CN113150127A - 快速检测病毒的核酸抗体试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了快速检测病毒的核酸抗体试剂盒。本发明筛选获得HBsAg单克隆抗体，将所述单克隆抗体标记量子点和其他抗体标记的硝酸纤维素膜制备获得HBV荧光量子点快速检测试纸，同时针对HBV‑DNA序列进行分析，选取保守区设计RPA引物和探针，并制备成为相应的检测试纸条；将两个检测方法进行组合使用，能够进一步提高检测的准确性，同时通过DNA含量反应病毒复制状态，从而及早诊断，利于患者尽快治疗，适于大规模推广使用。

Description

快速检测病毒的核酸抗体试剂盒
技术领域
本发明涉及病毒诊断领域,并且更具体地涉及快速检测病毒的核酸抗体试剂盒。
背景技术
乙型肝炎为乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染所致的一种以肝细胞受损为主要表现的疾病，具有治愈难度高、具有传染性以及易反复发作等特征，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化及原发性肝细胞癌。
HBV属于嗜肝DNA病毒，完整的HBV为双层衣壳颗粒，称为Dane颗粒，外层为脂蛋白包膜，包膜内为病毒衣壳，或称为核心颗粒，其中包膜由HBsAg组成；核壳由乙型肝炎核心抗原(HBcAg)组成，核心内含有病毒基因组及聚合酶。
目前检测HBV的主要检测方法有病原学检测、血清学检测。其中病原学检测主要为核酸检测(RT-qPCR，LAMP)，血清学检测包括：HBs Ag、抗-HBS、HBe Ag、抗-HBe和抗-HBc等五项标志物。病原学检测精准性高、检测时间短，但是设备昂贵，易出现假阳性；乙肝五项指标在药物或病毒变异情况下，其检测受到一定制约，无法及早、准确检测乙肝病毒状况，影响检出率，不利于患者及早治疗。
发明内容
为了更好规避以上缺陷,为患者提供尽早、准确的诊断结果，提供了一种制备简单、成本低廉、使用方便、不需要高精尖仪器、更为准确、高效的检测试剂盒。所述试剂盒通过核酸-抗体双重检测方法对乙肝病毒进行检测，能更有效检测乙肝病毒及其复制状态,从而及早诊断，利于患者尽快治疗。
本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种特异性结合HBV表面抗原(HBsAg)的单克隆抗体5G7-2，其包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，重链CDR1区、CDR2区和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2和3所示；该轻链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中轻链CDR1区、CDR2区和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、5和6所示。
另一方面，本发明提供一种特异性结合HBsAg的单克隆抗体5G7-2，其包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:7，轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO:8。
在一些实施方案中，本发明所述的抗HBsAg抗体包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链构成，其中各重链包含上述的重链恒定区序列、重链可变区序列或CDR序列，且各轻链包含上述的轻链恒定区序列、轻链可变区序列或CDR序列。本发明的抗体可以是全长抗体，所述全长抗体包含恒定区，所述全长抗体轻链恒定区进一步包含鼠源κ、λ链序列。所述全长抗体重链恒定区进一步包含鼠源IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA或IgM序列。
在一些实施方式中，本发明的抗HBsAg抗体是由上述的抗HBsAg抗体或抗体片段形成的Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子或多特异性抗体。
本发明另外提供一种乙肝病毒荧光量子点快速检测试纸，其中将5G7-2单克隆抗体标记量子点配制备而成。
本发明提供另外一种用于快速检测乙肝病毒的试纸条RPA(LFD RPA)检测试剂盒，含有侧流层析试纸条(Hybridetect 2T，Milenia Biotec GmbH,Germany)，以及有一对引物和一条探针，其中所述上游引物序列如SEQ ID NO:9所示，所述下游引物序列如SEQ ID NO:10所示，所述探针的序列如SEQ ID NO:11所示。
具体的，上游引物(SEQ ID NO:9)：
CTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTC
下游引物(SEQ ID NO:10)：
Biotin-CTGAGGCCCACTCCCATAGGAATTTTCCG
探针序列(SEQ ID NO:11)：
FAM-CCTGCATGACTACTGCTCAAGGAACCTCTATGTATCCCTCCTGTTGC,
在一些实施例中，本发明的探针在中间距5’端34bp的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的距5’端33bp和35bp位置的胸腺嘧啶(dT)分别被荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1取代，并且在探针的3’末端通过阻塞基团C3Spacer修饰。
在一些实施例中，如上所述的核酸探针，所述荧光基团可替换为TAMARA，所述淬灭基团可替换为BHQ2；所述的脱碱基位点可替换为四氢呋喃；所述探针3’端的C3Spacer修饰可替换为磷酸化设计或连接biotin-TEG。
所述试纸条带有检测线，检测线上固定有分子A；
序列如SEQ ID NO:10所述的引物，其末端带有特异性结合前述分子A的分子B。所述分子A是生物素配体，分子B是生物素。
在本发明所述的试纸条RPA检测试剂盒中，优选的，所述试剂盒中还包括水解缓冲液，醋酸镁以及ddH2O。
本发明提供的试纸条法，RPA探针中间位置的两个胸腺嘧啶核苷酸上分别标记一个荧光基团和一个荧光淬灭基团，两个基团之间设计一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点可被具有3'-5'外切酶活性的核酸外切酶III识别、切割，游离荧光基团，从而发出荧光信号随后被荧光检测的仪器；同时留下可延伸3’-OH，DNA聚合酶以探针为“正向引物”继续延伸合成DNA，与反向引物(带亲和标记，例如生物素)一起扩增出一种带有双重标记(荧光基团标记、亲和标记)的扩增产物；该产物在侧向流检测试纸中层析，遇到可识别亲和标记的试纸区域(通常为一条线，即“检测线”，带有链霉亲和素)时，则被富集，表现出线形荧光信号。试纸条法由于不依赖荧光定量PCR仪，成本和适用范围更广。
本发明进一步的，提供一种乙肝病毒的检测方法，它是使用前述引物和探针对样品进行扩增，再用核酸检测试纸条检测扩增产物即可。结果检测：结合试纸条进行显色，上述扩增产物吸取5μL-25μL吸取用缓冲液1×PBST稀释10倍-50倍，用相应标记的试纸条进行检测。结果判读：同时出现T线和C线为阳性(+)，仅出现C线为阴性(-)，只出现T线需考虑试纸条是否有效性。
在一些实施方式中，本发明提供一种核酸-抗体双重检测乙肝病毒的试剂盒，所述试剂盒含有特异性检测HBsAg核酸的RPA试剂盒以及特异性检测HBsAg的含有单克隆抗体的试纸条；所述RPA试剂盒含有SEQ ID NO:9和10的引物以及SEQ ID NO:11的探针；所述单克隆抗体的试纸条为将抗HBsAg单克隆抗体5G7-2标记量子点制备而成的荧光量子点快速检测试纸条；其中，所述抗HBsAg单克隆抗体5G7-2包括重链可变区，其包含SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的CDR3,以及轻链可变区，其包含SEQID NO:4所示的CDR1、SEQ ID NO:5所示的CDR2和SEQ ID NO:6所示的CDR3。
在一些实施方式中，本发明提供一种核酸-抗体双重检测乙肝病毒的试剂盒，所述试剂盒含有特异性检测HBsAg核酸的RPA试剂盒以及特异性检测HBsAg的含有单克隆抗体的试纸条；所述RPA试剂盒含有SEQ ID NO:9和10的引物以及SEQ ID NO:11的探针；所述单克隆抗体的试纸条为将抗HBsAg单克隆抗体5G7-2标记量子点制备而成的荧光量子点快速检测试纸条；其中，所述抗HBsAg单克隆抗体5G7-2单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ IDNO:7所示,轻链可变区序列如SEQ ID NO:8所示。
一种检测乙肝病毒试剂盒的应用，所述试剂盒通过体外测定来自受试者的生物试样中是否存在HBV表面抗原、HBV DNA及其含量。
在一些实施方式中，本发明所述的生物试样为血液、血浆、血清、尿或唾液。
有益效果
本发明通过针对HBV的DNA序列进行分析获得了特异性针对HBV-DNA的RPA引物和探针，并制备出HBV-DNA检测试剂；同时针对HBV表面抗原筛选并获得效果较好的单克隆抗体，将所述单克隆抗体标记量子点和其他抗体标记的硝酸纤维素膜制备获得乙肝病毒荧光量子点快速检测试纸，将以上两个检测方法进行组合使用，用于乙肝病毒患者的诊断，能够进一步提高检测的准确性，同时通过DNA含量反应病毒复制状态,从而及早诊断，利于患者尽快治疗，适于大规模推广使用。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
图1小鼠抗体亚型鉴定结果
图2RPA检测方法灵敏度评价结果图
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1.抗HBsAg抗体制备
取HBV表面抗原蛋白，将抗原稀释至1mg/ml，首次免疫取50μl抗原溶液、50μl0.01M PBS与150μl弗氏完全佐剂混合乳化，皮下多点免疫6～8周龄的雄性BALB/c小鼠。初次免疫后、每隔二周，取2 5μl抗原溶液、75μl 0.01M PBS与100μl弗氏不完全佐剂混合后进行5次追加免疫。在最后一次免疫后的第四天取脾，进行细胞融合。取免疫后的Balb/c小鼠脾细胞，使用PEG法将其与骨髓瘤Sp2/0细胞株融合，将融合后的细胞用20％FBS-HAT-DMEM培养基重悬，然后均匀铺于96孔板内，37℃，5％CO2培养。融合后的细胞在培养一周左右后用10％FBS-HT-DMEM培养基进行半量换液，当细胞菌落覆盖孔底的面积达到1/3～1/2时，取培养上清，用间接ELISA方法进行阳性克隆的检测。选取OD450nm值较高且细胞集落数目少的孔，通过有限稀释法进行克隆化。同样以ELISA方法进行筛选，最终获得阳性杂交瘤细胞株并将其命名为5G7-2。扩大培养后，冻存杂交瘤细胞。
实施例2.单克隆抗体的纯化
取BALB/c小鼠，在接种杂交瘤细胞前1周，经腹腔注射降植烷，0.5ml/只。1周后，每只小鼠经腹腔接种约1X106个杂交瘤细胞；7～10d后，收集腹水。将腹水经10000×g离心30min后，弃沉淀，用50％硫酸铵盐析粗提,PBS溶解，流水透析5h；用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)透析平衡过夜；上样，用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)洗脱杂蛋白，用不同pH值的柠檬酸盐洗脱液洗脱，分段收集洗脱峰，浓缩后，得到纯化后的抗HBsAg抗体5G7-2。
实施例3.抗HBsAg抗体亚型鉴定
根据亚类测定试剂(sigma公司)对间接ELISA筛选出的阳性鼠单克隆细胞株进行亚类测定。试剂盒中提供的酶标板上已经预包被了针对小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM、kappa轻链、lambda轻链的特异性抗体，将实施例2中纯化的抗HBsAg抗体5G7-2样品加入样品孔中，每孔50μl，无需孵育。将1X羊抗鼠IgA+IgM+IgG-HRP加入样品孔中，每孔50μl，轻轻混匀后，孵育1h。扣去孔中液体加入1XPBST洗孔3次，吸水纸吸干多余水分。加入显色液，每孔100μl，室温避光显色15min。加入100μl终止液，终止显色反应。结果如图1所示，本发明的单克隆抗体为IgG2b亚型。
实施例4.单克隆抗体序列确定
从液氮中取出5G7-2杂交瘤细胞细胞冻存管，于37℃快速融解，1000rpm，5min离心去除冻存液，置于100mm孔板，培养至占培养板约80％，加入1ml Trizol试剂(Thermo公司)，并依据说明书提取杂交瘤细胞总RNA。取2.5μg上述总RNA，加入DECP水，使体积达到11μl，加入1.0μl oligo(dT)(10μM)，加入1μl dNTPs(10mM)，混合均匀，65℃孵育5分钟后置冰上1分钟，然后加入4μl RT buffer(5×)，1.0μl DTT(100mM)，1μl Ribonuclease Inhibitor及1μl逆转录酶(takara公司)，50℃反应10min。80℃孵育10分钟以终止反应，获得的cDNA保存在-20℃。设计特异性的巢式PCR引物，该扩增反应中所使用的引物序列与抗体可变区第一框架区和恒定区互补，采用常规PCR方法扩增目的基因。其中，引物序列的设计按照文献(Bodo Brocks.Species-Crossreactive scFv Against the Tumor Stroma Marker“Fibroblast Activation Protein”Selected by Phage Display From an ImmunizedFAP-/-Knock-Out Mouse)进行。
测序结果显示,本发明所述的抗HBsAg抗体5G7-2的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；该抗体的重链可变区3个CDR的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示；轻链可变区3个CDR的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示。
实施例5.抗HBsAg抗体亲和力测定
将抗体捕获抗体(AHC)通过氨基偶联的方式包被在CM5芯片表面，参照氨基偶联试剂盒和抗捕获试剂盒说明书，准备芯片活化缓冲液盐酸N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、AHC和封闭用的乙醇胺，选择Biacore3000系统中的包被程序，将AHC氨基偶联在CM5芯片表面。将实施例2中获得的抗HBsAg抗体5G7-2捕获于芯片表面。用HBS-EP+缓冲液将抗体稀释至1μg/mL，设置流速为10μl/min，包被至响应值达100RU。HBsAg抗原设置7个不同浓度梯度，用HBS-EP缓冲液依次进行2倍梯度稀释，浓度从40nM到0nM。设置HBsAg抗原的流速为30μl/min，结合时间为3min。设置HBS-EP+缓冲液流速为30μl/min，解离时间为10min。使用3M MgCl2作为再生缓冲液，按照再生程序对芯片进行再生。通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(Ka)和解离速率(Kd)。平衡解离常数(Kd)用解离速率(Kd)/结合速率(Ka)计算。结果如表1所示：本发明的抗体亲和力较高，亲和力KD值达到6.12x10-9M。
表1
Figure BDA0003057144520000091
Figure BDA0003057144520000101
实施例6.抗HBsAg多克隆抗体的制备
取HBsAg抗原，按照每只兔子1mg蛋白的量进行免疫。将1mg蛋白溶于500μl无菌PBS中，然后加入等体积的佐剂，在漩涡震荡器上混匀1h，然后用注射器吹吸混匀后皮下多点注射。14天后重复该实验，多次免疫后，采取耳缘静脉血进行抗血清效价的检测。当抗血清的效价达到融合标准，进行一次加强免疫后，选用一次全采血法,自颈动脉无菌放血,分离血清,加入适量防腐剂,分装小瓶,低温冰箱保存。用50％硫酸铵沉淀一次,33％硫酸铵沉淀两次,然后用DEAE层析法把兔血清进行纯化，提取IgG。用间接ELISA法测定纯化的IgG效价,得到抗HBsAg多克隆抗体。
实施例7.乙肝病毒荧光量子点快速检测试纸的制备及验证
将实施例2纯化的5G7-2单克隆抗体标记量子点，实施例2纯化的抗HBsAg多克隆抗体包被硝酸纤维素膜搭配检测。将其制备成快速检测试纸后，对其进行交叉反应测试。将乙肝疫苗原液、甲肝灭活疫苗原液、柯萨奇A16(CA16)灭活疫苗原液、肠道病毒71型(EV71)灭活疫苗原液稀释后,用所述乙肝病毒荧光量子点快速检测试纸检测，观察是否存在交叉反应。(+)代表检测结果阳性，(-)代表检测结果阴性。检测结果表明乙肝病毒荧光量子点快速检测试纸与所测样品没有交叉反应，具有良好的特异性。
表2
Figure BDA0003057144520000102
Figure BDA0003057144520000111
实施例8.RPA特异性检测引物的设计
对乙肝病毒常见株的基因序列进行比对，选择特异性的保守区，设计检测乙肝病毒的RPA引物组，其序列如下所示：
上游引物(SEQ ID NO:9)：
具体的，上游引物(SEQ ID NO:9)：
CTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTC
下游引物(SEQ ID NO:10)：
Biotin-CTGAGGCCCACTCCCATAGGAATTTTCCG
探针序列(SEQ ID NO:11)：
FAM-CCTGCATGACTACTGCTCAAGGAACCTCTATGTATCCCTCCTGTTGC,探针在中间距5’端34bp的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的距5’端33bp和35bp位置的胸腺嘧啶(dT)分别被荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1取代，并且在探针的3’末端通过阻塞基团C3Spacer修饰。
实施例9.RPA反应灵敏度检测
以乙肝病毒DNA作为模板，进行RPA试验，采用筛选的引物进行RPA扩增，同时设置超纯水为阴性对照，反应温度为38℃，反应时长为20min，RPA反应体系为50μl，其中，2μl正反向引物(10μM)，2μl反向引物(10μM)，0.6μl探针，25μl含重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白、核酸内切酶IV的缓冲液，1μl模板和17.9μlddH2O，充分振荡混匀并且瞬离，最后加入2.5μl的280mM醋酸镁，将反应管置于实时荧光PCR仪中38℃恒温反应相应时长；结果如图2所示。如图2所示，当模板浓度为1ng，100pg，10pg时，均出现明显扩增曲线与目的条带，但模板浓度低于1pg时无明显扩增曲线与目的条带，即说明RPA的检测最低限为10pg，具有较好的检测精度。
实施例10.乙肝病毒RPA检测试纸条的制备及检测
乙肝病毒的RPA试剂盒包括实施例8中设计的引物和探针、阳性对照质粒(SEQ IDNO:12)、水解缓冲液、酶混合物、醋酸镁(280mM)、无核酸酶纯水以及侧向层析试纸条，试纸条带有检测线，检测线上固定有分子链霉亲和素，能够与引物SEQ ID NO:10末端的生物素特异性结合。
将所述的试纸条分别检测待测样品的DNA、阳性对照质粒以及阴性对照ddH2O。RPA反应体系为50μl，其中，2μl正反向引物(10μM)，2μl反向引物(10μM)，0.6μl探针，25μl含重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白、核酸内切酶IV，1μl样品和17.9μlddH2O，充分振荡混匀并且瞬离，最后加入2.5μl的280mM醋酸镁。反应温度设为38℃的水浴锅中进行，反应时间设定为20min。结果表明，含有乙肝病毒DNA的样本和阳性对照同时出现T线和C线为阳性(+)，阴性对照样本仅出现C线为阴性(-)，说明本发明的试纸条试剂盒可以有效检测HBV病毒，结果如下表3所示。
表3
Figure BDA0003057144520000131
实施例11.实际样品检测
取经过临床症状、试验检查确诊为乙肝的200例患者，以及200例健康患者进行检测，上述样品均由天津医院提供。取上述患者血清，分别采用荧光量子点快速检测试纸以及试纸条RPA进行检测，检测结果见表4。从表4结果可以看出，抗体荧光量子点试纸条和RPA试纸条的方法均可以较好的检测乙肝病毒，但由于病毒变异或其他因素的影响，仍有部分乙肝患者的HBsAg抗原为阴性。将HBsAg抗原检测与乙肝DNA检测二者结合，可以起到良好的补充，加强检测结果的准确性。
表4
Figure BDA0003057144520000132
序列表
<110> 北京保图生物技术有限公司
<120> 快速检测病毒的核酸抗体试剂盒
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asn Ala Arg Ser Thr
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Trp Ile Asn Phe Lys Ile Asn Asn Asp Gly Ser Ala Thr Pro Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Gly Arg Phe Lys Leu Met Asp
1 5
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Gly Cys Ala Arg Thr Pro Leu Leu Trp Ile Cys Asn Gly Lys
1 5 10 15
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Leu Ala Ser Asn Lys Phe Gly
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Gln Asp Trp Asn Thr Ile Tyr Thr
1 5
<210> 7
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Tyr Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ala
20 25 30
Arg Ser Thr Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Phe Lys Ile Asn Asn Asp Gly Ser Ala Thr Pro Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Ala Gly Arg Phe Lys Leu Met Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 8
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly Cys Ala Arg Thr Pro Leu Leu
20 25 30
Trp Ile Cys Asn Gly Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Lys Phe Gly Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Gly Asp Asp Val Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Trp
85 90 95
Asn Thr Ile Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Met Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctggactatc aaggtatgtt gcccgtttgt c 31
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctgaggccca ctcccatagg aattttccg 29
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cctgcatgac tactgctcaa ggaacctcta tgtatccctc ctgttgc 47
<210> 12
<211> 211
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctggactatc aaggtatgtt gcccgtttgt cctctaattc caggatcctc aacaaccagc 60
acgggaccat gccggacctg catgactact gctcaaggaa cctctatgta tccctcctgt 120
tgctgtacca aaccttcgga cggaaattgc acctgtattc ccatcccatc atcctgggct 180
ttcggaaaat tcctatggga gtgggcctca g 211

Claims (6)

1.一种特异性结合HBsAg的抗体，其特征在于:所述抗HBsAg单克隆抗体包括重链可变区，其包含SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的CDR3,以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:4所示的CDR1、SEQ ID NO:5所示的CDR2和SEQ ID NO:6所示的CDR3。
2.一种特异性结合HBsAg的抗体，其特征在于:所述抗HBsAg单克隆抗体包括重链可变区，其包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列,以及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
3.一种检测HBV的试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有由权利要求1或2所述的单克隆抗体标记量子点制备而成的荧光量子点快速检测试纸条。
4.一种核酸-抗体双重检测HBV的试剂盒，所述试剂盒含有权3所述的抗体检测试剂盒和一种用于快速检测HBV的试纸条RPA检测试剂盒，其中包括一对引物和一条探针，所述的一对引物的序列如SEQ ID NO:9和10所示，所述探针的序列如SEQ ID NO:11所示。
5.如权利要求4所述的核酸-抗体双重检测HBV的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括水解缓冲液，醋酸镁以及ddH2O。
6.如权利要求4或5所述的核酸-抗体双重检测HBV的试剂盒，其特征在于RPA扩增反应在温度设定为38℃的水浴锅中进行，反应时间为20min。
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