转录。使用SYBR-Green PCR Master Mix试剂盒(Takara，中国大连)在ABI 7900检测系统(Applied Biosystems, Foster City,CA,USA)上实施了qRT-PCR。以GAPDH为内参基因通过2^-ΔΔCt方法将基因相对表达量标准化。

QPCR扩增引物序列如下：

circ_SMAD4引物序列：

F：5’-GCCACTCGTAGCTTCTGCTT-3’(SEQ ID NO.1)，

R：5’-TAATCCGGTCCCCAGCCTTT-3’(SEQ ID NO.2)；

GAPDH引物序列：

F：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’(SEQ ID NO.3)，

R：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’(SEQ ID NO.4)。

3、结果

QPCR结果显示，相比正常对照组织，40个胃癌组织中circ_SMAD4表达更高(图1)。

二、细胞水平

1、细胞培养

胃上皮细胞(GES-1)和人胃癌细胞(SGC-7901，MKN45，MGC-803，AGS 和BGC-823)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA，USA)。上述细胞接种于添加了1％青霉素/链霉素(Solarbio，北京，中国)、10％FBS (Gibco，Rockville，MD，USA)的RPMI-1640(GEHealthcare Life Sciences， Logan，UT，USA)培养基中放置在37℃、5％CO₂条件下的潮湿培养箱中培养。

2、QPCR检测

步骤同前。

3、结果

QPCR结果显示，与正常GES-1细胞相比，胃癌细胞中circ_SMAD4表达水平增加(图2)。

实施例2环状RNA与胃癌患者预后的相关性研究

步骤：生存分析采用Kaplan-Meier法和log-rank rest法。

结果：circ_SMAD4表达低的胃癌患者具有相对较好的生存率(图3)。

实施例3环状RNA对胃癌细胞增殖和凋亡的影响

1、细胞转染

针对circ_SMAD4的shRNA(sh/circ_SMAD4#1/2)、阴性对照shRNA (sh/ctrl)由Genechem(中国上海)构建。通过Lipotransfectamine 3000(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)将shRNA转染至细胞中。

sh/circ_SMAD4#1序列如下：

5’-CCGCGCCAACTAAGTCTGTCAGCTGCTCGAGCAGCTGACAGACTTA GTTGGCTTTTTG-3’(SEQID NO.5)；

sh/circ_SMAD4#2序列如下：

5’-CCGCGAAAGCCAACTAAGTCTGTCACTCGAGTGACAGACTTAGTTG GCTTTCTTTTTG-3’(SEQID NO.6)；

sh/ctrl序列如下：

5’-CCGCGCCAACTAAGCGGTACAATGCTCGAGCATTGTACCGCTTAGTT GGCTTTTTG-3’(SEQID NO.7)。

2、QPCR

步骤同实施例1。

结果如图4显示，干扰circ_SMAD4表达成功。

3、菌落形成试验

菌落形成试验旨在评估经过或未经过LiCl处理的转染AGS或BGC-823细胞的集落形成能力。将每孔500个细胞加入6孔板中并培养14天。除去培养基后，将菌落固定在甲醇(Sigma-Aldrich)中，并用结晶紫(Sigma-Aldrich)染色。在显微镜下(Olympus,Tokyo,Japan)检查染色的菌落。

培养中的细胞加入终浓度为20mM LiCl处理细胞24h。

结果显示，干扰circ_SMAD4表达导致胃癌细胞增殖变慢(图5)。

4、EdU分析

将经过或未经过LiCl处理的4×10⁴转染的AGS或BGC-823细胞与50μm EdU(RiboBio，南京，中国)孵育2小时，并用Apollo(RiboBio)和DAPI (Sigma-Aldrich)染色。通过荧光显微镜(Nikon,Tokyo,Japan)评估EdU阳性细胞的数目。

培养中的细胞加入终浓度为20mM LiCl处理细胞24h。

结果显示，干扰circ_SMAD4表达导致GC细胞增殖变慢(图6)。

5、流式细胞仪

6孔板中的细胞在冷PBS(Sigma-Aldrich)中洗涤两次，然后重悬于1×结合缓冲液(Invitrogen)中。将细胞通过膜联蛋白V-FITC/PI(Invitrogen)依次避光孵育15分钟，最后使用Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences，Franklin Lakes， NJ，USA)进行分析。

细胞转染时间为48h。

流式细胞仪分析结果显示，干扰circ_SMAD4表达后促进细胞凋亡(图7)。

实施例4环状RNA对肿瘤生长影响的体内研究

1、皮下异种移植肿瘤

动物来源和动物培养

6周龄BALB/c裸小鼠来源于上海施莱克公司。

2、动物处理

将circ_SMAD4-nockdown胃癌细胞或经sh/ctrl处理的胃癌细胞注射入裸鼠，并发展为皮下异种移植肿瘤。

1)将转染sh/circ_SMAD4#1或sh/ctrl的胃癌细胞按1*10⁶个/只的细胞量种植到小鼠皮下，每组6只小鼠。

2)每4天用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，由此计算肿瘤体积，并绘制生长曲线。

3)小鼠种植肿瘤细胞4周后予以颈椎脱臼处死，剥离瘤组织并称重。

3、结果：

sh/circ_SMAD4#1组小鼠的肿瘤尺寸大于sh/ctrl对照组(图8A)。

此外，与sh/ctrl对照组相比，sh/circ_SMAD4#1组小鼠肿瘤重量降低(图8B)。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 桂林医学院附属医院

<120> cricRNA在诊治胃癌中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gccactcgta gcttctgctt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taatccggtc cccagccttt 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggagcgagat ccctccaaaa t 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggctgttgtc atacttctca tgg 23

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgcgccaac taagtctgtc agctgctcga gcagctgaca gacttagttg gctttttg 58

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgcgaaagc caactaagtc tgtcactcga gtgacagact tagttggctt tctttttg 58

<210> 7

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccgcgccaac taagcggtac aatgctcgag cattgtaccg cttagttggc tttttg 56

<210> 8

<211> 6786

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtctgtcagc tgctgctgga attggtgttg atgaccttcg tcgcttatgc atactcagga 60

tgagttttgt gaaaggctgg ggaccggatt acccaagaca gagcatcaaa gaaacacctt 120

gctggattga aattcactta caccgggccc tccagctcct agacgaagta cttcatacca 180

tgccgattgc agacccacaa cctttagact gaggtctttt accgttgggg cccttaacct 240

tatcaggatg gtggactaca aaatacaatc ctgtttataa tctgaagata tatttcactt 300

ttgttctgct ttatcttttc ataaagggtt gaaaatgtgt ttgctgcctt gctcctagca 360

gacagaaact ggattaaaac aatttttttt ttcctcttca gaacttgtca ggcatggctc 420

agagcttgaa gattaggaga aacacattct tattaattct tcacctgtta tgtatgaagg 480

aatcattcca gtgctagaaa atttagccct ttaaaacgtc ttagagcctt ttatctgcag 540

aacatcgata tgtatatcat tctacagaat aatccagtat tgctgatttt aaaggcagag 600

aagttctcaa agttaattca cctatgttat tttgtgtaca agttgttatt gttgaacata 660

cttcaaaaat aatgtgccat gtgggtgagt taattttacc aagagtaact ttactctgtg 720

tttaaaaagt aagttaataa tgtattgtaa tctttcatcc aaaatatttt ttgcaagtta 780

tattagtgaa gatggtttca attcagattg tcttgcaact tcagttttat ttttgccaag 840

gcaaaaaact cttaatctgt gtgtatattg agaatccctt aaaattacca gacaaaaaaa 900

tttaaaatta cgtttgttat tcctagtgga tgactgttga tgaagtatac ttttcccctg 960

ttaaacagta gttgtattct tctgtatttc taggcacaag gttggttgct aagaagccta 1020

taagaggaat ttcttttcct tcattcatag ggaaaggttt tgtatttttt aaaacactaa 1080

aagcagcgtc actctaccta atgtctcact gttctgcaaa ggtggcaatg cttaaactaa 1140

ataatgaata aactgaatat tttggaaact gctaaattct atgttaaata ctgtgcagaa 1200

taatggaaac attacagttc ataataggta gtttggatat ttttgtactt gatttgatgt 1260

gacttttttt ggtataatgt ttaaatcatg tatgttatga tattgtttaa aattcagttt 1320

ttgtatcttg gggcaagact gcaaactttt ttatatcttt tggttattct aagccctttg 1380

ccatcaatga tcatatcaat tggcagtgac tttgtataga gaatttaagt agaaaagttg 1440

cagatgtatt gactgtacca cagacacaat atgtatgctt tttacctagc tggtagcata 1500

aataaaactg aatctcaaca tacaaagttg aattctaggt ttgattttta agattttttt 1560

tttcttttgc acttttgagt ccaatctcag tgatgaggta ccttctacta aatgacaggc 1620

aacagccagt tctattgggc agctttgttt ttttccctca cactctaccg ggacttcccc 1680

atggacattg tgtatcatgt gtagagttgg tttttttttt ttttaatttt tattttacta 1740

tagcagaaat agacctgatt atctacaaga tgataaatag attgtctaca ggataaatag 1800

tatgaaataa aatcaaggat tatctttcag atgtgtttac ttttgcctgg agaactttta 1860

gctatagaaa cacttgtgtg atgatagtcc tccttatatc acctggaatg aacacagctt 1920

ctactgcctt gctcagaagg tcttttaaat agaccatcct agaaaccact gagtttgctt 1980

atttctgtga tttaaacata gatcttgatc caagctacat gacttttgtc tttaaataac 2040

ttatctacca cctcatttgt actcttgatt acttacaaat tctttcagta aacacctaat 2100

tttcttctgt aaaagtttgg tgatttaagt tttattggca gttttataaa aagacatctt 2160

ctctagaaat tgctaacttt aggtccattt tactgtgaat gaggaatagg agtgagtttt 2220

agaataacag atttttaaaa atccagatga tttgattaaa accttaatca tacattgaca 2280

taattcattg cttctttttt ttgagatatg gagtcttgct gtgttgccca ggcaggagtg 2340

cagtggtatg atctcagctc actgcaacct ctgcctcccg ggttcaactg attctcctgc 2400

ctcagcctcc ctggtagcta ggattacagg tgcccgccac catgcctggc taacttttgt 2460

agttttagta gagacggggt tttgcctgtt ggccaggctg gtcttgaact cctgacctca 2520

agtgatccat ccaccttggc ctcccaaagt gctgggatta cgggcgtgag ccactgtccc 2580

tggcctcatt gttccctttt ctactttaag gaaagttttc atgtttaatc atctggggaa 2640

agtatgtgaa aaatatttgt taagaagtat ctctttggag ccaagccacc tgtcttggtt 2700

tctttctact aagagccata aagtatagaa atacttctag ttgttaagtg cttatatttg 2760

tacctagatt tagtcacacg cttttgagaa aacatctagt atgttatgat cagctattcc 2820

tgagagcttg gttgttaatc tatatttcta tttcttagtg gtagtcatct ttgatgaata 2880

agactaaaga ttctcacagg tttaaaattt tatgtctact ttaagggtaa aattatgagg 2940

ttatggttct gggtgggttt tctctagcta attcatatct caaagagtct caaaatgttg 3000

aatttcagtg caagctgaat gagagatgag ccatgtacac ccaccgtaag acctcattcc 3060

atgtttgtcc agtgcctttc agtgcattat caaagggaat ccttcatggt gttgccttta 3120

ttttccgggg agtagatcgt gggatatagt ctatctcatt tttaatagtt taccgcccct 3180

ggtatacaaa gataatgaca ataaatcact gccatataac cttgcttttt ccagaaacat 3240

ggctgttttg tattgctgta accactaaat aggttgccta taccattcct cctgtgaaca 3300

gtgcagattt acaggttgca tggtctggct taaggagagc catacttgag acatgtgagt 3360

aaactgaact catattagct gtgctgcatt tcagacttaa aatccatttt tgtggggcag 3420

ggtgtggtgt gtaaaggggg gtgtttgtaa tacaagttga aggcaaaata aaatgtcctg 3480

tctcccagat gatatacatc ttattatttt taaagtttat tgctaattgt aggaaggtga 3540

gttgcaggta tctttgacta tggtcatctg gggaaggaaa attttacatt ttactattaa 3600

tgctccttaa gtgtctatgg aggttaaaga ataaaatggt aaatgtttct gtgcctggtt 3660

tgatggtaac tggttaatag ttactcacca ttttatgcag agtcacatta gttcacaccc 3720

tttctgagag ccttttggga gaagcagttt tattctctga gtggaacaga gttctttttg 3780

ttgataattt ctagtttgct cccttcgtta ttgccaactt tactggcatt ttatttaatg 3840

atagcagatt gggaaaatgg caaatttagg ttacggaggt aaatgagtat atgaaagcaa 3900

ttacctctaa agccagttaa caattatttt gtaggtgggg tacactcagc ttaaagtaat 3960

gcattttttt ttcccgtaaa ggcagaatcc atcttgttgc agatagctat ctaaataatc 4020

tcatatcctc ttttgcaaag actacagaga ataggctatg acaatcttgt tcaagccttt 4080

ccattttttt ccctgataac taagtaattt ctttgaacat accaagaagt atgtaaaaag 4140

tccatggcct tattcatcca caaagtggca tcctaggccc agccttatcc ctagcagttg 4200

tcccagtgct gctaggttgc ttatcttgtt tatctggaat cactgtggag tgaaattttc 4260

cacatcatcc agaattgcct tatttaagaa gtaaaacgtt ttaattttta gccttttttt 4320

ggtggagtta tttaatatgt atatcagagg atatactaga tggtaacatt tctttctgtg 4380

cttggctatc tttgtggact tcaggggctt ctaaaacaga caggactgtg ttgcctttac 4440

taaatggtct gagacagcta tggttttgaa tttttagttt ttttttttta acccacttcc 4500

cctcctggtc tcttccctct ctgataatta ccattcatat gtgagtgtta gtgtgcctcc 4560

ttttagcatt ttcttcttct ctttctgatt cttcatttct gactgcctag gcaaggaaac 4620

cagataacca aacttactag aacgttcttt aaaacacaag tacaaactct gggacaggac 4680

ccaagacact ttcctgtgaa gtgctgaaaa agacctcatt gtattggcat ttgatatcag 4740

tttgatgtag cttagagtgc ttcctgattc ttgctgagtt tcaggtagtt gagatagaga 4800

gaagtgagtc atattcatat tttccccctt agaataatat tttgaaaggt ttcattgctt 4860

ccacttgaat gctgctctta caaaaactgg ggttacaagg gttactaaat tagcatcagt 4920

agccagaggc aataccgttg tctggaggac accagcaaac aacacacaac aaagcaaaac 4980

aaaccttggg aaactaaggc catttgtttt gttttggtgt cccctttgaa gccctgcctt 5040

ctggccttac tcctgtacag atatttttga cctataggtg cctttatgag aattgagggt 5100

ctgacatcct gccccaagga gtagctaaag taattgctag tgttttcagg gattttaaca 5160

tcagactgga atgaatgaat gaaacttttt gtcctttttt tttctgtttt tttttttcta 5220

atgtagtaag gactaaggaa aacctttggt gaagacaatc atttctctct gttgatgtgg 5280

atacttttca caccgtttat ttaaatgctt tctcaatagg tccagagcca gtgttcttgt 5340

tcaacctgaa agtaatggct ctgggttggg ccagacagtt gcactctcta gtttgccctc 5400

tgccacaaat ttgatgtgtg acctttgggc aagtcattta tcttctctgg gccttagttg 5460

cctcatctgt aaaatgaggg agttggagta gattaattat tccagctctg aaattctaag 5520

tgaccttggc taccttgcag cagttttgga tttcttcctt atctttgttc tgctgtttga 5580

gggggctttt tacttatttc catgttattc aaaggagact aggcttgata ttttattact 5640

gttcttttat ggacaaaagg ttacatagta tgcccttaag acttaatttt aaccaaaggc 5700

ctagcaccac cttaggggct gcaataaaca cttaacgcgc gtgcgcacgc gcgcgcgcac 5760

acacacacac acacacacac acacacacag gtcagagttt aaggctttcg agtcatgaca 5820

ttctagcttt tgaattgcgt gcacacacac acgcacgcac acactctggt cagagtttat 5880

taaggctttc gagtcatgac attatagctt ttgagttggt gtgtgtgaca ccaccctcct 5940

aagtggtgtg tgcttgtaat tttttttttc agtgaaaatg gattgaaaac ctgttgttaa 6000

tgcttagtga tattatgctc aaaacaagga aattcccttg aaccgtgtca attaaactgg 6060

tttatatgac tcaagaaaac aataccagta gatgattatt aactttattc ttggctcttt 6120

ttaggtccat tttgattaag tgacttttgg ctggatcatt cagagctctc ttctagccta 6180

cccttggatg agtacaatta atgaaattca tattttcaag gacctgggag ccttccttgg 6240

ggctgggttg agggtggggg gttggggagt cctggtagag gccagctttg tggtagctgg 6300

agaggaaggg atgaaaccag ctgctgttgc aaaggctgct tgtcattgat agaaggactc 6360

acgggcttgg attgattaag actaaacatg gagttggcaa actttcttca agtattgagt 6420

tctgttcaat gcattggaca tgtgatttaa gggaaaagtg tgaatgctta tagatgatga 6480

aaacctggtg ggctgcagag cccagtttag aagaagtgag ttgggggttg gggacagatt 6540

tggtggtggt atttcccaac tgtttcctcc cctaaattca gaggaatgca gctatgccag 6600

aagccagaga agagccactc gtagcttctg ctttggggac aactggtcag ttgaaagtcc 6660

caggagttcc tttgtggctt tctgtatact tttgcctggt taaagtctgt ggctaaaaaa 6720

tagtcgaacc tttcttgaga actctgtaac aaagtatgtt tttgattaaa agagaaagcc 6780

aactaa 6786

Claims (9)

1.检测circ_SMAD4表达的试剂在制备诊断胃癌或预测胃癌预后的产品中的应用，其特征在于，所述circ_SMAD4如SEQ ID NO.8所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，circ_SMAD4在胃癌患者中上调；circ_SMAD4表达低代表胃癌患者预后好。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品包括circ_SMAD4检测试剂。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测试剂包括通过实时荧光定量PCR方法检测circ_SMAD4表达水平使用的试剂。

5.一种检测胃癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括特异性扩增circ_SMAD4的引物。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，引物包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物。

7.如权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、Taq酶和dNTPs。

8.一种治疗胃癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含抑制circ_SMAD4的试剂，所述试剂包括干扰RNA，所述干扰RNA序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。

9.序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的干扰RNA在制备治疗胃癌的药物中的应用。

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