CN101921852A

CN101921852A - 一种检测黄牛AdPLA基因单核苷酸多态性的方法

Info

Publication number: CN101921852A
Application number: CN 201010255603
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 朱金龙; 张亚; 蓝贤勇; 侯飞; 雷初朝
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2010-08-18
Filing date: 2010-08-18
Publication date: 2010-12-22
Anticipated expiration: 2030-08-18
Also published as: CN101921852B

Abstract

本发明公开了一种检测黄牛AdPLA基因单核苷酸多态性的方法，以包含AdPLA基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛AdPLA基因；用限制性内切酶FbaI消化PCR产物后，再进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定黄牛AdPLA基因第23076位的基因型；由于AdPLA基因功能涉及初生重、体重、日增重、体斜长、胸围等生长和体尺性状，基因型数据与这些性状关联分析后发现：18月龄和24月龄TT基因型个体的体斜长显著大于CC基因型个体(P＜0.05)；24月龄时TT基因型个体胸围显著大于CC基因型个体(P＜0.05)。以上说明TT基因型可以作为一个提高黄牛体斜长和胸围的候选分子遗传标记。本发明提供的检测方法可以用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

Description

一种检测黄牛AdPLA基因单核苷酸多态性的方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种检测黄牛AdPLA基因第23076位单核苷酸多态性的方法。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。因此，通常所说的SNPs包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起；具有转换型变异的SNPs约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。

在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs(cSNPs)、基因周边SNPs(pSNPs)和基因间SNPs(iSNPs)等三类。总的说来，cSNP比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。根据对遗传性状的影响，cSNPs又可分为两种：一种是同义cSNPs，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含义”相同；另一种是非同义cSNPs，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。虽然同义突变未能改变目的蛋白质的氨基酸序列，但有研究显示同义突变会影响目的蛋白质的翻译效率，进而对基因功能产生重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。

由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs：即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。

PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

在脊椎动物，甘油三酯贮存在脂肪细胞内的脂滴中。脂滴是一种亚细胞结构，是体内最重要的能量贮库。白色脂肪的主要作用是从贮存的甘油三酯中释放能量供给其他组织利用。脂肪特异性磷脂酶A2(adipose-specific phospholipase A2，AdPLA，也叫PLA2G16，HRASLS3，HREV107，HREV107-3，MGC118754或者H-REV107-1)只在脂肪组织中进行高表达，属于胞内钙依赖性PLA2超家族中的一员，PLA2超家族的酶能够催化磷脂中sn-2位脂肪酸的水解。另外，磷脂的sn-2位脂肪酸通常都是花生四烯酸或者其他不饱和脂肪酸，PLA2酶是催化类花生酸类物质产生的限速酶。类花生酸类物质，比如PG(前列腺素)是局部信号转导的介质，调控着许多已知的生理学系统。这些信号分子发挥自分泌、旁分泌或两者兼有途径，通过增强或抑制结合特异性G蛋白受体来发挥众多的生物学效应，包括通过调节cAMP的水平来调控脂解作用。因为AdPLA是脂肪组织中最主要的PLA2酶，它通过PGE2以自分泌和旁分泌的途径来调节脂肪水解。尽管高脂肪饮食或Leptin缺失条件下，缺失AdPLA小鼠能通过PGE2-EP3-cAMP通路来调节脂肪水解从而抑制肥胖。

目前，对于AdPLA基因的研究多在小鼠和人类上，国内外尚未见关于动物AdPLA基因遗传变异的研究。中国黄牛AdPLA基因遗传变异领域的研究匮乏，基因位点的功能研究及其遗传变异与经济性状(如：初生重、日增重、体重、体斜长、胸围等性状)的关联研究仍是空白。由于AdPLA基因功能涉及初生重、体重、日增重、体斜长、胸围等生长和体尺性状，本发明提供的检测方法为AdPLA基因SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

发明内容

本发明解决的问题在于利用PCR-RFLP方法检测黄牛AdPLA基因的多态性，并将其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种检测黄牛AdPLA基因单核苷酸多态性的方法，以包含AdPLA基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛AdPLA基因；用限制性内切酶FbaI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛AdPLA基因第23076位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

上游引物：5’-AGATACTCGCCATTGCCTCC-3’ 20bp；

下游引物：5’-GATGGGGGCACACTGAGGACCCACCTGATC-3’ 30bp。

所述的PCR扩增反应程序为：

94℃预变性5min；30～35个循环94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸10min。

所述的琼脂糖凝胶电泳为3％的琼脂糖凝胶电泳。

所述根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛AdPLA基因第23076位的单核苷酸多态性为：TT基因型表现为135bp和30bp条带；TC基因型表现为165bp、135bp和30bp条带；CC基因型表现为165bp条带，其中30bp条带在3％琼脂糖凝胶电泳中因片段太小不可见，但不影响鉴定基因型。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明根据AdPLA基因的序列设计引物，分别以5个黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，测序后得到黄牛AdPLA基因的部分序列。与NCBI公布的序列进行比较后，发现在第23076位存在SNP多态性。当AdPLA基因第23076位的T突变为C时，导致编码第127位氨基酸的密码子由AGT突变为AGC，由于密码子AGT和AGC均编码丝氨酸，所以该突变没有导致氨基酸的变化。但是以下材料证明同义突变仍然会对蛋白质的翻译速度、含量、折叠结构等产生影响，进而影响机体的表型性状。首先，蛋白质的翻译是通过携带相应氨基酸的tRNA识别特定密码子来实现的，同义密码子将被不同的tRNA识别，但在不同物种、组织中，携带相同氨基酸的tRNA的量是不同的，这将会影响蛋白质的翻译速度、含量等；其次，蛋白质只有经过正确的折叠形成高级结构后才能发挥作用，越来越多的研究证明，密码子的作用不仅决定蛋白质的氨基酸序列，还在蛋白质的卷曲折叠中发挥作用，即同义密码子也会导致蛋白质的折叠结构发生变化，影响蛋白质的功能。Saunders等人2010年研究发现同义密码子的偏爱性会导致蛋白质结构的变化，Kimchi-Sarfaty等人2007年报道MDR1基因的一个同义突变引起蛋白质底物特异性的改变。

针对上述第23076位的SNP多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，通过设计特定的引物，PCR扩增目的片段，然后用特定的限制性内切酶酶切鉴定，能够简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。

本发明对5个黄牛品种的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNP位点与黄牛部分生长性状(初生重、体重、日增重、体斜长和胸围)进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高黄牛体斜长和胸围的分子标记。

附图说明

图1为黄牛AdPLA基因PCR产物电泳；

图2为黄牛AdPLA基因第23076位不同基因型PCR产物的FbaI酶切电泳结果；

图3为黄牛AdPLA基因第23076位不同基因型的测序图。

具体实施方式

本发明利用PCR-RFLP方法对黄牛AdPLA基因第23076位同义密码子突变的单核苷酸多态性进行检测，下面对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

A、黄牛AdPLA基因第四外显子区域PCR引物的设计

以NCBI所公布的牛(NC_007330.4)序列为参考，利用Primer 5.0软件设计能够扩增包含黄牛AdPLA基因第四外显子区域的PCR引物，其引物序列如下：

上游引物：5’-AGATACTCGCCATTGCCTCC-3’ 20bp；

下游引物：5’-GATGGGGGCACACTGAGGACCCACCTGATC-3’ 30bp。

其中下游引物3’端起第3位引入错配碱基G-＞A，从而人为构建了一个FbaI的酶切位点TGATCA，可以使用PCR-RFLP方法进行基因型的判定。

以上述引物对黄牛基因组扩增，能够扩增包含黄牛AdPLA基因(NC_007314.3序列)第四外显子区域第22942bp～23106bp的165bp的基因片段，扩增后片段的电泳检测如图1所示，其中，泳道1～4为检测片段，泳道M为Marker；对扩增的片段进行测序鉴定后，其中，第23051bp～23100bp的序列为如下所示：

AGCTGCGCTA CGGGGTCCCC

AGGTGGGTCCTCAGTGTGCC；

经过分析，发现AdPLA基因第23076位(即CDS区第381位)存在SNP多态性；当AdPLA基因第23076位由T突变为C，导致编码第127位氨基酸的密码子由AGT突变为AGC，由于密码子AGT和AGC均编码丝氨酸，所以该突变没有引起氨基酸的变化。但是以下材料证明同义突变仍然会对蛋白质的翻译速度、含量、折叠和高级结构等产生影响，进而影响机体的表型性状。首先，蛋白质的翻译是通过携带相应氨基酸的tRNA识别特定密码子来实现的，同义密码子将被不同的tRNA识别，但在不同物种、组织中，携带相同氨基酸的tRNA的量是不同的，这将会影响蛋白质的翻译速度、含量等；其次，蛋白质只有经过正确的折叠形成高级结构后才能发挥作用，越来越多的研究证明，密码子的作用不仅决定蛋白质的氨基酸序列，还在蛋白质的卷曲折叠中发挥作用，即同义密码子也会导致蛋白质的折叠结构发生变化，影响蛋白质的功能。Saunders等人2010年研究发现同义密码子的偏爱性会导致蛋白质结构的变化，Kimchi-Sarfaty等人2007年报道MDR1基因的一个同义突变引起蛋白质底物特异性的改变。

由于在P引物对的下游引物中引入了错配碱基，导致AdPLA基因第23079位碱基(即上面所示序列中斜体下划线标注的核苷酸)由C变为T，所以当第23076位为T时，PCR扩增AdPLA基因产物的第23076bp～23081bp序列为tgatca，形成了限制性内切酶FbaI的酶切位点t/gatca，当在23076位点由T突变为C时，PCR扩增AdPLA基因产物的第23076bp～23081bp序列为cgatca，限制性内切酶FbaI不能识别；这样就可以对该位点SNP多态性进行检测。当用限制性内切酶FbaI对引物P扩增的基因片段进行酶切消化时，可以将PCR产物切成2段或不能切开。

B、以引物P进行PCR扩增待测黄牛的AdPLA基因片段

1、黄牛样本的采集

本发明具体以5个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1：河南南阳牛(210头)，陕西秦川牛(224头)，河南平顶山市郏县红牛(414头)，山东鲁西牛(168头)，吉林草原红牛(237头)；

表1黄牛样本的采集信息

2、基因组DNA的提取、纯化、检测

a.从血样中提取基因组DNA

1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，转移500μL至1.5mLEppendorf离心管，加入等体积PBS液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色；

2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h；

3)加蛋白酶K至3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清；

4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；

5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

6)加氯仿、异戊醇混合液(24∶1)500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

7)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃放置30～60min；

8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；

9)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；

10)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

b.DNA的纯化

1)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到100μg/mL；

2)5℃保温10h左右；

3)等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿各抽提一次；

4)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；

5)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；

6)倒掉液体，70％乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测；

c.分光光度法检测DNA

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(ng)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。

3、PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；

PCR反应体系见表2：

表2PCR反应体系

25μL反应体系包括0.4U Taq DNA聚合酶(北京天根科技有限公司)，2×Buffer 12.5μL(内含Mg²⁺、dNTPs等)(北京天根科技有限公司Mix)，50ng/μL含AdPLA基因的黄牛基因组DNA 0.45μL，10pmol/μL上、下游引物各0.5μL；

PCR反应程序为：

94℃预变性5min；

72℃延伸30s，

72℃延伸10min；

对5个黄牛品种共1255个样本的基因组DNA进行PCR扩增，获得1255个个体的黄牛AdPLA基因片段，即包含该SNP位点的165bp的DNA片段。

C、FbaI酶切消化PCR扩增的AdPLA基因片段

1、FbaI酶切反应消化体系(25～30μL)：10～15μL PCR产物，10×缓冲液2.5～3.0μL，FbaI(10U/μL)为1.0～1.5μL，灭菌纯水(H₂O)11.5～16.5μL；

2、酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化5～10h。

D、FbaI消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析

1、制作3％的琼脂糖凝胶，点样后120V电压电泳40min，直至分子量不同的DNA片段分离清晰，电泳结束后EB染色；

2、EB染色后，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像；

3、根据琼脂糖凝胶电泳结果分析SNP多态性：

用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统照相分析，判断SNP的多态性：

当第23076位为T时，PCR扩增AdPLA基因产物的第23076bp～23081bp序列为tgatca，形成了限制性内切酶FbaI的酶切位点t/gatca，当在23076位点由T突变为C时，PCR扩增AdPLA基因产物的第23076bp～23081bp序列为cgatca，限制性内切酶FbaI不能识别；这样就可以对该位点SNP多态性进行检测。

由于黄牛为2倍体，所以黄牛基因组AdPLA基因第23076位SNP多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：

TT基因型表现为135bp和30bp条带；TC基因型表现为165bp、135bp和30bp条带；CC基因型表现为165bp条带，其中30bp条带在3％琼脂糖凝胶电泳中因片段太小不可见，但通过165bp和135bp这两条带还是能够准确的鉴定TT基因型、TC基因型和CC基因型：只有165bp条带的为CC基因型个体；只有135bp条带为TT基因型个体；同时包含165bp和135bp条带为TC基因型个体。

如图2所示，其中，左起第2泳道只有165bp一条带，为CC基因型个体，左起第3泳道只有135bp一条带，为TT基因型个体，左起第4泳道包含165bp和135bp两条带，为TC基因型个体，泳道M为Marker I(600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)。

4、TC基因型个体PCR产物的测序验证

利用ABI 377和ABI 3730测序仪对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序；同时，进行SNP位置分析，结果表明包含165bp和135bp条带的杂合子TC基因型个体，其23076位的测序图确实表示为T和C杂合子，如图3c左起第5位核苷酸所示；同时只有165bp条带的纯合子CC，其23076位的测序图如图3a左起第5位核苷酸所示为C；只有135bp条带的纯合子TT，其23076位的测序图如图3b左起第5位核苷酸所示为C。

E、黄牛AdPLA基因SNP位点的频率统计分析

1、基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+N_Aa3+N_Aa4+......+N_Aan)/2N

式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。

本研究所涉及的等位基因为T和C，所以具体的基因频率计算公式为：

P_C＝(2N_CC+N_TC)/2N

P_T＝(2N_TT+N_TC)/2N

式中，P_T，P_C分别表示等位基因T和C等位基因的频率，N_TT、N_TC和N_CC分别表示TT、TC和CC基因型的个体数量，N表示总群体数目。

在不同黄牛品种AdPLA基因SNP中的T等位基因频率变化幅度在24.1％～71.7％，C等位基因频率变化幅度在28.3％～75.9％之间，如表3所示。

表3黄牛AdPLA基因第23076位SNP基因频率分布表

F、黄牛AdPLA基因SNP位点基因效应的关联分析

基因型数据：FbaI识别的基因型(TT、TC和CC)；

生产数据：南阳牛6月、12月、18月和24月龄的体重、日增重、体斜长和胸围数据；

关联分析模型：

先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SAS(9.1)软件的GLM过程分析基因型和品种对各性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_ijkl＝μ+BF_i+Month_j+G_k+e_ijkl

其中：Y_ijkl为性状观察值，μ为总体均值，BF_i为第i个品种和农场的固定效，Month_j为第j个月观测的固定效应，G_k为第k个单SNP标记基因型的固定效应，e_ijkl为随机误差。

结果表明(见表4)：黄牛AdPLA基因第四外显子FbaI位点，18月龄和24月龄TT基因型的个体体斜长均高于CC基因型个体且差异显著(P＜0.05)，TT基因型个体相对于CC基因型个体，18月龄和24月龄体斜长性状分布提高了6.22％和5.40％，TT基因型18月龄和24月龄体斜长也均高于TC基因型，但未达到显著水平(P＞0.05)；24月龄TT基因型个体胸围显著大于CC基因型和TC基因型个体(P＜0.05)，分别提高了8.24％和6.58％。以上说明TT基因型可以作为一个提高黄牛体斜长和胸围的候选分子遗传标记。

表4AdPLA基因FbaI多态位点与南阳牛各月龄体斜长和胸围之间的方差分析

注：具有相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

Claims

1.一种检测黄牛AdPLA基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，以包含AdPLA基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛AdPLA基因；用限制性内切酶FbaI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛AdPLA基因第23076位的单核苷酸多态性；

所述的引物对P为：

上游引物：5’-AGATACTCGCCATTGCCTCC-3’ 20bp；

下游引物：5’-GATGGGGGCACACTGAGGACCCACCTGATC-3’ 30bp。

2.如权利要求1所述的检测黄牛AdPLA基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：

3.如权利要求1所述的检测黄牛AdPLA基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶电泳为3％琼脂糖凝胶电泳。

4.如权利要求1所述的检测黄牛AdPLA基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛AdPLA基因第23076位的单核苷酸多态性为：TT基因型表现为135bp和30bp条带；TC基因型表现为165bp、135bp和30bp条带；CC基因型表现为165bp条带，其中30bp条带在3％琼脂糖凝胶电泳中因片段太小不可见，但不影响鉴定基因型。