CN115074447A - 一种用于鉴定中国荷斯坦牛乳房炎抗性的引物组合、方法及应用 - Google Patents

一种用于鉴定中国荷斯坦牛乳房炎抗性的引物组合、方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115074447A
CN115074447A CN202111136727.9A CN202111136727A CN115074447A CN 115074447 A CN115074447 A CN 115074447A CN 202111136727 A CN202111136727 A CN 202111136727A CN 115074447 A CN115074447 A CN 115074447A
Authority
CN
China
Prior art keywords
site
primer
chinese holstein
genotype
holstein cattle
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111136727.9A
Other languages
English (en)
Inventor
俞英
达日格日乐
唐永杰
周月玲
文惠
李文龙
肖炜
张毅
任永红
田茜茜
王景艳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN202111136727.9A priority Critical patent/CN115074447A/zh
Publication of CN115074447A publication Critical patent/CN115074447A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定中国荷斯坦牛乳房炎抗性的引物组合、方法及应用。该方法包括如下步骤：检测待测中国荷斯坦牛基于SNP1位点(rs135854456)、SNP11位点(位于中国荷斯坦牛基因组第5号染色体的第104010752位)、SNP15位点(rs109421300)和SNP16位点(rs109350371)的基因型，如果基于SNP1位点的基因型为CC纯合型、基于SNP11位点的基因型为CC纯合型、基于SNP15位点的基因型为AA纯合型且基于SNP16位点的基因型为AA纯合型，待测中国荷斯坦牛具有乳房炎抗性。本发明提供的方法可以准确鉴定中国荷斯坦牛乳房炎抗性，具有重要的应用价值。

Description

一种用于鉴定中国荷斯坦牛乳房炎抗性的引物组合、方法及 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于鉴定中国荷斯坦牛乳房炎抗性的引物组合、方法及应用。
背景技术
奶牛乳房炎即奶牛乳房发生的炎症，其为奶牛乳腺最常见的疾病且属于复杂疾病。奶牛乳房炎是乳腺组织发生的不同程度的病理学变化，其导致乳汁体细胞数(Somaticcell count，SCC)增多，牛奶产量和品质大幅度降低，对世界乳业发展影响巨大。一方面在实际饲养时，牛场通常通过检测SCC对牛群乳房健康状况进行管理，即SCC作为判断奶牛乳房炎的间接指标(如健康牛的SCC为10万/mL以下)，以控制牛奶质量，但利用SCC判断奶牛乳房炎的标准并未统一，其判断结果受环境影响也并不稳定准确。另一方面，传统奶牛育种工作中，通常以低的体细胞评分(Somatic cell score，SCS)为育种目标间接提升奶牛乳房炎抗性，但此选择方法取得的遗传进展有限。因此，在规范用药、大规模施行替抗、减抗养殖战略的趋势下，建立针对中国荷斯坦牛乳房炎抗性鉴定标准，对于提升奶牛生产性能，提高乳房炎抗性牛育种效率显得尤为重要。
近年来，SNP作为第三代分子标记，以其数量多、分布广、遗传稳定等优点受到广泛重视。基于中国荷斯坦牛的基因信息进行分析，可以挖掘更加稳定高效的SNP位点。因此，有必要探索基于基因多态性有效进行中国荷斯坦牛乳房炎抗性鉴定的方法。采用等位基因竞争性特异PCR法，可以开发其特异性引物，获得样本在SNP位点的基因型，最终针对中国荷斯坦牛乳房炎抗性进行鉴定。
发明内容
本发明的目的为鉴定中国荷斯坦牛乳房炎抗性。
本发明首先保护引物组合。所述引物组合可包括引物组1—引物组4；
所述引物组1由SEQ ID NO:1所示的正向引物01F1、SEQ ID NO:2所示的正向引物01F2和SEQ ID NO:3所示的反向引物01R组成；
所述引物组2由SEQ ID NO:4所示的正向引物02F1、SEQ ID NO:5所示的正向引物02F2和SEQ ID NO:6所示的反向引物02R组成；
所述引物组3由SEQ ID NO:7所示的正向引物03F1、SEQ ID NO:8所示的正向引物03F2和SEQ ID NO:9所示的反向引物03R组成；
所述引物组4由SEQ ID NO:10所示的正向引物04F1、SEQ ID NO:11所示的正向引物04F2和SEQ ID NO:12所示的反向引物04R组成。
上述引物组合中，所述正向引物01F1、所述正向引物02F1、所述正向引物03F1和所述正向引物04F1可进行FAM荧光标记。所述正向引物01F2、所述正向引物02F2、所述正向引物03F2和所述正向引物04F2可进行HEX荧光标记。
所述引物组合具体可由所述引物组1、所述引物组2、所述引物组3和所述引物组4组成。
上述任一所述引物组合在制备用于鉴定或辅助鉴定中国荷斯坦牛是否具有乳房炎抗性的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述引物组合在制备用于辅助筛查具有乳房炎抗性的中国荷斯坦牛的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还保护上述任一所述引物组合在辅助筛查具有乳房炎抗性的中国荷斯坦牛中的应用；所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
本发明还保护上述任一所述引物组合在鉴定或辅助鉴定中国荷斯坦牛是否具有乳房炎抗性中的应用；所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
上述任一所述应用中，采用上述任一所述引物组合可检测SNP1位点(rs135854456)、SNP11位点(位于中国荷斯坦牛基因组第5号染色体的第104010752位)、SNP15位点(rs109421300)和SNP16位点(rs109350371)的基因型，如果待测中国荷斯坦牛基于SNP1位点的基因型为CC纯合型、基于SNP11位点的基因型为CC纯合型、基于SNP15位点的基因型为AA纯合型且基于SNP16位点的基因型为AA纯合型，则待测中国荷斯坦牛具有乳房炎抗性；如果待测中国荷斯坦牛基于SNP1位点的基因型为TT纯合型和/或基于SNP11位点的基因型为TT纯合型和/或基于SNP16位点的基因型为GG纯合型和/或基于SNP15位点的基因型为GG纯合型，则待测中国荷斯坦牛不具有乳房炎抗性(即具有易感性)。
本发明还保护一种辅助筛查待测中国荷斯坦牛是否具有乳房炎抗性的方法，可包括如下步骤：检测待测中国荷斯坦牛基于SNP1位点、SNP11位点、SNP15位点和SNP16位点的基因型，然后进行如下判断：
如果待测中国荷斯坦牛基于SNP1位点的基因型为CC纯合型、基于SNP11位点的基因型为CC纯合型、基于SNP15位点的基因型为AA纯合型且基于SNP16位点的基因型为AA纯合型，则待测中国荷斯坦牛具有乳房炎抗性；
如果待测中国荷斯坦牛基于SNP1位点的基因型为TT纯合型和/或基于SNP11位点的基因型为TT纯合型和/或基于SNP16位点的基因型为GG纯合型和/或基于SNP15位点的基因型为GG纯合型，则待测中国荷斯坦牛不具有乳房炎抗性(即具有易感性)；
SNP1位点为rs135854456；
SNP11位点位于中国荷斯坦牛基因组第5号染色体的第104010752位；
SNP15位点为rs109421300；
SNP16位点为rs109350371；
所述方法用于非疾病的诊断与治疗。
上述方法中，所述检测待测中国荷斯坦牛基于SNP1位点、SNP11位点、SNP15位点和SNP16位点的基因型的步骤如下：
(1)以待测中国荷斯坦牛的基因组DNA为模板，分别采用上述任一所述引物组合中的引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(2)完成步骤(1)后，采用仪器检测PCR扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测中国荷斯坦牛基于SNP1位点、SNP11位点、SNP15位点和SNP16位点的基因型。
上述方法中，所述PCR扩增可采用华牛芯片进行。具体步骤如下：
(a)取华牛芯片，每个芯片孔中注入模板和引物组；
(b)完成步骤(a)后，从所述华牛芯片的孔中注入PCR预混液(2×)(ThermoScientificTM)，之后密封进出口.
每个芯片孔中的反应体系为1μL，包括0.14μL混合引物(12μM正向引物1(名称中含有“F1”的引物)、12μM正向引物2(名称中含有“F2”的引物)和30μM反向引物(名称中含有“R”的引物)、0.5μLPCR预混液(2×)(Thermo ScientificTM)、0.3μL模板(20ng/μL)和ddH2O。
(c)完成步骤(b)后，将所述华牛芯片置于离心机，4000rpm离心1min；
(d)完成步骤(c)后，将所述华牛芯片置于热封仪中热封，1sec；
(e)完成步骤(d)后，取所述华牛芯片，各孔同时进行PCR扩增；
反应程序为：95℃预变性，15min；95℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低1℃)，1min，扩增10个循环；95℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环；37℃延伸60sec。
(f)完成步骤(e)后，将所述华牛芯片置于荧光信号扫描仪，生成扫描图像，根据荧光信号颜色判断待测中国荷斯坦牛基于每个SNP位点的基因型。具体的判断原则如下：如果待测中国荷斯坦牛基于某SNP位点显示红色荧光信号，则该中国荷斯坦牛基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点且名称中含有“F1”的引物的3’末端第1个碱基或其互补碱基”纯合型；如果待测中国荷斯坦牛基于某SNP位点显示绿色荧光信号，则该中国荷斯坦牛基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点且名称中含有“F2”的引物的3’末端第1个碱基或其互补碱基”纯合型；如果待测中国荷斯坦牛基于某SNP位点显示黄色荧光信号，则该中国荷斯坦牛基于该SNP位点的基因型为杂合型，一个碱基为“扩增该SNP位点且名称中含有“F1”的引物的3’末端第1个碱基或其互补碱基”，另一个碱基“扩增该SNP位点且名称中含有“F2”的引物的3’末端第1个碱基或其互补碱基”。
上述方法中，所述检测待测中国荷斯坦牛基于SNP1位点、SNP11位点、SNP15位点和SNP16位点的基因型的步骤如下：
(1)以待测中国荷斯坦牛的基因组DNA为模板，分别采用上述任一所述引物组合中的引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(2)取步骤(1)得到的PCR扩增产物，测序；
(3)根据步骤(2)得到的测序结果，获得待测中国荷斯坦牛基于SNP1位点、SNP11位点、SNP15位点和SNP16位点的基因型。
本发明还保护中国荷斯坦牛中SNP1位点、SNP11位点、SNP15位点和SNP16位点的基因型在鉴定或辅助鉴定乳房炎抗性中的应用；SNP1位点为rs135854456；SNP11位点位于中国荷斯坦牛基因组第5号染色体的第104010752位；SNP15位点为rs109421300；SNP16位点为rs109350371；所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
实验证明，本发明提供的方法及其引物组合可以准确鉴定中国荷斯坦牛乳房炎抗性。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为A牧场、B牧场和C牧场的中国荷斯坦牛基于SNP1的检测结果。
图2为A牧场、B牧场和C牧场的中国荷斯坦牛基于SNP11的检测结果。
图3为A牧场、B牧场和C牧场的中国荷斯坦牛基于SNP15的检测结果。
图4为A牧场、B牧场和C牧场的中国荷斯坦牛基于SNP16的检测结果。
图5为D牧场的中国荷斯坦牛基于SNP1的检测结果。
图6为D牧场的中国荷斯坦牛基于SNP11的检测结果。
图7为D牧场的中国荷斯坦牛基于SNP15的检测结果。
图8为D牧场的中国荷斯坦牛基于SNP16的检测结果。
图9为E牧场的中国荷斯坦牛基于SNP1的检测结果。
图10为E牧场的中国荷斯坦牛基于SNP11的检测结果。
图11为E牧场的中国荷斯坦牛基于SNP15的检测结果。
图12为E牧场的中国荷斯坦牛基于SNP16的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
华牛芯片为北京博奥晶典生物技术有限公司的产品，产品编号为G020010。
实施例1、用于鉴定中国荷斯坦牛乳房炎抗性的引物组合的获得
一、4个SNP位点的发现
利用IMAP微流控SNP芯片系统针对华牛芯片中中国荷斯坦牛乳房健康相关的20个SNP位点进行基因型分型，质控后联合中国荷斯坦牛的生产性能测定数据表型(如SCC、305天产奶量)，经混合线性模型分析筛选出有2个及以上月份显著相关的SNP位点，最终获得与中国荷斯坦牛乳房炎抗性显著相关的4个SNP位点，分别为SNP1、SNP11、SNP15和SNP16。
4个SNP位点的基本信息详见表1。
表1.4个SNP位点基本信息
Figure BDA0003282278740000051
二、用于鉴定中国荷斯坦牛乳房炎抗性的引物组合的获得
根据步骤一发现的4个SNP位点，开发出适合用等位基因竞争性特异PCR法鉴定中国荷斯坦牛乳房炎抗性的引物组合。
引物组合由4个引物组组成。每个引物组的名称见表2中第2列。每个引物组由3条引物序列组成，用于扩增一个SNP位点。4个引物组中各个引物的核苷酸序列如表2中第4列所示。
表2.4个引物组及其引物的核苷酸序列
Figure BDA0003282278740000052
Figure BDA0003282278740000061
注：FAM表示FAM荧光标记，HEX表示HEX荧光标记。
实施例2、来源于北京五个牧场(分别为首农集团某某牧场(简称A牧场)、首农集团某某牧场(简称B牧场)、首农集团某某牧场(简称C牧场)、中鼎牧业某某牧场(简称D牧场)和首农集团某某牧场(简称E牧场))的837头中国荷斯坦牛对实施例1开发的引物组合的有效性检验
1、837头中国荷斯坦牛的基因组DNA的获得
分别采集837头中国荷斯坦牛的(895份)牛尾静脉血，采用CTAB法提取基因组DNA，得到837头中国荷斯坦牛的基因组DNA(实际为895份中国荷斯坦牛的基因组DNA，有重复采样)。
中国荷斯坦牛基因组DNA的质量和浓度均须满足PCR要求，达标标准为：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；紫外分光光度计Nanodrop2000(Thermo)检测A260/A280比值大于等于1.7，A260/A230比值大于1.8；中国荷斯坦牛的基因组DNA的浓度大于20ng/μL，样品浓度尽量保持一致。
2、分别以895份血液中国荷斯坦牛基因组DNA为模板，分别采用4个引物组进行PCR扩增，得到中国荷斯坦牛基于4个SNP位点的基因型。
PCR扩增采用华牛芯片进行，具体步骤如下：
(1)取华牛芯片，每个芯片孔中注入模板和引物组；
(2)完成步骤(1)后，从所述华牛芯片的孔中注入PCR预混液(2×)(ThermoScientificTM)，之后密封进出口；
每个芯片孔中的反应体系为1μL，包括0.14μL混合引物(12μM正向引物1(名称中含有“F1”的引物)、12μM正向引物2(名称中含有“F2”的引物)和30μM反向引物(名称中含有“R”的引物)、0.5μLPCR预混液(2×)(Thermo Scientific TM)、0.3μL模板(20ng/μL)和ddH2O。
(3)完成步骤(2)后，将所述华牛芯片置于离心机，4000rpm离心1min；
(4)完成步骤(3)后，将所述华牛芯片置于热封仪中热封，1sec；
(5)完成步骤(4)后，取所述华牛芯片，各孔同时进行PCR扩增；
反应程序为：95℃预变性，15min；95℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低1℃)，1min，扩增10个循环；95℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环；37℃延伸60sec。
(6)完成步骤(5)后，将所述华牛芯片置于荧光信号扫描仪，生成扫描图像，根据荧光信号颜色判断837头中国荷斯坦牛基于每个SNP位点的基因型。具体的判断原则如下：如果某中国荷斯坦牛基于某SNP位点显示红色荧光信号，则该中国荷斯坦牛基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点且名称中含有“F1”的引物的3’末端第1个碱基或其互补碱基”纯合型；如果某中国荷斯坦牛基于某SNP位点显示绿色荧光信号，则该中国荷斯坦牛基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点且名称中含有“F2”的引物的3’末端第1个碱基或其互补碱基”纯合型；如果某中国荷斯坦牛基于某SNP位点显示黄色荧光信号，则该中国荷斯坦牛基于该SNP位点的基因型为杂合型，一个碱基为“扩增该SNP位点且名称中含有“F1”的引物的3’末端第1个碱基或其互补碱基”，另一个碱基“扩增该SNP位点且名称中含有“F2”的引物的3’末端第1个碱基或其互补碱基”。
A牧场、B牧场和C牧场的中国荷斯坦牛基于SNP1的检测结果见图1。
A牧场、B牧场和C牧场的中国荷斯坦牛基于SNP11的检测结果见图2。
A牧场、B牧场和C牧场的中国荷斯坦牛基于SNP15的检测结果见图3。
A牧场、B牧场和C牧场的中国荷斯坦牛基于SNP16的检测结果见图4。
D牧场的中国荷斯坦牛基于SNP1的检测结果见图5。
D牧场的中国荷斯坦牛基于SNP11的检测结果见图6。
D牧场的中国荷斯坦牛基于SNP15的检测结果见图7。
D牧场的中国荷斯坦牛基于SNP16的检测结果见图8。
E牧场的中国荷斯坦牛基于SNP1的检测结果见图9。
E牧场的中国荷斯坦牛基于SNP11的检测结果见图10。
E牧场的中国荷斯坦牛基于SNP15的检测结果见图11。
E牧场的中国荷斯坦牛基于SNP16的检测结果见图12。
837头中国荷斯坦牛基于每个SNP位点的基因型统计结果见表3。检测样品份数为895，图1-图12中数量合计等于895，去重后为837，分型检出率为基于NA数/837得。
表3
Figure BDA0003282278740000071
结果表明，各个引物组在中国荷斯坦牛中可以得到良好的分型效果。
3、混合线性模型分析
依据混合线性模型如下，联合表型数据SCC进行显著性分析。
scc～p+fys+stage+x
其中，p为胎次效应，stage为泌乳阶段效应，fys为场、年、季节效应，x为SNP效应。
分析结果见表4。统计遗传效应结果显示SNP1、SNP11、SNP15和SNP16有2个及以上月份对SCC有显著影响，符合实施例1中乳房炎抗性显著相关SNP筛选标准。其中SNP1、SNP11的CC型个体、SNP15和SNP16的AA型个体分别具有较低的SCC及较高的305天产奶量。因此认为上述基因型为4个SNP位点的乳房炎抗性基因型。
表4
Figure BDA0003282278740000081
Figure BDA0003282278740000091
注：标*代表P值小于0.05，差异显著；**代表P值小于0.01，差异极显著。
基于SNP1位点为CC纯合型、基于SNP11位点为CC纯合型、基于SNP16位点为AA纯合型且基于SNP15位点为AA纯合型中所有基因型的中国荷斯坦牛为抗性牛；基于SNP1位点为TT纯合型、基于SNP11位点为TT纯合型、基于SNP16位点为GG纯合型和基于SNP15位点为GG纯合型中任一基因型的中国荷斯坦牛为易感牛，针对抗性牛与易感牛SCC及305M进行方差分析，结果如表5所示。
抗性牛的SCC显著低于易感牛(P＜0.05)，305M极显著高于易感牛的305M(P＜0.01)，因此认为SNP1、SNP11、SNP15和SNP16位点组成的SNP位点组合可用于筛选具有乳房炎抗性的中国荷斯坦牛。本例中研究群体检测结果为抗性牛174头，易感牛232头。
表5
Figure BDA0003282278740000101
注：①易感性牛：四个SNPs中有易感性基因型的牛。
②标*代表P值小于0.05，差异显著。
上述结果表明，采用实施例1开发的引物组合完全可以鉴定中国荷斯坦牛乳房炎，且具有较高的准确性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 中国农业大学
<120> 一种用于鉴定中国荷斯坦牛乳房炎抗性的引物组合、方法及应用
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
cagtcatgtc cgactctttg c 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
ctcagtcatg tccgactctt tgt 23
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
ggagcttggt aggctacact ccat 24
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
gaccatgagg gaagtctttt gag 23
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
ggaccatgag ggaagtcttt tgaa 24
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
tgccaggggg aatcagaaaa ggatt 25
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
gcccctgcgc aggcacat 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
gcccctgcgc aggcacac 18
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
aagctctgag actccccacc ca 22
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
gggtccatgg ctgctcct 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
gggtccatgg ctgctccc 18
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
ctaaacactt ccttcaaggt tctaagacta 30

Claims (10)

1.引物组合，包括引物组1—引物组4；
所述引物组1由SEQ ID NO:1所示的正向引物01F1、SEQ ID NO:2所示的正向引物01F2和SEQ ID NO:3所示的反向引物01R组成；
所述引物组2由SEQ ID NO:4所示的正向引物02F1、SEQ ID NO:5所示的正向引物02F2和SEQ ID NO:6所示的反向引物02R组成；
所述引物组3由SEQ ID NO:7所示的正向引物03F1、SEQ ID NO:8所示的正向引物03F2和SEQ ID NO:9所示的反向引物03R组成；
所述引物组4由SEQ ID NO:10所示的正向引物04F1、SEQ ID NO:11所示的正向引物04F2和SEQ ID NO:12所示的反向引物04R组成。
2.如权利要求1所述引物组合，其特征在于：
所述正向引物01F1、所述正向引物02F1、所述正向引物03F1和所述正向引物04F1进行FAM荧光标记；
所述正向引物01F2、所述正向引物02F2、所述正向引物03F2和所述正向引物04F2进行HEX荧光标记。
3.权利要求1或2所述引物组合在制备用于鉴定或辅助鉴定中国荷斯坦牛是否具有乳房炎抗性的试剂盒中的应用。
4.权利要求1或2所述引物组合在制备用于辅助筛查具有乳房炎抗性的中国荷斯坦牛的试剂盒中的应用。
5.权利要求1或2所述引物组合在辅助筛查具有乳房炎抗性的中国荷斯坦牛中的应用；
所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
6.权利要求1或2所述引物组合在鉴定或辅助鉴定中国荷斯坦牛是否具有乳房炎抗性中的应用；
所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
7.一种辅助筛查待测中国荷斯坦牛是否具有乳房炎抗性的方法，包括如下步骤：检测待测中国荷斯坦牛基于SNP1位点、SNP11位点、SNP15位点和SNP16位点的基因型，然后进行如下判断：
如果待测中国荷斯坦牛基于SNP1位点的基因型为CC纯合型、基于SNP11位点的基因型为CC纯合型、基于SNP15位点的基因型为AA纯合型且基于SNP16位点的基因型为AA纯合型，则待测中国荷斯坦牛具有乳房炎抗性；
如果待测中国荷斯坦牛基于SNP1位点的基因型为TT纯合型和/或基于SNP11位点的基因型为TT纯合型和/或基于SNP16位点的基因型为GG纯合型和/或基于SNP15位点的基因型为GG纯合型，则待测中国荷斯坦牛不具有乳房炎抗性；
SNP1位点为rs135854456；
SNP11位点位于中国荷斯坦牛基因组第5号染色体的第104010752位；
SNP15位点为rs109421300；
SNP16位点为rs109350371；
所述方法用于非疾病的诊断与治疗。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述检测待测中国荷斯坦牛基于SNP1位点、SNP11位点、SNP15位点和SNP16位点的基因型的步骤如下：
(1)以待测中国荷斯坦牛的基因组DNA为模板，分别采用权利要求2所述引物组合中的引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(2)完成步骤(1)后，采用仪器检测PCR扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测中国荷斯坦牛基于SNP1位点、SNP11位点、SNP15位点和SNP16位点的基因型。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述检测待测中国荷斯坦牛基于SNP1位点、SNP11位点、SNP15位点和SNP16位点的基因型的步骤如下：
(1)以待测中国荷斯坦牛的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1所述引物组合中的引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(2)取步骤(1)得到的PCR扩增产物，测序；
(3)根据步骤(2)得到的测序结果，获得待测中国荷斯坦牛基于SNP1位点、SNP11位点、SNP15位点和SNP16位点的基因型。
10.中国荷斯坦牛中SNP1位点、SNP11位点、SNP15位点和SNP16位点的基因型在鉴定或辅助鉴定乳房炎抗性中的应用；SNP1位点为rs135854456；
SNP11位点位于中国荷斯坦牛基因组第5号染色体的第104010752位；
SNP15位点为rs109421300；
SNP16位点为rs109350371；
所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
CN202111136727.9A 2021-09-27 2021-09-27 一种用于鉴定中国荷斯坦牛乳房炎抗性的引物组合、方法及应用 Pending CN115074447A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111136727.9A CN115074447A (zh) 2021-09-27 2021-09-27 一种用于鉴定中国荷斯坦牛乳房炎抗性的引物组合、方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111136727.9A CN115074447A (zh) 2021-09-27 2021-09-27 一种用于鉴定中国荷斯坦牛乳房炎抗性的引物组合、方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115074447A true CN115074447A (zh) 2022-09-20

Family

ID=83245558

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111136727.9A Pending CN115074447A (zh) 2021-09-27 2021-09-27 一种用于鉴定中国荷斯坦牛乳房炎抗性的引物组合、方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115074447A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109694916B (zh) 一种与绵羊饲料转化率相关的分子标记及其应用
CN107475412A (zh) 一种与鸡产蛋性状相关的分子标记及其在鸡育种中的应用
CN113502335A (zh) 一种与绵羊生长性状相关的分子标记及其应用
CN106498083B (zh) 一种检测牛pcaf基因单核苷酸多态性的rflp方法及试剂盒
CN107988385B (zh) 一种检测肉牛PLAG1基因Indel标记的方法及其专用试剂盒
CN115029444A (zh) 一种与绵羊生长性状相关的分子标记及其应用
CN116837112B (zh) 一种与牦牛生长性状相关的snp分子标记及其应用
CN112921101A (zh) 一种与绵羊剩余采食量相关的分子标记及其应用
CN105603088B (zh) 一种鉴定位于白菜a08染色体上的霜霉病抗性qtl的snp分子位点及其应用
CN108531642B (zh) 一组用于鉴别玉米品种的ssr分子标记及其应用
CN114921568B (zh) 一种秦川牛体尺及肉质性状相关的snp分子标记及其应用
CN116083592A (zh) 一种与绵羊生长性状相关的分子标记及其应用
CN115044682A (zh) 与湖羊生长性状相关的分子标记、其检测方法及应用
CN115074447A (zh) 一种用于鉴定中国荷斯坦牛乳房炎抗性的引物组合、方法及应用
CN107130037B (zh) 一种tnni1基因辅助检测牛生长和胴体性状的方法及专用试剂盒
CN106755422A (zh) 一种与黄牛生长性状相关的meg3基因snp的检测方法及其应用
CN110423826A (zh) 一种c57bl/6亚系小鼠kasp遗传检测试剂盒及引物
CN113736906B (zh) 用于检测番茄黄萎病抗性的snp位点组合及其应用
CN116083604B (zh) 一种影响绵羊断奶重的snp分子标记及其应用
CN114717336B (zh) 一种与绵羊内脏器官重量相关的分子标记及其应用
CN118272546B (zh) 一种脊尾白虾繁殖性状相关的SNP标记g.reelin-936及其应用
CN109161601B (zh) 一种plagl1基因snp标记辅助快速检测黄牛生长性状的方法及其应用
RU2691995C2 (ru) Способ одновременной генодиагностики четырех мутантных аллелей каппа-казеина у крупного рогатого скота и тест-система для его осуществления
CN116790729A (zh) 一种鉴别慢羽公鸡慢羽基因座基因型的方法
CN117925856A (zh) 一种与克氏原螯虾生长性能相关的snp分子标记及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination