JP2001526048A

JP2001526048A - エレクトロスプレー質量分析による核酸同定法

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Publication number: JP2001526048A
Application number: JP2000524468A
Authority: JP
Inventors: イヴォ・グリュンネ・グート; クルト・ベルリン; ハンス・レーラッハ
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1997-12-05
Filing date: 1998-12-04
Publication date: 2001-12-18
Also published as: WO1999029897A1; DE59812184D1; ATE280838T1; EP1038034A1; CA2312945A1; EP1038034B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、核酸分子中のヌクレオチド配列を、異なる質量の予め決められたプローブを使って、エレクトロスプレー質量分析により検出する方法に関する。本発明の方法により、複数の未知の核酸分子を種々のプローブのセットを用いて、同時に特性付けることが可能になる。本発明はまた、プローブ及び／またはプローブ担体、場合によりそこに結合された核酸分子を含むキットに関連する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、核酸分子中のヌクレオチド配列を、異なる質量の予め決められたプ
ローブを使って、エレクトロスプレー質量分析により検出する方法に関する。本
発明の方法により、複数の未知の核酸分子を種々のプローブのセットを用いて、
同時に特性付けることが可能になる。本発明はまた、プローブ及び／またはプロ
ーブ担体、場合によりそこに結合された核酸分子を含むキットに関連する。

【０００２】核酸を正確に特性付けは非常に時間がかかり、高価につくものである。不明な
ＤＮＡを配列決定により特性付けることができる。これがＤＮＡを分析するのに
最も正確な方法である。しかし、ＤＮＡの配列決定は非常に時間がかかり、高価
につくものであり、そして配列全体が重要である場合のみに必要である。非常に
短いＤＮＡ断片(＜1000塩基対)のみが1度の工程で配列決定され得る。1000塩基より長い長さのＤＮＡ断片を、より大きな範囲で分析しなければならない場合、
ＤＮＡを分割することが必要となり、よりこの手法は高くつくことになる。

【０００３】しかしながら、多くの性質付けを、より程度の低い分析によっても行い得る。
現在までに開示された方法は、放射性物質を使用する必要があるかも知れない、
そして、1つの分析にたった1つのプローブしか使えないという不都合があった。
当分野におけるこのような方法には例えば、種々の標的ＤＮＡ配列を用いて、部
分情報を探すことを含む。数千の標的ＤＮＡを含む配列を1つの固相に固定し、続いて全ての標的ＤＮＡを一緒に、1つのプローブ(相補配列を持つ核酸)を用いて特定の配列が存在するかどうかを検索することができる^1,2。プローブと標的ＤＮＡとの一致は、両核酸のハイブリッド形成により証明されることができる。
プローブは種々の長さの、いかなる核酸配列でもあり得る。最小限にしか互いに
重複しないプローブ配列の至適ライブラリーを選択する様々な方法が存在する^3, ⁴ 。プローブ配列はまた、特定の標的ＤＮＡを見つけ出すために目的を持って製造され得る。オリゴフィンガープリント法は、この技術を手始めに用いたもので
ある。標的ＤＮＡライブラリーが、短い核酸プローブにより走査される。ここで
はプローブはたいてい、8〜12塩基の長さでしかない。1度に1つのプローブが、1
枚のナイロン膜に固定された標的ＤＮＡライブラリーにハイブリダイズされる。
プローブは放射活性標識されており、そしてハイブリダイズは放射活性の位置に
より判定される。固定されたＤＮＡ配列の走査にはまた、蛍光標識されたプロー
ブが用いられている⁵。類似の方法が、マルチプレックスＤＮＡ配列決定法でも用いられる^6,7。標的配列のクローン化のため、種々のベクター系が用いられる。各クローン化ベクターから1つのクローンがプールされ、配列決定反応が行われ、断片がゲル上で分けられ、ゲルがナイロン膜上にブロットされる。続いて、
固定されたＤＮＡにクローニング系の種々の配列がハイブリダイズされ、各クロ
ーニング系に対応する配列を得る。ここでもまた、質量分析により検出可能なプ
ローブによりクローニング系の走査を行うことができる。

【０００４】標的ＤＮＡと配列特異的に相互作用することができる、いかなる分子をもプロ
ーブとして用いることができる。最も一般的なのは、オリゴデオキシリボヌクレ
オチドである。この目的のためには、例えば、ペプチド核酸(ＰＮＡ)^9,10、ホス
ホロチオエート核酸、または、メチルホスホネート核酸である核酸のあらゆる修
飾が適当である。プローブの特異性は非常に重要である。構造が硫黄原子により
変えられ、ハイブリダイズ特性にマイナスの影響を及ぼすため、ホスホロチオエ
ート核酸は特に好ましいものではない。これは、ホスホロチオエート核酸が通常
、純粋なジアステレオマーとして合成されないことに由来するかもしれない。過
去には、メチルホスホネート核酸でも同様な純粋性に関る問題が生じたが、これ
らのオリゴヌクレオチドは、だんだん純粋なジアステレオマーとして合成されて
きている。メチルホスホネート核酸とホスホロチオエートとの明らかな違いは、
前者が荷電していない骨格を持つ結果、緩衝塩への依存がより少ないハイブリッ
ド形成が起こり、全体として、より少ない拒絶によって、より高い親和性が導か
れることである。ペプチド核酸もまた荷電していない骨格を持ち、また同時に、
核酸の骨格の慣用な糖-リン酸構造とは化学的に完全に区別される。ＰＮＡの骨格は、通常のＤＮＡの糖-リン酸骨格に代えてアミド配列を持つ。ＰＮＡは相補的なＤＮＡ配列と非常によくハイブリダイズする。ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッド
の融解温度は、対応するＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドよりも高く、そのため緩衝
塩に対するハイブリッド形成の依存性は比較的低い。

【０００５】エレクトロスプレー質量分析(ＥＳＩ)は、生物分子を分析するための新しい、
非常に能率良い方法である(Meng,C.K.,Mann,M.及びFenn,J.B.,Z.Phys.D.,10,361
〜368(1988年)；Siuzdak,G.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,91,11290〜11297(1994
年))。この方法の基本的な特色は、生物分子の混合物溶液が、高電圧(典型的には数キロボルト)をかけた金属性の針を介して、質量分析計のバキュウームへと導かれることである。電気的不安定性及び圧力の減少により液体は、その各表面
が帯電している小さな水滴に分けられる。何段階ものスキマーを通って、水滴は
質量分析計の高真空(high vacuum)へ移される。その際、水滴の溶剤は徐々に失われ、裸の雑多に荷電された生物分子は、断片化されずに質量分析計の高真空で
見つかる。この方法の該工程については、質量分析を含む多くの手段がある。そ
の中には、異なる質量及び荷電の分子の磁石による分離(セクター若しくは四極子)；飛行時間に基づく分析等がある。この際、イオンビームに対して垂直に加速圧力が加えられ、その飛行時間により分子の大きさが決定される。この2つの実施形体により、質量範囲で数千ダルトンまでの同位体分析が可能になる。新し
いナノスプレー源により、数100ｆｍｏｌ材料から抜群のスペクトルが描かれる。これまでのところ、ＥＳＩは主にペプチドの分析について実施されており(Siu
zdak,G.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,91,11290〜11297(1994年))及び、特にコン
ビナトリアル法により合成されたペプチドライブラリーの分析に役立つことが示
された(Metzger,J.W.,Kempter,C.Wiesmuller,K.H.及びJung,G.,Anal.Biochem.,2 19 ,261〜277(1994年)；Winger,B.E.及びCampana,J.E.,Rapid Commun.Mass Spect rom. ,10,1811〜1813(1996年))。核酸及び修飾された核酸の変異体の分析は、現在のところあまり考慮されていない(Reddy,D.M.,Rieger,R.A.,Torres,M.C.及びI
den,C.R.,Anal.Biochem.,220,200〜207(1994年);Potier,N.,Van Dorsselaer,A.,
Cordier,Y.,Roch,O.及びBischoff,R.,Nucleic Acids Res.,22,3895〜3903(1994 年)；Greig,M.及びGriffey,R.H.,Rapid Commun.Mass Spectrom,9,97〜102(1995 年))。そのために、核酸分子がポリアニオンであり、それによりイオン化の際に
その他の問題が起こる等の問題が生じた。

【０００６】コンビナトリアル合成¹³、即ち、前段階の混合物からの物質ライブラリーの製
造は、固相と同様に液相でも行われる。とりわけコンビナトリアル固相合成は、
副生成物からの単離が特に簡単なので、早期に確立された。担体(サポート)に結
合された目的結合体は、洗浄工程でもそのままで、合成の最後に目的とするリン
カーの分解により単離される。この技術により、簡単な方法で1つの固相上に同時に複数種類の結合の合成が可能になり、それにより化学的に「純粋な」物質ラ
イブラリーが得られる^14,15,16。このため、コンビナトリアル法ではなく、慣用
な固相上で合成される合成法による結合の種類も、コンビナトリアルケミストリ
ーで簡単に使用できるので、それに従って広く用いられる。これは特にペプチド
、核酸、及び、ＰＮＡライブラリーに当てはまる。

【０００７】ペプチドの合成は、最初のＮ-保護アミノ酸(例えば、Ｂｏｃ)を担体の結合、続いての脱保護、及び、第2のアミノ酸とフリーになった第1のアミノ酸のＮＨ₂ 基との反応による。反応しなかったアミノ官能基は、合成周期の続いての反応の
「キャッピング」工程により除去される。第2のアミノ酸のアミノ官能基の保護基が除かれ、次の構成単位(building block)を結合することができる。ペプチド
ライブラリーの合成では、アミノ酸の混合物が1または複数の工程で用いられる。ＰＮＡ及びＰＮＡライブラリーの合成も同様である。

【０００８】核酸ライブラリーは、大抵の固相合成により、種々のホスホロアミダイトヌク
レオシドの混合物から得られる。市販のＤＮＡシンセサイザー上で、変更を加え
ることなく合成プロトコルに従って行いうる。さらに、ＰＮＡライブラリーのコ
ンビナトリアル合成につての種々の研究が報告された^17,18。これらの報告は、コンビナトリアル配列の構築、即ち、配列中の個々の特異的塩基が、変性された
塩基により置換され、それにより偶然の配列変異体が得られるＰＮＡ群の合成に
ついて扱っている。コンビナトリアルライブラリーの質量分析法による分析も、
度々、説明されてきた^19,20,21,22。

【０００９】ＤＮＡを修飾するための種々の方法が存在する。最も有名な方法は、ビオチン
が官能基として付加されたＤＮＡの、ストレプトアビジンで被覆された表面への
結合である²³。この系の結合強度は、共有化学結合ではないにも係わらず、その
強度に相当する。標的ＤＮＡを、化学的に前処理した表面に共有結合させるため
には、標的ＤＮＡの適当な官能性が必要とされる。ＤＮＡ自身は、それに適した
官能基を有していない。標的ＤＮＡに適当な官能基を導入するための種々の変異
体が存在する：2つの簡単に取り扱うことができる官能基は、一級脂肪属アミン及びチオールである。このようなアミンは定量的に、Ｎ-ヒドロキシ-スクシンイ
ミドと反応する。チオールは、適当な条件下で定量的にアルキルヨードと反応す
る。ＤＮＡへのそのような官能基の導入で、1つ困難が生じる。1つの難点は、そ
のような官能基のＤＮＡ中への導入である。最も簡単な方法は、ＰＣＲのプライ
マーにより導入する。該方法は、5'-修飾されたプライマー(ＮＨ₂及びＳＨ)、並
びに、2機能性のリンカーを用いている^24,25,26。

【００１０】或る表面上での固定では、その性質的が何より根本的に重要である。現在まで
開示された系は、主に珪素または金属(磁石ビーズ)から成る。その他の標的ＤＮ
Ａの結合方法は、表面に固定されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる
ための標的ＤＮＡ中の短い認識配列(例えば、20塩基)の使用を基礎とする²⁷。ま
た、標的ＤＮＡへの化学的に活性化された位置導入のための酵素的方法も報告さ
れた²⁸。この場合、標的ＤＮＡに酵素的に、5'-ＮＨ₂-官能化が行われる。

【００１１】前述のように、この技術については、何よりもその核酸の正確な分析に方向を
定めた一連の方法が公知である。これらの方法は、決まって時間がかかるか、及
び／または、高価につくものである。

【００１２】本発明の根底にある技術的な問題は、迅速で、費用に対し最も効率の良い標的
核酸の同定方法を提供することであった。

【００１３】この技術的な問題は、請求の範囲に記載される実施態様により解決される。

【００１４】従って、本発明は、以下の(ａ)〜(ｅ)の工程を含む、核酸分子中のヌクレオチ
ド配列を検出する方法に関する： (ａ)各プローブが他の全てのプローブと異なる質量を有する、種々の塩基配列のプローブセットに核酸分子をハイブリダイズさせ、； (ｂ)ハイブリダイズしなかったプローブを分離し； (ｃ)特異的にハイブリダイズしたプローブを溶媒中で脱離させ； (ｄ)溶液中のハイブリダイズしたプローブをエレクトロスプレー質量分析により分析し；そして、 (ｅ)それにハイブリダイズしたプローブにより核酸分子を決定する。

【００１５】核酸分子は、好ましくは担体(サポート)に固定される。この場合、プローブ担
体上のプローブの位置が、それにハイブリダイズされる核酸分子の配置を促すこ
とが好ましい。本発明で使用される「プローブ担体」は、いかなる形体の担体材
料をも指す。

【００１６】本発明の方法(図１参照)は、標的核酸の分析法(オリゴフィンガープリント法)
、並びに、核酸及び修飾された核酸の質量分析を有利な方法で組合せている。そ
れにより、多数の種々のプローブが用いられ、それにより1つの核酸分子中の、1
以上のヌクレオチド配列(群)の検出が可能になる。プローブの質量の差によって
その配列に関して明解な結合表を得ることができず、そして、核酸の質量分析の
感度ではオリゴフィンガープリント実験のプローブ量に適していなかったので、
この2つの方法を組み合わせて行うことはこれまでできなかった。本発明の最も広い意味で、ある特定のプローブ(または多数の特定のプローブ群)のハイブリダ
イズにより、(本質的に)相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子が決定される
。この決定により、特異的なヌクレオチド配列または非常に類似の配列(例えば、ストリンジェントではない条件下でのハイブリッド形成の場合、下記参照)が分子中に含まれるかどうかを検定することができる。例えストリンジェントな条
件下であれ、プローブのハイブリッド形成はいわゆる「ミスマッチ」にも係わら
ず起こるので(例えば、プローブ中のある一定の最小の長さ、または、ハイブリッド形成の間許容され得るミスマッチの配置から)、ハイブリッド形成手法によりヌクレオチド配列を正確に決定することが常に可能なわけではないことが当業
者には理解される。プローブの或る種のヌクレオチド配列によっては、核酸分子
中の相補配列は、いくらかの部分は、実施態様のある種の推定によってしか決定
することができないが、完全に相補的な配列の他に、その配列が完全に相補的で
ない配列も決定できる。従って、90％よりも高い相同性、好ましくは95％よりも
高い相同性の程度を示す相同なヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列は含む。
本発明は上述の全ての態様を含む。

【００１７】どのハイブリダイズ条件が選択されるかによって、本発明の方法は特異的なヌ
クレオチド配列、または、類似の配列を有するヌクレオチド配列群を検出するの
に使われ得る。例えば、ストリンジェントなハイブリダイズ条件が選択されれば
、用いられるプローブはその塩基配列と完全に相補的なヌクレオチド配列とのみ
しかハイブリダイズすることができない。しかしながら、もしストリンジェント
でないハイブリダイズ条件が選択されると、用いられるプローブは選択された条
件下でのハイブリッド形成が可能な、その塩基配列とは異なるヌクレオチド配列
全てを検出することができる。この方法により、本発明の方法はまた、相同体(h
omologue)、変異体(variant)、対立遺伝子、または、特異的配列を検出するのに
用いることができる。ストリンジェントな、そして、ストリンジェントでない条
件がどういうものであるか、当業者には公知である(例えば、Sambrookら、『A L
aboratory Manual』第2版、CSH Press, Cold Spring Harbor(1989年)；Hames及びHiggins編『Nucleic Acid Hybridaization, A Practical Approach』IRL Pres
s, Oxford(1985年))。ストリンジェントなハイブリダイズ条件とは、例えば、6 ×ＳＳＣ、5×Denahardt試薬、0.5％ＳＤＳ及び100μｇ／ｍｌ変性ＤＮＡ中、65
℃でのハイブリッド形成、そして、0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ中、65℃での洗浄
である。ストリンジェントでないハイブリッド形成条件は、上述の条件と例えば
、ハイブリッド形成並びに洗浄が、例えば50℃若しくは55℃のより低い温度、及
び／または、ＳＳＣの総量が、例えば1×若しくは2×ＳＳＣに増加されて行われ
る。

【００１８】本発明の方法はまた、1つの標的ＤＮＡ中のいくつかの異なる配列の検出を可能にし、ここで異なる配列は異なるプローブに対して相補的であり得る。最も好
ましいのは、例えば、重複する配列を持つプローブを用いた場合、標的配列の全
ヌクレオチド配列が検出または解明され得る。

【００１９】本発明の方法ではまず最初に、選択された条件下でプローブにハイブリダイズ
することができる配列を提示する標的核酸が、固定化担体に固定されているかが
決定される。この場合、試料中の核酸はさらに分析され、特徴付けられる。本発
明の方法のように、通常、試料のうちごくわずかな割合しか本発明の分析では必
要とされないので、用いられなかった核酸をさらに、例えば配列決定法等の標準
的な方法により分析し得る。

【００２０】溶媒中での特異的にハイブリダイズされたプローブの除去は、温度による変性
、または、アルカリ変性の手法により好ましくは行われる。特に、水溶液、また
は、有機溶媒が水と混合できるものであれば、水及び有機溶媒の混合物(例えば、水及びアセトニトリル)が好ましい溶媒である。好ましくは混合物は、1:1の比
で用いられる。ハイブリダイズされた分子の変性が目的であるので、混合物の選
択はハイブリダイズされた分子の種類に依存する。

【００２１】本発明はまた、何回か、同時にまたは連続的に、様々なハイブリッド形成条件
で行い得る。この方法では、例えば、まず最初に標的ＤＮＡが他の標的ＤＮＡと
一定の相同性を有するかどうかを、特異的な配列を探す前に見つけ出すことが可
能である。

【００２２】プローブ担体の特定の位置にハイブリダイズしたプローブの、固定されたプロ
ーブに対する配置は、好ましくは、プローブ担体の位置で記録されたスペクトル
を正確に同じ場所に位置する標的ＤＮＡに対して配置するデータ処理システムを
手段として行われる。好ましくは、標的核酸は一定の順序で、タンパク質担体の
表面に配置されている。

【００２３】本発明の好ましい態様では、工程(ａ)の前、または、後で核酸分子は担体の表
面へ移される。このためには、例えば、対応する官能基を付加された標的ＤＮＡ
がそれに結合できるように官能化された「磁気ビーズ」、または、例えばその異
なるウェルに種々の標的ＤＮＡが固定され得るマイクロタイタープレートの官能
基化を用いることができる。この方法により、プローブライブラリーを含むハイ
ブリッド形成工程及び、それに続く洗浄工程が単純化され得る。ビオチン−スト
レプトアビジン、ＮＨ₂−Ｎ-スクシンイミジルエステル、または、ＳＨ−ハロゲ
ン化アルキルが用いられ得る。

【００２４】別の好ましい態様においては、ＮＨ₂-、エポキシ-若しくはＳＨ-官能基により
、プローブ担体の表面を珪酸塩若しくはシランによる被覆を使ったタンパク質- 基質、タンパク質-タンパク質若しくはタンパク質-核酸相互作用により、または
、2つの疎水性構成単位の相互作用によって核酸分子のプローブ担体表面への固定は行われる。

【００２５】プローブ担体が金で被覆されていれば、標的ＤＮＡの分子生物学的製造の間に
導入されたＳＨ-若しくはＮＨ₂-官能基より、標的ＤＮＡのカップリングは行われ得る。対応して修飾されたＤＮＡを官能化された金粒子に結合させるという逆
の可能性もまたある。例えば、Nanoprobes Inc.(Stony Brook, NY)は、ストレプ
トアビジン若しくはアミノ官能基が結合された金-ナノ粒子を販売している。アミノ官能基の付加により、続いての標的ＤＮＡのガラス表面への結合が達成され
る。標的ＤＮＡは、二官能性のリンカー(例えば、ＳＩＡＢ(Pierce Chemical,Ro
ckford,IL,USA))にＳＨ-官能基を介して結合されている。別の方法は、表面を直
接、トリメトキシ-３-アミノプロピルシランで被覆することである。それにより
、標的ＤＮＡはアミノ官能基に、上述の二官能性リンカーを介して結合され得る
。

【００２６】特に好ましい態様において、タンパク質-基質相互作用は、ビオチン-ストレプ
トアビジン、または、抗体-抗原結合である。多くのプローブ担体は一般的に、修飾を加えずには、タンパク質もＤＮＡ分子も固定化され得ない材料からできて
いる。固定化する1つの方法は、表面を金で被覆し、例えばＳＨ-官能基がそれと
結合できるようにすることである。結合のため、ＳＨ-官能基、及び、標的ＤＮＡの官能化に適した別の官能基を持つ二官能性リンカーを用いることができる。
例えば、標的ＤＮＡがビオチンで官能化されていれば、リンカーはストレプトア
ビジンで結合することができるはずである。もし、標的ＤＮＡがＮＨ₂-官能化さ
れていれば、リンカーはＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステル官能基を持ち得る。

【００２７】その他の特に好ましい態様では、タンパク質-核酸相互作用は配列非特異的に一本鎖ＤＮＡを結合するタンパク質であるＧｅｎｅ３２への核酸の結合である。

【００２８】本発明の方法の別の好ましい態様では、用いられるプローブは、質量タグ(mas
s tag)を持つ核酸である。この態様によると、プローブはさらに、例えば5'また
は3'末端で、種々の場所に位置する複数のタグを有し得る。質量タグの数と位置
の組合せ、及び、場合により荷電タグ(charge tag)との組合せにより、本発明の
用途及び感度はかなり増加され得る。

【００２９】特に好ましい態様では、質量タグは同時に荷電タグであり、別の特に好ましい
態様では、核酸は付加的に荷電タグを有する(例えば、図２)。

【００３０】荷電タグの付加は、Ｇｕｔら^11,12の方法により行われ得る。アミノ官能化された基質(1ｍＭ)が、氷上のトリエチルアミン／ＣＯ₂緩衝液(ｐＨ＝8.5、200ｍＭ)に0℃で、ω-トリメチルアンモニウムヘキサン酸-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(ＣＴ)と共に添加される。30分後、揮発性の緩衝液及び溶媒がバ
キューム中で除去される。アミノ官能化された基質は、例えば、質量が異なるコ
ンビナトリアル法により製造されたプローブのライブラリーで有り得る。長さの
違い、及び、ＣＴによる官能基付加により、基質ライブラリーの質量は定義され
た値だけ変異され得る(図２)。コンビナトリアル合成の場合のように、200Ｄａの範囲で質量が異なる64個のプローブを含むプローブライブラリーが製造され得
、質量／荷電タグは各200Ｄａの単位で質量を増加させ、即ち、最初のコンビナトリアル合成生成物は可能な限り小さい荷電タグで生成され、第2のものは質量が200Ｄａ多い質量／荷電タグで、第3の質量／荷電タグはさらに200Ｄａ多い、等々。理論的には、この範囲は任意に、用いる質量分析計が、隣り合った質量の
2つのプローブの間を分析できる限り、そして、実際にその合成が可能な限り延長され得る。10塩基のプローブからは、2600〜2800Ｄａの範囲の塩基質量が得ら
れる。現在、購入可能な質量分析計で、十分な質量精度を持つ有効な質量範囲は
、4000Ｄａ以下である。従って、64プローブの7集団を用いうる(全部で448プローブ)。

【００３１】自動合成装置におけるペプチドの合成は、Ｃ-末端からＮ-末端へ、核酸の合成
は3'から5'末端へ向かって進められる。1または2個の官能基により、質量をシフ
トさせることを目的として、一方または両末端に一次アミノ官能基を結合するこ
とができる。代りに、コンビナトリアル法により製造されたプローブライブラリ
ーの質量はまた、一定の質量の構成単位(例えば、ＰＮＡのコンビナトリアル合成におけるアミノ酸)をいくつか、コンビナトリアル構成単位を導入する前に導入することにより修飾し得る。コンビナトリアル合成はまず、直接担体上で始ま
る。コンビナトリアル合成の第2工程ではまず、例えば2個のバリンが結合される
。バリンは99Ｄａの質量を有する。第2のコンビナトリアル合成の質量は、2個の
バリンにより最初のもの比べ198Ｄａ変えられている。第3のコンビナトリアル合
成ではまず、4個のバリンが結合され、その結果、この集団の質量は最初のものよりも396Ｄａ高い、等々。荷電タグが必要な場合、上述の方法により後からＮ-
末端に付加され得る。また、荷電タグを最初に固相に結合し、その後、コンビナ
トリアル合成を続けることも可能である(例えば、図３参照)。

【００３２】別の方法としては、同じ極性のいくつかの一定の荷電を同時に結合することで
ある。これにより、検出範囲を縮小することができる。質量分析計では、2つの荷電と、相当する半分の質量の分子が観察される。これは、質量分析計の精度が
より高い質量に対してひどく減少する場合、有利である。陽性荷電をしっかりと
プローブに結合させる方法は公知である。陰性の荷電も類似の長所を持つかも知
れない。陽性及び陰性の荷電は、類似した方法により製造され得る。

【００３３】局在については、荷電タグの量及び組合せ、質量タグに関して述べたことが有
効である。従って、分析の感度は、ライブラリーの5'または3'末端における荷電
タグの付加により改善され得る。これは、さもなければランダム化されていない
位置へのアルキルホスホネート基の導入により中性電荷が生ずる場合、特に当て
はまる(下記参照)。さらに、荷電タグの付加と必然的に関連している質量タグの
付加により、ホスホロチオエート基における切断により生じる断片の分析が、容
易になる。特定の位置での好ましい切断を達成するために、ホスホロセレノエー
トを用いることも可能である。

【００３４】本発明の別の好ましい態様では、プローブは修飾された核酸分子である。

【００３５】特に好ましい態様では、これらの修飾された核酸分子は、ＰＮＡ、アルキル化
ホスホロチオエート核酸、または、アルキルホスホネート核酸である。

【００３６】別の好ましい態様では、本発明のプローブは、コンビナトリアル固相合成によ
り製造される。これは、例えば、ＰＮＡ純物質の合成にも商業的に利用されてい
る、一般的に使用されるＢｏｃ固相合成により行われ得る。この場合、アデニン
、グアニン、シトシン若しくはチミンの塩基、4つとも全て、または、そのうちの1つより多くが、これらが導入されない場合には確定したプローブＤＮＡ配列中の選択された位置で隣り合わせで導入される。これは、固相合成の1工程において、1つでなく複数の合成構成単位を用いることにより起こる。これらの位置をいくつか変えることにより、ＰＮＡライブラリーが構築される。ＰＮＡ合成の
後、遊離の末端アミノ官能基において荷電タグの付加が行われ得る。これにより
、ＥＳＩによるＰＮＡ分析の動力範囲が改善される。

【００３７】従って、好ましい態様では、固相合成における種々の構成単位は、その質量、
または、それらから合成されたプローブの質量が質量分析により区別できるよう
に標識されている。この標識化は、塩基に対応するよう、その骨格に異なる質量
修飾を導入することにより達成される。この方法により、合成されたプローブは
、その配列に特異的な質量を得る。もし、プローブが固定化された標的ＤＮＡに
特異的に結合すれば、質量分析実験により得られる質量についての情報は、それ
ぞれのハイブリダイズしたプローブの配列に関する結論を引き出すことを可能に
する。

【００３８】本発明の方法の別の特に好ましい態様では、構成単位は、メチル、エチル、プ
ロピル、分枝状若しくは直鎖状アルキル、ハロゲン置換された分枝状若しくは直
鎖状アルキルまたはアロキシアルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、
アルコキシ、または、アリロキシアルキル基、または、それらのうちの1つの重水素化若しくは同位体変異体で標識されている。もしその質量が修飾されていな
い構成単位が使用された場合、分子質量からは塩基の組成に関して決論を引き出
すことができるだけで、その配列については決論を引き出すことができないので
、ＰＮＡライブラリー中のいかなるランダムな位置でも特徴的である質量-標識化構成単位(即ち、骨格が置換されたＰＮＡモノマー)が用いられる。この方法で
は、特異的な塩基の合成構成単位は、位置Ｘと位置Ｙとで異なる質量を持つので
、分子質量により塩基の同じ全体組成物で配列の異なるものを区別することが可
能になる。それぞれの置換基は、記載のライブラリー合成方法に基づきいずれか
の可能な配列に、決定された質量が明確に対応するよう数値により選択される。

【００３９】核酸プローブライブラリーの合成は合成機により、種々のヌクレオシド(通常、ホスホロアミダイト)の混合物をランダム化する位置に挿入することにより行われる。それにより得られるライブラリーはまた、上述の方法においてプローブ
としても用い得る。ライブラリー中の異なる配列を区別するために、ランダム化
された位置での一定の部位にあるホスホジエステル結合の特異的な結合の切断が
行われる。

【００４０】従って、本発明の方法の別の好ましい態様では、プローブは、プローブの切断
を可能にする少なくとも1つの修飾を、ランダム化されるヌクレオチドとは離れた一定の部位に有する。

【００４１】特に好ましい態様では、この修飾はホスホロチオエート基、及び／または、Ｒ
ＮＡ塩基、及び／または、ホスホジエステル結合の導入である。

【００４２】プローブが3つのランダム化された位置を含む場合、そのような結合を切断できる部分が少なくとも2つ必要とされる(図６)。結果として、それぞれ1個のラン
ダム化された配列を含む3つの断片が得られ、知られている組成を根拠に、その質量から直接、変更可能な塩基に関する直接的な結論を得ることができる。記載
の結合の切断は不完全であってもよい。これにより、より大きい断片の導入が可
能になり、配列情報を確実にし、または、あいまいな部分を具体化することがで
きる。ランダム化位置における特異的な結合の切断は、ライブラリーの合成時に
ホスホロチオエートを導入することにより達成される。これらはまずハロゲン化
ヒドロキシアルキルによりヒドロキシアルキル化され、そしてアルカリ条件下で
選択的に切断され得る。代りに、ランダム化された位置の横にウラシルが挿入さ
れるように試料をセットすることもできる。その後、ウラシルＤＮＡグリコシラ
ーゼに続いて、アルカリ処理することにより、同じ位置で骨格を壊すことができ
る。

【００４３】特定の位置における一定の成分による質量タグの付加の上述の原理は、種々の
部分ライブラリーに用いることができ、その後、それらをより大きなライブラリ
ーとしてまとめることができる。

【００４４】そのため、別の好ましい態様では、プローブは異なる質量、及び／または、荷
電タグを持つ部分ライブラリーとして製造される。部分ライブラリーをまた、合
成時に質量標識化することが必要であり、それにより特異的に分析された質量か
ら特定の部分ライブラリーに関する結論を得ることができる。これは固相合成で
ＰＮＡライブラリーに結合するのが簡単な天然アミノ酸に適切に行われる。種々
の部分ライブラリーを質量標識化することにより、全体のライブラリーの分析に
自由に用いることができる質量の範囲が相当拡大される。

【００４５】さらに、本発明は、プローブ、及び／または、場合により核酸分子が結合され
た固定化用の系の一部(プローブ担体)を含むキットに関する。(被覆された)「磁
気ビーズ」または、(被覆された)マイクロタイタープレートは、適当な固定化用
の系である。前述のように、固定化用の系の表面は前処理され、それにより核酸
が結合することができる。好ましくは、この前処理は化学的な方法により行われ
る。

【００４６】本出願中に記載の多数の文献は、本明細書の一部を構成する。

【００４７】図面は以下のことを表す。図１質量分析走査によるフィンガープリントの概略。１．その質量により区別され得るコンビナトリアルに製造されたプローブライブ
ラリー。２．ライブラリーを固定化標的ＤＮＡにハイブリダイズ。徹底的に洗浄した後( 非特異的に結合されたプローブを取り除くため)、正しくハイブリダイズされたプローブを標的ＤＮＡより分離。３．この溶液のエレクトロスプレー質量分析による分析。標的ＤＮＡの部分的配
列は、配列への質量の明確な関係付けにより決定される。図２Ｎ-末端への質量／荷電タグの付加。荷電タグを、核酸の5'、核酸の修飾体、または、ＰＮＡのＮ-末端に導入し得る。荷電タグはＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステル官能基を有し、第4級アン
モニウム基を有する。これらの2つの官能基は、Ｒ₁基により離されている。Ｒ₁ は荷電タグの質量を多様にするのに用いられる(荷電タグの結合は、弱アルカリｐＨ(8.5)の氷上の水溶液中で行われる。反応は30分以内に完了する)。図３並行して行われる質量標識化合成の方法、及び、質量標識化構成単位Ｌ(ランダム化位置)を用いたＰＮＡライブラリー合成の原理。それぞれ異なる置換基を有する種々の塩基が、(質量タグとして)骨格のランダム化された位置で用いられ
る。各ＰＮＡ分子の質量は、配列に明確に関係付けられる。図４ＰＮＡライブラリーの質量スペクトルの計算値。それぞれ32個の異なる配列を用いた2つの異なる固相合成(一方は質量標識化さ
れている)により、64の異なる質量ピークが生じ、各々が4つの塩基(Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴが挿入される)から成る、3つの可変位置を持つＰＮＡライブラリーの特異
的配列に関係付けられる。計算は、表１に記載の置換基に基づいて行われる。計
算にはコンピュータープログラムＭＡＳＰ(著作権、Dr.Christoph Steinbeck)を
用いた。図５質量により区別できるＰＮＡライブラリーの合成に用いられるように、コンビ
ナトリアルＢｏｃ固相合成に用い得るＰＮＡ合成構成単位。表１に記載の成分を
示す。図６特異的な結合切断によるプローブの配列解析。ＤＮＡプローブライブラリーの異なる配列はまた、ランダム化された位置(Ｎ＝Ａ,Ｇ,ＣまたはＴ)における特異的な結合の切断によって、質量分析により同定され得る。ＤＮＡが、特異的に切断され得る(例えば、ヨウ化エタノールにより)ホスホロチオエート官能基が固相合成の間に挿入される。これが、断片の正確な化学的性質を考慮せずに、概略的に示される。配列のほとんどの部分が知ら
れているので、徹底的な配列解析を行うことなく、断片の質量により全体配列を
決定することができる。置換基Ｒ₁は、いかなる可能な追加のＤＮＡ配列を表し、Ｒ₂は別の可能な配列、または、Ｈを表す。Ｒ₃は−ＯＨ(ホスホジエステル)ま
たはアルキル−(アルキルホスホネート)を表す。

【００４８】実施例により本発明が説明される。

【００４９】実施例１：本発明の全方法の態様についての説明表面への結合が可能なように官能基を持つ標的ＤＮＡを製造する。標的ＤＮＡ
はＰＣＲにより製造し、該ＰＣＲではビオチンが官能基として結合されたプライ
マーを用いる。固定化のため、表面はストレプトアビジンで被覆する。質量によ
って区別され得るプローブのライブラリーを、上述の方法により標的ＤＮＡにハ
イブリダイズする。プローブライブラリー中の相補的な構成単位を、対応する標
的ＤＮＡに結合する。その後、それらを非特異的に結合されたプローブを取り除
くため良く洗浄する。熱変性により標的ＤＮＡから特異的プローブを分離する。
溶液をエレクトロスプレー質量分析計で分析する。見つけられた質量、及び、プ
ローブの質量が区別できるという事実から、標的ＤＮＡ中の部分的配列について
の判定が行われ得る。

【００５０】実施例２：ビオチン−ストレプトアビジン架橋により固定化された標的ＤＮＡの分析ビオチン官能基により標的ＤＮＡをストレプトアビジンで被覆された磁気ビー
ズに結合する。質量により区別できるプローブライブラリーを標的ＤＮＡにハイ
ブリダイズする。非特異的にハイブリダイズしたものを洗浄により除く。水溶液
中で加熱することにより、特異的ハイブリダイズしたプローブを切り離す。水溶
液をエレクトロスプレー質量分析計で分析する。見つけられた質量、及び、プロ
ーブの質量が区別できるという事実から、標的ＤＮＡ中の部分的配列についての
判定が行われ得る。

【００５１】実施例３：標的ＤＮＡの固定好ましい本発明の方法の態様では、標的ＤＮＡをエポキシ官能基化アクリルポ
リマーからなるビーズに結合する。その後、反応しなかったエポキシ官能基を過
剰のアミンにより不活性化する。実施例を実施例２に記載のように続ける。

【００５２】実施例４：マイクロタイタープレート中の種々の標的ＤＮＡの分析マイクロタイタープレート９６または３８４の各ウェルに、異なるビオチン官
能基化標的ＤＮＡを固定する。各ウェルにおいて、質量により区別可能なプロー
ブライブラリーへのハイブリダイズを行う。非特異的に結合したハイブリッド形
成を除くために、プレートを洗浄する。各ウェル中で特異的ハイブリッド形成を
、水溶液中で加熱することにより外す。見つけられた質量、及び、プローブの質
量が区別できるという事実から、標的ＤＮＡ中の部分的配列についての判定が行
われ得る。

【００５３】実施例５： 64個の異なる配列を有するＰＮＡライブラリーの合成質量と配列との間が明確に関係しているＰＮＡライブラリーを、図４及び表１
に示す。ＰＮＡはその他の点ではランダムでもよいが、3つの位置がコンビナトリアル固相合成で多様化されるべきである。4つの異なる塩基を用いると、これは64種の結合が可能である。本例においては、表１に挙げられる構成単位を用い
て2つの別々の合成を行う。第2合成では、2個のバリン単位を加えることにより、付加的に質量標識化する。各合成により32個の化合物が得られ、それらは、そ
の質量により区別することができる。どちらの部分ライブラリーも、1つのライブラリーが、各々が特異的な質量の64個の異なる配列を含む単位にすることがで
きる。64個のピークは重複せず、3つのランダム化された塩基位置を持つＰＮＡライブラリーからの特異的配列に各ピークは対応する。

【００５４】実施例６： 448プローブを含むプローブライブラリーの構築後述の実施例に記載の方法に従って7通りの合成を行い、続いて、質量／荷電タグを結合する。質量範囲１．64プローブ：荷電タグ-TCP₁GAP₂GAP₃G 2600〜2800Ｄａ２．64プローブ：荷電タグ+200Ｄａ質量タグ-TCP₁AGP₂GAP₃G 2800〜3000Ｄａ３．64プローブ：荷電タグ+400Ｄａ質量タグ-TCP₁AGP₂AGP₃G 3000〜3200Ｄａ４．64プローブ：荷電タグ+600Ｄａ質量タグ-TCP₁AAP₂AGP₃G 3200〜3400Ｄａ５．64プローブ：荷電タグ+800Ｄａ質量タグ-TCP₁AAP₂GAP₃G 3400〜3600Ｄａ６．64プローブ：荷電タグ+1000Ｄａ質量タグ-TCP₁GAP₂GAP₃G 3600〜3800Ｄａ７．64プローブ：荷電タグ+1200Ｄａ質量タグ-TCP₁GAP₂AGP₃G 3800〜4000Ｄａ上述の合成セットの6番目及び7番目の合成は内部コントロールである。代りに
次の合成をまた行うことができる。６．64プローブ：荷電タグ+1000Ｄａ質量タグ-TCP₁GGP₂GAP₃G 3600〜3800Ｄａ

【００５５】実施例７：マイクロタイタープレートのタンパク質による被覆マイクロタイタープレートの表面を、非特異的に一本鎖ＤＮＡと結合するタン
パク質であるＧｅｎｅ３２で被覆する。表面をこのタンパク質で被覆した後、そ
の上に標的ＤＮＡ配列を載せる。標的ＤＮＡ配列がｃＤＮＡから成る場合、これ
らをオリゴ-ｄＴ(例えば、ｄＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ)を用いたＰＣＲで付加した。オリゴ-ｄＴはＧｅｎｅ３２と強く相互作用する。オリゴ-ｄＴのＧｅｎ
ｅ３２への共有結合は、短波ＵＶ光を用いた光結合により達成され得る。この固
定化の後、上述の方法による標的ＤＮＡを分析するのにプローブライブラリーを
使用し得る。配列特異的タンパク質／ＤＮＡ相互作用を用いることもできる(例えば、ＧＣＮ４／ＡＰ１)。

【００５６】実施例８：エポキシ官能基化された固相における標的ＤＮＡの固定 10ｍｇの担体(Eupergit C250 L,Roehm Pharma Polymer)を1ｍｌの固定化緩衝液(1ＭＫ₂ＨＰＯ₄／ＫＨ₂ＰＯ₄,ｐＨ7.5)に懸濁する。固定化する標的ＤＮＡを
1.5ｎｍｏｌ添加し、ゆっくり攪拌しながら室温で、24時間インキュベートする。上清を除き、反応しなかったエポキシ官能基を、1Ｍグリシン溶液を用い、室温で24時間処理することにより不活性化する。上清を取り除き、担体を何度か洗
浄する。この方法により、固定化ＤＮＡを−20℃で、より長い時間保存すること
ができる。

【００５７】実施例９：「荷電タグ付加」ＰＮＡによる選択的ハイブリッド形成固定化標的ＤＮＡを「荷電タグ付加」ＰＮＡプローブライブラリー(20μｌ／8
ｐｍｏｌ固定化ＤＮＡ中に80ｐｍｏｌ)と共に、ハイブリッド形成緩衝液(10ｍＭ
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ,5ｍＭＮＨ₄Ｃｌ,15％ホルムアミド)中65℃で、15分間インキュベートし、その後、ハイブリダイズしなかったプローブをハイブリッド形成
緩衝液で3回洗浄することにより除去する。その後、40％アセトニトリル、80℃ で脱ハイブリッド形成を行う。この溶液の一部を凍結乾燥し、水に入れ、ＥＳＩ
質量分析計で分析する。

【００５８】

【表１】明確な質量／配列の質量標識ライブラリーを製造するためのＰＮＡサブ
ユニットに結合された置換基 * 第2合成、2個のバリン単位により質量標識化。図５は対応する合成構成単位
を表す。

【００５９】

【表２】

【表３】

【表４】

【図面の簡単な説明】

【図１】質量分析走査によるフィンガープリントの概略。

【図２】Ｎ-末端への質量／荷電タグの付加。

【図３】ＰＮＡライブラリー合成の原理。

【図４】ＰＮＡライブラリーの質量スペクトルの計算値。

【図５】質量により区別できるＰＮＡライブラリーの合成に用いられるよ
うに、コンビナトリアルＢｏｃ固相合成に用い得るＰＮＡ合成構成単位。

【図６】特異的な結合切断によるプローブの配列解析。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (71)出願人Ｂｅｒｌｉｎ，ＢＲＤ (72)発明者ハンス・レーラッハドイツ連邦共和国デー−14195ベルリン、リュッツェルシュタイナーヴェーク50番Ｆターム(参考） 2G045 AA35 BB14 BB46 BB50 BB51 FB02 FB03 FB07 GC30 4B024 AA11 CA01 CA09 CA11 HA12 HA13 HA19 4B063 QA01 QA13 QQ42 QR32 QR41 QR48 QR55 QR56 QR82 QS34 QX04 QX10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸分子中のヌクレオチド配列を検出する、以下の工程を含
む方法： (ａ)各プローブが他の全てのプローブと異なる質量を有する、種々の塩基配列のプローブセットに核酸分子をハイブリダイズさせ、； (ｂ)ハイブリダイズしなかったプローブを分離し； (ｃ)特異的にハイブリダイズしたプローブを溶媒中で脱離させ； (ｄ)溶液中のハイブリダイズしたプローブをエレクトロスプレー質量分析により分析し；そして、 (ｅ)それにハイブリダイズしたプローブにより核酸分子を決定する。
【請求項２】工程(ａ)の前または後で、核酸分子が担体の表面に固定され
る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】核酸分子の表面への固定がＮＨ₂、エポキシ、若しくは、ＳＨ官能基により、プローブ担体表面のシリカ若しくはシランの被覆を介して、タ
ンパク質-基質、タンパク質-タンパク質若しくはタンパク質-核酸相互作用、または、2つの疎水性物質の相互作用によって行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】タンパク質-基質相互作用がビオチン-ストレプトアビジン結
合、または、抗体-抗原結合である請求項３に記載の方法。
【請求項５】タンパク質-核酸相互作用がＧｅｎｅ３２-核酸結合である、
請求項３に記載の方法。
【請求項６】プローブが質量タグが付加された核酸である、請求項１〜５
に記載の方法。
【請求項７】質量タグが同時に荷電タグである請求項６に記載の方法。
【請求項８】核酸にさらに荷電タグが付加されている、請求項６に記載の
方法。
【請求項９】プローブが修飾された核酸分子である、請求項１〜８に記載
の方法。
【請求項１０】修飾された核酸分子が、ＰＮＡ、アルキル化ホスホロチオ
エート核酸、または、アルキルホスホネート核酸である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】プローブがコンビナトリアル固相合成により製造される、
請求項１〜１０に記載の方法。
【請求項１２】種々の塩基構成単位が、それより合成されたプローブがそ
の質量によって質量分析計により区別できるように標識化されている、請求項１
１に記載の方法。
【請求項１３】標識が、メチル、エチル、プロピル、分枝状若しくは直鎖
状アルキル、ハロゲン置換された分枝状若しくは直鎖状アルキル、アルコキシア
ルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、アルコキシアリール、若しくは
、アリールオキシアルキル基、または、その重水素化された若しくは他の同位体
変異体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】プローブが、ランダム化された核酸から離れた規定された
位置に少なくとも1つの改変を有し、それによりプローブの開裂が可能になる、請求項１０〜１３に記載の方法。
【請求項１５】改変が、ホスホロチオエート基、及び／または、ＲＮＡ塩
基、及び／または、リン酸トリエステル結合のプローブ内への導入である、請求
項１４に記載の方法。
【請求項１６】プローブが異なる質量、及び／または、異なる荷電タグが
付加された部分ライブラリーとして製造される、請求項１〜１５に記載の方法。
【請求項１７】プローブ担体上のプローブの位置が、それにハイブリダイ
ズした核酸分子の配置を可能にするものである、請求項１〜１６に記載の方法。
【請求項１８】 (ａ)請求項６〜１６に定義されるプローブセット、並びに
／または、 (ｂ)標的ＤＮＡの結合が可能になるよう前処理された、及び／若しくは、既に
結合された標的ＤＮＡを含むプローブ担体、を含むキット。