CN113980976A - 一种与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁的共显性SSR标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁的共显性SSR标记及其应用，所述的与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TM50931和TM56908、TMc44058和TMc44049，其PCR扩增产物核苷酸序列分别为SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。所述的应用为所述的与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁的共显性SSR标记在检测烟草基因组DNA中是否存在IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485中的应用。本发明所述的共显性SSR标记具有精准、高效、稳定、便捷和低成本的特点，因此该分子标记可以作为烟草高香气品质育种中IV型蔗糖酯基因qBMVSE485分子标记辅助选择的应用。

Description

一种与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁的共显性SSR 标记及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁的共显性SSR标记及其应用。
背景技术
烟草蔗糖酯是其叶片表面化学主要成分之一，也是烟草中重要的潜在致香前体物质，其中，栽培烟草中含量较高的为蔗糖四酯(Severson R F,Arrendale R F,Chortyk OT,Quantitation of the major cuticular components from green leaf of differenttobacco types.Journal of Agricultural and Food Chemistry,1984,(32):566-570.)，其降解可产生小分子挥发性脂肪酸并可极大地提高烟叶的香气品质(Severson R F,Arrendale R F,Chortyk O T,Isolation and characterization of the sucroseesters of the cuticular waxes of green tobacco leaf.Journal of Agriculturaland Food Chemistry,1985,(33):870-875.Leffingwell J C,Chemical constituents oftobacco leaf and differences among tobacco types.Social Science ElectronicPublishing,2001,1:38-44.)。大量研究表明，普通烟草中的蔗糖四酯依据分子量的大小不同，进一步分为6个类型(组)，即，I型烟草蔗糖酯～VI型烟草蔗糖酯，其中，III型～VI型烟草蔗糖酯中因含有3-甲基戊酰基而被称为BMVSE(Vontimitta V,Danehower D A,SteedeT,Moon H S,Lewis R S,Analysis of a Nicotiana tabacum L.genomic regioncontrolling two leaf surface chemistry traits.Journal of Agricultural andFood Chemistry,2010,58:294-300.)。不同栽培烟草类型中蔗糖四酯的结构类型和含量存在较大差异，烤烟、白肋烟和马里兰烟中仅含少量的I型和II型烟草蔗糖酯，不含或含有痕量的BMVSE；而香料烟和雪茄烟含有大量的BMVSE(蔡莉莉，谢复炜，刘克建，张映，谢剑平，香料烟中蔗糖酯的气相色谱/质谱分析.烟草科技,2009,3:40-44.王瑞玲，王莹莹，毛多斌，贾春晓，烟草中蔗糖四酯类化合物的GC-MS分析.化学研究与应用,2011,23(8):1030-1035.屈亚芳，许明录，曹建敏，孙惠青，尤祥伟，王国平，蒋彩虹，王元英，常爱霞，不同基因型烟草腺毛主要分泌物差异分析.中国烟草学报,2018,24(1):45-52.陈彪，陈铭，李洋洋，屈亚芳，程立锐，杨爱国，胡日生，刘旦，罗成刚，向世鹏，冯全福，常爱霞，烟草糖酯SSR分子标记筛选及辅助育种应用.中国烟草科学,2019,40(3):8-15.)。BMVSE经硅烷化气相色谱质谱(GC-MS)进一步解析后，依据葡萄糖环部分特征碎片离子大小又可分为BMVSE471(III型烟草蔗糖酯)、BMVSE485(IV型烟草蔗糖酯)和BMVSE499(V型烟草蔗糖酯)，上述3种类型烟草蔗糖酯也是培育含高蔗糖酯而具有高香气品质烤烟新品种的核心关注点。
针对栽培烟草叶片中BMVSE含量的遗传研究表明，雪茄烟Beinhart1000-1中控制BMVSE性状的基因呈显性，被定位于SSR标记PT30354和PT52061、PT61362之间约5.2cM区域内，且与SSR标记PT30209和PT20315呈共分离(Vontimitta V,Danehower D A,Steede T,Moon H S,Lewis R S,Analysis of a Nicotiana tabacum L.genomic regioncontrolling two leaf surface chemistry traits.Journal of Agricultural andFood Chemistry,2010,58:294-300.)。国内的烟草育种工作者利用上述5个SSR标记对不同遗传背景的烟草材料及192份重组自交系群体进行BMVSE筛选验证，结果表明仅2个标记(PT20135和PT30354)可使用，但标记的基因型与BMVSE表型的一致率约92.165％(陈彪，陈铭，李洋洋，屈亚芳，程立锐，杨爱国，胡日生，刘旦，罗成刚，向世鹏，冯全福，常爱霞，烟草糖酯SSR分子标记筛选及辅助育种应用.中国烟草科学,2019,40(3):8-15.)。造成上述试验验证结果出现远未达到分子标记辅助选择(MAS)精准要求的主要原因为：文献的作者错误的将原本分别属于BMVSE471(III型)、BMVSE485(IV型)和BMVSE499(V型)三个不同独立基因视作一个基因(命名为BMVSE)进行遗传定位研究，故此，获得的定位结果是不准确的。本项目组的研究表明，III～V型BMVSE属于典型的数量性状，且受Beinhart1000-1基因组内不同染色体或同一染色体上不同位置的QTLs控制，这些基因/QTLs被暂时命名为qBMVSE471、qBMVSE485和qBMVSE499。进一步将文献报道的5个与BMVSE紧密连锁SSR标记信息与Beinhart1000-1基因组比对可知，即使与BMVSE呈共分离的PT30329和PT20315标记间仍存在约15Mb的物理距离，也即，文献针对III～V型烟草蔗糖酯作为一个基因(BMVSE)进行定位的结果是不准确的，该定位结果极有可能只是三种类型BMVSE中的一种，故此，在后续的实验验证中出现了5个紧密连锁标记仅有2个可用且无法精准实现标记基因型与BMVSE表型一致的情况。上述错误或不足，严重地制约了利用与III～V型BMVSE基因紧密连锁标记开展高香气烟草新品种的选育进程。
鉴于此，本发明将BMVSE中包含的BMVSE471(Ⅲ型)、BMVSE485(IV型)和BMVSE499(V型)三种类型烟草蔗糖酯进行区分，并以优质多抗雪茄烟品种Beinhart1000-1(其叶片中的高香气品质由BMVSE控制，而BMVSE受数量性状基因qBMVSE471(Ⅲ型)、qBMVSE485(IV型)和qBMVSE499(V型)控制)和烤烟品种红花大金元(综合性状优良但不含BMVSE)为亲本，通过杂交、连续套袋自交，构建一个含有341份株系的烟草重组自交系(RILs_F7:8)为作图群体，利用数量性状连锁分析(QTL)法和硅烷化气相色谱质谱(GC-MS)法，在烟草全基因组范围内筛选获得与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485(IV型烟草蔗糖酯性状由位于第15号连锁群上不同位置的两个基因/QTLs控制，暂命名为qBMVSE485_15.1和qBMVSE485_15.2)紧密连锁的共显性SSR标记，以弥补现有技术和已报道文献的不足、加速分子标记辅助选择(MAS)在烟草高香气品种选育中的精准、高效利用。
发明内容
本发明正是为了解决上述问题缺陷，提供一种与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁的共显性SSR标记及其应用。
本发明采用如下技术方案实现。
一种与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁的共显性SSR标记，本发明所述的与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TM50931和TM56908、TMc44058和TMc44049，其PCR扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQID No.3和SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。
本发明所述的分子标记所对应的4个位点的引物序列分别为：
TM50931序列为：
TM50931F：5’-AAAAACCCGAGATAAACCGATA -3’(SEQ ID NO.9)，
TM50931R：5’-AGCAAGGTGGTCAAGTTTACA-3’(SEQ ID NO.10)；
TM56908序列为：
TM56908F：5’-TGTGACAGGACAAGGTTCCA-3’(SEQ ID NO.11)，
TM56908R：5’-GTTGGCATCTCATAGCGACA-3’(SEQ ID NO.12)。
TMc44058序列为：
TMc44058F：5’-AACAGCAGCCCAGTTCACTT-3’(SEQ ID NO.13)，
TMc44058R：5’-TGAGTGCTTGACCCGTATTG-3’(SEQ ID NO.14)；
TMc44049序列为：
TMc44049F：5’-GTTTACCTTCGGGTCCGTTT-3’(SEQ ID NO.15)，
TMc44049R：5’-GGACCCACATCGATATCTGC-3’(SEQ ID NO.16)。
上述的与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁的共显性SSR标记的应用在于检测烟草基因组DNA中是否存在IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485。
本发明上述的应用，该应用的方法为，以TM50931和TM56908序列的引物、TMc44058和TMc44049序列的引物分别扩增待检测烟草基因组DNA，检测PCR扩增产物。
本发明PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5和SEQID No.7所示序列则表明该待测烟草植株含有高香气品质的IV型烟草蔗糖酯的纯合等位基因。
本发明PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示序列则表明该待测烟草植株也含有高香气品质的IV型烟草蔗糖酯的纯合等位基因。
本发明PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.5和SEQ ID No.7所示序列则表明该待测烟草植株同样含有高香气品质的IV型烟草蔗糖酯的纯合等位基因。
本发明PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6和SEQID No.8所示序列则为待测烟草植株不含或含有痕量的IV型烟草蔗糖酯的纯合等位基因
本发明PCR扩增产物中排除以下结果，即为含有IV型烟草蔗糖酯的杂合等位基因；所述的结果为：1)同时含有如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5和SEQ ID No.7所示序列；2)同时含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示序列；3)同时含有如SEQ ID No.5和SEQ ID No.7所示序列；4)同时含有如SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6和SEQ IDNo.8所示序列。
本发明的有益效果为，本发明提供了一种用于检测IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485的分子标记，与文献报道的标记检测烟草蔗糖酯含量相比，本发明所述分子标记可精准的确定待测烟草中是否含有IV型烟草蔗糖酯(IV型烟草蔗糖酯性状由位于第15号连锁群上不同位置的两个基因/QTLs控制，暂命名为qBMVSE485_15.1和qBMVSE485_15.2)，且相较于文献报道的标记具有更高的检测准确度，其有效纠正并弥补了文献中将三种不同类型BMVSE视作一个基因的错误与不足，同时也可精准的鉴别具有IV型烟草蔗糖酯的基因型；与现有的采用低通量、高成本、耗时费力的GC-MS法检测烟草蔗糖酯含量相比，本发明所述的共显性SSR标记具有高效、稳定、可靠、简捷和低成本的特点，且可在烟草生长的任何时期进行检测，极大的缩短了实验周期，进而加速了选育高香气品质烤烟新品种进程。
下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。
附图说明
图1是基于烟草重组自交系群体(RILs_F7:8；红花大金元×Beinhart1000-1)的第15号连锁群上IV型烟草蔗糖酯QTL分析曲线图。
其中，利用软件为：QTL IciMapping v4.2；参数设置：定位方法为ICIM-ADD：Inclusive Composite Interval Mapping of ADDitive(and dominant)QTL，迭代次数为1000(Permutation times＝1000)，显著性为0.01(Significance＝0.01)，步长为0.5cM(Walk speed＝0.5cM)。横坐标为遗传距离(单位：厘摩cM)；纵坐标为LOD值。图中的横向虚线是在0.01显著性阈值下的LOD值＝3.3733；第15号连锁群不同位置的LOD曲线最高点分别为两个主效基因(qBMVSE485_15.1和qBMVSE485_15.2)。
具体实施方式
本发明的第一目的在于提供一种与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁的共显性SSR标记；第二目的在于提供所述的与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁的共显性SSR标记的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TM50931和TM56908、TMc44058和TMc44049，其PCR扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。
本发明的第二目的是这样实现的，所述的与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁的共显性SSR标记在检测烟草基因组DNA中是否存在IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485中的应用。
为了简捷、精准、高效选择具有高香气品质潜力的IV型烟草蔗糖酯烟草品种，有针对性和特异性的选择含IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485的后代材料，本发明提供一种用于检测IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485的分子标记TM50931和TM56908、TMc44058和TMc44049，该分子标记采用数量性状连锁分析(QTL)法和硅烷化气相色谱质谱(GC-MS)法，在烟草全基因组范围内筛选获得与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485连锁的共显性SSR标记，可用于IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485的辅助选择，以提高分子标记辅助选择的效率及高香气烟草品种选育的效率。
本发明以优质多抗雪茄烟品种Beinhart1000-1(其叶片中的高香气品质由BMVSE控制，而BMVSE受数量性状基因qBMVSE471(Ⅲ型)、qBMVSE485(IV型)和qBMVSE499(V型)控制)和烤烟品种红花大金元(综合性状优良但不含BMVSE)为亲本，通过杂交、连续套袋自交，构建的烟草重组自交系(RILs_F7:8)为作图群体，采用数量性状连锁分析(QTL)法和硅烷化气相色谱质谱(GC-MS)法，在烟草全基因组范围内筛选获得与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁的共显性SSR标记，以弥补现有技术和已报道文献的不足、加速分子标记辅助选择(MAS)在烟草高香气品种选育中的精准、高效利用。
本发明所述的与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TM50931和TM56908、TMc44058和TMc44049，其PCR扩增产物核苷酸序列分别为SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6、SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8所示。
所述的分子标记所对应的4个位点的引物序列分别为：
TM50931序列为：
TM50931F：5’-AAAAACCCGAGATAAACCGATA-3’，
TM50931R：5’-AGCAAGGTGGTCAAGTTTACA-3’；
TM56908序列为：
TM56908F：5’-TGTGACAGGACAAGGTTCCA-3’，
TM56908R：5’-GTTGGCATCTCATAGCGACA-3’。
TMc44058序列为：
TMc44058F：5’-AACAGCAGCCCAGTTCACTT-3’，
TMc44058R：5’-TGAGTGCTTGACCCGTATTG-3’；
TMc44049序列为：
TMc44049F：5’-GTTTACCTTCGGGTCCGTTT-3’，
TMc44049R：5’-GGACCCACATCGATATCTGC-3’。
本发明所述的与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁的共显性SSR标记的应用为所述的与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁的共显性SSR标记在检测烟草基因组DNA中是否存在IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485中的应用。
所述的与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁的共显性SSR标记的应用是分别以TM50931和TM56908序列的引物、TMc44058和TMc44049序列的引物分别扩增待检测烟草基因组DNA，检测PCR扩增产物，如果PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5和SEQ ID No.7所示序列则表明该待测烟草植株含有高香气品质的IV型烟草蔗糖酯的纯合等位基因SE485_1SE485_1SE485_2SE485_2；如果PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示序列则表明该待测烟草植株也含有高香气品质的IV型烟草蔗糖酯的纯合基因SE485_1SE485_1se485_2se485_2；如果PCR扩增产物中同时含有如SEQID No.5和SEQ ID No.7所示序列则表明该待测烟草植株同样含有高香气品质的IV型烟草蔗糖酯的纯合基因se485_1se485_1SE485_2SE485_2；如果PCR扩增产物中同时含有如SEQID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6和SEQ ID No.8所示序列则为待测烟草植株不含或含有痕量的IV型烟草蔗糖酯的纯合等位基因se485_1se485_1se485_2se485_2；如果PCR扩增产物中含有除上述表述外的其他组合所示序列即为含有IV型烟草蔗糖酯的杂合基因SE485_1se485_1SE485_2se485_2、SE485_1se485_1se485_2se485_2和se485_1se485_1SE485_2se485_2。
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
实施例1
采用数量性状连锁分析(QTL)法并结合硅烷化气相色谱质谱(GC-MS)法，在烟草全基因组范围内筛选与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485连锁的共显性SSR标记
一、实验材料以综合性状优良且不含IV型烟草蔗糖酯的烤烟品种红花大金元为母本，以含III型、IV型和V型烟草蔗糖酯的雪茄烟品种Beinhart1000-1(其III～V型烟草蔗糖酯分别由qBMVSE471、qBMVSE485、qBMVSE499基因控制)为父本，经杂交、连续自交，获得341份株系的重组自交系(RILs_F7:8)作为遗传作图群体。
二、亲本及RILs_F7:8群体IV型烟草蔗糖酯含量数据获得
试验材料成苗后移栽至大田，待大田烟叶成熟时，每个株系随机选10株，且每株烟草选取3片中部叶片；将上述每个株系的30片中部叶片叠在一起，利用直径1cm的打孔器在叶片中部位置随机打2个孔，获得60个直径1cm的圆形叶片。将获得的60个圆形小叶片按照文献报道的方法(蔡莉莉，谢复炜，刘克建，张映，谢剑平，香料烟中蔗糖酯的气相色谱/质谱分析.烟草科技,2009,3:40-44.王瑞玲，王莹莹，毛多斌，贾春晓，烟草中蔗糖四酯类化合物的GC-MS分析.化学研究与应用,2011,23(8):1030-1035.)进行烟草蔗糖酯含量检测。经GC-MS法检测获得的341份RILs_F7:8III型烟草蔗糖酯含量作为RILs_F7:8群体的表型值，用于下一步的QTL连锁分析。
三、SSR标记分析
烟草基因组DNA提取：采用常规CTAB法或植物组织DNA提取试剂盒均可，方法可参考已有的文献或试剂盒中的说明书。
PCR扩增及电泳检测：PCR扩增体系是常规的体系可参照已发表的文献，其中，本发明所提供的标记退火温度均为60℃；PCR扩增程序信息可参照相关文献；电泳检测也是采用常规的方法，可参照已发表的相关文献。
利用本实验室分别基于烤烟红花大金元和雪茄烟Beinhart1000-1基因组信息开发的约50000个SSR标记，对RILs_F7:8群体的双亲(红花大金元和Beinhart1000-1)和子一代(F1)进行多态性筛选，最终，筛选获得2001个多态性SSR标记。再利用筛选获得2001个多态SSR标记，对341份RILs_F7:8样品进行基因型分析。其次，利用遗传连锁作图软件JoinMap4.0对341份RILs_F7:8样品的基因型数据进行连锁分析，绘制一张含有24条连锁群且均匀分布1974个SSR标记，覆盖烟草基因组长度为3213.138cM的高质量雪茄烟遗传连锁图谱，作为RILs_F7:8群体的基因型值，用于下一步的QTL连锁分析。
四、IV型烟草蔗糖酯(qBMVSE485)的全基因组QTL定位分析
利用QTL定位分析软件QTL IciMapping v4.2对RILs_F7:8群体的基因型数据(构建获得雪茄烟遗传连锁群图谱)和表型数据(341份RILs_F7:8群体的IV型烟草蔗糖酯含量)，对IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485进行全基因组QTL扫描。其中，相关参数设置为：定位方法选ICIM-ADD：Inclusive Composite Interval Mapping of ADDitive(and dominant)QTL，迭代次数为1000(Permutation times＝1000)，显著性为0.01(Significance＝0.01)，步长为0.5cM(Walk speed＝0.5cM)。最后，在全基因组范围内的LOD＝3.3733条件下，位于第15号连锁群的44.50cM和47.50cM处定位获得控制IV型烟草蔗糖酯性状的2个主效QTLs(暂命名为qBMVSE485_15.1和qBMVSE485_15.2)。该两个主效QTLs一起可解释约44.93％的表型变异率，其中，qBMVSE485_15.1和qBMVSE485_15.2的效应值分别约为11.67％和33.26％，LOD值分别约为11.15和19.63，详见图1和表1。
表1IV型烟草蔗糖酯QTL(qBMVSE485_15.1和qBMVSE485_15.2)信息统计
QTL Chromosome Position/cM LeftMarker RightMarker LOD PVE(％) Add
qBMVSE485_15.1 15 44.50 TM50931 TM56908 11.1497 11.6673 0.5014
qBMVSE485_15.2 15 47.50 TMc44058 TMc44049 19.6254 33.2603 0.6557
注：PVE为QTL的效应值，即，该QTL可解释表型变异百分比；Add为加性效应。
实施例2
共显性连锁标记在RILs_F8:9群体单株中的验证
利用获得的与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485两侧紧密连锁的共显性SSR标记TM50931和TM56908、TMc44058和TMc44049，对苗期的RILs_F8:9群体(红花大金元×Beinhart1000-1)单株进行基因型分析，获得RILs_F8:9群体各单株的基因型数据；另一方面，待RILs_F8:9群体的烟叶生长至成熟采烤前，采用GC-MS法对各株系的成熟中部叶片取样，检测叶片中的IV型烟草蔗糖酯含量，即，获取RILs_F8:9群体各株系的表型值。最后，分析341份RILs_F8:9群体的基因型数据与IV型烟草蔗糖酯表型值，发现本发明公布的四个共显性SSR标记TM50931和TM56908、TMc44058和TMc44049的基因型值与表型值完全吻合，即，一致率达100％。
具体的分析方法为：通过GC-MS检测获得的各株系IV型烟草蔗糖酯含量高于或等于亲本Beinhart1000-1含量时，该株系的基因型中也是同时呈现如SEQ ID NO.1(386bp)、SEQ ID NO.3(308bp)、SEQ ID NO.5(237bp)和SEQ ID NO.7(249bp)所示序列即为纯合基因型SE485_1SE485_1SE485_2SE485_2；
检测获得的各株系IV型烟草蔗糖酯含量等于或低于亲本红花大金元含量时，该株系的基因型中也是同时呈现如ID NO.2(400bp)、SEQ ID NO.4(344bp)、ID NO.6(252bp)和SEQ ID NO.8(264bp)所示序列即为纯合基因型se485_1se485_1se485_2se485_2；
检测获得的各株系IV型烟草蔗糖酯含量低于亲本Beinhart1000-1而高于子一代(F1)含量时，该株系的基因型中也是同时呈现如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3或同时呈现如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7所示序列即分别为纯合基因型SE485_1SE485_1se485_2se485_2或se485_1se485_1SE485_2SE485_2；
当检测获得的各株系IV型烟草蔗糖酯含量介于亲本红花大金元与Beinhart1000-1之间，也即与子一代(F1)含量相近时，该株系的基因型中则呈现除上述表述外的其他组合所示序列即为含有IV型烟草蔗糖酯的杂合基因型SE485_1se485_1SE485_2se485_2、SE485_1se485_1se485_2se485_2和se485_1se485_1SE485_2se485_2。
以上结果表明，共显性标记TM50931和TM56908、TMc44058和TMc44049分别与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁，且该四个标记位于目的基因(qBMVSE485_15.1和qBMVSE485_15.2)两侧。
利用上述四个共显性紧密连锁SSR标记，不仅可以精准、高效、便捷且低成本的实现烟草任何生育期的IV型烟草蔗糖酯含量的检测，而且也可清晰鉴别待测植株中的IV型烟草蔗糖酯的基因型状态，进而既提高了具有高香气品质烤烟新品种选育的科学性、可预测性，又加速了育种进程。
本发明所涉序列表：
SEQ ID NO.1：
AAAAACCCGAGATAAACCGATATTAAAAAACTCGACTTTTATTGGTTTGGTTTGGTATTTAGATTTAATAACCCGATACAATTGGTTTAGTTTGGTAATTATAAAATCCGAACCAACCCGACTCATATATATATATATATATATATATATATATATATAAGTGGGCATAGACAATATATAGAGAGAGATATATTTGGCAAACTTTACACATTGTCACTTTTGAATCGCTTTGTTTATATCTTTTTTATCTGCTTATCCAAGTCAGAAAACAATTATGCCTGTTCTTTAAACTAGAATAAAAGTGAAAAAATAATTAAGCTTGATCTCCAAAATTAAAACATTTACAATAATTTTGTAGTCAATTGTGTAAACTTGACCACCTTGCT
SEQ ID NO.2：
AAAAACCCGAGATAAACCGATATTAAAAAACTCGACTTTTATTGGTTTGGTTTGGTATTTAGATTTAATAACCCGATACAATTGGTTTAGTTTGGTAATTATAAAATCCGAACCAACCCGACTCATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAAGTGGGCATAGACAATATATAGAGAGAGATATATTTGGCAAACTTTACACATTGTCACTTTTGAATCGCTTTGTTTATATCTTTTTTATCTGCTTATCCAAGTCAGAAAACAATTATGCCTGTTCTTTAAACTAGAATAAAAGTGAAAAAATAATTAAGCTTGATCTCCAAAATTAAAACATTTACAATAATTTTGTAGTCAATTGTGTAAACTTGACCACCTTGCT
SEQ ID NO.3：
TGTGACAGGACAAGGTTCCAACCTGCTAGTTTGTCATTGATTGACTCACTGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAATGGTGATAGTACTGAGAATTGTTGTGTGATTTGTTTGGGAGATTTACCAGTGGGTACTCAAGTTGTTCGCACGCCTTGTTCGCATTACTTTCATCTTCGCTGCCTATGGACTTGGCTTGAGAGAAGGGGCAGCTGTCCTATTTGTCGCTATGAGATGCCAAC
SEQ ID NO.4：
TGTGACAGGACAAGGTTCCAACCTGCTAGTTTGTCATTGATTGACTCACTGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAATGGTGATAGTACTGAGAATTGTTGTGTGATTTGTTTGGGAGATTTACCAGTGGGTACTCAAGTTGTTCGCACGCCTTGTTCGCATTACTTTCATCTTCGCTGCCTATGGACTTGGCTTGAGAGAAGGGGCAGCTGTCCTATTTGTCGCTATGAGATGCCAAC
SEQ ID NO.5：
AACAGCAGCCCAGTTCACTTGAATTGGACCAGAATTAAAAATGAACTCTTCAGGCCCCAAAGTGTTCATGCAAAAGAGAGAAAAGATAATGACTAGTACTTACTCATAAAAATAAAGGCAGAAATACAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATGCATAACTGCAACACTCTAAAAAATCGGACAGAAGTGATTCCCCAAAAGAACAATACGGGTCAAGCACTCA
SEQ ID NO.6：
AACAGCAGCCCAGTTCACTTGAATTGGACCAGAATTAAAAATGAACTCTTCAGGCCCCAAAGTGTTCATGCAAAAGAGAGAAAAGATAATGACTAGTACTTACTCATAAAAATAAAGGCAGAAATACAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATGCATAACTGCAACACTCTAAAAAATCGGACAGAAGTGATTCCCCAAAAGAACAATACGGGTCAAGCACTCA
SEQ ID NO.7：
GTTTACCTTCGGGTCCGTTTATATGAGTTATTTCCTTATTTCTATTCCTATTTTTCCTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTGTATACTTGTTATTGTAAGTGACTTGCCATAGCCTCGTTACTACTTCTTCGAGGTTAGGCTCGGCAGTTACAGAGTACATGGGGTTGGTTGTACTCATACTACACTTTTGTACTTCTGATGCAGATATCGATGTGGGTCC
SEQ ID NO.8：
GTTTACCTTCGGGTCCGTTTATATGAGTTATTTCCTTATTTCTATTCCTATTTTTCCTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTGTATACTTGTTATTGTAAGTGACTTGCCATAGCCTCGTTACTACTTCTTCGAGGTTAGGCTCGGCAGTTACAGAGTACATGGGGTTGGTTGTACTCATACTACACTTTTGTACTTCTGATGCAGATATCGATGTGGGTCC
SEQ ID NO.9：
AAAAACCCGAGATAAACCGATA
SEQ ID NO.10：
AGCAAGGTGGTCAAGTTTACA
SEQ ID NO.11：
TGTGACAGGACAAGGTTCCA
SEQ ID NO.12：
GTTGGCATCTCATAGCGACA
SEQ ID NO.13：
AACAGCAGCCCAGTTCACTT
SEQ ID NO.14：
TGAGTGCTTGACCCGTATTG
SEQ ID NO.15：
GTTTACCTTCGGGTCCGTTT
SEQ ID NO.16：
GGACCCACATCGATATCTGC
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例,方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
<110>云南省烟草农业科学研究院
<120>一种与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁的共显性SSR标记及其应用
<160>16
<210>1
<211>386
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
AAAAACCCGAGATAAACCGATATTAAAAAACTCGACTTTTATTGGTTTGGTTTGGTATTTAGATTTAATAACCCGATACAATTGGTTTAGTTTGGTAATTATAAAATCCGAACCAACCCGACTCATATATATATATATATATATATATATATATATATAAGTGGGCATAGACAATATATAGAGAGAGATATATTTGGCAAACTTTACACATTGTCACTTTTGAATCGCTTTGTTTATATCTTTTTTATCTGCTTATCCAAGTCAGAAAACAATTATGCCTGTTCTTTAAACTAGAATAAAAGTGAAAAAATAATTAAGCTTGATCTCCAAAATTAAAACATTTACAATAATTTTGTAGTCAATTGTGTAAACTTGACCACCTTGCT
<210>2
<211>400
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
AAAAACCCGAGATAAACCGATATTAAAAAACTCGACTTTTATTGGTTTGGTTTGGTATTTAGATTTAATAACCCGATACAATTGGTTTAGTTTGGTAATTATAAAATCCGAACCAACCCGACTCATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAAGTGGGCATAGACAATATATAGAGAGAGATATATTTGGCAAACTTTACACATTGTCACTTTTGAATCGCTTTGTTTATATCTTTTTTATCTGCTTATCCAAGTCAGAAAACAATTATGCCTGTTCTTTAAACTAGAATAAAAGTGAAAAAATAATTAAGCTTGATCTCCAAAATTAAAACATTTACAATAATTTTGTAGTCAATTGTGTAAACTTGACCACCTTGCT
<210>3
<211>308
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
TGTGACAGGACAAGGTTCCAACCTGCTAGTTTGTCATTGATTGACTCACTGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAATGGTGATAGTACTGAGAATTGTTGTGTGATTTGTTTGGGAGATTTACCAGTGGGTACTCAAGTTGTTCGCACGCCTTGTTCGCATTACTTTCATCTTCGCTGCCTATGGACTTGGCTTGAGAGAAGGGGCAGCTGTCCTATTTGTCGCTATGAGATGCCAAC
<210>4
<211>344
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
TGTGACAGGACAAGGTTCCAACCTGCTAGTTTGTCATTGATTGACTCACTGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAATGGTGATAGTACTGAGAATTGTTGTGTGATTTGTTTGGGAGATTTACCAGTGGGTACTCAAGTTGTTCGCACGCCTTGTTCGCATTACTTTCATCTTCGCTGCCTATGGACTTGGCTTGAGAGAAGGGGCAGCTGTCCTATTTGTCGCTATGAGATGCCAAC
<210>5
<211>237
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
AACAGCAGCCCAGTTCACTTGAATTGGACCAGAATTAAAAATGAACTCTTCAGGCCCCAAAGTGTTCATGCAAAAGAGAGAAAAGATAATGACTAGTACTTACTCATAAAAATAAAGGCAGAAATACAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATGCATAACTGCAACACTCTAAAAAATCGGACAGAAGTGATTCCCCAAAAGAACAATACGGGTCAAGCACTCA
<210>6
<211>252
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
AACAGCAGCCCAGTTCACTTGAATTGGACCAGAATTAAAAATGAACTCTTCAGGCCCCAAAGTGTTCATGCAAAAGAGAGAAAAGATAATGACTAGTACTTACTCATAAAAATAAAGGCAGAAATACAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATGCATAACTGCAACACTCTAAAAAATCGGACAGAAGTGATTCCCCAAAAGAACAATACGGGTCAAGCACTCA
<210>7
<211>249
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
GTTTACCTTCGGGTCCGTTTATATGAGTTATTTCCTTATTTCTATTCCTATTTTTCCTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTGTATACTTGTTATTGTAAGTGACTTGCCATAGCCTCGTTACTACTTCTTCGAGGTTAGGCTCGGCAGTTACAGAGTACATGGGGTTGGTTGTACTCATACTACACTTTTGTACTTCTGATGCAGATATCGATGTGGGTCC
<210>8
<211>264
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
GTTTACCTTCGGGTCCGTTTATATGAGTTATTTCCTTATTTCTATTCCTATTTTTCCTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTATTGTATACTTGTTATTGTAAGTGACTTGCCATAGCCTCGTTACTACTTCTTCGAGGTTAGGCTCGGCAGTTACAGAGTACATGGGGTTGGTTGTACTCATACTACACTTTTGTACTTCTGATGCAGATATCGATGTGGGTCC
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
AAAAACCCGAGATAAACCGATA
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
AGCAAGGTGGTCAAGTTTACA
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
TGTGACAGGACAAGGTTCCA
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
GTTGGCATCTCATAGCGACA
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
AACAGCAGCCCAGTTCACTT
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
TGAGTGCTTGACCCGTATTG
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
GTTTACCTTCGGGTCCGTTT
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
GGACCCACATCGATATCTGC

Claims (9)

1.一种与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁的共显性SSR标记，其特征在于，所述的与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁的共显性SSR标记的编号为TM50931和TM56908、TMc44058和TMc44049，其PCR扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8所示。
2.根据权利要求1所述的与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁的共显性SSR标记，其特征在于，所述的分子标记所对应的4个位点的引物序列分别为：
TM50931序列为：
TM50931F：5’-AAAAACCCGAGATAAACCGATA-3’(SEQ ID NO.9)，
TM50931R：5’-AGCAAGGTGGTCAAGTTTACA-3’(SEQ ID NO.10)；
TM56908序列为：
TM56908F：5’-TGTGACAGGACAAGGTTCCA-3’(SEQ ID NO.11)，
TM56908R：5’-GTTGGCATCTCATAGCGACA -3’(SEQ ID NO.12)。
TMc44058序列为：
TMc44058F：5’-AACAGCAGCCCAGTTCACTT-3’(SEQ ID NO.13)，
TMc44058R：5’-TGAGTGCTTGACCCGTATTG-3’(SEQ ID NO.14)；
TMc44049序列为：
TMc44049F：5’-GTTTACCTTCGGGTCCGTTT-3’(SEQ ID NO.15)，
TMc44049R：5’-GGACCCACATCGATATCTGC-3’(SEQ ID NO.16)。
3.权利要求1或2所述的与IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485紧密连锁的共显性SSR标记的应用在于检测烟草基因组DNA中是否存在IV型烟草蔗糖酯基因qBMVSE485。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，该应用的方法为，以TM50931和TM56908序列的引物、TMc44058和TMc44049序列的引物分别扩增待检测烟草基因组DNA，检测PCR扩增产物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5和SEQ ID No.7所示序列则表明该待测烟草植株含有高香气品质的IV型烟草蔗糖酯的纯合等位基因。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示序列则表明该待测烟草植株也含有高香气品质的IV型烟草蔗糖酯的纯合等位基因。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.5和SEQ ID No.7所示序列则表明该待测烟草植株同样含有高香气品质的IV型烟草蔗糖酯的纯合等位基因。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，PCR扩增产物中同时含有如SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6和SEQ ID No.8所示序列则为待测烟草植株不含或含有痕量的IV型烟草蔗糖酯的纯合等位基因。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，PCR扩增产物中排除以下结果，即为含有IV型烟草蔗糖酯的杂合等位基因；所述的结果为：1)同时含有如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5和SEQ ID No.7所示序列；2)同时含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示序列；3)同时含有如SEQ ID No.5和SEQ ID No.7所示序列；4)同时含有如SEQ ID No.2、SEQID No.4、SEQ ID No.6和SEQ ID No.8所示序列。
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