CN105002298A

CN105002298A - 一种鲤春病毒血症病毒的荧光定量pcr检测方法

Info

Publication number: CN105002298A
Application number: CN201510264774.XA
Authority: CN
Inventors: 邵玲; 肖雨
Original assignee: Shanghai Fisheries Research Institute
Current assignee: Shanghai Fisheries Research Institute Shanghai Fisheries Technical Extension Station
Priority date: 2015-05-21
Filing date: 2015-05-21
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2035-05-21
Also published as: CN105002298B

Abstract

一种鲤春病毒血症病毒的荧光定量PCR检测方法，属于水生病毒检测技术领域。本发明提供了检测鲤春病毒血症病毒的特异引物探针组，由针对鲤春病毒血症病毒的特异引物对以及荧光探针组成。采用本发明提供的引物对鉴定鲤春病毒血症病毒具有良好的灵敏性和特异性。本发明能检测鲤春病毒血症病毒感染的病鱼组织，也能检测无症状的鲤春病毒血症病毒携带鱼和鲤春病毒血症病毒感染的细胞，在对进出境水生动物进行快速检测和疫病监控中具有极大的应用前景。

Description

一种鲤春病毒血症病毒的荧光定量PCR检测方法

技术领域

本发明属于水生病毒检测领域，特别是鱼类鲤春病毒血症病毒的快速检测。

背景技术

鲤春病毒血症（Spring viraemia of carp，SVC）是一种以出血为主要临床症状并伴有高度传染性的急性流行病，其病原为鲤春病毒血症病毒（Spring viraemia of carp virus，SVCV）。鲤春病毒血症病毒在鲤、锦鲤、草鱼、鲢、鳙、鲫等鲤科鱼类中均可导致明显的症状，但普通鲤鱼是其最主要、最敏感的宿主，并且各个年龄段的鲤鱼都能被感染。该病毒常于春季在水温8～20°C，尤其是13～15°C时爆发流行，水温超过22°C时不发病。水温越适宜、鱼体健康状况越差越容易感染，病鱼全身出血及严重腹水、发病急、死亡率高，死亡率可高达90%左右，严重危害渔业生产并造成毁灭性打击，世界动物卫生组织OIE将其列为必须申报的重要疫病。2008年，农业部第1125号公告更是将该病列为“中华人民共和国进境动物一类传染病”，也是唯一一个被列为一类传染病的鱼类疫病，因此成为鱼类口岸检疫的第一类检疫对象。

目前，尚缺乏有效控制鲤春病毒血症病毒的药物和方法。国际上通行的控制该病的有效措施是进行鲤春病毒血症的监测，及早发现并进行隔离或扑杀。该病的诊断主要依赖于实验室的检测，因此建立快速、灵敏、准确的检测方法至关重要。目前，鲤春病毒血症病毒的检测方法包括细胞学诊断、免疫学诊断及分子生物学诊断三大类。

细胞学诊断技术主要是利用细胞分离培养病毒和电镜观察。该类方法操作繁琐，检测周期长，灵敏度低。

免疫学诊断技术主要包括酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫荧光方法。该类方法灵敏度较高，但对抗体要求也高，已有报道表明针对鲤春病毒血症病毒欧洲株制备的抗体不能用于检测亚洲株。另外，该类方法操作也相当繁琐，大量样本检测工作量巨大。

分子生物学诊断技术主要包括传统聚合酶链式反应（PCR）方法以及荧光PCR方法。目前，鲤春病毒血症病毒检测的国家标准是通过两轮普通的PCR组成的套式PCR方法。然而，传统的PCR方法只能定性，不能定量，灵敏度也较低。此外，鲤春病毒血症检疫技术规范SN/T 1152-2011也采用了荧光定量PCR技术进行鲤春病毒血症病毒的检测。但是，这两种方法所采用的扩增引物均是针对病毒G基因进行设计的，然而由于鲤春病毒血症病毒是RNA病毒，G蛋白又是病毒表面糖蛋白，G基因变异很快，基因序列的变异严重影响了其检测的准确度和灵敏度，容易造成假阴性结果，导致误判，最终造成疫病的进一步扩散。例如，2014上海分离株SH140503（Genebank注册号：KR012467）和SH140522（Genebank注册号：KR012468）利用针对G的荧光定量PCR方法均不能被有效检测到。

基于以上原因，设计更加灵敏可靠的检测方法尤为重要。一方面，我们对鲤春病毒血症病毒基因组序列分析表明，相对于G基因，核蛋白编码基因N在进化上更为保守。另一方面，弹状病毒科狂犬病毒、水疱性口炎病毒等研究表明，它们基因组转录水平N>P>M>G>L，并且依次递减约20%-30%，因而N基因的转录水平高于G基因。因此，我们推测同为弹状病毒科成员的鲤春病毒血症病毒中N基因的转录水平也高于G基因。在鲤春病毒血症病毒感染组织中，不仅仅存在完整的病毒粒子，也存在大量的基因组转录产物，而病毒粒子包装的基因组中N基因和G基因是等量的，因此，病毒感染组织中，N基因的总拷贝数应大于基因的拷贝数。基于以上理论，我们针对N基因的保守区域，设计并筛选出了一对荧光定量PCR引物和对应的荧光探针，以便更加灵敏准确的检测鲤春病毒血症病毒。

发明内容

本发明的目的是提供一种比现有方法更为灵敏、准确、高特异性的采用针对鲤春病毒血症病毒N基因的特异性引物和荧光探针，通过荧光探针或SYBR GREEN I荧光染料实时定量PCR检测鲤春病毒血症病毒的方法，以克服现有技术的不足。

本发明的技术方案包括以下步骤：

1）、荧光PCR引物及探针的设计：

首先根据美国国家生物技术信息中心建立的DNA序列数据库Genbank上所有鲤春病毒血症病毒N基因序列，针对N基因的序列保守区，利用Primer Express 3.0软件设计特异性的引物序列和荧光探针序列，如下：

正向引物：N-TF1：ATCAGGCCGATTATCCTTCCA；

反向引物：N-TR1：AGATAAGCATTCACATGCTGTAT；

荧光探针：N-tag1：5′-FAM-TCTCCACCAGTCCCATATAGACATATTGCCT-TAMRA-3′；

荧光探针的5 ′ 端标记荧光报告基团FAM，3′ 端标记荧光淬灭基团TAMRA，扩增片段长度151 bp；

2）、病毒RNA的提取：

采用经典的Trizol法或商业化试剂盒提取待测样品总RNA；

3）、反转录及cDNA的获得：

反转录体系及条件：在200 μl PCR反应管中依次加入2 μg 步骤2中的待测样品总RNA、1 μl 随机六聚体引物、补充无RNA酶水至总体积12 μl；于65°C 反应5 min，立即置于冰上，然后加入 4 μl 5×Reaction Buffer，1 μl RiboLock RNase Inhibitor，2 μl 10 mM dNTP Mix 和 1 μl RevertAid M-MuLV RT (美国Thermo公司)，25°C反应5 min，之后42°C保温45 min 获得病毒cDNA；

4）、荧光PCR反应体系建立：

可以采用两种实时荧光PCR反应体系：

TaqMan 荧光探针法：在200 μl 荧光PCR反应管中依次加入10 μl 2×Premix Ex Taq (TAKARA公司)，浓度10 μmol/L的正向引物、反向引物各0.4 μl，0.8 μl 浓度10 μmol/L的荧光探针，0.4 μl ROX reference dye II和 1 μl cDNA 模板，置于ABI 7500Fast荧光定量PCR仪中进行反应，反应条件为94°C 30 s；之后94°C 3 s、60°C 30 s 40个循环；

SYBR Green I荧光染料法：在200 μl 荧光PCR反应管中依次加入10 μl 2×SYBR Premix Ex Taq (TAKARA公司)，浓度10 μmol/L正向引物、反向引物各0.4 μl，0.4 μl ROX reference dye II 和 1 μl cDNA 模板，置于7500Fast荧光定量PCR仪中进行反应，反应条件为95°C 30 s；之后95°C 5 s、60°C 30 s、72°C 30 s 40个循环，结束后，立即由仪器进行熔解曲线分析，最后通过ABI 7500 2.0.6软件计算扩增产物Tm值；

5 )、标准曲线的制备：

为了准确定量样本中病毒的拷贝数，制备含有目的扩增片段的质粒作为标准品以绘制标准曲线；首先设计N基因的正向引物和反向引物，扩增鲤春病毒血症病毒SVCV-265株基因组得到1261 bp的扩增产物，按照经典的分子克隆操作方法，将其连接到pMD18-T载体上，命名为pMD/SVCV-N，筛选阳性克隆并提取质粒DNA，利用分光光度计测定质粒浓度，即为标准品；将其进行10倍梯度稀释，之后进行TaqMan 荧光PCR反应；根据标准品的浓度和Ct值，仪器软件会自动绘制出荧光定量标准曲线；

6 )、检测结果判定：

利用荧光定量PCR反应收集荧光信号，再利用仪器软件处理数据，得到扩增曲线、熔解曲线、Ct值、Tm值；以标准品最低浓度对应的Ct值作为检测下限，以标准品对照的Tm值作为SYBR GREEN I 荧光染料法判定依据。

本发明通过对GenBank中所有鲤春病毒血症病毒基因组序列进行进化分析以及各基因的突变速率计算，建立了针对鲤春病毒血症病毒N基因的荧光定量PCR检测方法，设计并筛选了一对引物及探针，与已有的针对G基因的荧光定量PCR方法进行比较，发现本发明具有更加灵敏、准确、高特异性的特点。与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明公开了一种鲤春病毒血症病毒的荧光定量PCR检测方法，能够检测鲤春病毒血症病毒欧洲株和亚洲株，检测范围广，能有效检测进化距离很远的不同鲤春病毒血症病毒毒株；

2、本发明与已有检测方法相比，灵敏性高，在标准品为4×10⁷-40拷贝范围内都有极好的线性关系，检测范围可达7个数量级，可以高效检测出鲤春病毒血症病毒病鱼组织以及无临床症状的病毒携带鱼，提高了检测效率；

3、本方法可实现准确定量，通过制备标准品并绘制标准曲线，根据待测样品的Ct值，与标准曲线对照，可定量计算病毒拷贝数，并且本方法比基于G基因的检测方法更为灵敏，使得检测结果更加准确；

4、本发明方法特异性强，检测引物和探针与鲤春病毒血症病毒特异性结合，与其他水生病毒，如传染性脾肾坏死病毒ISKNV，锦鲤疱疹病毒KHV，草鱼呼肠孤病毒GCRV，对虾白斑综合征病毒WSSV 和传染性皮下及造血器官坏死病毒 IHHNV都没有交叉反应。

附图说明

图1. 本发明的利用新型引物和TaqMan荧光探针实时定量PCR检测鲤春病毒血症病毒欧洲株和亚洲株感染细胞样品的扩增曲线图谱，A：欧洲标准株SVCV 10/3感染的细胞样品；B：SVCV-265、SH140501、SH140502、SH140503和SH1405022 5株亚洲株病毒感染的细胞样品；C：空白对照。

图2. 本发明的利用SYBR GREEN I实时定量PCR检测6份鲤鱼样品的扩增曲线图谱，横坐标代表反应循环数，纵坐标代表荧光强度，A：欧洲标准株阳性对照；B：6份鲤鱼样品。

图3. 本发明的利用SYBR GREEN I实时定量PCR检测鲤鱼样品的熔解曲线图谱，横坐标代表熔解温度，纵坐标代表荧光信号导数，A：欧洲标准株阳性对照；B：为6份鲤鱼样品，熔解曲线的峰值对应的温度即为Tm值，阳性对照及待测样品的Tm值均为79.17±0.01°C。

图4. 本发明的利用N基因TaqMan荧光探针实时定量PCR检测鲤鱼组织样品的扩增曲线图谱，从左到右依次为肾、脾、肌肉、肝、脑和精巢组织。

图5. 采用鲤春病毒血症检疫技术规范SN/T 1152-2011中的G基因TaqMan荧光探针实时定量PCR检测鲤鱼组织样品的扩增曲线图谱，从左到右同样依次为肾、脾、肌肉、肝、脑和精巢组织。

图6. 本发明的不同浓度的鲤春病毒血症病毒标准品的实时荧光定量PCR反应的扩增曲线图谱，横坐标代表反应循环数，纵坐标代表荧光信号强度，1-7：PCR反应体系中加入标准品浓度分别为4×10⁷、4×10⁶、4×10⁵、4×10⁴、4×10³、4×10²、4×10¹拷贝。

图7. 本发明的鲤春病毒血症病毒的实时定量PCR检测方法的标准曲线图谱，横坐标代表样品的拷贝数，纵坐标代表Ct值，拷贝数x 与Ct值y的线性公式为：y=-3.397x+44.2，相关系数R²=0.999。

图8. 本发明的其他水生病毒的SYBR GREEN I实时荧光检测熔解曲线图谱，A：鲤春病毒血症病毒标准品； B：传染性脾肾坏死病毒（ISKNV），锦鲤疱疹病毒（KHV），草鱼呼肠孤病毒（GCRV），对虾白斑综合征病毒（WSSV）和传染性皮下及造血器官坏死病毒（IHHNV）。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图来进一步阐述本发明。

实施例1、

以进化距离很远的鲤春病毒血症病毒欧洲株和亚洲株感染的细胞样品为例，采用TaqMan实时荧光定量PCR方法检测鲤春病毒血症病毒。

上述的设计特异性引物序列和荧光探针序列：

在GenBank数据库中搜索鲤春病毒血症病毒基因序列，利用BioEdit 7.9软件进行基因序列比对分析，通过BEAST 1.8软件分析比较各基因的进化速率，结果表明，相对于G基因，鲤春病毒血症病毒的核蛋白N基因更加保守。因此，根据N基因的保守区，利用Primer Express 3.0软件，设计并筛选特异性的引物序列和荧光探针序列，其中，特异性引物序列包含正向引物和反向引物，荧光探针为TaqMan探针，设计的实时荧光定量PCR特异性引物序列和探针序列如下：

正向引物：N-TF1：ATCAGGCCGATTATCCTTCCA；

反向引物：N-TR1：AGATAAGCATTCACATGCTGTAT；

荧光探针：N-tag1：5′-FAM-TCTCCACCAGTCCCATATAGACATATTGCCT-TAMRA-3′；

荧光探针通过TAKARA公司的引物标记服务，在荧光探针的5′端标记荧光报告基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团TAMRA，扩增片段长度为151 bp。

上述的建立荧光PCR反应体系：

取待测病毒感染的细胞样品200μl，采用常规Trizol法提取样品总RNA。

采用PrimeScript 1^st strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒（TAKARA公司），按照说明书操作步骤进行cDNA合成。

按技术方案4中TaqMan 荧光探针法建立实时定量PCR反应体系。采用ABI 7500Fast型荧光定量PCR仪进行反应，反应程序为：94°C 30 s；之后94°C 3 s、60°C 30 s 40个循环，收集荧光；

结果判定方法：若待测样品荧光信号超过阈值且Ct≤37.0，同时扩增曲线为平滑的“S”型，则可以判定待测样品中含有鲤春病毒血症病毒。本检测中设立鲤春病毒血症病毒欧洲标准株SVCV10/3、亚洲株SVCV-265、SH140501、SH140502、SH140503和SH1405022作为测试对象，水为空白对照，经检测发现，本发明的特异性引物和探针可以同时扩增鲤春病毒血症病毒欧洲株以及亚洲株感染的细胞样品，其扩增曲线见图1，所有病毒感染细胞样品均有扩增。表明本发明的荧光定量PCR检测方法，能够同时检测鲤春病毒血症病毒欧洲株和亚洲株，检测范围广，实用性强。

实施例2、

以鲤鱼样品为例，采用SYBR GREEN I 荧光染料法检测鲤春病毒血症病毒。

6份待测鲤鱼样品采自上海闵行某养殖场，解剖学表明无任何明显鲤春病毒血症临床症状，检测是否携带鲤春病毒血症病毒。

取30mg待测鲤鱼的肝、脾、肾、脑混合匀浆组织，总RNA提取及cDNA合成同实施例1，使用的特异性引物及探针序列同实施例1，SYBR GREEN I 荧光染料法仅需要特异性引物，不需要荧光探针。

SYBR GREEN I 实时定量PCR反应体系及反应程序同技术方案中4所述。采用7500Fast荧光定量PCR仪进行反应，反应条件为95°C 30 s；之后95°C 5 s、60°C 30 s、72°C 30 s进行40个循环，结束后，仪器会立即进行熔解曲线分析，最后通过ABI 7500 2.0.6软件计算扩增产物Tm值；

上述样品的扩增曲线见图2，反应结束后，仪器自带软件给出上述样品的熔解曲线见图3，结果表明待测样品扩增曲线呈“S”型，样品的Tm值为79.17±0.01°C，介于78.5-79.4°C之间，与阳性对照一致，由此判定6份鲤鱼样品中都包含有鲤春病毒血症病毒。

实施例3、

采用本发明设计的针对N基因的特异性引物和探针与采用鲤春病毒血症检疫技术规范SN/T 1152-2011中的针对G基因的引物和探针的荧光定量PCR检测方法的灵敏性比较。

取20条健康鲤鱼进行人工感染实验，病毒接种14天后，将感染鲤鱼的肝、脾、肾、脑、肌肉、精巢不同组织分别取样，总RNA提取及cDNA合成见同实施例2，使用的N基因的特异性引物和探针同实施例1。

使用的G基因的引物和探针如下：

SVCV-GF：ATCATTCAAAGGATTGCATCAG；

SVCV-GR：CATATGGCTCTAAATGAACAGAA；

SVCV-G-tag：FAM-TCCCCCTCAAAGTTGCGGATGG-TRAMA

荧光探针通过TAKARA公司的引物标记服务，在荧光探针的5′端标记荧光报告基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团TAMRA，扩增片段长度为136 bp。

TaqMan荧光探针法PCR反应体系和程序同实施例1，检测的6种不同鲤鱼组织样品的扩增曲线见图4和图5，其中图4为采用本发明的N基因TaqMan荧光探针实时定量PCR检测鲤鱼组织样品的扩增曲线图谱；图5为采用鲤春病毒血症检疫技术规范SN/T 1152-2011中的针对G基因的引物和荧光探针实时定量PCR检测鲤鱼组织样品的扩增曲线图谱。

为了计算组织样品中病毒拷贝数，从而制作了标准曲线。

上述的用于制备含有目的扩增片段的质粒作为标准品以绘制标准曲线：

利用Primer Express 3.0软件，设计N基因的阳性质粒，PCR引物序列为：

SVCV- NF：ATCATGAGTGTCATTCGGATC；

SVCV- NR：CTTACCCATAGGTTTGTTTTATCC。扩增片段长度为1261bp。

通过常规PCR扩增鲤春病毒血症病毒SVCV-265株 N基因片段，连接T载体后，构建含有目的片段的质粒，命名为pMD/SVCV-N。用分光光度计测定质粒浓度为173.4ng/μl，pMD18-T载体长度为2692bp，插入片段长度为1261bp，每对碱基的平均分子量为660g/mol，根据阿伏加德罗常量，计算出标准品的浓度为4×10¹⁰拷贝/μl。将标准品进行10倍依次稀释，分别得到浓度4×10⁹、4×10⁸、4×10⁷、4×10⁶、4×10⁵、4×10⁴、4×10³、4×10²、4×10¹拷贝/μl的标准品。选取4×10⁷到40范围标准品为模板，进行实时荧光定量PCR反应，每个浓度做三个平行样，通过定量PCR仪器自动绘制出荧光定量标准曲线。

7500Fast荧光定量PCR仪会在反应过程中自动收集荧光，反应结束后，利用仪器自带软件进行数据分析，扩增曲线图谱结果见图6。反应体系中标准品浓度依次为4×10⁷-40个拷贝，结果表明，7个数量级的范围内扩增曲线都为平滑的“S”型，表明本实时定量PCR检测范围广，检测下限为40个拷贝。仪器自动绘制荧光定量标准曲线见图7，其中模板浓度与Ct值的线性关系为：y=-3.397x+44.2，相关系数R²=0.999，呈现良好的线性关系。

结果表明，人工感染鲤鱼样品的各组织都含有鲤春病毒血症病毒，其中采用本发明的N基因TaqMan荧光探针实时定量PCR检测各组织样品相对于采用G基因TaqMan荧光探针所需循环数更少，基因拷贝数更高（见表1）。表明本发明的特异性引物和探针比目前广泛使用的鲤春病毒血症检疫技术规范SN/T 1152-2011中的针对G基因的荧光探针和引物更加灵敏。

表1 鲤鱼各组织鲤春病毒血症病毒荧光定量PCR检测结果

实施例4、

分析鲤春病毒血症病毒SYBR GREEN I实时荧光PCR检测方法的特异性。

采用本发明的特异性引物，利用SYBR GREEN I实时荧光PCR检测方法检测鲤春病毒血症病毒和其他水生病毒：传染性脾肾坏死病毒（ISKNV），锦鲤疱疹病毒（KHV），草鱼呼肠孤病毒（GCRV），对虾白斑综合征病毒（WSSV）和传染性皮下及造血器官坏死病毒（IHHNV）。

检测过程同实施例2，只是将待测样品的cDNA换成传染性脾肾坏死病毒（ISKNV），锦鲤疱疹病毒（KHV），草鱼呼肠孤病毒（GCRV），对虾白斑综合征病毒（WSSV）和传染性皮下及造血器官坏死病毒（IHHNV）的cDNA或DNA。

SYBR GREEN I 实时荧光PCR的熔解曲线见图8，其中鲤春病毒血症病毒扩增产物的Tm值为78.64°C，其他5种病毒的Tm值均不在78.5-79.4°C的Tm值范围，且熔解曲线的荧光信号值远低于阳性对照，因此表明采用本发明的特异性引物，利用SYBR GREEN I实时荧光PCR检测鲤春病毒血症病毒不会与其他水生病毒发生交叉反应。

结果判定依据为：若采用SYBR GREEN I荧光染料，当待测样品的荧光信号大于阈值且Ct值≤37.0，并有“S”型扩增曲线，同时Tm值介于78.5°C-79.4°C之间时，判定待测样品中含有鲤春病毒血症病毒。

核苷酸序和氨基酸序列表

<110> 上海市水产研究所

<120> 一种鲤春病毒血症病毒的荧光定量PCR检测方法

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1335

<212> DNA

<213> 鲤春病毒血症病毒（Spirivivirus）

<220>

<221> 核蛋白基因（nucleoprotein）

<222> （1）…（1335）

<400> 1

aacagacatc atgagtgtca ttcggatcaa aacaaatgct acagttgctg ccgtgcttcc 60

ggctaacgaa gatcaggccg attatccttc cacttttttt gaagggggga atgagattag 120

attgtatgtt aacagggggg agaaattgga tgttttaagg caatatgtct atatgggact 180

ggtggagaaa aactgtagga tacagcatgt gaatgcttat ctatatgctg tgctgaaggg 240

agaaagagag ctgctagaag cggattggga tagctttggg cacaagattg ggattcaggg 300

ggataagatc gggcctttta acttggtgcg agtggaagac atccccgacg ggttaccaga 360

tgggaaactg aatgcagagg tgagtgctga ggatgatgca tggctgcctc tcttcttgct 420

gggtctttac agagtgggaa gggcaagtga gactgcatac cggactttgc tgatggagtc 480

cctgataaaa cagtgtaagg caataaaatc tgactgggtg tctcctgtaa cggcaactca 540

caaatatttc gatatctggg gcaatgatgg gaattacctg aagattgtgg cctgtgtgga 600

catgttttac aaccatttta aaaagagcat taaagcaaca ttccgatggg gaacgattgt 660

atcacggttc aaagactgtg ctgcactcgc caccctggga catgttgtca aaatcaccgg 720

tttgaccatt gaagaggtgt tcacatgggt actgcagact gaagtcgcgg atgagttagt 780

caaaatgatg aagcctggac aggagataga taaaagcacg tcttacatgc cgtacctgat 840

tgatatggga atctctgcca aatcaccata ctcaacaata aagaatccgt ctttccattt 900

ctgggggcag cttgttgctg cattgtgccg ctccaagaga gcactgaacg caagacagcc 960

tgatgagatt gactcaatgt ctatctcaaa tgcaagcttg ctgatggctt acgcattagg 1020

cagcagccct gacattgagc agcaattcag tacaggagac acatacagaa aaccgccaaa 1080

agaggcttcg tacctggtga gtgaggaacc gaaaaaccga tctgtcgttg aatggattgc 1140

atggtattct gacgtggaca acaaacctac ggatgacatg ctcatgatgg caaaacgagt 1200

agcggggact atctctgggc ctcgcgataa ttcagttggc aaatggataa aacaaaccta 1260

tgggtaagga taatcacatc acactgcaat gattttaagt aataagagaa gtagtagttg 1320

atagtatgaa aaaaa 1335

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> prim_bind

<222> （1）…（21）

<223> 荧光PCR正链引物

<400> 2

atcaggccga ttatccttcc a 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> prim_bind

<222> （1）…（23）

<223> 荧光PCR负链引物

<400> 3

agataagcat tcacatgctg tat 23

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> prim_bind

<222> （1）…（31）

<223> 荧光探针

<400> 4

tctccaccag tcccatatag acatattgcc t 31

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> prim_bind

<222> （1）…（21）

<223> 制备阳性质粒正链引物

<400> 5

atcatgagtg tcattcggat c 21

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> prim_bind

<222> （1）…（24）

<223> 制备阳性质粒负链引物

<400> 6

cttacccata ggtttgtttt atcc 24

<210> 7

<211> 151

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 定量PCR反应的目的扩增片段序列

<400> 7

atcaggccga ttatccttcc actttttttg aaggggggaa tgagattaga ttgtatgtta 60

acagggggga gaaattggat gttttaaggc aatatgtcta tatgggactg gtggagaaaa 120

actgtaggat acagcatgtg aatgcttatc t 151

Claims

1.一种鲤春病毒血症病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于以针对病毒N基因设计的特异性N-TF1和N-TR1作为正向引物和反向引物，以N-tag1作为荧光探针进行实时荧光定量PCR检测，其中，N-TF1: ATCAGGCCGATTATCCTTCCA；N-TR1: AGATAAGCATTCACATGCTGTAT；N-tag1：5′-FAM-TCTCCACCAGTCCCATATAGAC

ATATTGCCT-TAMRA-3′。

2.根据权利要求1所述的一种鲤春病毒血症病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于采用TaqMan荧光探针法定量PCR反应体系由以下组分组成：10 ??L 2×SYBR Premix Ex Taq，10 μmol/L正向引物、反向引物各0.4 ??L；0.4 μl ROX reference dye II，100ng/??L待测样品的cDNA 1-2 ??L，补充双蒸水至20 ??L。

3.根据权利要求1所述的一种鲤春病毒血症病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于采用SYBR GREEN I 荧光染料法定量PCR反应体系由以下组分组成：10 ??L 2×Probe qPCR Premix Ex Taq，10 μmol/L正向引物、反向引物各0.4 ??L，0.8 ??L 10 μmol/L荧光探针，0.4 μl ROX reference dye II，100ng/??L待测样品的cDNA 1-2 ??L，补充双蒸水至20 ??L。

4.根据权利要求1所述的一种鲤春病毒血症病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于TaqMan荧光定量PCR反应程序为：94°C 30 s；之后94°C 3 s、60°C 30 s 进行40到45个循环；SYBR GREEN I 荧光染料法PCR反应程序为：95°C 30 s；之后95°C 5 s、60°C 30 s、72°C 30 s进行40到45个循环，结束后，仪器会进行熔解曲线分析并计算待测样品Tm值。

5.根据权利要求1所述的一种鲤春病毒血症病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于结果判定依据为：若采用SYBR GREEN I荧光染料，当待测样品的荧光信号大于阈值且Ct值≤37.0，并有“S”型扩增曲线，同时Tm值介于78.5°C-79.4°C之间时，判定待测样品中含有鲤春病毒血症病毒；若采用荧光探针，若待测样品荧光信号超过阈值且Ct≤37.0，同时扩增曲线为平滑的“S”型，则可以判定待测样品中含有鲤春病毒血症病毒。