EP0702090B1 - Procédé pour la coamplification d'acide nucléique utilisant un agent d'exclusion volumique dans la composition de réaction, trousse d'analyse et dispositif de test - Google Patents

Procédé pour la coamplification d'acide nucléique utilisant un agent d'exclusion volumique dans la composition de réaction, trousse d'analyse et dispositif de test Download PDF

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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction

Claims (20)

  1. Procédé de coamplification de deux ou plusieurs acides nucléiques cibles, ledit procédé comprenant au moins 15 cycles d'amplification primaires, chaque cycle d'amplification primaire comportant les étapes successives de :
    A) chauffage d'un mélange réactionnel de deux ou plusieurs acides nucléiques cibles, ou de leurs produits d'extension d'amorces, à une première température, T1, pour la dénaturation des brins desdits acides nucléiques cibles ou de leurs produits d'extension d'amorces,
    B) amorçage desdits brins dénaturés avec un jeu d'amorces qui sont spécifiques et capables de s'hybrider avec des brins opposés de chaque acide nucléique cible à amplifier, par refroidissement jusqu'à une deuxième température, T2, et
    C) soit en tant que continuation de l'étape B) soit dans une étape séparée, formation de produits d'extension d'amorces dans un mélange réactionnel de réactifs de PCR, par incubation à une troisième température, T3, pourvu que lorsque l'amorçage et la formation des produits d'extension d'amorces sont effectués dans la même étape, T2 et T3 soient les mêmes, où ledit mélange réactionnel dans au moins un desdits cycles d'amplification primaires comprend au moins environ 4 % en poids d'un agent d'exclusion volumique polymère, non ionique, et où au moins un acide nucléique cible est un acide nucléique cible à faible nombre de copies, et au moins un acide nucléique cible est un acide nucléique cible à nombre de copies élevé.
  2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel ledit agent d'exclusion volumique est choisi dans le groupe constitué d'un polyéther, d'un produit de la réaction d'un sucre avec une épichlorhydrine, d'un polysaccharide, et d'un polyacrylate.
  3. Procédé selon la revendication 2 dans lequel ledit agent d'exclusion volumique est un polyéther de formule : H-(O-R)n-H dans laquelle R est un alkylène de 1 à 6 atomes de carbone et n est un entier de 15 à 1000.
  4. Procédé selon la revendication 3 dans lequel ledit agent d'exclusion volumique est un poly(éthylèneglycol) ou poly(propylèneglycol).
  5. Procédé selon la revendication 1 dans lequel ledit agent d'exclusion volumique a une masse moléculaire moyenne d'environ 1000 à environ 20 000 daltons.
  6. Procédé selon la revendication 1 dans lequel ledit agent d'exclusion volumique est présent dans ledit mélange réactionnel en une quantité d'environ 4 à environ 12 % en poids.
  7. Procédé selon la revendication 1 dans lequel au moins un acide nucléique cible est un acide nucléique cible à faible nombre de copies, et au moins un acide nucléique cible est un acide nucléique cible à nombre de copies élevé soupçonné d'être présent à au moins environ 1000 fois la concentration dudit acide nucléique cible à faible nombre de copies.
  8. Procédé selon la revendication 1 dans lequel chaque amorce de chaque jeu d'amorces pour les acides nucléiques cibles à amplifier est présente à la même concentration qui est d'au moins environ 0,025 et inférieure à environ 1 µmolaire.
  9. Procédé selon la revendication 8 dans lequel chaque amorce de chaque jeu d'amorces est présente à une concentration d'environ 0,05 à environ 0,2 µmolaire.
  10. Procédé selon la revendication 7 comprenant en outre au moins 5 cycles d'amplification secondaires, chaque cycle secondaire comprenant la répétition des étapes A) à C) d'une manière successive, et en outre,
       entre les étapes A) et B) de chaque cycle d'amplification secondaire, le mélange réactionnel est refroidi jusqu'à et maintenu à une quatrième température, T4, qui est définie comme suit : (TmH + 5)°C ≤ T4 ≤ TPH où TmH est la température de fusion des amorces pour ledit acide nucléique cible à nombre de copies élevé, et TPH est la température de fusion des doubles brins dudit acide nucléique cible à nombre de copies élevé, pendant environ 15 à environ 120 secondes.
  11. Procédé selon la revendication 1 dans lequel les étapes B) et C) sont les mêmes pour tous les cycles et T2 et T3 sont la même température d'environ 62 à environ 70°C.
  12. Procédé selon la revendication 1 dans lequel une ou les deux amorces spécifiques d'au moins un acide nucléique cible sont biotinylées, et la détection dudit acide nucléique cible amplifié est effectuée par capture du brin biotinylé amplifié résultant en utilisant un oligonucléotide insolubilisé complémentaire de celui-ci, et détection dudit brin biotinylé capturé avec un conjugué de streptavidine marqué d'une manière détectable.
  13. Procédé selon la revendication 12 dans lequel ledit oligonucléotide est immobilisé sur une particule magnétique ou polymérique.
  14. Procédé selon la revendication 1 dans lequel chaque cycle d'amplification primaire est effectué en environ 30 à environ 120 secondes.
  15. Procédé de coamplification de deux ou plusieurs acides nucléiques cibles et de détection d'un ou plusieurs desdits acides nucléiques cibles, ledit procédé comprenant au moins 15 cycles d'amplification primaires, chaque cycle d'amplification primaire comportant les étapes successives de :
    A) chauffage d'un mélange réactionnel de deux ou plusieurs acides nucléiques cibles, ou de leurs produits d'extension d'amorces, à une première température, T1, pour la dénaturation des brins desdits acides nucléiques cibles ou de leurs produits d'extension d'amorces,
    B) amorçage desdits brins dénaturés avec un jeu d'amorces qui sont spécifiques et capables de s'hybrider avec des brins opposés de chaque acide nucléique cible à amplifier, par refroidissement jusqu'à une deuxième température, T2,
    C) soit en tant que continuation de l'étape B) soit dans une étape séparée, formation de produits d'extension d'amorces dans un mélange réactionnel de réactifs de PCR, par incubation à une troisième température, T3, pourvu que lorsque l'amorçage et la formation des produits d'extension d'amorce sont effectués dans la même étape, T2 et T3 soient les mêmes,
       où ledit mélange réactionnel dans au moins un desdits cycles d'amplification primaires comprend au moins environ 4 % en poids d'un agent d'exclusion volumique polymère, non ionique, où au moins un acide nucléique cible est un acide nucléique cible à faible nombre de copies, et au moins un acide nucléique cible est un acide nucléique cible à nombre de copies élevé, et
    D) après le dernier cycle d'amplification primaire, détection d'un ou plusieurs desdits produits d'extension d'amorces en tant qu'indication d'un ou plusieurs desdits acides nucléiques cibles.
  16. Procédé de coamplification de deux ou plusieurs acides nucléiques cibles, dans lequel au moins un acide nucléique cible est un acide nucléique cible à faible nombre de copies, et au moins un acide nucléique cible est un acide nucléique cible à nombre de copies élevé, et dans lequel le procédé utilise une composition de réaction d'amplification tamponnée à un pH d'environ 7,5 à environ 9 et comprenant :
    un ou plusieurs jeux d'amorces,
    une ADN polymérase thermostable,
    une pluralité de dNTP, et
    au moins environ 4 % en poids d'un agent d'exclusion volumique polymère, non ionique.
  17. Procédé selon la revendication 16 dans lequel :
    chaque amorce de chaque jeu d'amorces est présente à la même concentration qui est inférieure à environ 1 µmolaire, et
    ledit agent d'exclusion volumique est choisi dans le groupe constitué d'un polyéther, d'un produit de la réaction d'un sucre avec une épichlorhydrine, d'un polysaccharide, et d'un polyacrylate, a une masse moléculaire moyenne d'environ 1000 à environ 20 000 daltons, et est présent dans ledit mélange réactionnel en une quantité d'environ 4 à environ 12 % en poids.
  18. Procédé de coamplification de deux ou plusieurs acides nucléiques cibles, dans lequel au moins un acide nucléique cible est un acide nucléique cible à faible nombre de copies, et au moins un acide nucléique cible est un acide nucléique cible à nombre de copies élevé, et dans lequel le procédé utilise une trousse d'analyse comprenant, conditionnés individuellement :
    a) une composition de réaction d'amplification tamponnée à un pH d'environ 7,5 à environ 9 et comprenant :
    un ou plusieurs jeux d'amorces,
    une ADN polymérase thermostable,
    une pluralité de dNTP, et
    au moins environ 4 % en poids d'un agent d'exclusion volumique polymère, non ionique, et
    b) un réactif de capture comprenant un oligonucléotide immobilisé sur un substrat insoluble dans l'eau.
  19. Procédé selon la revendication 18 dans lequel :
    chaque amorce de chaque jeu d'amorces est présente à la même concentration qui est inférieure à environ 1 µmolaire,
    ledit agent d'exclusion volumique est choisi dans le groupe constitué d'un polyéther, d'un produit de la réaction d'un sucre avec une épichlorhydrine, d'un polysaccharide, et d'un polyacrylate, a une masse moléculaire moyenne d'environ 1000 à environ 20 000 daltons, et est présent dans ledit mélange réactionnel en une quantité d'environ 4 à environ 12 % en poids, et
    ledit réactif de capture comprend des particules magnétiques ou polymériques.
  20. Procédé de coamplification de deux ou plusieurs acides nucléiques cibles, dans lequel au moins un acide nucléique cible est un acide nucléique cible à faible nombre de copies, et au moins un acide nucléique cible est un acide nucléique cible à nombre de copies élevé, et dans lequel le procédé utilise un dispositif d'analyse autonome comprenant, dans des compartiments séparés :
    a) une composition de réaction d'amplification tamponnée à un pH d'environ 7,5 à environ 9 et comprenant :
    un ou plusieurs jeux d'amorces,
    une ADN polymérase thermostable,
    une pluralité de dNTP, et
    au moins environ 4 % en poids d'un agent d'exclusion volumique polymère, non ionique, et
    b) un réactif de capture comprenant un oligonucléotide immobilisé sur un substrat insoluble dans l'eau,
       lesdits compartiments étant reliés dans ledit dispositif d'analyse de sorte que ladite composition de réaction d'amplification puisse être amenée au contact dudit réactif de capture après amplification sans ouvrir ledit dispositif d'analyse.
EP95306480A 1994-09-15 1995-09-14 Procédé pour la coamplification d'acide nucléique utilisant un agent d'exclusion volumique dans la composition de réaction, trousse d'analyse et dispositif de test Expired - Lifetime EP0702090B1 (fr)

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