DE112014006075B9 - Transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle und Verfahren zur Herstellung eines Exsudats - Google Patents

Transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle und Verfahren zur Herstellung eines Exsudats Download PDF

Info

Publication number
DE112014006075B9
DE112014006075B9 DE112014006075.5T DE112014006075T DE112014006075B9 DE 112014006075 B9 DE112014006075 B9 DE 112014006075B9 DE 112014006075 T DE112014006075 T DE 112014006075T DE 112014006075 B9 DE112014006075 B9 DE 112014006075B9
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
protein
seq
amino acid
plant
transformed plant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
DE112014006075.5T
Other languages
English (en)
Other versions
DE112014006075T8 (de
DE112014006075B4 (de
DE112014006075T5 (de
Inventor
Chikara Ohto
Madoka Yonekura
Naohiro Aoki
Ryu Ohsugi
Tatsuro Hirose
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Agriculture and Food Research Organization
University of Tokyo NUC
Toyota Motor Corp
Original Assignee
National Agriculture and Food Research Organization
University of Tokyo NUC
Toyota Motor Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Agriculture and Food Research Organization, University of Tokyo NUC, Toyota Motor Corp filed Critical National Agriculture and Food Research Organization
Publication of DE112014006075T5 publication Critical patent/DE112014006075T5/de
Publication of DE112014006075T8 publication Critical patent/DE112014006075T8/de
Application granted granted Critical
Publication of DE112014006075B4 publication Critical patent/DE112014006075B4/de
Publication of DE112014006075B9 publication Critical patent/DE112014006075B9/de
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle, bei der eine Nukleinsäure, die ein Transporterprotein kodiert, das eine die folgende Aminosäuresequenz umfassende Konsensussequenz besitzt:(L/I/V/M/F)x(G/A)xx(I/L/V/M/F)xxxx(L/I/V/F)(A/S)(P/S)(1-3aa)(P/S/T/A)T(F/L)xx(I/V)xxxKxxxxxxxxPYxxx(L/I)xxxx(L/I)x(I/L/M/V/F)x Y(A/S/G)(7-13aa)(I/L/V/M)(1-2aa)(I/V)Nxxxxxx(E/Q)xxYxxx(Y/F)xx(Y/F)(A/G/S)(35-36aa)(R/Q/H)xxxxGx(V/I/L)xxxxx(V/M/L/I/F)xxxx(A/S/T)P(L/M)x(I/V)(I/M/ V/L)(2-7aa)(V/I)(V/I/M)x(T/S)x(S/N)xx(F/Y)(M/L)(P/S)(F/I/V/L)xLSxx(L/I)(T/V)xx( A/G)xxW(F/L)xYGxxxxDxx(V/I)xxPNxxGxx(F/L)(G/S)xxQ(M/I)x(L/M/I/V/F) (Y/H/F) und das an Zuckertransport beteiligt ist, eingeführt ist:wobei das Transporterprotein ein Protein eines der folgenden (a) und (b) ist:(a) ein Protein, das eine in einer von SEQ ID NOs: 132 oder 136 aufgeführte Aminosäuresequenz umfasst;(b) ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die eine Identität von 90% oder mehr mit einer in einer von SEQ ID NOs: 132 oder 136 aufgeführten Aminosäuresequenz besitzt, und mit Transporteraktivität im Zusammenhang mit Zuckertransport.

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle und Verfahren zur Herstellung eines Exsudats
  • Bisheriger Stand der Technik
  • Für eine stabile Produktion von Biokraftstoff oder Biokunststoffen sind niedrige Kosten und eine stabile Versorgung mit deren Rohstoff Zucker wünschenswert. Das repräsentative Beispiel für den Rohstoff Zucker ist in Zuckerrohr eingelagerter Zucker. Die Extraktion von Zucker aus Zuckerrohr erfordert generell Prozesse wie etwa Schneiden des Zuckerrohrs zu einer vorbestimmten Erntezeit, Zerkleinern, Pressen, Konzentrieren und Reinigen. Überdies erfordert die Anbaufläche nach der Ernte Bewirtschaftungsarbeiten wie Flächenbearbeitung für neuen Anbau, Bepflanzung und Spritzen von Herbiziden und Insektiziden. Die Herstellung des Rohstoffs Zucker mit Pflanzen wie Zuckerrohr ist herkömmlicherweise ein Prozess, der hohe Kosten erfordert, wie etwa für den Herstellungsprozess und den Anbau, wie oben beschrieben.
  • Patentliteratur 1 offenbart ein Verfahren zum Gewinnen eines heterologen Proteins, das von einem heterologen Gen aus einer zum Exprimieren des heterologen Gens transformierten Pflanze kodiert wird. Das in Patentliteratur 1 offenbarte Verfahren umfasst das Sammeln eines Exsudats aus einer zum Exprimieren eines heterologen Gens transformierten Pflanze und das Gewinnen des heterologen Proteins aus dem gesammelten Exsudat. Beispiele für das Exsudat in Patentliteratur 1 umfassen Exsudat aus dem Rhizom sowie die von einer Pflanze durch die Hydathode des Blatts als ein Exsudat abgesonderte Guttation.
  • Patentliteratur 2 und Nichtpatentliteratur 1 offenbaren Transporterproteine, die in Arabidopsis thaliana und Reis (Oryza sativa) an Zuckertransport in Pflanzen beteiligt sind. Die in Patentliteratur 2 und Nichtpatentliteratur 1 offenbarten Transporterproteine sind als GLUE-Proteine oder SWEET-Proteine bekannt. Die Einführung einer Nukleinsäure, die ein in Patentliteratur 2 und Nichtpatentliteratur 1 offenbartes Transporterprotein kodiert, in eine Pflanze kann die Menge des Zuckertransports zur Wurzel verbessern.
  • Nichtpatentliteratur 2 beschreibt die Funktionsbestätigung eines Kleinmolekül-Zellmembrantransporters durch artifizielles Lokalisieren des Zellmembrantransporters auf dem endoplasmatischen Retikulum (ER) und Messen der Kleinmolekültransporteraktivität des ER. Insbesondere wurden die Glucosetransporter GLUTs und SGLTs auf dem ER lokalisiert und deren ursprüngliche Funktionen unter Verwendung von FRET (Förster-Resonanzenergietransfer oder Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer) spekuliert. Die Patentliteraturen 3 und 4 offenbaren verschiedene genetisch modifizierte Pflanzenzellen und Transporterproteine.
  • Liste der Entgegenhaltungen
  • Patentliteratur
  • Nichtpatentliteratur
    • Nichtpatentliteratur 1
    • CHEN, Li-Qing [et al.]: Sugar transporters for intercellular exchange and nutrition of pathogens. In: Nature, Vol. 468, 2010, No. 7323, S. 527-532. - ISSN 0028-0836
    • Nichtpatentliteratur 2
    • TAKANAGA, Hitomi; FROMMER, Wolf B.: Facilitative plasma membrane transporters function during ER transit. In: The FASEB Journal, Vol. 24, 2010, No. 8, S. 2849-2858. - ISSN 0892-6638
  • KURZFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Technisches Problem
  • Wie vorstehend beschrieben, stellen die hohen Kosten der Produktion von Zucker unter Verwendung von Pflanzen ein großes Problem dar. Das vorgenannte Problem kann jedoch durch Einbringen von Zucker in einer hohen Konzentration in das von einer Pflanze stammende Exsudat und Sammeln des Exsudats gelöst werden. Patentliteratur 1 offenbart die Entnahme eines heterologen Proteins aus Exsudat, jedoch keine Technik zur Entnahme von Zucker aus dem Exsudat. Patentliteratur 2 und Nichtpatentliteratur 1 offenbaren die als SWEETs bezeichneten Transporterproteine, die an Zuckertransport beteiligt sind, sowie diese kodierende Nukleinsäuren, jedoch keine Beziehung zwischen diesen Transporterproteinen oder Nukleinsäuren, die diese kodieren, und dem Zuckergehalt in dem Exsudat.
  • Demgemäß ist angesichts der oben beschriebenen Umstände eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung einer transformierten Pflanze, die ein Exsudat produziert, welches Zucker in einer hohen Konzentration enthält, sowie eines Verfahrens zur Herstellung von Zucker unter Verwendung der transformierten Pflanze.
  • Lösung des Problems
  • Die vorstehend genannte Aufgabe wird durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
  • Infolge gewissenhafter Untersuchungen zum Erreichen des oben beschriebenen Ziels haben die vorliegenden Erfinder festgestellt, dass in der transformierten Pflanze, in die eine Nukleinsäure eingeführt ist, welche ein SWEET-Protein in einer bestimmten Gruppe (Klade) kodiert, und bei der die Expression des Proteins verbessert ist, ein hoher Zuckergehalt in Exsudat erreicht wird, wodurch die vorliegende Erfindung vervollständigt wird.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst das Folgende:
    1. (1) Transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle, bei der eine Nukleinsäure, die ein Transporterprotein kodiert, das eine die folgende Aminosäuresequenz umfassende Konsensussequenz besitzt:
      • (L/I/V/M/F)x(G/A)xx(I/L/V/M/F)xxxx(L/I/V/F)(A/S)(P/S)(1-3aa)(P/S/T/A)T(F/L)xx(I/V)xxxKxxxxxxxxPYxxx(L/I)xxxx(L/I)x(I/L/M/V/F)xY(A/S/ G)(7-13aa)(I/L/V/M)(1-2aa)(I/V)Nxxxxxx(E/Q)xxYxxx(Y/F)xx(Y/F)(A/G/S)(35-36aa)(R/Q/H)xxxxGx(V/I/L)xxxxx(V/M/L/I/F)xxxx(A/S/T)P(L/M)x(I/V)(I/M/V/L)(2-7aa)(V/I)(V/I/M)x(T/S)x(S/N)xx(F/Y)(M/L)(P/S)(F/I/V/L)xLSxx(L/I)(T/V)xx(A/G)xx W(F/L)xYGxxxxDxx(V/I)xxPNxxGxx(F/L)(G/S)xxQ(M/I)x(L/M/I/V/F)(Y/H/F)
      und das an Zuckertransport beteiligt ist, eingeführt ist: wobei das Transporterprotein ein Protein eines der folgenden (a) und (b) ist:
      1. (a) ein Protein umfassend eine in einer von SEQ ID NOs: 132 oder 136 aufgeführte Aminosäuresequenz;
      2. (b) ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die eine Identität von 90% oder mehr mit der in einer von SEQ ID NOs: 132 oder 136 aufgeführten Aminosäuresequenz besitzt, und mit Transporteraktivität im Zusammenhang mit Zuckertransport.
    2. (2) Transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle nach (1), wobei die transformierte Pflanze eine Phanerogame ist.
    3. (3) Transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle nach (2), wobei die Phanerogame eine Angiosperme ist.
    4. (4) Transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle nach (3), wobei die Angiosperme eine Monokotyle ist.
    5. (5) Transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle nach (4), wobei die Monokotyle eine Pflanze aus der Familie der Poaceae ist.
    6. (6) Transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle nach (5), wobei die Pflanze aus der Familie der Poaceae eine Pflanze der Gattung Oryza ist.
    7. (7) Transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle nach (3), wobei die Angiosperme eine Dikotyle ist.
    8. (8) Transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle nach (7), wobei die Dikotyle eine Pflanze aus der Familie der Brassicaceae ist.
    9. (9) Transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle nach (8), wobei die Pflanze aus der Familie der Brassicaceae eine Pflanze der Gattung Arabidopsis ist.
    10. (10) Verfahren zur Herstellung eines Exsudats, umfassend die Schritte des Kultivierens einer transformierten Pflanze, bei der eine Nukleinsäure, die ein Transporterprotein kodiert, das eine die folgende Aminosäuresequenz umfassende Konsensussequenz besitzt:
      • (L/I/V/M/F)x(G/A)xx(I/L/V/M/F)xxxx(L/I/V/F)(A/S)(P/S)(1-3aa)(P/S/T/A)T(F/L)xx(I/V)xxxKxxxxxxxxPYxxx(L/I)xxxx(L/I)x(I/L/M/V/F)xY(A/S/ G)(7-13aa)(I/L/V/M)(1-2aa)(I/V)Nxxxxxx(E/Q)xxYxxx(Y/F)xx(Y/F)(A/G/S)(35-36aa)(R/Q/H)xxxxGx(V/I/L)xxxxx(V/M/L/I/F)xxxx(A/S/T)P(L/M)x(I/V)(I/M/V/L)(2-7aa)(V/I)(V/I/M)x(T/S)x(S/N)xx(F/Y)(M/L)(P/S)(F/I/V/L)xLSxx(L/I)(T/V)xx(A/G)xx W(F/L)xYGxxxxDxx(V/I)xxPNxxGxx(F/L)(G/S)xxQ(M/I)x(L/M/I/V/F)(Y/H/F)
      und das an Zuckertransport beteiligt ist, eingeführt ist und die Expression des Proteins verbessert ist; und des Sammelns eines Exsudats von der transformierten Pflanze; wobei das Transporterprotein ein Protein eines der folgenden (a) und (b) ist:
      1. (a) ein Protein, das eine in einer von SEQ ID NOs: 132 oder 136 aufgeführte Aminosäuresequenz umfasst;
      2. (b) ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die eine Identität von 90% oder mehr mit einer in einer von SEQ ID NOs: 132 oder 136 aufgeführten Aminosäuresequenz besitzt, und mit Transporteraktivität im Zusammenhang mit Zuckertransport.
    11. (11) Verfahren zur Herstellung eines Exsudats nach (10), wobei die transformierte Pflanze unter Bedingungen einer relativen Luftfeuchtigkeit von 80% RH oder mehr kultiviert wird.
    12. (12) Verfahren zur Herstellung eines Exsudats nach (10), wobei das Exsudat Guttation ist.
    13. (13) Verfahren zur Herstellung eines Exsudats nach (10), wobei die transformierte Pflanze eine Phanerogame ist.
    14. (14) Verfahren zur Herstellung eines Exsudats nach (13), wobei die Phanerogame eine Angiosperme ist.
    15. (15) Verfahren zur Herstellung eines Exsudats nach (14), wobei die Angiosperme eine Monokotyle ist.
    16. (16) Verfahren zur Herstellung eines Exsudats nach (15), wobei die Monokotyle eine Pflanze aus der Familie der Poaceae ist.
    17. (17) Verfahren zur Herstellung eines Exsudats nach (16), wobei die Pflanze aus der Familie der Poaceae eine Pflanze der Gattung Oryza ist.
    18. (18) Verfahren zur Herstellung eines Exsudats nach (14), wobei die Angiosperme eine Dikotyle ist.
    19. (19) Verfahren zur Herstellung eines Exsudats nach (18), wobei die Dikotyle eine Pflanze aus der Familie der Brassicaceae ist.
    20. (20) Verfahren zur Herstellung eines Exsudats nach (19), wobei die Pflanze aus der Familie der Brassicaceae eine Pflanze der Gattung Arabidopsis ist.
  • Die Beschreibung der vorliegenden Anmeldung umfasst die Inhalte, die in der Beschreibung und/oder den Zeichnungen der JP-Patentanmeldung Nr. 2013-273128 beschrieben sind, welche der Priorität der vorliegenden Anmeldung zugrundeliegt.
  • Vorteilhafte Wirkungen der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der Zuckergehalt in dem von Pflanzen stammenden Exsudat stark erhöht werden. Demgemäß können transformierte Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung Exsudat produzieren, das eine Eigenschaft wie einen hohen Zuckergehalt besitzt, indem eine Nukleinsäure, die ein bestimmtes an Zuckertransport beteiligtes Transporterprotein kodiert, eingeführt ist und/oder die Expression des Proteins verbessert ist. Auch kann das Verfahren zur Herstellung eines Exsudats gemäß der vorliegenden Erfindung ein Exsudat mit einem hohen Zuckergehalt durch Verwenden einer transformierten Pflanze herstellen, bei der eine Nukleinsäure, die ein bestimmtes an Zuckertransport beteiligtes Transporterprotein kodiert, eingeführt ist und/oder die Expression des Proteins verbessert ist. Ferner kann das von der transformierten Pflanze gesammelte Exsudat aufgrund seines hohen Zuckergehalts als ein Rohstoff zum Herstellen von Alkohol, organischer Säure, Alkan und Terpenoiden verwendet werden.
  • Figurenliste
    • [1-1] 1-1 ist eine schematische Ansicht eines phylogenetischen Baums, der basierend auf der Information von Aminosäuresequenzen von SWEET-Proteinen in der Klade III, definiert in Nichtpatentliteratur 1 (Nature (2010) 468, 527-532), welche der am National Center for Biotechnology Information (NCBI) bereitgestellten GenBank-Datenbank entnommen ist, erstellt wurde.
    • [1-2] 1-2 ist eine erweiterte Ansicht eines Teils des in 1-1 gezeigten phylogenetischen Baums.
    • [1-3] 1-3 ist eine erweiterte Ansicht eines Teils des in 1-1 gezeigten phylogenetischen Baums.
    • [2-1] 2-1 veranschaulicht ein Ergebnis einer Multiple-Alignment-Analyse der Proteine, die in dem in 1-1 veranschaulichten phylogenetischen Baum enthalten sind.
    • [2-2] 2-2 ist ein Diagramm, das ein Ergebnis einer Multiple-Alignment-Analyse des Proteins, das in dem in 1-1 veranschaulichten phylogenetischen Baum enthalten ist, veranschaulicht und sich unten an 2-1 anschließt.
    • [2-3] 2-3 ist ein Diagramm, das ein Ergebnis einer Multiple-Alignment-Analyse des Proteins, das in dem in 1-1 veranschaulichten phylogenetischen Baum enthalten ist, veranschaulicht und sich unten an 2-2 anschließt.
    • [2-4] 2-4 ist ein Diagramm, das ein Ergebnis einer Multiple-Alignment-Analyse des Proteins, das in dem in 1-1 veranschaulichten phylogenetischen Baum enthalten ist, veranschaulicht und sich rechts an 2-1 anschließt.
    • [2-5] 2-5 ist ein Diagramm, das ein Ergebnis einer Multiple-Alignment-Analyse des Proteins, das in dem in 1-1 veranschaulichten phylogenetischen Baum enthalten ist, veranschaulicht und sich rechts an 2-2 anschließt.
    • [2-6] 2-6 ist ein Diagramm, das ein Ergebnis einer Multiple-Alignment-Analyse des Proteins, das in dem in 1-1 veranschaulichten phylogenetischen Baum enthalten ist, veranschaulicht und sich rechts an 2-3 anschließt.
    • [2-7] 2-7 ist ein Diagramm, das ein Ergebnis einer Multiple-Alignment-Analyse des Proteins, das in dem in 1-1 veranschaulichten phylogenetischen Baum enthalten ist, veranschaulicht und sich rechts an 2-4 anschließt.
    • [2-8] 2-8 ist ein Diagramm, das ein Ergebnis einer Multiple-Alignment-Analyse des Proteins, das in dem in 1-1 veranschaulichten phylogenetischen Baum enthalten ist, veranschaulicht und sich rechts an 2-5 anschließt.
    • [2-9] 2-9 ist ein Diagramm, das ein Ergebnis einer Multiple-Alignment-Analyse des Proteins, das in dem in 1-1 veranschaulichten phylogenetischen Baum enthalten ist, veranschaulicht und sich rechts an 2-6 anschließt.
    • [2-10] 2-10 ist ein Diagramm, das ein Ergebnis einer Multiple-Alignment-Analyse des Proteins, das in dem in 1-1 veranschaulichten phylogenetischen Baum enthalten ist, veranschaulicht und sich rechts an 2-7 anschließt.
    • [2-11] 2-11 ist ein Diagramm, das ein Ergebnis einer Multiple-Alignment-Analyse des Proteins, das in dem in 1-1 veranschaulichten phylogenetischen Baum enthalten ist, veranschaulicht und sich rechts an 2-8 anschließt.
    • [2-12] 2-12 ist ein Diagramm, das ein Ergebnis einer Multiple-Alignment-Analyse des Proteins, das in dem in 1-1 veranschaulichten phylogenetischen Baum enthalten ist, veranschaulicht und sich rechts an 2-9 anschließt.
    • [2-13] 2-13 ist ein Diagramm, das ein Ergebnis einer Multiple-Alignment-Analyse des Proteins, das in dem in 1-1 veranschaulichten phylogenetischen Baum enthalten ist, veranschaulicht und sich rechts an 2-10 anschließt.
    • [2-14] 2-14 ist ein Diagramm, das ein Ergebnis einer Multiple-Alignment-Analyse des Proteins, das in dem in 1-1 veranschaulichten phylogenetischen Baum enthalten ist, veranschaulicht und sich rechts an 2-11 anschließt.
    • [2-15] 2-15 ist ein Diagramm, das ein Ergebnis einer Multiple-Alignment-Analyse des Proteins, das in dem in 1-1 veranschaulichten phylogenetischen Baum enthalten ist, veranschaulicht und sich rechts an 2-12 anschließt.
    • [3-1] 3-1 ist ein Diagramm, das ein Ergebnis einer Multiple-Alignment-Analyse der Aminosäuresequenzen der SWEET-Proteine veranschaulicht, die in Nichtpatentliteratur 1 (Nature (2010), 468, 527-532) in die Klade III eingeordnet sind.
    • [3-2] 3-2 ist ein Diagramm, das ein Ergebnis einer Multiple-Alignment-Analyse der Aminosäuresequenzen der SWEET-Proteine, die in Nichtpatentliteratur 1 (Nature (2010), 468, 527-532) in die Klade III eingeordnet sind, veranschaulicht und sich unten an 3-1 anschließt.
    • [3-3] 3-3 ist ein Diagramm, das ein Ergebnis einer Multiple-Alignment-Analyse der Aminosäuresequenzen der SWEET-Proteine, die in Nichtpatentliteratur 1 (Nature (2010), 468, 527-532) in die Klade III eingeordnet sind, veranschaulicht und sich unten an 3-2 anschließt.
    • [4-1] 4-1 ist ein Diagramm, das ein Ergebnis einer Multiple-Alignment-Analyse von SWEET-Proteinen, die von Arabidopsis thaliana stammen, und SWEET-Proteinen, die von Oryza sativa stammen, in der Klade III veranschaulicht.
    • [4-2] 4-2 ist ein Diagramm, das ein Ergebnis einer Multiple-Alignment-Analyse von SWEET-Proteinen, die von Arabidopsis thaliana stammen, und SWEET-Proteinen, die von Oryza sativa stammen, in der Klade III veranschaulicht und sich unten an 4-1 anschließt.
    • [5] 5 ist ein Diagramm, das ein Ergebnis einer Multiple-Alignment-Analyse von SWEET-Proteinen in der Klade III, die von Arabidopsis thaliana stammen, veranschaulicht.
    • [6] 6 ist ein Konfigurationsdiagramm, das eine physische Karte der in Beispielen hergestellten Nukleinsäure AtSWEET/pRI201AN schematisch veranschaulicht.
    • [7] 7 ist eine Photographie des Teils, der in Arabidopsis unter in Beispielen beschriebenen Bedingungen Guttation erzeugt.
    • [8] 8 ist ein Konfigurationsdiagramm, das eine physische Karte der in Beispielen hergestellten Nukleinsäuren pZH2B_GWOx_AtSWEET11 und pZH2B_GWOx_AtSWEET12 schematisch veranschaulicht.
    • [9] 9 ist eine Photographie des Teils, der in Reis unter in Beispielen beschriebenen Bedingungen Guttation erzeugt.
  • BESCHREIBUNG VON AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Erfindung wird nachstehend im Detail beschrieben.
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Einführung einer Nukleinsäure, die ein bestimmtes an Zuckertransport beteiligtes Transporterprotein kodiert, und/oder die Verbesserung der Expression des Proteins. Auf diese Weise können von transformierten Pflanzen, bei welchen die Nukleinsäure in Zellen eingeführt ist und/oder die Expression des Proteins verbessert ist, Exsudate mit hohen Zuckerkonzentrationen gesammelt werden. Wie hierin verwendet, bezieht sich das Exsudat auf eine Flüssigkeit, die aus Pflanzengewebe austritt, einschließlich beispielsweise Wurzelexsudat, Samenexsudat, Guttationsflüssigkeit, die aus der Hydathode austritt. Das Phänomen, bei dem eine Flüssigkeit aus der Hydathode austritt, wird als Guttation bezeichnet. Daher ist Guttationsflüssigkeit gleichbedeutend mit Guttation. Insbesondere kann die transformierte Pflanze, bei der eine Nukleinsäure, die ein bestimmtes an Zuckertransport beteiligtes Transporterprotein kodiert, in Zellen eingeführt ist und/oder die Expression des Proteins verbessert ist, Guttation mit hohen Zuckerkonzentrationen produzieren.
  • Wie vorliegend verwendet, beinhaltet die Bedeutung von Nukleinsäure natürlicherweise vorkommende Nukleinsäuren, wie etwa DNA und RNA, künstliche Nukleinsäuren, wie etwa Peptidnukleinsäure (PNA), und Nukleinsäuremoleküle, in denen eine Basen-, Zucker- oder Phosphodiestereinheit chemisch modifiziert ist. Die Bedeutung der Nukleinsäure, die ein bestimmtes an Zuckertransport beteiligtes Transporterprotein kodiert, beinhaltet sowohl das Gen in dem Genom als auch das Transkriptionsprodukt des Gens.
  • Wie vorliegend verwendet, bezieht sich der Zucker auf eine Substanz, die durch die chemische Formel Cn(H2O)m repräsentiert wird, einschließlich Polysacchariden, Oligosacchariden, Disacchariden und Monosacchariden, einschließlich Aldehyd- und Ketonderivaten von Polyol sowie damit zusammenhängenden Derivaten und Kondensationsprodukten. Glucoside, in denen ein Agylcon, wie etwa Alkohol, Phenol, Saponin oder Pigment, an eine reduzierte Zuckergruppe gebunden ist, sind auch beinhaltet. Die Monosaccharide können basierend auf der Anzahl von Kohlenstoffatomen in Triose, Tetrose, Hexose oder Pentose unterteilt werden und können basierend auf einer funktionellen Gruppe in dem Molekül in Aldose mit einer Aldehydgruppe, Ketose mit einer Ketongruppe oder dergleichen unterteilt werden. Der Zucker kann gemäß der Konformation am asymmetrischen Kohlenstoff, der von der Aldehyd- oder Ketongruppe am weitesten entfernt ist, in D-Form und L-Form eingeteilt werden. Konkrete Beispiele für die Monosaccharide umfassen Glucose, Fructose, Galactose, Mannose, Xylose, Xylulose, Ribose, Erythrose, Threose, Erythrulose, Glycerinaldeyhd, Dihydroxyaceton, etc., und konkrete Beispiele für die Disaccharide umfassen Rohrzucker (Saccharose), Lactose, Maltose, Trehalose, Cellobiose, etc.
  • Die Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten im Vergleich zum Wildtyp signifikant erhöhte Mengen an Zucker in Exsudat wie Guttation, indem eine Nukleinsäure, die ein bestimmtes an Zuckertransport beteiligtes Transporterprotein kodiert, in Zellen eingeführt wird und/oder die Expression des Proteins verbessert wird. Das Protein kann in allen Zellen in dem Pflanzengewebe exprimiert werden oder es kann in mindestens einem Teil der Zellen in dem Pflanzengewebe exprimiert werden. Wie hierin verwendet, beinhaltet die Bedeutung des Pflanzengewebes die Pflanzenorgane wie Blatt, Stiel, Samen, Wurzel und Blüte. In der vorliegenden Erfindung bedeutet Einführen einer Nukleinsäure ein signifikantes Erhöhen der Molekülzahl pro Zelle der Nukleinsäure, die ein Transporterprotein kodiert, im Vergleich zu der Molekülzahl beim Wildtyp. In der vorliegenden Erfindung bedeutet Verbessern der Expression eines Transporterproteins ein Erhöhen der Expression seines Transkriptionsprodukts und/oder seines Translationsprodukts durch Modifizieren einer Expressionsregulationsregion einer Nukleinsäure, die das Transporterprotein kodiert, und/oder Injizieren der Nukleinsäure selbst in eine Zelle.
  • Gen eines an Zuckertransport beteiligten Transporterproteins
  • Die vorgenannte „Nukleinsäure, die ein bestimmtes an Zuckertransport beteiligtes Transporterprotein kodiert“, kodiert ein Transporterprotein, das eine die folgende Aminosäuresequenz umfassende Konsensussequenz 1 besitzt:
    • (L/I/V/M/F)x(G/A)xx(I/L/V/M/F)xxxx(L/I/V/F)(A/S)(P/S)(1-3aa)(P/S/T/A)T(F/L)xx(I/V)xxxKxxxxxxxxPYxxx(L/I)xxxx(L/I)x(I/L/M/V/F)xY(A/S/ G)(7-13aa)(I/L/V/M)(1-2aa)(I/V)Nxxxxxx(E/Q)xxYxxx(Y/F)xx(Y/F)(A/G/S)(35-36aa)(R/Q/H)xxxxGx(V/I/L)xxxxx(V/M/L/I/F)xxxx(A/S/T)P(L/M)x(I/V)(I/M/V/L)(2-7aa)(V/I)(V/I/M)x(T/S)x(S/N)xx(F/Y)(M/L)(P/S)(F/I/V/L)xLSxx(L/I)(T/V)xx(A/G)xx W(F/L)xYGxxxxDxx(V/I)xxPNxxGxx(F/L)(G/S)xxQ(M/I)x(L/M/I/V/F)(Y/H/F)
    und das an Zuckertransport beteiligt ist.
  • In der vorstehenden Aminosäuresequenz bezeichnet x einen beliebigen Aminosäurerest. In der Aminosäuresequenz geben die Bezeichnungen mit 2 durch - verbundenen Zahlen und das nachfolgende „aa“ an, dass sich an der Position eine Sequenz von beliebigen Aminosäuren befindet, und dass die Sequenz aus einer Reihe von Aminosäureresten besteht, wobei die Anzahl im Bereich zwischen den 2 Zahlen liegt. In der Aminosäuresequenz geben die Bezeichnungen mit mehreren Aminosäuren, die in einer Klammer durch / getrennt sind, an, dass sich eine der mehreren Aminosäuren an der Position befindet. Diese Notationsweise wird vorliegend in der Beschreibung der Aminosäuresequenzen gewählt.
  • Die oben gezeigte Aminosäuresequenz kann mit anderen Worten eine Aminosäuresequenz sein, in der die in SEQ ID NO: 1 aufgeführte Aminosäuresequenz, 1 bis 3 beliebige Aminosäurereste, die in SEQ ID NO: 2 aufgeführte Aminosäuresequenz, 7 bis 13 beliebige Aminosäurereste, die in SEQ ID NO: 3 aufgeführte Aminosäuresequenz, irgendein Aminosäurerest von I/L/V/M, 1 bis 2 Aminosäurereste, die in SEQ ID NO: 4 aufgeführte Aminosäuresequenz, 2 bis 7 Aminosäurereste und die in SEQ ID NO: 5 aufgeführte Aminosäuresequenz in dieser Reihenfolge vom N-Terminus zum C-Terminus verbunden sind.
  • Die ergänzende 8 in Nature (2010) 468, 527-534 offenbart einen phylogenetischen Baum von SWEETs, an Zuckertransport beteiligten Transporterproteinen, der auf den Aminosäuresequenzen basiert. Das Dokument offenbart SWEET-Proteine von Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana), SWEET-Proteine von Reis (Oryza sativa), SWEET-Proteine von Schneckenklee (Medicago trunculata), SWEET-Proteine von Chlamydomonas reinhardtii, SWEET-Proteine von Physcomitrella patens, SWEET-Proteine von Petunia hybrida, SWEET-Proteine von Caenorhabditis elegans und SWEET-Proteine von Säugetieren. Diesem phylogenetischen Baum zufolge versteht sich, dass SWEETs, an Zuckertransport beteiligte Transporterproteine, basierend auf der Ähnlichkeit der Aminosäuresequenz in fünf Kladen von I bis V eingeteilt werden.
  • Die nachstehende Tabelle 1 zeigt entsprechende GenBank-ID-Nummern, Indizes der proteinkodierenden Regionen, die aus den Genomdaten errechnet wurden (Index im Genom), Gennamen, Proteinnamen, Abkürzungen der Proteine, SWEET-Protein-Kladennummern und Spezies der Ursprungsorganismen von SWEET-Proteinen von Arabidopsis thaliana, SWEET-Proteinen von Oryza sativa und SWEET-Proteinen von Medicago trunculata sowie eines SWEET-Proteins von Petunia hybrida aus den an Zuckertransport beteiligten Transporterproteinen SWEETs, die in dem Dokument offenbart sind. [Tabelle 1]
    GenBank (NCBI) ID-Nr #1 GenBank (NCBI) ID-Nr. #3 Index Im Genom Genname Kodiertes Protein Abkürzung von kodiertem Protein SWEET-Klade Organismus
    NP_564140 SWET1_ARATH At1g21460 AtSWEET1 AtSWEET1 AtSW01 I Arabidopsis thaliana
    NP_566493 SWET2_ARATH At3g14770 AtSWEET2 AtSWEET2 AtSW02 I Arabidopsis thaliana
    NP_200131 SWET3_ARATH At5g53190 AtSWEET3 AtSWEET3 AtSW03 I Arabidopsis thaliana
    NP_566829 SWET4_ARATH At3g28007 AtSWEET4 AtSWEET4 AtSW04 II Arabidopsis thaliana
    NP_201091 SWET5_ARATH At5g62850 AtSWEET5 AtSWEET5 AtSW05 II Arabidopsis thaliana
    NP_176849 SWET6_ARATH At1g66770 AtSWEET6 AtSWEET6 AtSW06 II Arabidopsis thaliana
    NP_567366 SWET7_ARATH At4g10850 AtSWEET7 AtSWEET7 AtSW07 II Arabidopsis thaliana
    NP_568579 SWET8_ARATH At5g40260 AtSWEET8 AtSWEET8 AtSW08 II Arabidopsis thaliana
    NP_181439 AAM63257 At2g39060 AtSWEET9 AtSWEET9 AtSW09 III Arabidopsis thaliana
    NP_199892 AED95992 At5g50790 AtSWEET10 AtSWEET10 AtSW10 III Arabidopsis thaliana
    NP_190443 AEE78451 At3g48740 ATSWEET11 ATSWEET11 AtSW11 III Arabidopsis thaliana
    NP_197755 AED93195 At5g23660 AtSWEET12 AtSWEET12 AtSW12 III Arabidopsis thaliana
    NP_199893 AED95993 At5g50800 AtSWEET13 AtSWEET13 AtSW13 III Arabidopsis thaliana
    NP_194231 AEE84991 At4g25010 AtSWEET14 AtSWEET14 AtSW14 III Arabidopsis thaliana
    NP_196821 AED91859 At5g13170 AtSWEET15 AtSWEET15 AtSW15 III Arabidopsis thaliana
    NP_188291 SWT16_ARATH At3g16690 AtSWEET16 AtSWEET16 AtSW16 IV Arabidopsis thaliana
    NP_193327 SWT17_ARATH At4g15920 AtSWEET17 AtSWEET17 AtSW17 IV Arabidopsis thaliana
    NP_001044998 SWT1A_ORYSJ Os01g0881300 OsSWEET1a OsSWEET1a OsSW01a I Oryza sativa
    NP_001055599 SWT1B_ORYSJ Os05g0426000 OsSWEET1b OsSWEET1b OsSW01b I Oryza sativa
    NP_001043270 SWT2A_ORYSJ Os01g0541800 OsSWEET2a OsSWEET2a OsSW02a I Oryza sativa
    NP_001043983 SWT2B_ORYSJ Os01g0700100 OsSWEET2b OsSWEET2b OsSW02b I Oryza sativa
    NP_001054926 SWT3A_ORYSJ 0s05g0214300 OsSWEET3a OsSWEET3a OsSW03a I Oryza sativa
    NP_001042428 SWT3B_ORYSJ 0s01g0220700 OsSWEET3b OsSWEET3b OsSW03b I Oryza sativa
    NP_001046621 SWET4_ORYSJ Os02g0301100 OsSWEET4 OsSWEET4 OsSW04 II Oryza sativa
    NP_001056475 SWET5_ORYSJ Os05g0588500 OsSWEET5 OsSWEET5 OsSW05 II Oryza sativa
    NP_001043523 SWT6A_ORYSJ Os01g0606000 OsSWEET6a OsSWEET6a OsSW06a II Oryza sativa
    NP_001043522 SWT6B_ORYSJ Os01g0605700 OsSWEET6b OsSWEET6b OsSW06b II Oryza sativa
    NP_001062690 SWT7A_ORYSJ Os09g0254600 OsSWEET7a OsSWEET7a OsSW07a II Oryza sativa
    NP_001062702 SWT7B_ORYSJ Os09g0258700 OsSWEET7b OsSWEET7b OsSW07b II Oryza sativa
    SWT7C ORYSJ Os12g0178500 OsSWEET7c OsSWEET7c OsSW07c II Oryza sativa
    NP_001062354 - 0s08g0535200 OsSWEET11 OsSWEET11 OsSW11 III Oryza sativa
    NP_001050099 - 0s03g0347500 OsSWEET12 OsSWEET12 OsSW12 III Oryza sativa
    SWT13_ORYSJ - Os12g0476200 OsSWEET13 OsSWEET13 OsSW13 III Oryza sativa
    NP_001067955 - Os11g0508600 OsSWEET14 OsSWEET14 OsSW14 III Oryza saliva
    NP_001046944 - Os02g0513100 OsSWEET15 OsSWEET15 OsSW15 III Oryza sativa
    NP_001050071 SWT16_ORYSJ Os03g0341300 OsSWEET16 OsSWEET16 OsSW16 IV Oryza sativa
    XP_003617528 - Medtr5g092600 MtSWEET9 MtSWEET9 MtSW09 III Medicago trunculata
    XP_003602780 - Medtr3g098930 MtSWEET10a MtSWEET10a MtSW10a III Medicago trunculata
    AFK35161 - - MtSWEET10b MtSWEET10b MtSW10b III Medicago trunculata
    CAC44123 - - MtSWEET10c MtSWEET10c MtSW10c III Medicagotrunculata
    NOD3_MEDTR - - NOD3 MtSWEET15a MtSW15a III Medicago trunculata
    XP_003620983 - Medtr7g005690 MtSWEET15b MtSWEET15b MtSW15b III Medicago trunculata
    XP_003615405 - Medtr5g067530 MtSWEET15c MtSWEET15c MtSW15c III Medicago trunculata
    XP_003593107 - Medtr2g007890 MtSWEET15d MtSWEET15d MtSW15d III Medicago trunculata
    NEC1_PETHY - - NEC1 PhNEC1 PhNEC1 III Petunia hybrida
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich das Wort AtSWEET auf AtSWEET1, AtSWEET2, AtSWEET3, AtSWEET4, AtSWEET5, AtSWEET6, AtSWEET7, AtSWEET8, AtSWEET9, AtSWEET10, AtSWEET11, AtSWEET12, AtSWEET13, AtSWEET14, AtSWEET15, AtSWEET16 und AtSWEET17 in Tabelle 1, und das Wort OsSWEET bezieht sich auf OsSWEET1a, OsSWEET1b, OsSWEET2a, OsSWEET2b, OsSWEET3a, OsSWEET3b, OsSWEET4, OsSWEET5, OsSWEET6a, OsSWEET6b, OsSWEET7a, OsSWEET7b, OsSWEET7c, OsSWEET11, OsSWEET12, OsSWEET13, OsSWEET14, OsSWEET15 und OsSWEET16 in Tabelle 1.
  • Die oben beschriebene Konsensussequenz 1 ist eine Aminosäuresequenz, die durch ClustalW und multiples Alignment (2-1 bis 2-15) aus einem phylogenetischen Baum (1-1 bis 1-3) generiert wurde, welcher basierend auf der der GenBank-Datenbank entnommenen Information über Aminosäuresequenzen von SWEET-Proteinen in der im vorgenannten Dokument definierten Klade III erstellt wurde. Demgemäß beinhalten die vorgenannten an Zuckertransport beteiligten Transporterproteine mit Konsensussequenz 1 die in dem vorgenannten Dokument in Klade III eingeordneten SWEET-Proteine, jedoch keine in dem vorgenannten Dokument in eine der Kladen I, II, IV und V eingeordneten SWEET-Proteine. Mit anderen Worten ist die oben beschriebene Konsensussequenz 1 eine für die in dem vorgenannten Dokument in Klade III eingeordneten SWEET-Proteine sowie für die der GenBank-Datenbank entnommenen, in Klade III eingeordneten SWEET-Proteine charakteristische Sequenz und ist ein Kriterium für die klare Unterscheidung von jenen in Klade I, II, IV und V gemäß dem vorgenannten Dokument.
  • 1-1 veranschaulicht ein Gesamtbild des phylogenetischen Baums, und die 1-2 bis 1-3 veranschaulichen die Vergrößerung von Teilbereichen des in 1-1 gezeigten Gesamtbildes. Das in 1-1 gezeigte Gesamtbild enthält weder GenBank-ID noch Proteinnamen. Die in den 1-2 bis 1-3 gezeigten Teilbereiche enthalten GenBank-IDs und Proteinnamen.
  • Konkrete Beispiele für Klade III umfassen neben den in Tabelle 1 aufgeführten SWEET-Proteinen, die von Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana), Reis (Oryza sativa), Schneckenklee (Medicago truncatula) und Petunie (Petunia hybrida) stammen, SWEET-Proteine, die von Sojabohne (Glycine max), Japanischem Hornklee (Lotus japonicus), Tomate (Solanum lycopersicum), spanischem Pfeffer (Capsicum annuum), Kichererbse (Cicer arietinum), Gurke (Cucumis sativus), Pfirsich (Prunus persica), Erdbeere (Fragaria vesca), Weinrebe (Vitisvinifera), Capsella rubella, Pappel (Populus trichocarpa), Rizinus (Ricinus communis), Mais (Zea mays), Hirse (Sorghum bicolor), Tauschs Ziegengras (Aegilops tauschii), Zwenke (Brachypodium distachyon), Rotem Wildeinkorn (Triticum urartu), Gerste (Hordeum vulgare), etc. stammen, wie in 1-1 bis 1-3 gezeigt.
  • Nachstehende Tabelle 2 zeigt entsprechende GenBank-ID-Nummern, Gennamen, Spezies der Ursprungsorganismen und SEQ ID NOs von Aminosäuresequenzen jener SWEET-Proteine aus diesen in Klade III beinhalteten SWEET-Proteinen, die von Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Medicago denticulata und Petunia hybrida stammen und in Tabelle 1 aufgeführt sind. [Tabelle 2]
    GenBank-ID Genname Spezies des Ursprungsorganismus SEQ ID NO der Aminosäuresequenz
    NP_181439 AtSWEET9 Arabidopsis thaliana SEQ ID NO: 15
    NP_199892 AtSWEET10 Arabidopsis thaliana SEQ ID NO: 16
    NP_190443 AtSWEET11 Arabidopsis thaliana SEQ ID NO: 17
    NP_197755 AtSWEET12 Arabidopsis thaliana SEQ ID NO: 18
    NP_199893 AtSWEET13 Arabidopsis thaliana SEQ ID NO: 19
    NP_194231 AtSWEET14 Arabidopsis thaliana SEQ ID NO: 20
    NP_196821 AtSWEET15 Arabidopsis thaliana SEQ ID NO: 21
    NP_001062354 OsSWEET11 Oryza sativa SEQ ID NO: 22
    NP_001050099 OsSWEET12 Oryza sativa SEQ ID NO: 23
    SWT13_ORYSJ OsSWEET13 Oryza sativa SEQ ID NO: 24
    NP_001067955 OsSWEET14 Oryza sativa SEQ ID NO: 25
    NP_001046944 OsSWEET15 Oryza sativa SEQ ID NO: 26
    XP_003617528 MtSWEET9 Medicago denticulata SEQ ID NO: 27
    XP_003602780 MtSWEET10a Medicago denticulata SEQ ID NO: 28
    AFK35161 MtSWEET10b Medicago denticulata SEQ ID NO: 29
    CAC44123 MtSWEET10c Medicago denticulata SEQ ID NO: 30
    NOD3_MEDTR NOD3 Medicago denticulata SEQ ID NO: 31
    XP_003620983 MtSWEET15b Medicago denticulata SEQ ID NO: 32
    XP_003615405 MtSWEET15c Medicago denticulata SEQ ID NO: 33
    XP_003593107 MtSWEET15d Medicago denticulata SEQ ID NO: 34
    NEC1_PETHY NEC1 Petunia hybrida SEQ ID NO: 35
  • Die nachstehenden Tabellen 3, 4 und 5 zeigen entsprechende GenBank-ID-Nummern, Spezies der Ursprungsorganismen und SEQ ID NOs von Aminosäuresequenzen der in 1-1 bis 1-3 gezeigten SWEET-Proteine, die von Organismen anderer Spezien stammen als von Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Medicago denticulata und Petunia hybrida. [Tabelle 3]
    GenBank-ID Spezies des Ursprungsorganismus SEQ ID NO der Aminosäuresequenz
    ACV71016 Capsicum annuum SEQ ID NO: 36
    AFK39311 Lotus japonicus SEQ ID NO: 37
    AFK48645 Lotus japonicus SEQ ID NO: 38
    AFW71563 Zea mays SEQ ID NO: 39
    AFW88409 Zea mays SEQ ID NO: 40
    BAJ85621 Hordeum vulgare SEQ ID NO: 41
    BAJ94651 Hordeum vulgare SEQ ID NO: 42
    BAJ99068 Hordeum vulgare SEQ ID NO: 43
    BAK07340 Hordeum vulgare SEQ ID NO: 44
    CBI15715 Vitis vinifera SEQ ID NO: 45
    CBI32263 Vitis vinifera SEQ ID NO: 46
    EAZ09693 Oryza sativa Indica SEQ ID NO: 47
    EMJ01437 Prunus persica SEQ ID NO: 48
    EMJ10621 Prunus persica SEQ ID NO: 49
    EMJ23678 Prunus persica SEQ ID NO: 50
    EMS45810 Triticum urartu SEQ ID NO: 51
    EMS46194 Triticum urartu SEQ ID NO: 52
    EMS51422 Triticum urartu SEQ ID NO: 53
    EMT09236 Aegilops tauschii SEQ ID NO: 54
    EMT11081 Aegilops tauschii SEQ ID NO: 55
    EMT20480 Aegilops tauschii SEQ ID NO: 56
    EMT20481 Aegilops tauschii SEQ ID NO: 57
    EMT20808 Aegilops tauschii SEQ ID NO: 58
    EMT31030 Aegilops tauschii SEQ ID NO: 59
    EMT31640 Aegilops tauschii SEQ ID NO: 60
    EOA14646 Capsella rubella SEQ ID NO: 61
    EOA14916 Capsella rubella SEQ ID NO: 62
    EOA17919 Capsella rubella SEQ ID NO: 63
    EOA21276 Capsella rubella SEQ ID NO: 64
    EOA22072 Capsella rubella SEQ ID NO: 65
    EOA24501 Capsella rubella SEQ ID NO: 66
    EOA28959 Capsella rubella SEQ ID NO: 67
    NP_001132836 Zea mays SEQ ID NO: 68
    NP_001141106 Zea mays SEQ ID NO: 69
    NP_001141654 Zea mays SEQ ID NO: 70
    NP_001148964 Zea mays SEQ ID NO: 71
    [Tabelle 4]
    GenBank-ID Spezies des Ursprungsorganismus SEQ ID NO der Aminosäuresequenz
    NP_001149028 Zea mays SEQ ID NO: 72
    NP_001237418 Glycine max SEQ ID NO: 73
    NP_001239695 Glycine max SEQ ID NO: 74
    NP_001241307 Glycine max SEQ ID NO: 75
    NP_001242732 Glycine max SEQ ID NO: 76
    XP_002264875 Vitis vinifera SEQ ID NO: 77
    XP_002267792 Vitis vinifera SEQ ID NO: 78
    XP_002284244 Vitis vinifera SEQ ID NO: 79
    XP_002299333 Populus trichocarpa SEQ ID NO: 80
    XP_002321730 Populus trichocarpa SEQ ID NO: 81
    XP_002321731 Populus trichocarpa SEQ ID NO: 82
    XP_002322281 Populus trichocarpa SEQ ID NO: 83
    XP_002333315 Populus trichocarpa SEQ ID NO: 84
    XP_002442119 Sorghum bicolor SEQ ID NO: 85
    XP_002443167 Sorghum bicolor SEQ ID NO: 86
    XP_002444688 Sorghum bicolor SEQ ID NO: 87
    XP_002450786 Sorghum bicolor SEQ ID NO: 88
    XP_002453892 Sorghum bicolor SEQ ID NO: 89
    XP_002462642 Sorghum bicolor SEQ ID NO: 90
    XP_002465280 Sorghum bicolor SEQ ID NO: 91
    XP_002511126 Ricinus communis SEQ ID NO: 92
    XP_002511127 Ricinus communis SEQ ID NO: 93
    XP_002511128 Ricinus communis SEQ ID NO: 94
    XP_002514863 Ricinus communis SEQ ID NO: 95
    XP_002520679 Ricinus communis SEQ ID NO: 96
    XP_002862913 Arabiopsis lyrata SEQ ID NO: 97
    XP_003518628 Glycine max SEQ ID NO: 98
    XP_003523161 Glycine max SEQ ID NO: 99
    XP_003524088 Glycine max SEQ ID NO: 100
    XP_003530901 Glycine max SEQ ID NO: 101
    XP_003547573 Glycine max SEQ ID NO: 102
    XP_003561640 Brachypodium distachyon SEQ ID NO: 103
    XP_003572455 Brachypodium distachyon SEQ ID NO: 104
    XP_003575028 Brachypodium distachyon SEQ ID NO: 105
    XP_003576036 Brachypodium distachyon SEQ ID NO: 106
    XP_003576225 Brachypodium distachyon SEQ ID NO: 107
    [Tabelle 5]
    GenBank-ID Spezies des Ursprungsorganismus SEQ ID NO der Aminosäuresequenz
    XP_003578398 Brachypodium distachyon SEQ ID NO: 108
    XP_004138032 Cucumis sativus SEQ ID NO: 109
    XP_004138250 Cucumis sativus SEQ ID NO: 110
    XP_004138978 Cucumis sativus SEQ ID NO: 111
    XP_004138979 Cucumis sativus SEQ ID NO: 112
    XP_004140547 Cucumis sativus SEQ ID NO: 113
    XP_004145146 Cucumis sativus SEQ ID NO: 114
    XP_004153501 Cucumis sativus SEQ ID NO: 115
    XP_004161952 Cucumis sativus SEQ ID NO: 116
    XP_004235326 Solanum lycopersicum SEQ ID NO: 117
    XP_004235333 Solanum lycopersicum SEQ ID NO: 118
    XP_004235334 Solanum lycopersicum SEQ ID NO: 119
    XP_004235339 Solanum lycopersicum SEQ ID NO: 120
    XP_004235340 Solanum lycopersicum SEQ ID NO: 121
    XP_004235342 Solanum lycopersicum SEQ ID NO: 122
    XP_004235470 Solanum lycopersicum SEQ ID NO: 123
    XP_004241452 Solanum lycopersicum SEQ ID NO: 124
    XP_004247459 Solanum lycopersicum SEQ ID NO: 125
    XP_004297511 Fragaria vesca SEQ ID NO: 126
    XP_004297512 Fragaria vesca SEQ ID NO: 127
    XP_004301046 Fragaria vesca SEQ ID NO: 128
    XP_004302124 Fragaria vesca SEQ ID NO: 129
    XP_004489106 Cicer arietinum SEQ ID NO: 130
    XP_004503778 Cicer arietinum SEQ ID NO: 131
  • Die 2-1 bis 2-15 veranschaulichen ein Ergebnis einer Alignment-Analyse der Aminosäuresequenzen der in Tabelle 2 bis 5 aufgeführten, von verschiedenen Organismen stammenden SWEET-Proteine unter Verwendung des ClustalW multiple-Sequenz-Alignment-Programms (erhältlich in DDBJ am National Institute of Genetics). Die Version und verschiedene Parameter, die bei der Analyse verwendet wurden, sind nachstehend ausgewiesen.
  • ClustalW-Version, 2.1
    • - Parameter des paarweisen Alignments
      • - - Alignment-Typ: langsam
      • - - Optionen des langsamen paarweisen Alignments
      • - - Protein Weight Matrix, Gonnet
        • - - - Gap Open, 10
        • - - - Gap Extension, 0,1
  • Parameter des multiplen Sequenz-Alignments
    • - Protein Weight Matrix, Gonnet
    • - Gap Open, 10
    • - Gap-Erweiterung, 0,20
    • - Gap-Abstände, 5
    • - keine End-Gaps, nein
    • - Wiederholung, keine
    • - Max. Anzahl Wiederholungen, 1
    • - Clustering, NJ
  • Ausgabeoptionen
    • - Format, Aln mit Zahlen
    • - Reihenfolge, Aligned
  • Für die vorgenannten, in Klade III der SWEET-Proteine eingeordneten SWEET-Proteine wird festgestellt, dass sie die oben beschriebene Konsensussequenz 1 besitzen, wie in 2-1 bis 2-15 gezeigt. Die Variationen von Aminosäureresten, die an den bestimmten Positionen in der oben aufgezeigten Konsensussequenz 1 auftreten können, beruhen auf den folgenden Gründen. Es ist wohlbekannt, dass Aminosäuren gemäß ihren Seitenketten mit ähnlichen Eigenschaften (chemische Eigenschaften und physische Größe) unterteilt werden, wie in Entgegenhaltung (1) („McKee's Biochemistry“, 3rd edition, Chapter 5 Amino acid, peptide, protein, 5.1 Amino acid, japanische Ausgabe betreut von Atsuhi Ichikawa, Übersetzung betreut von Shinnichi Fukuoka, herausgegeben von Ryosuke Sone der Kagaku-Dojin Publishing Company, inc., ISBN4-7598-0944-9) beschrieben. Auch ist wohlbekannt, dass in der molekularen Evolution häufig ein Substitutionsvorgang zwischen Aminosäureresten erfolgt, die in eine bestimmte Gruppe eingeordnet sind, während die Aktivität des Proteins erhalten bleibt. Basierend auf diesem Gedanken wird in 2 in Entgegenhaltung (2): Henikoff S., Henikoff J.G., Amino-acid substitution matrices from protein blocks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10915-10919 (1992) eine Score-Matrix (BLOSUM) für die Aminosäurerestsubstitution vorgeschlagen und in großem Umfang verwendet. Entgegenhaltung (2) basiert auf den Erkenntnissen, dass die Substitution zwischen Aminosäuren, die Seitenketten mit ähnlichen chemischen Eigenschaften besitzen, eine geringere Auswirkung auf die Struktur und Funktion des gesamten Proteins hat. Gemäß den oben erwähnten Entgegenhaltungen (1) und (2) können die Gruppen von Seitenketten von Aminosäuren, die beim multiplen Alignment zu berücksichtigen sind, jene sein, die auf Kennzahlen für chemische Eigenschaften, der physischen Größe, etc. basieren. Diese sind als die Gruppen von Aminosäuren mit Scores von 0 oder mehr, oder vorzugsweise Aminosäuren mit 1 oder mehr in der in Entgegenhaltung (2) offenbarten Score-Matrix (BLOSUM) ausgewiesen. Repräsentative Gruppen umfassen die folgenden 8 Gruppen. Eine weitere Untergruppierung können die Gruppen von Aminosäuren mit Scores von 0 oder mehr, bevorzugt die Gruppen von Aminosäuren mit Scores von 1 oder mehr oder bevorzugter die Gruppen von Aminosäuren mit Scores von 2 oder mehr sein.
  • 1) Gruppe aliphatischer hydrophober Aminosäuren (ILMV-Gruppe)
  • Aus den in oben genannter Entgegenhaltung (1) ausgewiesenen neutralen, unpolaren Aminosäuren ist diese Gruppe eine Gruppe der Aminosäuren, die eine aliphatische hydrophobe Seitenkette besitzt und aus Valin (V, Val), Leucin (L, Leu), Isoleucin (I, Ile) und Methionin (M, Met) besteht. Aus den in Entgegenhaltung (1) als neutrale, unpolare Aminosäuren eingeordneten Aminosäuren sind FGACWP aus den folgenden Gründen nicht in dieser „Gruppe aliphatischer hydrophober Aminosäuren“ beinhaltet. Glycin (G, Gly) und Alanin (A, Ala) besitzen schwache Wirkungen der unpolaren Gruppen, da deren Größe nicht größer ist als jene der Methylgruppe. Cystein (C, Cys) kann bei der S-S-Bindung eine wichtige Rolle spielen und kann in der Natur auch eine Eigenschaft des Bildens einer Wasserstoffbindung mit dem Sauerstoffatom und dem Stickstoffatom besitzen. Phenylalanin (F, Phe) und Tryptophan (W, Trp) besitzen eine Seitenkette mit einem hohen Molekulargewicht und eine starke Wirkung der aromatischen Gruppe. Prolin (P, Pro) besitzt eine starke Wirkung der Iminosäuregruppe und fixiert den Winkel der Hauptkette des Polypeptids.
  • 2) Gruppe mit Hydroxymethylengruppe (ST-Gruppe)
  • Von den neutralen, polaren Aminosäuren ist diese Gruppe eine Gruppe von Aminosäuren, die eine Hydroxymethylengruppe in der Seitenkette besitzt und aus Serin (S, Ser) und Threonin (T, Thr) besteht. Da die Hydroxylgruppe in den Seitenketten von S und T eine Zuckerbindestelle ist, sind diese häufig wichtige Stellen für eine bestimmte Aktivität eines bestimmten Polypeptids (Proteins).
  • 3) Saure Aminosäure (DE-Gruppe)
  • Diese Gruppe ist eine Gruppe von Aminosäuren mit einer sauren Carboxylgruppe in der Seitenkette und besteht aus Asparaginsäure (D, Asp) und Glutaminsäure (E, Glu).
  • 4) Basische Aminosäure (KR-Gruppe)
  • Diese Gruppe ist eine Gruppe der basischen Aminosäuren und besteht aus Lysin (K, Lys) und Arginin (R, Arg). Diese, K und R, sind positiv geladen und zeigen basische Eigenschaften in einem breiten pH-Bereich. Dagegen wird Histidin (H, His), das als eine basische Aminosäure eingestuft wird, nicht in diese Gruppe eingeordnet, da es bei pH 7 kaum ionisiert wird.
  • 5) Methylengruppe=polare Gruppe (DHN-Gruppe)
  • In dieser Gruppe besitzen alle Aminosäuren charakteristischerweise als eine Seitenkette eine an das α-Kohlenstoffatom gebundene Methylengruppe und eine an die Methylengruppe gebundene polare Gruppe. Sie sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Methylengruppe ähnlicher physischer Größe besitzen, welche eine unpolare Gruppe ist, und die Gruppe besteht aus Asparagin (N, Asn, die polare Gruppe ist die Amidogruppe), Asparaginsäure (D, Asp, die polare Gruppe ist die Carboxylgruppe) und Histidin (H, His, die polare Gruppe ist die Imidazolgruppe).
  • 6) Dimethylengruppe=polare Gruppe (EKQR-Gruppe)
  • In dieser Gruppe besitzen alle Aminosäuren charakteristischerweise als eine Seitenkette einen linearen Kohlenwasserstoff, der gleich lang oder länger ist als die an das α-Kohlenstoffatom gebundene Dimethylengruppe, und eine an den Kohlenwasserstoff gebundene polare Gruppe. Sie sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Dimethylengruppe ähnlicher physischer Größe besitzen, welche eine unpolare Gruppe ist. Die Gruppe besteht aus Glutaminsäure (E, Glu, die polare Gruppe ist die Carboxylgruppe), Lysin (K, Lys, die polare Gruppe ist die Aminogruppe), Glutamin (Q, Gln, die polare Gruppe ist die Amidogruppe) und Arginin (R, Arg, die polaren Gruppen sind die Iminogruppe und die Aminogruppe).
  • 7) Aromatisch (FYW-Gruppe)
  • Diese Gruppe ist eine Gruppe von aromatischen Aminosäuren, die einen Benzolkern in der Seitenkette besitzen und durch chemische Eigenschaften gekennzeichnet sind, die aromatischen Gruppen zu eigen sind. Die Gruppe besteht aus Phenylalanin (F, Phe), Tyrosin (Y, Tyr) und Tryptophan (W, Trp).
  • 8) Cyclisch & polar (HY-Gruppe)
  • Diese Gruppe ist eine Gruppe von Aminosäuren mit einer Ringstruktur und Polarität in der Seitenkette und besteht aus Histidin (H, His, die Ringstruktur und die polare Gruppe sind beide die Imidazolgruppe), Tyrosin (Y, Tyr, die Ringstruktur ist der Benzolkern und die polare Gruppe ist die Hydroxylgruppe).
  • Basierend auf den vorgenannten Aminosäuregruppen steht ohne Weiteres zu erwarten, dass die Substitution eines Aminosäurerests in der Aminosäuresequenz eines Proteins, das eine bestimmte Funktion besitzt, durch einen Aminosäurerest in derselben Gruppe zu einem neuen Protein mit einer ähnlichen Funktion führt. Beispielsweise steht basierend auf der vorgenannten „1) Gruppe aliphatischer hydrophober Aminosäuren (ILMV-Gruppe)“ ohne Weiteres zu erwarten, dass die Substitution eines Isoleucinrests in der Aminosäuresequenz eines Proteins, das eine bestimmte Funktion besitzt, durch einen Leucinrest zu einem neuen Protein mit einer ähnlichen Funktion führt. Falls es mehrere Proteine mit einer bestimmten Funktion gibt, können ihre Aminosäuresequenzen als eine Konsensussequenz ausgedrückt werden. Auch in einem solchen Fall steht ohne weiteres zu erwarten, dass die Substitution eines Aminosäurerestes durch einen Aminosäurerest in derselben Gruppe zu einem neuen Protein mit einer ähnlichen Funktion führt. Falls es beispielsweise mehrere Proteine mit einer bestimmten Funktion gibt und ein Aminosäurerest in der daraus berechneten Konsensussequenz Isoleucin oder Leucin (L/I) ist, steht basierend auf der vorgenannten „1) Gruppe aliphatischer hydrophober Aminosäuren (ILMV-Gruppe)“ ohne Weiteres zu erwarten, dass die Substitution des Isoleucin- oder Leucinrests durch einen Methionin- oder Valinrest zu einem neuen Protein mit einer ähnlichen Funktion führt.
  • Das vorgenannte „bestimmte an einem Zuckertransport beteiligte Transporterprotein“ kann als ein Protein mit Konsensussequenz 2 definiert werden, welche aus einer Aminosäuresequenz besteht, bei der bestimmte Aminosäurereste an der N-terminalen Seite und der C-terminalen Seite der oben beschriebenen Konsensussequenz 1 angefügt sind und die Variationen von Aminosäuren, die an bestimmten Positionen vorliegen können, beschränkt sind. Die Aminosäuresequenz von Konsensussequenz 2 lautet wie folgt.
    • G(L/I/V/F/M)xGx(I/V/L)(I/V/L)(S/T)xxxxL(A/S)P(L/V/I/M)(P/S/T/A)TFxx(I/V)x(K/R )xK(S/T)xxx(F/Y)x(S/A)xPYxx(A/S/T)LxSxxLx(L/I/M/V)(Y/F)Y(A/G)(7-9aa)(L/I)(I/V/L)(T/S)INxx(G/A)xx(I/V/M)(E/Q)xxYxxx(F/Y)(L/I/V/F)x(Y/F)Ax(K/R/ N)xxxxx(T/A)(7-8aa)(V/F/L/I/M)( 18-19aa)(R/Q/H)xxxxGx(I/V)xxxxx(V/I/L/M)x(V/M)F(A/V)(A/S/T)PLx(I/V)(I/M/V/L)xx V(I/V)(K/R/Q)(T/S)(K/R)S(V/A)x(F/Y)MP(F/I/L)xLS(L/F/V)xL(T/V)(L/I)xAxxW(F/L )xYG(L/F)xxxDxx(V/I)xxPNxxGxx(L/F)(G/S)xxQMx(L/V/I)(Y/F)xx(Y/F)
  • Die Aminosäuresequenz von Konsensussequenz 2 kann mit anderen Worten eine Aminosäuresequenz sein, bei der die in SEQ ID NO: 6 aufgeführte Aminosäuresequenz, 7 bis 9 beliebige Aminosäurereste, die in SEQ ID NO: 7 aufgeführte Aminosäuresequenz, 7 bis 8 beliebige Aminosäurereste, irgendein Aminosäurerest von V/F/L/I/M, 18 bis 19 Aminosäurereste und die in SEQ ID NO: 8 aufgeführte Aminosäuresequenz in dieser Reihenfolge vom N-Terminus zum C-Terminus verbunden sind.
  • Konsensussequenz 2 ist eine Aminosäuresequenz, die SWEET-Proteinen, die im vorgenannten Dokument in Klade III eingeordnet sind, gemeinsam ist. Genauer gesagt ist Konsensussequenz 2 eine Aminosäuresequenz, die aus einem multiplen Alignment generiert wird, das, wie oben beschrieben, durch die ClustalW-Analyse der aus Arabidopsis thaliana stammenden, an Zuckertransport beteiligten Transporterproteine, der aus Oryza sativa stammenden, an Zuckertransport beteiligten Transporterproteine, der aus Medicago denticulata stammenden, an Zuckertransport beteiligten Transporterproteine und der aus Petunia hybrida stammenden, an Zuckertransport beteiligten Transporterproteine, welche im vorgenannten Dokument in Klade III eingeordnet sind, erhalten wird. Daher ist Konsensussequenz 2 eine für die in den vorgenannten Dokumenten in Klade III eingeordneten SWEET-Proteine charakteristische Sequenz und ist ein Kriterium für die klare Unterscheidung von jenen in Klade I, II, IV und V gemäß dem vorgenannten Dokument.
  • Die 1-3 bis 3-3 veranschaulichen ein Ergebnis einer Alignment-Analyse der Aminosäuresequenzen der in dem vorgenannten Dokument in Klade III eingeordneten SWEET-Proteine unter Verwendung des ClustalW multiple-Sequenz-Alignment-Programms (erhältlich in DDBJ am National Institute of Genetics; die Version und verschiedene Parameter, welche in der Analyse verwendet wurden, sind wie oben beschrieben). Für die in dem vorgenannten Dokument in Klade III eingeordneten SWEET-Proteine wird festgestellt, dass sie die oben beschriebene Konsensussequenz 2 besitzen, wie in den 3-1 bis 3-3 gezeigt.
  • Ferner kann das vorgenannte „bestimmte an einem Zuckertransport beteiligte Transporterprotein“ als ein Protein mit Konsensussequenz 3 definiert werden, die aus einer Aminosäuresequenz besteht, bei der bestimmte Aminosäurereste an der N-terminalen Seite der oben beschriebenen Konsensussequenz 2 angefügt sind und die Variationen von Aminosäuren, die an bestimmten Positionen vorliegen können, beschränkt sind. Die Aminosäuresequenz von Konsensussequenz 3 lautet wie folgt.
    • (A/V)xxxG(I/L/V)xGN(I/L/V)(I/L/V)S(F/L)x(V/T)xL(A/S)P(V/L/I)(P/A)TFxx(I/V)x(K /R)xK(S/T)xx(G/S)(F/Y)(Q/S/E)SxPYxx(A/S/T)LxS(A/C/S)xLx(L/I/M)(Y/F)Y(A/G)x x(K/T)(3-5aa)(L/M/P)(L/I)(I/L/V)(T/S)INxx(G/A)xx(I/V)(E/Q)xxY(I/L)x(L/M/V/I)(F/Y)(L/I/V/F )x(Y/F)Ax(K/R)xxxxx(T/A)xx(L/M/F/V/I)(L/F/V/I)xxx(N/D)(F/V/I/L)xx(F/L)xx(I/L/V )xxxxxx(L/I/V)(5-6aa)(R/Q)xxxxGx(I/V)xxxx(S/A)(V/L/M)(C/S/A)VF(A/V)(A/S)PLx(I/V)(I/M/V)xxV(I /V)(K/R/Q)(T/S)(K/R)S(V/A)E(F/Y)MP(F/I)xLS(L/F/V)xL(T/V)(L/I)(S/N)A(V/I)xW( F/L)xYGLxx(K/N)Dxx(V/I)xxPN(V/I)xGxx(F/L)(G/S)xxQMxL(Y/F)xx(Y/F)
  • Die Aminosäuresequenz von Konsensussequenz 3 kann mit anderen Worten eine Aminosäuresequenz sein, bei der die in SEQ ID NO: 9 aufgeführte Aminosäuresequenz, 3 bis 5 beliebige Aminosäurereste, die in SEQ ID NO: 10 aufgeführte Aminosäuresequenz, 5 bis 6 beliebige Aminosäurereste und die in SEQ ID NO: 11 aufgeführte Aminosäuresequenz in dieser Reihenfolge vom N-Terminus zum C-Terminus verbunden sind.
  • Konsensussequenz 3 ist eine Aminosäuresequenz, generiert aus einem durch ClustalW-Analyse wie oben beschrieben erhaltenen multiplen Alignment der Aminosäuresequenz der an Zuckertransport beteiligten, von Arabidopsis thaliana stammenden Transporterproteine und der an Zuckertransport beteiligten, von Orzya sativa stammenden Transporterproteine aus den im vorgenannten Dokument in Klade III eingeordneten SWEET-Proteinen. Daher ist Konsensussequenz 3 eine für die an Zuckertransport beteiligten, von Arabidopsis thaliana stammenden Transporterproteine sowie die an Zuckertransport beteiligten, von Orzya sativa stammenden Transporterproteine, welche in dem vorgenannten Dokument in Klade III eingeordnet sind, charakteristische Sequenz und ist ein Kriterium für die klare Unterscheidung von jenen in Klade I, II, IV und V gemäß dem vorgenannten Dokument.
  • Die 4-1 bis 4-2 veranschaulichen ein Ergebnis einer Alignment-Analyse der Aminosäuresequenz der an Zuckertransport beteiligten, von Arabidopsis thaliana stammenden Transporterproteine sowie der an Zuckertransport beteiligten, von Orzya sativa stammenden Transporterproteine, welche in dem vorgenannten Dokument in Klade III eingeordnet sind, unter Verwendung des ClustalW multiple-Sequenz-Alignment-Programms (erhältlich in DDBJ am National Institute of Genetics; die Version und verschiedene Parameter, die bei der Analyse verwendet wurden, sind wie oben beschrieben). Für die an Zuckertransport beteiligten, von Arabidopsis thaliana stammenden Transporterproteine und die an Zuckertransport beteiligten, von Orzya sativa stammenden Transporterproteine, welche in dem vorgenannten Dokument in Klade III eingeordnet sind, wird festgestellt, dass sie die oben beschriebene Konsenussequenz 3 besitzen, wie in den 4-1 bis 4-2 gezeigt.
  • Ferner kann das oben erwähnte „bestimmte an einem Zuckertransport beteiligte Transporterprotein“ als ein Protein mit Konsensussequenz 4 definiert werden, welche aus einer Aminosäuresequenz besteht, bei der bestimmte Aminosäurereste an der N-terminalen Seite und der C-terminalen Seite der oben beschriebenen Konsensussequenz 3 angefügt sind und die Variationen von Aminosäuren, die an bestimmten Positionen vorliegen können, beschränkt sind. Die Aminosäuresequenz von Konsensussequenz 4 lautet wie folgt.
    • (M/L/V)xx(T/K/N/S)xxxxAxxFG(L/I/V)LGN(I/L/V)(I/V)SFxVxL(S/A)P(V/I)PTFxxIx K(K/R)K(S/T)x(E/K)(G/S)(F/Y)(Q/E)S(I/L)PYxx(A/S)LxS(A/C)xLx(L/I/M)YY(A/G)x xK(4-5aa)(L/M)(L/I)(I/V)(T/S)IN(A/S/T)(F/V)(G/A)x(F/V)(I/V)(E/Q)xxY(I/L)x(L/M/I)(F/Y) (F/V/I/L)x(Y/F)Ax(K/R)xx(R/K)xx(T/A)(L/V/M)K(V/L/M/F)(L/I/V/F)xxx(N/D)(F/V/I )xx(F/L)xx(I/L)(L/I/V/F)(L/M/V)(L/V)xx(F/L)(L/I/V)(5-6aa)(R/Q)x(K/S/Q)x(L/I/V)Gx(I/V)Cxxx(S/A)(V/L)(S/C/A)VF(A/V)(A/S)PLx(I/V)(M/ I/V)xxV(I/V)(K/R)T(K/R)S(V/A)E(Y/F)MPFxLS(L/F)xLT(I/L)(S/N)A(V/I)xW(L/F)x YGLx(L/I)(K/N)Dxx(V/I)A(L/F/I/M)PN(V/I)(L/I/V)Gxx(L/F)GxxQM(I/V)L(Y/F)(V/L /I/M)(V/L/I/M)(Y/F)(K/R/Q)
  • Die Aminosäuresequenz von Konsensussequenz 4 kann mit anderen Worten eine Aminosäuresequenz sein, bei der die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 12, 4 bis 5 beliebige Aminosäurereste, die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 13, 5 bis 6 beliebige Aminosäurereste und die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 14 in dieser Reihenfolge vom N-Terminus zum C-Terminus verbunden sind.
  • Konsensussequenz 4 ist eine Aminosäuresequenz, generiert aus einem durch ClustalW-Analyse wie oben beschrieben erhaltenen multiplen Alignment der Aminosäuresequenzen der an Zuckertransport beteiligten, von Arabidopsis thaliana stammenden Transporterproteine aus den im vorgenannten Dokument in Klade III eingeordneten SWEET-Proteinen. Daher ist Konsensussequenz 4 eine für die an Zuckertransport beteiligten, von Arabidopsis thaliana stammenden Transporterproteine, welche in dem vorgenannten Dokument in Klade III eingeordnet sind, charakteristische Sequenz und ist ein Kriterium für die klare Unterscheidung von jenen in Klade I, II, IV und V gemäß dem vorgenannten Dokument.
  • 5 veranschaulicht ein Ergebnis einer Alignment-Analyse der Aminosäuresequenz der an Zuckertransport beteiligten, von Arabidopsis thaliana stammenden Transporterproteine, welche in dem vorgenannten Dokument in Klade III eingeordnet sind, unter Verwendung des ClustalW multiple-Sequenz-Alignment-Programms (erhältlich in DDBJ am National Institute of Genetics; die Version und verschiedene Parameter, die bei der Analyse verwendet wurden, sind wie oben beschrieben). Für die an Zuckertransport beteiligten, von Arabidopsis thaliana stammenden Transporterproteine, welche in dem vorgenannten Dokument in Klade III eingeordnet sind, wird festgestellt, dass sie die oben beschriebene Konsenussequenz 4 besitzen, wie in 5 gezeigt.
  • Wie vorstehend beschrieben, unterliegen verwenbare „Nukleinsäuren, die ein bestimmtes an Zuckertransport beteiligtes Transporterprotein kodieren“, keinen besonderen Einschränkungen, sofern sie ein bestimmtes an Zuckertransport beteiligtes Transporterprotein, das die oben beschriebene Konsensussequenz 1, 2, 3 oder 4 besitzt, kodieren. Mit anderen Worten sind die Nukleinsäuren nicht auf jene beschränkt, die die in Tabelle 2 bis 5 aufgeführten konkreten SWEET-Proteine kodieren, sondern beinhalten auch jene, die SWEET-Proteine kodieren, welche von Organismen anderer Spezies als den in Tabelle 2 bis 5 aufgeführten stammen. Beispielsweise können auch Nukleinsäuren verwendet werden, die von Organismen stammen, deren Sequenzdaten nicht in Datenbanken wie GenBank gespeichert sind, und die an Zuckertransport beteiligte Transporterproteine mit Konsensussequenz 1, 2, 3 oder 4 kodieren.
  • Konkrete Beispiele für das bestimmte an einem Zuckertransport beteiligte Transporterprotein können Proteine beinhalten, die eine in einer von SEQ ID NOs: 15 bis 131 aufgeführte Aminosäuresequenz umfassen, wie in Tabelle 2 bis 5 veranschaulicht. Insbesondere kann das bestimmte an einem Zuckertransport beteiligte Transporterprotein vorzugsweise ein Protein sein, das eine in einer von SEQ ID NOs: 15 bis 35 aufgeführte Aminosäuresequenz umfasst (Tabelle 2), bevorzugter ein Protein, das eine in einer von SEQ ID NOs: 15 bis 26 aufgeführte Aminosäuresequenz umfasst (und von Arabidopsis thaliana oder Orzya sativa stammt) oder ferner bevorzugt ein Protein, das eine in einer von SEQ ID NOs: 15 bis 21 aufgeführte Aminosäuresequenz umfasst (und von Arabidopsis thaliana stammt). Die am stärksten bevorzugten Beispiele für das bestimmte an einem Zuckertransport beteiligte Transporterprotein sind AtSWEET11, das die in SEQ ID NO: 17 aufgeführte Aminosäuresequenz umfasst, AtSWEET12, das die in SEQ ID NO: 18 aufgeführte Aminosäuresequenz umfasst, OsSWEET14, das die in SEQ ID NO: 25 aufgeführte Aminosäuresequenz umfasst, und OsSWEET15, das die in SEQ ID NO: 26 aufgeführte Aminosäuresequenz umfasst.
  • Die verwendbaren „Nukleinsäuren, die ein bestimmtes an Zuckertransport beteiligtes Transporterprotein kodieren“, sind nicht auf die Nukleinsäuren beschränkt, die das bestimmte an Zuckertransport beteiligte Transporterprotein kodieren, welches durch eine konkrete SEQ ID NO identifiziert ist, wie oben beschrieben, sondern jede Nukleinsäure kann verwendet werden, die ein bestimmtes an Zuckertransport beteiligtes Transporterprotein mit der oben beschriebenen Konsensussequenz 1, 2, 3 oder 4 kodiert.
  • Die Nukleinsäure, die ein bestimmtes an Zuckertransport beteiligtes Transporterprotein kodiert, bedeutet, dass das durch die Nukleinsäure kodierte Protein die Transporteraktivität im Zusammenhang mit Zuckertransport besitzt. Die Transporteraktivität im Zusammenhang mit Zuckertransport ist eine Aktivität, die mit einem in Cytoplasma oder endoplasmatischem Retikulum (ER) lokalisierten FRET(Förster-Resonanzenergietransfer oder Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer)-Zuckersensor für Zuckertransport über die ER-Membran gemessen wird, beispielsweise jenen, die in Nichtpatentliteratur 1 und 2 in Verfahren beschrieben sind.
  • Ob ein bestimmtes an Zuckertransport beteiligtes Transporterprotein die Konsensussequenz 1, 2, 3 oder 4 besitzt, oder ob die das Protein kodierende Nukleinsäure ein Protein mit Konsensussequenz 1, 2, 3 oder 4 kodiert, lässt sich auf einfache Weise durch Vergleichen der Aminosäuresequenz des Proteins oder der Aminosäuresequenz, die durch die Nukleinsäure kodiert wird, mit einer in Konsensussequenz 1, 2, 3 oder 4 aufgeführten Aminosäuresequenz bestimmen.
  • Beispiele für die an Zuckertransport beteiligten Transporterproteine, die eine Aminosäuresequenz umfassen, welche von irgendeiner der in SEQ ID NOs: 15 bis 131 aufgeführten Aminosäuresequenzen verschieden ist, und die die Konsensussequenz 1, 2, 3 oder 4 besitzen, können jene kodierenden Proteine beinhalten, die eine Aminosäuresequenz umfassen, bei der eine oder mehrere Aminosäuresequenzen deletiert von, substituiert durch, angefügt an oder eingefügt sind in eine Aminosäuresequenz, die in einer von SEQ ID NO: 15 bis 131 aufgeführt ist, und die die Konsensussequenz 1, 2, 3 oder 4 sowie Transporteraktivität im Zusammenhang mit Zuckertransport besitzen. Wie hierin verwendet, bedeuten die mehreren Aminosäuren beispielsweise 1 bis 20, bevorzugt 1 bis 10, stärker bevorzugt 1 bis 7, ferner bevorzugt 1 bis 5 und am bevorzugtesten 1 bis 3 Aminosäuren. Die Deletion, Substitution oder Anfügung der Aminosäuren kann durch Modifizieren der Nukleotidsequenz von Nukleinsäuren, die das vorgenannte bestimmte an Zuckertransport beteiligte Transporterprotein kodieren, anhand einer im Stand der Technik bekannten Technik erfolgen. Eine Mutation kann anhand einer bekannten Technik, wie der Kunkel-Methode oder der Gapped-Duplex-Methode oder einer ähnlichen Methode, in eine Nukleotidsequenz eingeführt werden. Beispielsweise wird eine Mutation unter Verwendung eines Kits zur Einführung von Mutationen anhand eines ortsspezifischen Mutagenese-Verfahrens (beispielsweise anhand von Mutant-K oder Mutant-G (beides Handelsnamen, TAKARA Bio Inc.) oder eines Kits der Serie LA PCR in vitro Mutagenesis (Handelsname, TAKARA Bio Inc.)) eingeführt. Das Verfahren zum Einführen einer Mutation kann ein Verfahren sein, das die Verwendung eines chemischen Mutagens, wie durch EMS (Ethylmethansulfonsäure), 5-Bromouracil, 2-Aminopurin, Hydroxylamin, N-Methyl-N'-nitro-N-Nitrosoguanidin und andere karzinogene Verbindungen repräsentiert, beinhaltet, oder es kann ein Verfahren sein, das Behandlung mit Strahlung beinhaltet, wie durch Röntgenstrahlen, Alpha-, Beta-, Gamma- und Ionenstrahlen oder Ultraviolettlicht-Behandlung repräsentiert.
  • Beispiele für die an Zuckertransport beteiligten Transporterproteine, die eine Aminosäuresequenz umfassen, welche von irgendeiner der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOs: 15 bis 131 verschieden ist, und die die Konsensussequenz 1, 2, 3 oder 4 besitzen, können jene kodierenden Proteine mit Aminosäuresequenzen beinhalten, die eine Ähnlichkeit oder Identität mit einer in einer von SEQ ID NOs: 15 bis 131 aufgeführten Aminosäuresequenz von beispielsweise 70% oder mehr, bevorzugt 80% oder mehr, bevorzugter 90% oder mehr oder am bevorzugtesten 95% oder mehr aufweisen und die die Konsenussequenz 1, 2, 3 oder 4 sowie Transporteraktivität im Zusammenhang mit Zuckertransport besitzen. Die Ähnlichkeits- und Identitätswerte bedeuten Werte, die unter Verwendung eines Computerprogramms, das mit einem Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)-Programm mit der Standardeinstellung ausgestattet ist, und einer Gensequenzinformationen speichernden Datenbank berechnet werden.
  • Ferner können die Nukleinsäuren, die die an Zuckertransport beteiligten Transporterproteine kodieren und die eine von irgendeiner der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOs: 15 bis 131 verschiedene Aminosäuresequenz umfassen und die Konsensussequenz 1, 2, 3 oder 4 besitzen, durch Extrahieren von Nukleinsäure aus der interessierenden Pflanze und Isolieren einer Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäure hybridisiert, welche eine Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NOs: 15 bis 131 kodiert, identifiziert werden, wenn die Genominformation der Pflanze nicht bekannt ist. Wie hierin verwendet, beziehen sich die stringenten Bedingungen auf Bedingungen, unter denen sogenannte spezifische Hybride, jedoch keine unspezifischen Hybride gebildet werden. Beispielsweise können die stringenten Bedingungen eine Hybridisierung in 6xSSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) bei 45°C und dann Waschen mit 0,2 bis lxSSC, 0,1% SDS bei 50 bis 65°C beinhalten; oder derartige Bedingungen können eine Hybridisierung in 1xSSC bei 65 bis 70°C und dann Waschen mit 0,3xSSC bei 65 bis 70°C beinhalten. Die Hybridisierung kann durch ein herkömmlich bekanntes Verfahren, wie etwa jene, die in J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989), beschrieben sind, durchgeführt werden.
  • Wie vorstehend beschrieben, wurde ein „bestimmtes an einem Zuckertransport beteiligtes Transporterprotein“, als ein Protein definiert, das Konsensussequenz 1, 2, 3 oder 4 besitzt. Jedoch sind die verwendbaren „bestimmten an einem Zuckertransport beteiligten Transporterproteine“ nicht auf diese Proteine beschränkt, die die Konsenussequenz 1, 2, 3 oder 4 besitzen.
  • Genauer gesagt können Beispiele für das „bestimmte an einem Zuckertransport beteiligte Transporterprotein“ jene kodierenden Proteine beinhalten, die eine Aminosäuresequenz umfassen, bei der eine oder mehrere Aminosoäuresequenzen deletiert von, substituiert durch, angefügt an oder eingefügt sind in eine Aminosäuresequenz, die in einer von SEQ ID NOs: 15 bis 131 aufgeführt ist, und die Transporteraktivität im Zusammenhang mit Zuckertransport besitzen. Wie hierin verwendet, bedeuten die mehreren Aminosäuren beispielsweise 1 bis 20, bevorzugt 1 bis 10, stärker bevorzugt 1 bis 7, ferner bevorzugt 1 bis 5 und am bevorzugtesten 1 bis 3 Aminosäuren. Die Deletion, Substitution oder Anfügung der Aminosäuren kann durch Modifizieren der Nukleotidsequenz von Nukleinsäuren, die das bestimmte an Zuckertransport beteiligte Transporterprotein kodieren, anhand einer im Stand der Technik bekannten Technik erfolgen. Das Verfahren zum Einführen einer Mutation in eine Nukleotidsequenz kann entsprechend aus den oben beschriebenen Verfahren gewählt werden.
  • Beispiele für das „bestimmte an einem Zuckertransport beteiligte Transporterprotein“ können jene kodierenden Proteine mit Aminosäuresequenzen beinhalten, die eine Ähnlichkeit oder Identität mit einer in einer von SEQ ID NOs: 15 bis 131 aufgeführten Aminosäuresequenz von beispielsweise 70% oder mehr, bevorzugt 80% oder mehr, bevorzugter 90% oder mehr oder am bevorzugtesten 95% oder mehr aufweisen und die Transporteraktivität im Zusammenhang mit Zuckertransport besitzen. Die Ähnlichkeits- und Identitätswerte können durch das oben beschriebene Verfahren berechnet werden.
  • Ferner können Beispiele für das „bestimmte an einem Zuckertransport beteiligte Transporterprotein“ jene kodierenden Proteine beinhalten, die durch Nukleinsäuren kodiert sind, welche unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäure hybridisieren, die eine Aminosäuresequenz einer von SEQ ID NOs: 15 bis 131 kodiert, und die Transporteraktivität im Zusammenhang mit Zuckertransport besitzen. Die stringenten Bedingungen sind hier die gleichen wie jene, die oben beschrieben sind.
  • Die Pflanze, auf die die vorliegende Erfindung angewendet wird, kann ein Exsudat mit hoher Zuckerkonzentration produzieren, indem eine Nukleinsäure, die ein vorstehend definiertes „bestimmtes an Zuckertransport beteiligtes Transporterprotein“ kodiert, in eine Zelle eingeführt wird oder die Expression des durch die Nukleinsäure kodierten Proteins verbessert wird. Beispiele für Techniken zum Einführen der Nukleinsäure, die diesen an Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, in eine Zelle können beispielsweise eine Technik zum Einführen in eine Zelle eines Expressionsvektors umfassen, in den eine DNA, die den an Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, zum Erlauben der Expression davon eingebracht wird. Auch können Beispiele für eine Technik zum Verbessern der Expression der Nukleinsäure, die den an Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, eine Technik zum Modifizieren eines Transkriptionspromotors umfassen, welcher in der Nähe der DNA angeordnet ist, die den an Zuckertransport in einer interessierenden Pflanze beteiligten Transporter kodiert. Insbesondere ist eine Technik zum Einführen eines Expressionsvektors in eine Zelle in der interessierenden Pflanze bevorzugt, in dem eine DNA, die den vorgenannten an Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, der Kontrolle eines Promotors unterstellt wird, der eine konstante Expression ermöglicht, um die Expression davon zu erlauben.
  • Künstliches Gen, das einen an Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert
  • Die vorgenannten „Nukleinsäuren, die ein bestimmtes an einem Zuckertransport beteiligtes Transporterprotein kodieren“, sind nicht auf Nukleinsäuren beschränkt, die eine Nukleotidsequenz besitzen, die gleich jener einer natürlich vorkommenden Nukleinsäure ist, sofern sie Nukleinsäuren mit Konsensussequenz 1, 2, 3 oder 4 sind und einen an Zuckertransport beteiligten Transporter kodieren, und sie können Nukleinsäuren mit einer artifiziell konzipierten Nukleotidsequenz sein, d.h. künstliche Gene. Wie hierin verwendet, bedeutet das künstliche Gen eine Desoxyribonukleinsäure (DNA), die eine artifiziell konzipierte Aminosäuresequenz kodiert und eine nicht natürlich vorkommende Nukleotidsequenz besitzt. Das künstliche Gen kann ein Gen sein, das ein Protein kodiert, in dem ein Teil eines natürlich vorkommenden Proteins modifiziert ist (einer Deletion, Substitution, Insertion oder dergleichen einer oder mehrerer Aminosäurereste unterzogen wird), ein Gen, das ein chimäres Protein kodiert, in dem natürlich vorkommende Aminosäuresequenzen verbunden sind, oder ein Gen, das ein Protein kodiert, dessen gesamte Sequenz vom N-Terminus zum C-Terminus einzigartig konzipiert ist.
  • Das künstliche Gen kann eine DNA mit einer Nukleotidsequenz sein, die eine Aminosäuresequenz umfassend Konsensussequenz 1, 2, 3 oder 4 kodiert. Wenn ein an Zuckertransport beteiligtes Transportergen als ein künstliches Gen konzipiert wird, wird das Gen vorzugsweise eigens so konzipiert, dass es die Transmembrandomäne umfasst. Diese Domäne soll den Transporter an einer stärker bevorzugten Position lokalisieren und zur Transporteraktivität beitragen.
  • Konkretere Beispiele für das künstliche Gen, das einen an Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, können jene beinhalten, die zum Kodieren von in SEQ ID NOs: 132 bis 137 aufgeführten Aminosäuresequenzen ausgelegt sind. Diese in SEQ ID NOs: 132 bis 137 aufgeführten Aminosäuresequenzen umfassen eine der vorgenannten Konsensussequenzen in der N-terminalen Seite und die Transmembrandomäne in der C-terminalen Seite. Das Protein mit der in SEQ ID NO: 132 aufgeführten Aminosäuresequenz wird als SWo1 bezeichnet, das Protein mit der in SEQ ID NO: 133 aufgeführten Aminosäuresequenz wird als SWo2 bezeichnet, das Protein mit der in SEQ ID NO: 134 aufgeführten Aminosäuresequenz wird als SWo3 bezeichnet, das Protein mit der in SEQ ID NO: 135 aufgeführten Aminosäuresequenz wird als SWo4 bezeichnet, das Protein mit der in SEQ ID NO: 136 aufgeführten Aminosäuresequenz wird als SWo5 bezeichnet und das Protein mit der in SEQ ID NO: 137 aufgeführten Aminosäuresequenz wird als SWo6 bezeichnet.
  • Expressionsvektor
  • Der Expressionsvektor wird so konstruiert, dass er eine Nukleinsäure mit einer Promotornukleotidsequenz, die eine konstitutionelle Expression erlaubt, sowie eine Nukleinsäure umfasst, die einen an Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert (darunter fällt sowohl eine Nukleinsäure mit einer natürlich vorkommenden Nukleotidsequenz als auch ein künstliches Gen, das ebenfalls auf das Folgende anwendbar ist). Eine Vielzahl an herkömmlich bekannten Vektoren kann als ein Basisvektor verwendet werden, aus dem der Expressionsvektor abgeleitet wird. Beispielsweise kann ein Plasmid, ein Bakteriophage oder ein Cosmid je nach der Pflanzenzelle, in die der Vektor eingeführt wird, und dem Einführverfahren auf geeignete Weise verwendet und gewählt werden. Konkrete Beispiele können beispielsweise pBR322, pBR325, pUC19, pUC119, PBluescript, pBluescriptSK und pBI-Vektoren umfassen. Insbesondere ist die Verwendung eines binären pBI-Vektors bevorzugt, wenn das Verfahren zum Einführen des Vektors in die Pflanzenzelle ein Verfahren ist, das die Verwendung von Agrobacterium beinhaltet. Konkrete Beispiele für den binären pIB-Vektor können pBIG, pBIN19, pBI101, pBI121, pBI221, etc. umfassen.
  • Der Promotor unterliegt keinen besonderen Einschränkungen, sofern er ein Promotor ist, der imstande ist, die Expression der Nukleinsäure zu erlauben, welche den an Zuckertransport in der Pflanze beteiligten Transporter kodiert, und vorzugsweise kann ein bekannter Promotor verwendet werden. Beispiele für einen solchen Promotor können beispielsweise den 35S-Promotor aus dem Blumenkohlmosaikvirus (CaMV35S), verschiedene Actin-Genpromotoren, verschiedene Ubiquitin-Genpromotoren, den Nopalin-Synthase-Genpromotor, den PR1a-Genpromotor in Tabak, Ribulose 1 in Tomate, den Genpromotor der kleinen Untereinheit der 5-Diphosphat-Carboxylase/Oxidase, den Napin-Genpromotor, den Oleosin-Genpromotor, etc. umfassen. Aus diesen kann die Verwendung des 35S-Promotors aus dem Blumenkohlmosaikvirus, eines Actin-Genpromotors oder eines Ubiquitin-Genpromotors stärker bevorzugt sein. Die Verwendung irgendeines der vorgenannten Promotoren erlaubt bei Einführung in eine Pflanzenzelle eine starke Expression einer Nukleinsäure.
  • Zu den verwendbaren Promotoren zählen Promotoren, die die Funktion besitzen, eine Nukleinsäure regionspezifisch in einer Pflanze zu exprimieren. Ein solcher verwendbarer Promotor kann irgendein herkömmlich bekannter Promotor sein. Durch Verwenden eines solchen Promotors und regionsspezifisches Einführen der vorgenannten Nukleinsäure, die den an Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, kann der Zuckergehalt in dem Exsudat erhöht werden, das aus dem Pflanzenorgan oder -gewebe produziert wird, welches aus den Zellen besteht, in die die Nukleinsäure eingeführt wurde.
  • Der Expressionsvektor kann neben dem Promotor und der vorgenannten Nukleinsäure, die den an Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, ferner eine Nukleinsäure mit einer anderen Segmentsequenz umfassen. Die Nukleinsäure mit einer anderen Segmentsequenz unterliegt keinen besonderen Einschränkungen, und Beispiele können eine Nukleinsäure mit einer Terminator-Nukleotidsequenz, eine Nukleinsäure mit einer Transformanten-Selektionsmarker-Nukleotidsequenz, eine Nukleinsäure mit einer Verstärker-Nukleotidsequenz, eine Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz zum Erhöhen der Translationseffizienz, etc. umfassen. Überdies kann der vorgenannte rekombinante Expressionsvektor eine T-DNA-Region besitzen. Die T-DNA-Region kann die Effizienz der Einführung von Nukleinsäure erhöhen, insbesondere wenn eine Nukleinsäure mit der vorgenannten Nukleotidsequenz in dem rekombinanten Expressionsvektor unter Verwendung von Agrobacterium in eine Pflanzenzelle eingeführt wird.
  • Die Nukleinsäure mit einer Terminator-Nukleotidsequenz unterliegt keinen besonderen Einschränkungen, sofern sie die Funktion einer Transkriptionsterminationstelle besitzt, und kann eine bekannte solche sein. Konkrete Beispiele für die verwendbare Nukleinsäure umfassen die Terminator-Region von Nopalin-Synthase-Gen (Nos-Terminator), die Terminator-Region des 35S-Promotors aus dem Blumenkohlmosaikvirus (CaMV35S-Terminator), etc. Insbesondere kann die Verwendung des Nos-Terminators stärker bevorzugt sein. In dem vorgenannten rekombinanten Vektor kann das Einbringen eines Terminators an eine geeignete Position die Synthese eines unnötig langen Transkripts nach Einführen des Vektors in eine Pflanzenzelle verhindern.
  • Beispiele für die verwendbare Nukleinsäure mit einer Transformanten-Selektionsmarker-Nukleotidsequenz umfassen eine Nukleinsäure, die ein Arzneimittelresistenzgen enthält. Konkrete Beispiele für ein solches Arzneimittelresistenzgen können Nukleinsäuren umfassen, die Arzneimittelresistenzgene für Hygromycin, Bleomycin, Kanamycin, Gentamicin, Chloramphenicol, etc. enthalten. Dies erlaubt die erleichterte Selektion transformierter Pflanzen durch Selektieren von Pflanzen, die in Medien wachsen, welche die vorgenannten Antibiotika enthalten.
  • Beispiele für die Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz zum Erhöhen der Translationseffizienz können eine Nukleinsäure umfassen, deren Omegasequenz vom Tabakmosaikvirus stammt. Durch Einbringen dieser Nukleinsäure mit der Omegasequenz in der nichtkodierenden Region (5' UTR) stromaufwärts der proteinkodierenden Region kann die Effizienz der Expression der vorgenannten Nukleinsäure, die einen an Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, erhöht werden. Wie bereits dargelegt, können in dem vorgenannten rekombinanten Expressionsvektor je nach seinem Zweck Nukleinsäuren mit verschiedenen DNA-Segmentsequenzen beinhaltet sein.
  • Verfahren zum Konstruieren des rekombinanten Expressionsvektors unterliegen keinen besonderen Einschränkungen, und der rekombinante Expressionsvektor kann durch Einführen der vorgenannten Nukleinsäure mit einer Promotornukleotidsequenz, der Nukleinsäure, die das bestimmte an Zuckertransport beteiligte Transporterprotein kodiert, und gegebenenfalls der vorgenannten Nukleinsäure mit einer anderen DNA-Segmentsequenz in einer bestimmten Reihenfolge in den geeignet gewählten Basisvektor konstruiert werden. Beispielsweise kann der rekombinante Expressionsvektor durch Ligieren der Nukleinsäure, die einen an Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, der Nukleinsäure mit einer Promotor-Nukleotidsequenz (und gegebenenfalls der Nukleinsäure mit einer Terminator-Nukleotidsequenz) und Einführen dieser in den Vektor konstruiert werden.
  • Verfahren zum Replizieren (Verfahren zum Herstellen) des vorgenannten Expressionsvektors unterliegen keinen besonderen Einschränkungen, und herkömmlich bekannte Verfahren können verwendet werden. Generell kann Escherichia coli als ein Host verwendet werden, und der Vektor kann in dem Host repliziert werden. Irgendein bevorzugter Stamm von Escherichia coli kann je nach der Art von Vektor gewählt werden.
  • Transformation
  • Der vorgenannte Expressionsvektor wird anhand eines allgemeinen Transformationsverfahrens in eine interessierende Pflanzenzelle eingeführt. Verfahren zum Einführen des Expressionsvektors in eine Pflanzenzelle (Verfahren zum Transformieren einer Pflanzenzelle) unterliegen keinen besonderen Einschränkungen, und herkömmlich bekannte Verfahren, die sich für die Pflanzenzelle eignen, können verwendet werden. Konkrete Beispiele für derartige verwendbare Verfahren umfassen Verfahren, die die Verwendung von Agrobacterium beinhalten, und Verfahren, die die unmittelbare Einführung in Pflanzenzellen beinhalten. Beispiele für die verwendbaren Verfahren, die die Verwendung von Agrobacterium beinhalten, umfassen die Verfahren, die in Bechtold, E., Ellis, J. und Pelletier, G. (1993) In Planta, Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis plants. C.R. Acad. Sci. Paris Sci. Vie, 316, 1194-1199. oder Zyprian E, Kado Cl, Agrobacterium-mediated plant transformation by novel mini-T vectors in conjunction with a high-copy vir region helper plasmid. Plant Molecular Biology, 1990, 15 (2), 245-256, beschrieben sind.
  • Beispiele für die verwendbaren Verfahren zum unmittelbaren Einführen des Expressionsvektors in eine Pflanzenzelle umfassen Mikroinjektion, Elektroporation, das Polyethylenglycol-Verfahren, das Partikelbeschussverfahren, Protoplastenfusion, das Calciumphosphat-Verfahren, etc.
  • Wenn eines der vorgenannten Verfahren zum unmittelbaren Einführen der Nukleinsäure, die den an Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, in eine Pflanzenzelle verwendet wird, sind eine Nukleinsäure, die eine für die Expression der Nukleinsäure, welche den interessierenden Transporter kodiert, notwendige Transkriptionseinheit enthält, beispielsweise eine Nukleinsäure mit einer Promotor-Nukleotidsequenz und/oder eine Nukleinsäure mit einer Transkriptions-Terminator-Nukleotidsequenz; und die Nukleinsäure, die den interessierenden Transporter kodiert, ausreichend, und die Vektorfunktion ist nicht erforderlich. Ferner reicht selbst eine Nukleinsäure aus, die keine Transkriptionseinheit, sondern lediglich die proteinkodierende Region der vorgenannten Nukleinsäure enthält, welche den an Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, falls die Nukleinsäure in eine Transkriptionseinheit in dem Host-Genom integriert werden kann und das interessierende Gen exprimieren kann. Selbst wenn die Nukleinsäure nicht in das Host-Genom integriert wird, genügt es auch, wenn die vorgenannte Nukleinsäure, die den an Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, in der Zelle transkribiert und/oder translatiert wird.
  • Beispiele für die Pflanzenzelle, in die der vorgenannte Expressionsvektor oder eine Nukleinsäure, die keinen Expressionsvektor enthält und die den interessierenden, am Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, eingeführt wird, können Zellen in Geweben in Pflanzenorganen wie etwa Blüte, Blatt und Wurzel, Kallus, Zellen in Suspensionskultur, etc. umfassen. Der Expressionsvektor kann ein geeigneter Expressionsvektor sein, der erforderlichenfalls für die herzustellende Art von Pflanze konstruiert wird, oder ein vorkonstruierter universeller Expressionsvektor kann in eine Pflanzenzelle eingeführt werden.
  • Die Pflanze, die aus Zellen besteht, in die der Expressionsvektor eingeführt wird, unterliegt keinen besonderen Einschränkungen. Dies bedeutet, dass die in einem Exsudat wie Guttation enthaltene Zuckerkonzentration in irgendeiner Pflanze erhöht werden kann, indem die vorgenannte Nukleinsäure, die den an Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, eingeführt wird. Bevorzugte Beispiele für eine solche Pflanze sind phanerogame Pflanzen. Von den phanerogamen Pflanzen sind angiosperme Pflanzen stärker bevorzugt. Beispiele für solche angiosperme Pflanzen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf dikotyle und monokotyle Pflanzen, beispielsweise Brassicaceae-, Gramineae-, Solanaceae-, Leguminosae- und Salicaceae-Pflanzen (siehe unten).
    Brassicaceae Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana), Arabiopsis lyrata, Raps (Brassica rapa, Brassica napus, Brassica campestris), Kohl (Brassica oleracea var. capitata), Chinakohl (Brassica rapa var. pekinensis), Chinesischer Senfkohl (Brassica rapa var. chinensis), Speiserübe (Brassica rapa var. rapa), Nozawana (Brassica rapa var. hakabura), Japankohl (Brassica rapa var. lancinifolia), Komatsuna (Brassica rapa var. peruviridis), Pak Choi (Brassica rapa var. chinensis), Komatsuna (Raphanus sativus), Wasabi (Wasabia japonica), Capsella rubella, etc.
    Chenopodiaceae: Zuckerrübe (Beta vulgaris).
    Aceraceae Zuckerahorn (Acer saccharum):
    • Euphorbiaceae: Rizinus (Ricinus communis):
      • Solanaceae: Tabak (Nicotiana tabacum), Aubergine (Solanum melongena), Kartoffel (Solanum tuberosum), Tomate (Solanum lycopersicum), Pfeffer (Capsicum annuum), Petunie (Petunia hybrida), etc.
      • Fabaceae: Sojabohne (Glycine max), Erbse (Pisum sativum), Ackerbohnen (Vicia faba), Japanischer Blauregen (Wisteria floribunda), Erdnuss (Arachis hypogaea), Japanischer Hornklee (Lotus japonicus), Kidney-Bohne (Phaseolus vulgaris), Adzukibohne (Vigna angularis), Akazie (Acacia), Schneckenklee (Medicago truncatula), Kichererbse (Cicer arietinum), etc.
      • Compositae: Chrysantheme (Chrysanthemum morifolium), Sonnenblume (Helianthus annuus), etc.
      • Arecaceae: Ölpalme (Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Kokospalme (Cocos nucifera), Dattelpalme (Phoenix dactylifera), Wachspalme (Copernicia), etc.
      • Anacardiaceae: Wachsbaum (Rhus succedanea), Cashewbaum (Anacardium occidentale), Chinesischer Lackbaum (Toxicodendron vernicifluum), Mango (Mangifera indica), Pistazie (Pistacia vera), etc.
      • Cucurbitaceae: Kürbis (Cucurbita maxima, Cucurbita moschata, Cucurbita pepo), Gurke (Cucumis sativus), Japanische Schlangenhaargurke (Trichosanthes cucumeroides), Flaschenkürbis (Lagenaria siceraria var. gourda), etc.
      • Rosaceae: Mandel (Amygdalus communis), Rose (Rosa), Erdbeere (Fragaria vesca), Kirschbaum (Prunus), Apfel (Malus pumila var. domestica), Pfirsich (Prunus persica), etc.
      • Vitaceae: Weinrebe (Vitis vinifera)
      • Caryophyllaceae: Nelken (Dianthus caryophyllus), etc.
      • Salicaceae: Pappel (Populus trichocarpa, Populus nigra, Populus tremula), etc.
      • Poaceae: Mais (Zea mays), Reis (Oryza sativa), Gerste (Hordeum vulgare), Weizen (Triticum aestivum), Rotes Wildeinkorn (Triticum urartu), Tauschs Ziegengras (Aegilops tauschii), Zwenke (Brachypodium distachyon), Bambus (Phyllostachys), Zuckerrohr (Saccharum officinarum), Napiergras (Pennisetum pupureum), Erianthus (Erianthus ravenae), Susuki-Gras (Miscanthus virgatum), Hirse (Sorghum bicolor) Rutenhirse (Panicum), etc.
      • Liliaceae: Tulpe (Tulipa), Lilie (Lilium), etc.
  • Insbesondere sind Pflanzen bevorzugt, die relativ viel Exsudat produzieren und eine hohe Zucker- und Stärkeproduktivität besitzen, wie etwa Zuckerrohr, Mais, Reis, Hirse, Weizen, Zuckerrübe und Zuckerahorn. Dies liegt daran, dass Exsudat, das von diesen Pflanzen gesammelt wird, als Rohstoff für Biokraftstoff und Biokunststoffe verwendet werden kann, wie später im Detail beschrieben.
  • Während die verwendbare Nukleinsäure, die den an Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, aus einer Vielzahl von Pflanzen isoliert und verwendet werden kann, wie vorstehend erwähnt, kann die Nukleinsäure je nach der Pflanzenklasse geeignet gewählt und verwendet werden. Wenn somit die interessierende Pflanzenzelle von einer monokotylen Pflanze stammt, kann die einzuführende Nukleinsäure, die einen an Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, jene sein, die aus einer monokotylen Pflanze isoliert wird. Wenn die interessierende Pflanze eine Pflanze in der Familie der Poaceae ist, ist es besonders bevorzugt, eine der folgenden Nukleinsäuren einzuführen, die einen an Zuckertransport beteiligten, von Oryza sativa stammenden Transporter kodieren: die Nukleinsäure, die OsSWEET13 kodiert (Os12g047620001), und die Nukleinsäure, die OsSWEET14 kodiert (Os11t050860001), und die Nukleinsäure, die OsSWEET15 kodiert (Os02t051310001). Durch Einführen einer aus der Nukleinsäure, die OsSWEET13 kodiert (Os12g047620001), und der Nukleinsäure, die OsSWEET14 kodiert (Os11t050860001), und der Nukleinsäure, die OsSWEET15 kodiert (Os02t051310001), kann die in dem von Oryza sativa stammenden Exsudat enthaltene Zuckermenge merklich erhöht werden.
  • Selbst wenn die interessierende Pflanzenzelle von einer monokotylen Pflanze stammt, kann eine von einer dikotylen Pflanze stammende Nukleinsäure eingeführt werden, die einen an Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert. Wenn die interessierende Pflanzenzelle von einer monokotylen Pflanze stammt, ist es bevorzugt, von den von Arabidopsis thaliana, einer dikotylen Pflanze, stammenden Nukleinsäuren, welche einen an Zuckertransport beteiligten Transporter kodieren, die Nukleinsäure, die AtSWEET11 kodiert (At3g48740), und die Nukleinsäure, die AtSWEET12 kodiert (At5g23660), einzuführen. Diese Nukleinsäure, die AtSWEET11 kodiert (At3g48740), und die Nukleinsäure, die AtSWEET12 kodiert (At5g23660), können die in dem Exsudat enthaltene Zuckermenge merklich erhöhen, selbst wenn die interessierende Pflanze eine monokotyle Pflanze wie Oryza sativa ist.
  • Andere Prozesse, andere Verfahren
  • Nach dem vorgenannten Transformationsprozess kann anhand eines herkömmlich bekannten Verfahrens ein Selektionsprozess zum Selektieren einer geeigneten Transformanten aus Pflanzen durchgeführt werden. Das Selektionsverfahren unterliegt keinen besonderen Einschränkungen. Die geeignete Transformante kann beispielsweise auf Grundlage einer Arzneimittelresistenz, wie etwa Hygromycin-Resistenz, oder durch Anbau von Transformanten, Sammeln von Exsudat aus den Pflanzen, Messen des in dem gesammelten Exsudat enthaltenen Zuckers und Selektieren der Pflanze, deren Exsudat im Vergleich zum Wildtyp eine signifikant erhöhte Zuckerkonzentration besitzt, selektiert werden. Die Messung von Zucker, der in dem gesammelten Exsudat enthalten ist, kann durch ein qualitatives Verfahren, nicht aber ein quantitatives Verfahren erfolgen. Beispielsweise kann die Messung anhand eines Färbungsverfahrens unter Verwendung eines sich als Reaktion auf Zucker färbenden Indikatorpapiers durchgeführt werden.
  • Nachkommenpflanzen sind gemäß einem üblichen Verfahren aus transformierten Pflanzen erhältlich, die durch den Transformationsprozess erhalten werden. Durch Selektieren von Nachkommenpflanzen, die im Vergleich zum Wildtyp auf Grundlage der in dem Exsudat enthaltenen Zuckermenge eine Eigenschaft („Trait“) aufrechterhalten, die mit einer signifikant erhöhten Expression der vorgenannten Nukleinsäure verbunden ist, welche einen an Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, können stabile Pflanzenstämme geschaffen werden, deren Exsudat aufgrund der Trait-Stämme eine erhöhte Zuckermenge besitzt. Aus solchen transformierten Pflanzen oder deren Nachkommen können Zuchtmaterialien, wie etwa Pflanzenzellen, Samen, Früchte, Unterlagen, Kalli, Knollen, Stecklinge, und Mengen erhalten werden, um aus solchen Materialien in großer Menge stabile Pflanzenstämme zu produzieren, deren Exsudat aufgrund der vorgenannten Eigenschaft eine erhöhte Zuckermenge besitzt.
  • Wie vorstehend beschrieben, lässt sich im Vergleich zur Wildtyppflanze die in Exsudat enthaltene Zuckerkonzentration signifikant erhöhen, indem eine Nukleinsäure, die den am vorgenannten, bestimmten Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, in eine Zelle eingeführt oder die Expression der Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung verbessert wird. Die in dem Exsudat enthaltenen Zuckerkomponenten sollen Monosaccharid, wie etwa Glucose, Galactose, Mannose und Fructose, sowie Disaccharide, wie etwa Saccharose, Lactose und Maltose, umfassen. Demgemäß lässt sich durch Einführen der Nukleinsäure, die den bestimmten an einem Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, in eine Zelle oder Verbessern der Expression des endogen vorliegenden Gens die Konzentration einer oder mehrerer von Zuckerkomponenten, wie etwa Glucose, Galactose, Mannose, Fructose, Saccharose, Lactose und Maltose, die in Exsudat enthalten sind, erhöhen. Insbesondere kann die Konzentration von Glucose, Fructose und Saccharose in Exsudat gemäß der vorliegenden Erfindung stark erhöht werden.
  • Insbesondere ist es bevorzugt, wenn Guttation, die von der Hydathode erzeugt wird, als Exsudat gesammelt wird, dass die Pflanze, bei der die Nukleinsäure, die den bestimmten am Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, in eine Zelle eingeführt ist oder die Expression der Nukleinsäure verbessert ist, unter Bedingungen kultiviert wird, die ein Verdunsten der erzeugten Guttation verhindern. Ferner ist stärker bevorzugt, die Pflanze unter Bedingungen anzuzüchten, in denen die Menge an erzeugter Guttation erhöht ist. Beispielsweise kann die Verdunstung von Guttation verhindert und die Menge der erzeugten Guttation erhöht werden, indem die Pflanze in einem geschlossenen Raum unter Bedingungen einer Luftfeuchtigkeit von 80% RH oder mehr oder bevorzugter 90% RH oder mehr kultiviert wird.
  • Während beispielsweise die Konzentration von Zucker, der in Guttation des Arabidopsis-thaliana-Wildtyps enthalten ist, etwa 2,0 µM beträgt (mittleres Monosaccharid-Äquivalent), wird bei der transformierten Arabidopsis thaliana, bei der das vorgenannte bestimmte Transportergen, das an einem Zuckertransport beteiligt ist, in Zellen eingeführt ist, die Zuckerkonzentration in Guttation auf etwa 98,5 bis 6057,5 µM erhöht. Insbesondere kann die transformierte Arabidopsis thaliana, bei der die Nukleinsäure, die AtSWEET12 kodiert (At5g23660), in Zellen eingeführt ist, Guttation produzieren, die Zuckerkomponenten in einer höheren Konzentration enthält im Vergleich zu anderen transformierten Arabidopsis thaliana.
  • Überdies wird bei dem transformierten Oryza sativa, bei dem die vorgenannte Nukleinsäure, die einen bestimmten an einem Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, in Zellen eingeführt ist, die Zuckerkonzentration in der Guttation auf etwa 1074,3 bis 185641,2 µM erhöht, wohingegen beim Wildtyp Oryza sativa in der Guttation eine Zuckerkonzentration von etwa 1,3 µM (mittleres Monosaccharid-Äquivalent) beinhaltet ist. Insbesondere kann der transformierte Oryza sativa, bei dem die Nukleinsäure, die AtSWEET11 kodiert (At3g48740), oder die Nukleinsäure, die OsSWEET13 kodiert (Os12g0476200), oder die Nukleinsäure, die SWo5 kodiert, in Zellen eingeführt ist, Guttation produzieren, die Zuckerkomponenten in höheren Konzentrationen im Vergleich zu anderen transformierten Orzya-sativa-Pflanzen enthält. Ferner kann der transformierte Oryza sativa, bei dem die Nukleinsäure, die OsSWEET15 kodiert (Os02g051310001) in Zellen eingeführt ist, Guttation produzieren, die Zuckerkomponenten in Konzentrationen enthält, welche höher sind als die höchste Zuckerkonzentration in der Guttation bei dem transformierten Oryza sativa, bei dem eine Nukleinsäure, die einen anderen bestimmten an einem Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, in Zellen eingeführt ist, und die Zuckerkonzentration in der Guttation erhöht sich auf bis zu 450340,4 µM.
  • Wie vorstehend beschrieben, kann gemäß der vorliegenden Erfindung Exsudat mit einer hohen Zuckerkonzentration gesammelt werden. Das gesammelte Exsudat kann zur fermentativen Herstellung von Alkohol und/oder organischer Säure verwendet werden. Ferner kann das gesammelte Exsudat als ein Rohstoff für Bioraffinerie verwendet werden. Wenn hierfür beispielsweise Guttation als ein Exsudat verwendet wird, wird die vorgenannte Nukleinsäure, die den bestimmten an einem Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, in Zellen eingeführt, und die Guttation, die von der Pflanze gesammelt wird, bei der die Expression der Nukleinsäure verbessert ist, kann unverändert in dem Reaktionssystem zur alkoholischen Fermentation und organischen Säurefermentation verwendet werden und kann als ein Rohstoff für Bioraffinerie verwendet werden. Alternativ kann die von der Pflanze gesammelte Guttation auch nach einem Konzentrierungsprozess oder einem Prozess zum Zusetzen einer anderen Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle in Reaktionssystemen zur alkoholischen Fermentation und organischen Säurefermentation verwendet werden.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf Beispiele ausführlicher beschrieben. Der technische Umfang der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.
    1. 1. Erstellung eines DNA-Konstrukts zur Transformation von Arabidopsis thaliana
      • 1.1. Herstellung von DNA, die ein AtSWEET-Protein kodiert, durch PCR
      • 1.1.1. Amplifikation von DNA, die ein AtSWEET-Protein kodiert
  • Die zu beurteilenden DNAs, die das AtSWEET1-, AtSWEET2-, AtSWEET3-, AtSWEET4-, AtSWEET5-, AtSWEET6-, AtSWEET7-, AtSWEET9-, AtSWEET11-, AtSWEET12, AtSWEET13, AtSWEET15- und AtSWEET17-Protein kodieren, wurden anhand von PCR unter Verwendung von cDNA, hergestellt aus Arabidopsis thaliana, als ein Template amplifiziert. Zum Einsetzen der zu beurteilenden DNAs in den pRI201AN-Vektor (Takara Bio Inc., #3264), wurden Vorwärtsprimer mit einer am 5'-Ende angefügten Sal I-Restriktionsenzymerkennungssequenz und Rückwärtsprimer mit einer am 3'-Ende angefügten Sac I- oder Pst I-Restriktionsenzymerkennungssequenz entworfen (Tabelle 6). [Tabelle 6]
    Name der amplifizierten DNA Name des Primers Sequenz SEQ ID NO
    SWEET1 sal I-SWEET1-F26mer 5'-TAATGTCGACATGAACATCGCTCACACTATCTTCGG-3' 138
    sac I-SWEET1-R 5'-TATGAGCTCTTAAACTTGAAGGTCTTGCTTTCCATTAAC-3' 139
    SWEET2 sal I-SWEET2-F27mer 5'-TAATGTCGACATGGATGTTTTTGCTTTCAATGCTTC-3' 140
    sac I-SWEET2-R27mer 5'-TATGAGCTCTCACACGTAAGAAACAATCAAAGGCTC-3' 141
    SWEET3 sal I-SWEET3-F27mer 5'-TAATGTCGACATGGGTGATAAACTTCGATTATCCATC-3' 142
    sac I-SWEET3-R28mer 5'-TATGAGCTCTTAGATCGATGAGGCATTGTTAGAATTC-3' 143
    SWEET4 sal I-SWEET4-F31 mer 5'-TAATGTCGACATGGTTAACGCTACAGTTGCGAGAAACATTG-3' 144
    sac I-SWEET4-R30mer 5'-TATGAGCTCTCAAGCTGAAACTCGTTTAGCTTGTCCAC-3' 145
    SWEET5 sal I-SWEET5-F30mer 5'-TAATGTCGACATGACGGACCCCCACACCGCCCGGACGATC-3' 146
    sac I-SWEET5-R31mer 5'-TATGAGCTCTCAAGCCTGGCCAAGTTCGATTCCAGCATTC-3' 147
    SWEET6 sal I-SWEET6-F33mer 5'-TAATGTCGACATGGTGCATGAACAGTTGAATCTTATTCGGAAG-3' 148
    sac I-SWEET6-R32mer 5'-TATGAGCTCTCAAACGCCGCTAACTCTTTTGTTTAAATATG-3' 149
    SWEET7 sal I-SWEET7-F28mer 5'-TAATGTCGACATGGTGTTTGCACATTTGAACCTTCTTC-3' 150
    sac I-SWEET7-R31mer 5'-TATGAGCTCTTAAACATTGTTAGGTTCTTGGTTGGTATTC-3' 151
    SWEET9 sal I-SWEET9-F31mer 5'-TAATGTCGACATGTTCCTCAAGGTTCATGAAATTGCTTTTC-3' 152
    sac I-SWEET9-R27mer 5'-TATGAGCTCTCACTTCATTGGCCTCACCGATCCTTC-3' 153
    SWEET11 sal I-SWEET11-F29mer 5'-TAATGTCGACATGAGTCTCTTCAACACTGAAAACACATG-3' 154
    sac I-SWEET11-R27mer 5'-TATGAGCTCTCATGTAGCTGCTGCGGAAGAGGACTG-3' 155
    SWEET12 sal I-SWEET12-F29mer 5'-TAATGTCGACATGGCTCTCTTCGACACTCATAACACATG-3' 156
    sac I-SWEET12-R29mer 5'-TATGAGCTCTCAAGTAGTTGCAGCACTGTTTCTAACTC-3' 157
    SWEET13 Nde I-SWEET13-F30mer 5'-GGAATTCCATATGGCTCTAACTAACAATTTATGGGCATTTG-3' 158
    sal I-SWEET13-R30mer 5'-TAATGTCGACTTAAACTTGACTTTGTTTCTGGACATCCTTG-3' 159
    SWEET15 sal I-SWEET15-F30mer 5'-TAATGTCGACATGGGAGTCATGATCAATCACCATTTCCTC-3' 160
    sac I-SWEET15-R27mer 5'-TATGAGCTCTCAAACGGTTTCAGGACGAGTAGCCTC-3' 161
    SWEET17 sal I-SWEET17-F30mer 5'-TAATGTCGACATGGCAGAGGCAAGTTTCTATATCGGAGT-3' 162
    sac I-SWEET17-R29mer 5'-TATGAGCTCTTAAGAGAGGAGAGGTTCAACACGTGATG-3' 163
  • Und die PCR-Amplifikation wurde unter Verwendung dieser Primer und von PrimeSTAR GXL DNA-Polymerase (TaKaRa, #R050A) durchgeführt. Die Zusammensetzung der Reaktionslösung ist in Tabelle 7 gezeigt und die Reaktionsbedingungen sind in Tabelle 8 gezeigt. [Tabelle 7]
    Komponente (µl)
    Template-DNA (100 ng/µl) 1µl
    5×Prime Star GXL Puffer 4 µl
    dNTP-Gemisch (25 mM) 1,6 µl
    Vorwärtsprimer (10 ng/µl) 0,4 µl
    Rückwärtsprimer (10 ng/µl) 0,4 µl
    Prime Star GXL (1u/µl) 0,8 µl
    Steriles Wasser 12,6 µl
    Gesamt 20 µl
    Figure DE112014006075B9_0001
  • Als Nächstes wurde der folgende Vorgang durchgeführt, um Adenin an das 5'- und 3'-Ende anzufügen, um die durch die PCR-Amplifikation erhaltenen DNA-Fragmente in die pCR2.1-TOPO Vektor-DNA (Invitrogen, #K4500-01) einzusetzen. Die Zusammensetzung der Reaktionslösung ist in Tabelle 9 gezeigt. Die in Tabelle 9 gezeigte Reaktionslösung wurde 15 Minuten bei 70°C inkubiert. [Tabelle 9]
    Komponente
    PCR-Reaktionslösung 15 µl
    10×ExTaq-Puffer 3 µl
    dNTP-Gemisch (25 mM) 2 µl
    Ex Taq (0,5 u/µl) 0,1 µl
    Steriles Wasser 9,9 µl
    Gesamt 30 µl
  • 1.1.2. Ausschneiden und Reinigen amplifizierter DNA-Fragmente
  • Die durch PCR amplifizierten DNA-Fragmente wurden einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und unter Verwendung eines MagExtractor-PCR & Gel Clean Up Kits (TOYOBO, #NPK-601) ausgeschnitten und gereinigt. Das Ausschneiden und Reinigen wurde nach dem im Kit enthaltenen Handbuch durchgeführt.
  • 1.1.3. Transformation mit amplifizierten DNA-Fragmenten
  • Die gereinigten amplifizierten DNA-Fragmente wurden unter Verwendung von TOPO TA Klonierung (Invitrogen, #K4500-01) in den pCR2.1-TOPO Vektor eingesetzt. Die Zusammensetzung der Reaktionslösung ist in Tabelle 10 gezeigt. Die in Tabelle 10 gezeigte Reaktionslösung wurde 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. [Tabelle 10]
    Komponente (µl)
    Ausgeschnittenes Reinigungsprodukt (amplifizierte SWEET-Sequenz) 2 µl
    Salzlösung 0,5 µl
    pCR2.1-TOPO Vektor 0,5 µl
    Gesamt 3 µl
  • Als Nächstes wurde durch Zusetzen von 2 µl dieser Reaktionslösung zu kompetenten Zellen von Escherichia coli DH5a (TOYOBO, #DNA-903) eine Transformation durchgeführt. Nach 30-minütigem Belassen der Zellen in Eisbad wurden die Zellen 30 Sekunden bei 42°C einer Wärmebehandlung unterzogen. Anschließend wurden die Zellen rasch im Eisbad abgekühlt. 500 µl SOC-Medium (Invitrogen, #15544-034) wurden zugesetzt, und die Zellen wurden 1 Stunde bei 37°C, 180 rpm in Suspension angezüchtet. Auf eine LB-Agar-Platte enthaltend Kanamycin in einer Endkonzentration von 50 µg/ml wurden 40 mg/ml X-gal und 40 µl von 100 mM IPTG, gelöst in 40 µl DMF (N,N-Dimethylformamid), aufgebracht und dann wurden 100 bis 200 µl der Kultur aufgebracht. Die Platte wurde über Nacht bei 37°C inkubiert und am nächsten Morgen wurden Kolonien erhalten.
  • 1.1.4. Überprüfung der Transformation durch Kolonie-PCR und Selektion auf positives Klon
  • Infolge der Transformation wurden viele Kolonien erhalten. Um das Vorliegen oder Nichtvorliegen der eingesetzten DNA in den Kolonien zu bestätigen, wurde eine Kolonie-PCR unter Verwendung von M13-F: 5'-GTA AAA CGA CCA GTC TTA AG-3' (SEQ ID NO: 164) and M13-R: 5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3 '(SEQ ID NO: 165) durchgeführt. Die Zusammensetzung der Reaktionslösung für die Kolonie-PCR ist in Tabelle 11 gezeigt und die PCR-Bedingungen sind in Tabelle 12 gezeigt. [Tabelle 11]
    Komponente (µl)
    DNA Kolonie
    Amprltaq Gold 360 Master Mix (ABI, #4398881) 10 µl
    Vorwärtsprimer (M13-F) (10 ng/µl) 0,4 µl
    Rückwärtsprimer (M13-R) (10 ng/µl) 0,4 µl
    Steriles Wasser 9,2 µl
    Gesamt 20 µl
    Figure DE112014006075B9_0002
    Figure DE112014006075B9_0003
  • 1.1.5. Reinigung der Plasmid-DNA aus positiven Klonen
  • Die Plasmid-DNAs derjenigen Klone, bei denen die eingesetzten DNAs bestätigt wurden, wurde gereinigt. Die Reinigung der Plasmid-DNAs wurde unter Verwendung des QIAprep Spin Miniprep Kits (QIAGEN, #27106) nach dem im Kit enthaltenen Protokoll durchgeführt.
  • 1.1.6. Sequenzierung positiver Klone
  • Eine PCR-Amplifikation wurde unter Verwendung der in 1.1.5 erhaltenen Plasmid-DNAs als Templates und M13-F- und M13-R-Primern durchgeführt und die Nukleotidsequenzen der DNA-Fragmente wurden durch die Didesoxymethode (Sanger-Methode) bestimmt.
  • 1.2. Herstellung von das AtSWEET-Protein kodierender DNA durch chemische Synthese
  • Die DNAs, welche das AtSWEET8-, AtSWEET10-, AtSWEET14- und AtSWEET16-Protein kodieren, wurden gänzlich chemisch synthetisiert, wobei ihre Nukleotidsequenzen so konzipiert waren, dass eine Pst I-Restriktionsenzymerkennungssequenz am 5'-Ende und eine Sal I-Restriktionsenzymerkennungsstelle am 3'-Ende angefügt war. Infolgedessen konnten die in den pEX-A Vektor (Operon Biotechnologies, Inc.) eingesetzten DNAs, die das AtSWEET8- und AtSWEET14-Protein kodierten, und die in den pCR2.1-TOPO Vektor eingesetzten DNAs, die das AtSWEET10- und AtSWEET16-Protein kodierten, erhalten werden.
  • 1.3. Ausschneiden von das AtSWEET-Protein kodierender DNA durch Restriktionsenzymreaktion und Reinigung
  • Um die DNA-Fragmente, welche die AtSWEET-Proteine kodieren, aus den in 1.1.5 und 1.2 erhaltenen Plasmid-DNAs auszuschneiden, wurden Behandlungen mit zwei Restriktionsenzymen durchgeführt. Die Kombination von Restriktionsenzymen für jede DNA ist in Tabelle 13 gezeigt. [Tabelle 13]
    Name der DNA Erstes Zweites Name der DNA Erstes Zweites
    AtSWEET1 Sac I Sal I AtSWEET10 Sal I Sac I
    AtSWEET2 Sac I Sal I AtSWEET11 Sac I Sal I
    AtSWEET3 Sac I Sal I AtSWEET12 Sac I Sal I
    AtSWEET4 Sac I Sal I AtSWEET13 Nde I Sal I
    AtSWEET5 Sac I Sal I AtSWEET14 Nde I Sal I
    AtSWEET6 Sac I Sal I AtSWEET15 Sac I Sal I
    AtSWEET7 Sac I Sal I AtSWEET16 Sal I Xba I
    AtSWEET8 Nde I Sal I AtSWEET17 Sac I Sal I
    AtSWEET9 Sac I Sal I
  • 1.3.1. Sac I-, Nde I- oder Sal I-Restriktionsenzymreaktion amplifizierter DNA-Fragmente (erste Runde)
  • Die in den nachstehenden Tabellen ausgewiesenen Reaktionslösungen wurden mit Sac I (TaKaRa, #1078A), Nde I (TaKaRa, #1161A) oder Sal I (TaKaRa, #1080A) zubereitet und zum Verdau der in 1.1.5 oder 1.2 erhaltenen Plasmide über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Zusammensetzung der Reaktionslösung mit Sal I ist in Tabelle 14 gezeigt, die Zusammensetzung der Reaktionslösung mit Nde I ist in Tabelle 15 gezeigt und die Zusammensetzung der Reaktionslösung mit Sac I ist in Tabelle 16 gezeigt. [Tabelle 14]
    Komponente (µl)
    Plasmid 45 µl
    10×L Puffer 10 µl
    Sac I 1 µl
    DW 44 µl
    Gesamt 100 µl
    [Tabelle 15]
    Komponente (µl)
    Plasmid 45 µl
    10×H Puffer 10 µl
    Nde I 1 µl
    DW 44 µl
    Gesamt 100 µl
    [Tabelle 16]
    Komponente (µl)
    Plasmid 45 µl
    10×H Puffer 10 µl
    Sal I 1 µl
    DW 44 µl
    Gesamt 100µl
  • 1.3.2. Reinigung von in Restriktionsenzymreaktion verdauten DNA-Fragmenten
  • Als Nächstes wurden zur Reinigung der DNA eine PCI(Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol = 24:24:1)-Extraktion und Ethanolfällung durchgeführt. Ein gleiches Volumen PCI wurde der Reaktionslösung zugegeben und der Ansatz wurde 5 Minuten bei 15000 rpm gerührt und zentrifugiert. Die obere Schicht wurde abgenommen und ein gleiches Volumen Chloroform wurde dieser zugesetzt. Der Ansatz wurde auf ähnliche Weise zentrifugiert und die obere Schicht abgenommen. Der abgenommenen oberen Schicht wurde das doppelte Volumen Ethanol zugesetzt und eine Ethanolfällung wurde mit Pellet Paint NF Co-Präzipitant (Merck, #70748) durchgeführt. Die resultierende DNA wurde getrocknet und sodann in 44 µl sterilem Wasser gelöst.
  • 1.3.3. Sal I-, Xba I- und Sac I-Restriktionsenzymreaktion amplifizierter DNA-Fragmente (zweite Runde)
  • Als Nächstes wurden die in den nachstehenden Tabellen gezeigten Reaktionslösungen mit Sal I (TaKaRa, #1080A), Xba I (TaKaRa, #1093A) oder Sac I (TaKaRa, #1078A) zubereitet und zum Verdau der in 1.3.2 erhaltenen Plasmide über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Zusammensetzung der Reaktionslösung mit Sal I ist in Tabelle 17 gezeigt, die Zusammensetzung der Reaktionslösung mit Xba I ist in Tabelle 18 gezeigt und die Zusammensetzung der Reaktionslösung mit Sac I ist in Tabelle 19 gezeigt. [Tabelle 17]
    Komponente (µl)
    Pellet
    10×H Puffer 5 µl
    Sal I 1 µl
    DW 44 µl
    Gesamt 50 µl
    [Tabelle 18]
    Komponente (µl)
    Pellet
    10×M Puffer 5 µl
    100×BSA 0,5 µl
    Xba I 1 µl
    DW 43,5 µl
    Gesamt 50 µl
    [Tabelle 19]
    Komponente (µl)
    Pellet
    10×L Puffer 5 µl
    Sac I 1 µl
    DW 44 µl
    Gesamt 50 µl
  • 1.3.4. Reinigung der in Restriktionsenzymreaktion verdauten DNA-Fragmente
  • Die in 1.3.3 erhaltenen Reaktionslösungen wurden auf ähnliche Weise wie dem Verfahren von 1.1.2 einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und die DNAs wurden mit dem MagExtractor-PCR & Gel Clean up Kit ausgeschnitten und gereinigt.
  • 1.4. Ausschneiden von pRI201AN-Vektor in Restriktionsenzymreaktion und Reinigung
  • Zum Ligieren des pRI201AN-Vektors mit den in 1.3 erhaltenen, die AtSWEET-Proteine kodierenden DNA-Fragmenten wurde der Vektor auf ähnliche Weise wie dem Verfahren von 1.3 mit Restriktionsenzymen behandelt.
  • 1.5. Ligation
  • 1.5.1. Ligationsreaktion
  • Eine Ligationsreaktion wurde zum Einsetzen der in 1.3 erhaltenen DNA-Fragmente, die die AtSWEET-Proteine kodieren, in den in 1.4 erhaltenen pRI201AN-Vektor durchgeführt. Die Ligationsreaktion wurde über Nacht bei 16°C mit dem DNA Ligation Kit Ver.2.1 (Takara Bio, #6022) durchgeführt.
  • 1.5.2. Transformation mit Ligationsreaktionsprodukt
  • Nach der vorgenannten Ligationsreaktion wurde eine Transformation mit 2 µl der Ligationsreaktionslösung auf eine ähnliche Weise wie 1.1.3 durchgeführt.
  • 1.5.3. Überprüfung der Ligationsreaktion durch Kolonie-PCR
  • Die Insertion der DNAs, die die AtSWEET-Proteine kodieren, in den Vektor wurde durch Untersuchen der Länge visualisierter DNA-Fragmente, die durch Kolonie-PCR amplifiziert worden waren, in einer Agarose-Gelelektrophorese bestätigt.
  • 1.5.4. Herstellung von durch Ligationsreaktion erhaltenen DNA-Konstrukten
  • Von den Kolonien, in denen die eingesetzten DNAs bestätigt wurden, wurden die Plasmid-DNAs gereinigt, um die Klone zu erhalten, in denen die interessierenden DNA-Fragmente eingesetzt waren. Die Plasmid-DNAs wurden mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, #27106) nach dem im Kit enthaltenen Protokoll gereinigt. 6 veranschaulicht die physische Karte des resultierenden DNA-Konstrukts (AtSWEET / pRI201AN). In 6 steht LB für linker Rand, RB steht für rechter Rand, TNOS steht für Transkriptionsterminator des Nopalin-Synthase-Gens NOS aus dem Ti-Plasmid in Agrobacterium tumefaciens, NPTII steht für Neomycin-Phosphotransferase-II-Gen aus Escherichia coli, Pnos steht für Transkriptionspromotor des Nopalin-Synthase-Gens NOS aus dem Ti-Plasmid in Agrobacterium tumefaciens, THSP steht für Transkriptionsterminator des Hitzeschockprotein-Gens HSP aus Arabidopsis thaliana, AtSWEET steht für DNA, die ein SWEET-Protein aus Arabidopsis thaliana kodiert, P35S steht für den 35S-Transkriptionspromotor aus dem Blumenkohlmosaikvirus, AtADH 5'-UTR steht für Translationsverstärker des Alkoholdehydrogenase-Gens ADH aus Arabidopsis thaliana, ColE1 ori steht für den Reproduktionsursprung von Escherichia coli, Ri ori steht für den Reproduktionsursprung von Agrobacterium rhizogenes.
  • 1.6.1. Herstellung von das OsSWEET-Protein kodierender DNA durch chemische Synthese und Konstrukterstellung
  • Die das OsSWEET5-, OsSWEET11-, OsSWEET12-, OsSWEET13-, OsSWEET14- und OsSWEET15-Protein kodierenden DNAs, deren Nukleotidsequenzen in Bezug auf den Codongebrauch in Arabidopsis thaliana neu konzipiert wurden, so dass keine Veränderung der Aminosäuresequenz erfolgen würde, wurden mit einer Nde I-Restriktionsenzymerkennungssequenz auf der Startcodon-Seite und einer Sac I-Restriktionsenzymerkennungssequenz auf der Stopcodon-Seite konzipiert. Die konzipierten DNAs wurden gänzlich chemisch synthetisiert und in den pRI201AN-Vektor eingesetzt, um die jeweiligen DNA-Konstrukte zu erhalten. Die DNAs waren so konzipiert, dass das ATG in der an das 5'-Ende angefügten Nde I-Restriktionsenzymerkennungssequenz (5'CATATG3') mit den Startcodonen der DNAs übereinstimmt, die die SWEET-Proteine kodieren.
  • 1.6.2. Herstellung eines künstlichen Gens, das einen an Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, sowie eines Konstrukts durch chemische Synthese
  • Desoxyribonukleinsäuren (DNAs), die an Zuckertransport beteiligte Transporter mit der Konsensussequenz 1 und mit einer nicht natürlich vorkommenden Nukleotidsequenz kodieren, oder 6 künstliche Gene von an Zuckertransport beteiligten Transportern mit der Konsensussequenz 1 wurden wie folgt hergestellt. Zunächst wurden SEQ ID NO: 168, 169, 170, 171, 172 und 173 als Nukleinsäuren konzipiert, die die Transporter SWo1, SWo2, SWo3, SWo4, SWo5 bzw. SWo6 mit in SEQ ID NOs: 132 bis 137 aufgeführten Aminosäuresequenzen kodieren. DNAs wurden so konzipiert, dass jede von ihnen eine Nde I-Restriktionsenzymerkennungssequenz auf der Startcodonseite und eine Sac I-Restriktionsenzymerkennungssequenz auf der Stopcodonseite von SEQ ID NOs: 168, 169, 170, 171, 172 und 173 besitzt. Die konzipierten DNAs wurden sodann gänzlich chemisch synthetisiert und in den pRI201AN-Vektor eingesetzt, um die 6 DNA-Konstrukte zu erhalten. Die DNAs waren so konzipiert, dass das ATG in der an das 5'-Ende angefügten Nde I-Restriktionsenzymerkennungssequenz (5'CATATG3') mit den Startcodonen in SEQ ID NOs: 168, 169, 170, 171, 172 und 173 übereinstimmt.
  • 1.7. Transformation von Arabidopsis thaliana
  • Die in 1.5 und 1.6.1 und 1.6.2 hergestellten Vektoren zur Pflanzenexpression wurden durch Elektroporation (Plant Molecular Biology Manual, Second Edition, B. G. Stanton and A. S. Robbert, Kluwer Academic Publishers 1994) in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm C58C1 eingeführt. Dann wurde Agrobacterium tumefaciens, in die die Vektoren zur Pflanzenexpression jeweils eingeführt waren, durch von Clough, et al. (Steven J. Clough und Andrew F. Bent, 1998, The Plant Journal 16, 735-743) beschriebenes Eintauchen in den Wildtyp Arabidopsis thaliana Ökotyp Col-0 eingeführt, und T1(Transformante der ersten Generation)-Samen wurden gesammelt. Die gesammelten T1-Samen wurden unter sterilen Bedingungen auf MS-Agar-Medium (Agarkonzentration 0,8%) enthaltend Kanamycin (50 mg/l), Carbenicillin (100 mg/l) und benetzbares Benlate-Pulver (10 mg/l: Sumitomo Chemical Co., Ltd.) ausgesät und etwa 2 Wochen zum Selektieren von Transformanten angezüchtet. Die selektierten Transformanten wurden auf ein frisches Präparat des gleichen MS-Agar-Mediums verpflanzt, etwa 1 Woche weiter kultiviert und dann in einen Topf enthaltend Erde, welche ein 1:1-Gemisch aus Vermiculit und Soil-mix (Sakata Seed Co.) war, verpflanzt, um T2(Transformante der zweiten Generation)-Samen zu erhalten.
  • 1.8. Herstellung von Arabidopsis thaliana-Guttation
  • T1- oder T2-Pflanzen von Arabidopsis thaliana, die mit den das AtSWEET-, OsSWEET-, SWo1-, SWo2-, SWo3-, SWo4-, SWo5- und SWo6-Proteinen kodierenden DNAs transformiert worden waren, wurden mit 18H/6D (24-Stunden-Zyklen mit 18 Stunden unter hellen Bedingungen, gefolgt von 6 Stunden unter dunklen Bedingungen) bei 22°C kultiviert. Nach der Akklimatisierung wurden Pflanzen, die 1 bis 2 Wochen kultiviert worden waren, mit 1/1000 Hyponex versorgt und die Pflanzen wurden mit einer Plastikfolie (Saran Wrap (R), Asahi Chemical Industry) umhüllt, um die Luftfeuchtigkeit auf 80% oder mehr, oder bevorzugt 90% oder mehr zu erhöhen, so dass Guttation abgesondert wird (7). Hauptsächlich wurde Guttation, die der Rückseite von Blättern anhaftete, aufgefangen und die Zuckerkonzentration in der Guttation wurde analysiert. T1-Samen sind als Samen definiert, die nach Infizieren des Wildtyps Arabidopsis thaliana mit Agrobacterium und Kultivieren des Resultierenden geerntet werden, T1-Pflanzen sind als Pflanzen definiert, bei denen die Einführung von DNA in Zellen beispielsweise durch Screening von T1-Samen mit Arzneimittel oder durch PCR bestätigt wird, und T2-Samen sind als Samen definiert, die nach Kultivieren von T1-Pflanzen geerntet werden.
  • 2. Erstellung von DNA-Konstrukt für die Transformation von Oryza sativa
  • 2.1. Amplifikation von das AtSWEET-Protein kodierender DNA
  • Unter Verwendung der in 1.5.4 hergestellten, vorgenannten DNA-Konstrukte (der DNA, die das AtSWEET8-Protein kodiert, und der DNA, die das AtSWEET11-Protein kodiert, sowie der DNA, die das AtSWEET12-Protein kodiert) zur Transformation von Arabidopsis thaliana als Templates wurden die das AtSWEET8-Protein kodierende DNA und die das AtSWEET11-Protein kodierende DNA sowie die das AtSWEET12-Protein kodierende DNA durch PCR amplifiziert. Zur Einführung des Amplifikationsprodukts in den pENTR/D-TOPO-Vektor wurde die Sequenz CACC an das 5'-Ende jedes Amplifikationsprodukts angehängt.
  • 2.2. Transformation mit amplifiziertem DNA-Fragment
  • Teile der resultierenden Reaktionslösungen wurden einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um das Vorliegen erwarteter Größen von amplifizierten Produkten zu bestätigen. Die amplifizierten Produkte wurden dann unter Verwendung des pENTER Directional TOPO Cloning Kits (Invitrogen) in den pENTR/D-TOPO-Vektor eingeführt.
  • Als Nächstes wurden kompetente Zellen von Escherichia coli DH5a (Takara Bio) durch Zusetzen der Gesamtmenge der Reaktionslösungen transformiert. Die Zellen wurden 30 Minuten in Eisbad belassen und dann 45 Sekunden einer Wärmebehandlung bei 42°C unterzogen. Anschließend wurden die Zellen rasch im Eisbad abgekühlt, und 300 µl SOC-Medium (Takara Bio) wurden zugesetzt. Der Ansatz wurde bei 37°C unter einstündigem Schütteln bei 180 rpm angezüchtet, und diese Flüssigkultur wurde auf einer LB-Agar-Platte enthaltend Kanamycin in einer Endkonzentration von 50 µg/ml ausgestrichen und über Nacht bei 37°C angezüchtet, um am nächsten Morgen Kolonien zu erhalten.
  • 2.3. Überprüfung der Transformation durch Kolonie-PCR und Selektion auf positives Klon
  • Die Insertion der die AtSWEET-Proteine kodierenden DNAs in den Vektor wurde durch Untersuchen der Länge visualisierter DNA-Fragmente, die durch Kolonie-PCR amplifiziert worden waren, in einer Agarose-Gelelektrophorese bestätigt.
  • 2.4. Reinigung von Plasmid-DNA aus positivem Klon
  • Die Plasmid-DNAs von jenen Klonen, bei denen die eingesetzten DNAs bestätigt werden konnten, wurden gereinigt. Die Reinigung der Plasmid-DNAs wurde unter Verwendung des QIAprep Spin Miniprep Kits (QIAGEN, #27106) nach dem im Kit enthaltenen Protokoll durchgeführt.
  • 2.5. Sequenzierung von positivem Klon
  • Unter Verwendung der in 2.4 gereinigten Plamid-DNAs als Templates sowie von M13-F- und M13-R-Primern wurden die DNA-Fragmente durch einen DNA-Sequenzierer (Beckman Coulter, CEQ8000) sequenziert.
  • 2.6. LR-Reaktion und Transformation
  • Die in 2.4 erhaltenen pENTR/D-TOPO-Plasmid-DNAs, in denen die das AtSWEET8-Protein kodierende DNA, die das AtSWEET11-Protein kodierende DNA und die das AtSWEET12-Protein kodierende DNA eingesetzt waren, sowie ein Vektor zur Transformation von Oryza sativa (pZH2B_GWOx) wurden der Gateway-LR-Reaktion unterzogen, um die Konstrukte für die Überexpression in der Pflanze von Oryza sativa zu erstellen, wie in 8 gezeigt.
  • Als Nächstes wurden durch Zusetzen der Gesamtmenge der Reaktionslösungen kompetente Zellen von Escherichia coli DH5a (Takara Bio) transformiert. Die Zellen wurden 30 Minuten in Eisbad belassen und dann 45 Sekunden einer Wärmebehandlung bei 42°C unterzogen. Anschließend wurden die Zellen rasch im Eisbad abgekühlt, und 300 µl SOC-Medium (Takara Bio) wurden hinzugegeben. Der Ansatz wurde bei 37°C unter 1-stündigem Schütteln bei 180 rpm angezüchtet. Diese Flüssigkultur wurde auf einer LB-Agar-Platte enthaltend Spectionmycin in einer Endkonzentration von 50 (µg/ml ausgestrichen und über Nacht bei 37°C angezüchtet, um am nächsten Morgen Kolonien zu erhalten.
  • 2.7. Überprüfung der Transformation durch Kolonie-PCR und Selektion auf positives Klon
  • Die Insertion der die AtSWEET-Proteine kodierenden DNAs in den Vektor wurde durch Untersuchen der Länge visualisierter DNA-Fragmente, die durch Kolonie-PCR amplifiziert worden waren, in einer Agarose-Gelelektrophorese bestätigt.
  • 2.8. Reinigung von Plasmid-DNA aus positivem Klon
  • Die Plasmid-DNAs jener Klone, bei denen die eingesetzten DNAs bestätigt werden konnten, wurden gereinigt. Die Plasmid-DNAs wurden mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, #27106) nach dem im Kit enthaltenen Protokoll durchgeführt.
  • 2.9. Sequenzierung positiver Klone
  • Unter Verwendung der in 2.8 gereinigten Plasmid-DNAs als Templates und der folgenden Primer wurden die DNA-Fragmente durch den DNA-Sequenzierer (Beckman Coulter, CEQ8000) sequenziert.
    • Ubi3'F: 5'-TGC TGT ACT TGC TTG GTA TTG-3' (SEQ ID NO: 166)
    • UbiTseq3: 5'-GGA CCA GAC CAG ACA ACC-3 '(SEQ ID NO: 167)
  • 2.10.1. Herstellung von OsSWEET kodierender DNA durch chemische Synthese
  • DNAs, welche das OsSWEET13-, OsSWEET14- oder OsSWEET15-Protein kodieren, wurden so konzipiert, dass sie die Sequenz CACC am 5'-Ende zur Einführung in den pENTR/D-TOPO-Vektor besaßen. Die konzipierten DNAs wurden gänzlich chemisch synthetisiert und in den pENTR/D-TOPO-Vektor eingesetzt.
  • 2.10.2. Herstellung eines künstlichen Gens, das an Zuckertransport beteiligten Transporter kodiert, durch chemische Synthese
  • Desoxyribonukleinsäuren (DNAs), die an Zuckertransport beteiligte Transporter mit der Konsensussequenz 1 und mit einer nicht natürlich vorkommenden Nukleotidsequenz kodieren, oder 2 künstliche Gene von an Zuckertransport beteiligten Transportern mit der Konsensussequenz 1 wurden wie folgt hergestellt. Zunächst wurden SEQ ID NOs: 174 und 175 als Nukleinsäuren konzipiert, die die Transporter SWo1 und SWo5 mit in SEQ ID NOs: 132 und 136 aufgeführten Aminosäuresequenzen kodieren. DNAs wurden so konzipiert, dass sie die Sequenz CACC am 5'-Ende von SEQ ID NOs: 174 und 175 zur Einführung in den pENTR/D-TOPO-Vektor besitzen. Die konzipierten DNAs wurden gänzlich chemisch synthetisiert und in den pENTR/D-TOPO-Vektor eingesetzt.
  • 2.11. Herstellung eines DNA-Konstrukts oder künstlichen Gens, das ein OsSWEET-Protein kodiert
  • Vektoren zur Transformation von Oryza sativa wurden unter Verwendung der in 2.10.1 und 2.10.2 synthetisierten DNAs auf ähnliche Weise wie 2.6 bis 2.9 oben konstruiert.
  • 2.12. Transformation von Oryza sativa
  • Die das AtSWEET-, OsSWEET-, SWo1- und SWo5-Protein kodierenden DNAs wurden unter Verwendung der vorgenannten, in 2.9 und 2.11 konstruierten Vektoren zur Pflanzenexpression gemäß dem in The Plant Journal (2006) 47, 969-976 beschriebenen Verfahren in Oryza sativa (c.v. Nipponbare) eingeführt.
  • 2.13. Herstellung von Oryza sativa-Guttation
  • T1-Transformanten von Oryza sativa, in denen DNA, welche das AtSWEET-, OsSWEET-, SWo1- und SWo5-Protein kodiert, eingeführt worden war, wurden in einen Topf mit einem Durchmesser von 6 cm, enthaltend das 0,8-fache Volumen Vermiculit, verpflanzt und akklimatisiert. Oryza sativa wurde mit 18H(30°C)/6D(25°C) (24 Stunden Photozyklusbedingungen mit 18 Stunden unter hellen Bedingungen bei 30°C, gefolgt von 6 Stunden unter dunklen Bedingungen bei 25°C) kultiviert. Nach der Akklimatisierung wurden die 1 bis 2 Wochen kultivierten Pflanzen ausreichend mit 1/1000 Hyponex versorgt und die Pflanzen wurden mit einer Plastikfolie (Saran Wrap (R), Asahi Chemical Industry) umhüllt, um die Luftfeuchtigkeit auf 80% oder mehr, oder bevorzugt 90% oder mehr zu erhöhen, so dass Guttation aus der Hydathode in Oryza sativa abgesondert wird (9). Guttation, die an Blättern anhaftete, wurde aufgefangen und auf die Zuckerkonzentration untersucht.
  • 3. Untersuchung auf Zuckerkonzentration in Guttation
  • 3.1. Verdünnung von Guttationsprobe
  • Die Volumina der in 1.8 erhaltenen Guttation von Arabidopsis thaliana und der in 2.13 erhaltenen Guttation von Oryza sativa wurden unter Verwendung einer Pipettiervorrichtung gemessen, und reines Wasser wurde einem festen Volumen von 0,35 ml zugesetzt. Als Nächstes wurde die Guttation 10 Minuten bei 10000xG zentrifugiert und dann wurden 0,3 ml des Überstands in ein Gefäß eines automatischen Probenehmers überführt und für eine HPLC-Analyse verwendet.
  • 3.2. HPCL-Analyse auf Zuckerkonzentration
  • Die Zuckerkonzentration wurde unter Verwendung von HPLC unter den folgenden Bedingungen analysiert. In dieser Analyse wurde eine Standardlösung verwendet, die ein Gemisch aus jeweils 50 µM Glucose, Fructose und Saccharose als Standardsubstanzen enthielt.
    • Analytische Säule: CarboPac PA1 (Dionex)
    • Elutionsmittel: 100 mM NaOH
    • Flussrate: 1 ml/min
    • Einspritzmenge: 25 µl
    • Detektor: gepulst-amperometrischer Detektor (Dionex ED40)
  • 4. Analyseergebnis
  • Die Ergebnisse der Messung der Zuckerkonzentrationen in der in 1.8 erhaltenen Guttation von Arabidopsis thaliana und der in 2.13 erhaltenen Guttation von Oryza sativa sind in Tabelle 20 und 21 gezeigt. [Tabelle 20]
    Klade Transgen Host Glc (µM) Fru (µM) Sacch (µM) Gesamtes Monosacharid-Äquivalent (µM)
    Durchsch Max Min Durchsch Max Min Durchsch Max Min Durchsch Max Min
    I AtSW01 A. thaliana 1,3 14,2 0,0 1,8 11,8 0,0 0,0 0,0 0,0 3,1 22,1 0,0
    I AtSW02 A. thaliana 5,7 33,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,1 1,8 0,0 5,8 33,6 0,0
    I AtSW03 A. thaliana 4,0 14,7 0,0 0,9 6,0 0,0 0,2 3,4 0,0 5,2 19,6 0,0
    II AtSW04 A. thaliana 3,0 9,1 0,0 8,5 20,7 0,0 0,0 0,0 0,0 11,6 23,2 0,0
    II AtSW05 A. thaliana 5,5 15,7 0,0 3,4 20,5 0,0 0,0 0,0 0,0 8,8 30,8 0,0
    II AtSW06 A. thaliana 3,3 10,3 0,0 0,1 2,0 0,0 0,2 5,0 0,0 3,9 10,3 0,0
    II AtSW07 A. thaliana 4,9 15,1 0,0 8,0 19,0 0,0 1,6 4,9 0,0 16,1 36,9 0,0
    II AtSW08 A. thaliana 419,9 838,6 50,2 610,6 1.154,3 145,6 697,1 1.172,5 217,6 2.424,8 4.337,8 631,0
    II AtSW08 O. sativa 571,4 1.205,6 152,4 419,0 845,5 153,1 41,9 47,8 33,6 1.074,3 2.146,7 394,3
    III AtSW09 A. thaliana 399,5 2.708,3 36,4 552,5 2.838,7 69,5 228,3 1.309,4 41,2 1.408,5 7.865,4 211,8
    III AtSW10 A. thaliana 331,6 586,3 77,0 650,9 1.085,9 215,8 280,9 516,6 45,2 1.544,3 2.705,4 383,1
    III AtSW11 A. thaliana 711,1 2.137,9 80,1 674,6 1.384,7 117,6 290,7 470,4 97,2 1.967,1 4.463,5 449,6
    III AtSW11 O. sativa 31.304,7 59.730,0 757,3 36.772,0 74.830,9 964,0 8.196,6 19.339,4 110,8 84.469,9 173.239,6 1.942,9
    III AtSW12 A. thaliana 1.375,5 2.920,7 183,4 1.720,7 3.542,4 201,4 1.480,7 6.099,3 214,7 6.057,5 18.661,6 1.185,5
    III AtSW12 O. sativa 14.006,2 45.976,5 1.081,6 11.477,3 43.830,5 1.690,7 2.598,2 22.209,9 56,4 30.679,9 130.872,6 3.247,4
    III AtSW13 A. thaliana 230,5 941,5 51,1 304,3 1.336,8 85,5 146,8 402,7 51,9 828,5 3.083,7 287,3
    III AtSW14 A. thaliana 60,4 211,6 24,9 163,2 451,8 74,8 48,8 118,7 22,2 321,2 900,7 151,6
    III AtSW15 A. thaliana 796,6 2.064,2 143,1 1.140,0 2.727,5 226,1 514,2 1.217,2 70,1 2.965,0 6.511,9 582,7
    IV AtSW16 A. thaliana 3,1 14,6 0,0 0,5 3,0 0,0 0,0 0,0 0,0 3,5 14,6 0,0
    IV AtSW17 A. thaliana 2,0 3,5 0,0 1,2 3,7 0,0 0,0 0,0 0,0 3,2 7,1 0,0
    [Tabelle 21]
    Klade Transgen Host Glc (µM) Fru (µM) Sacch (µM) Gesamtes Monosaccharid-Äquivalent (µM)
    Durchsch Max Min Durchsch Max Min Durchsch Max Min Durchsch Max Min
    II OsSW05 A. thaliana 2,7 5,3 0,0 3,8 12,8 0,0 2,2 3,9 0,0 10,8 21,5 0,0
    III OsSW11 A. thaliana 318,0 607,1 81,5 490,8 833,1 179,7 221,0 723,7 14,0 1.250,7 2.887,6 360,7
    III OsSW12 A. thaliana 41,7 172,9 9,7 89,5 334,1 32,4 36,9 127,8 3,0 205,0 762,5 71,1
    III OsSW13 A. thaliana 48,5 160,9 8,0 121,0 367,7 24,8 41,3 93,7 19,6 252,1 716,0 71,9
    III OsSW13 O. sativa 62.407,2 125.776,4 3.917,0 77.858,6 156.842,0 4.650,0 22.687,7 74.320,2 64,5 185.641,2 358.704,4 8.994,7
    III OsSW14 A. thaliana 37,5 128,5 10,7 115,6 460,4 45,5 51,2 118,0 19,4 255,6 824,9 95,0
    III OsSW14 O. sativa 43.115,4 90.201,0 543,0 58.581,3 152.827,3 229,1 7.104,2 21.756,3 10,8 115.905,1 275.262,5 793,8
    III OsSW15 A. thaliana 14,9 39,7 8,2 39,3 97,3 19,6 25,5 82,0 7,2 105,3 300,9 59,8
    III OsSW15 O. sativa 33.018,8 246.007,1 197,8 31.135,4 197.244,2 461,9 2.011,4 10.537,3 85,2 68.176,9 450.340,4 830,2
    III SWo1 A. thaliana 182,9 337,5 28,2 125,9 219,2 32,6 14,3 22,4 6,1 337,3 601,5 73,0
    III SWo1 O. sativa 11.181,0 33.889,1 284,2 6.586,0 19.670,8 351,1 221,1 795,8 18,5 18.209,1 51.684,6 1.019,9
    III SWo2 A. thaliana 81,6 128,4 30,6 103,3 146,3 26,7 9,9 13,8 6,3 204,7 284,5 84,9
    III SWo3 A. thaliana 141,1 141,1 141,1 166,9 166,9 166,9 16,0 16,0 16,0 340,0 340,0 340,0
    III SWo4 A. thaliana 41,9 96,3 12,7 35,5 88,2 3,8 10,6 13,4 6,7 98,5 210,9 51,7
    III SWo5 A. thaliana 31,8 31,8 31,8 7,7 7,7 7,7 10,1 10,1 10,1 59,6 59,6 59,6
    III SWo5 O. sativa 12.006,9 43.461,2 1.371,6 7.166,2 31.839,2 734,7 892,0 4.573,9 42,4 20.957,0 84.448,2 2.197,3
    III SWo6 A. thaliana 179,1 455,3 33,5 121,1 155,1 64,6 10,8 21,1 2,8 321,8 638,2 108,6
    - keines A. thaliana 1,6 8,1 0,0 0,3 7,3 0,0 0,0 2,6 0,0 2,0 11,0 0,0
    - keines O. sativa 1,0 8,3 0,0 0,0 0,2 0,0 0,1 0,8 0,0 1,3 8,3 0,0
  • Es wurde festgestellt, dass die Zuckerkonzentration in Guttation bei allen Arabidopsis thaliana und Oryza sativa stark erhöht ist, die mit jenen DNAs von den SWEET-Proteine kodierenden Nukleinsäuren transformiert sind, die die in Klade III eingeordneten AtSWEET9 bis 15 sowie OsSWEET13 bis 15 kodieren, wie in Tabelle 20 und 21 ersichtlich. Insbesondere wurde festgestellt, dass die Zuckerkonzentration in Guttation stärker erhöht werden kann, wenn die Transformation mit einer der AtSWEET11 kodierenden DNA, der AtSWEET12 kodierenden DNA, der AtSWEET15 kodierenden DNA, der OsSWEET13 kodierenden DNA und der OsSWEET14 kodierenden DNA erfolgt. Überdies wurde festgestellt, dass die Zuckerkonzentration in Guttation bei Oryza sativa, der mit DNAs transformiert ist, welche in Klade III eingeordnete SWEET-Proteine kodieren, stärker erhöht ist als bei Arabidopsis thaliana, die mit DNAs transformiert ist, welche in Klade III eingeordnete SWEET-Proteine kodieren. Insbesondere wurde festgestellt, dass die Zuckerkonzentration in Guttation in Orzya sativa, der mit einer der OsSWEET13 kodierenden DNA, der OsSWEET14 kodierenden DNA und der OsSWEET15 kodierenden DNA transformiert wurde, merklich erhöht ist gegenüber Arabidopsis thaliana, die mit der gleichen DNA transformiert wurde.
  • Überdies wurde festgestellt, dass die Zuckerkonzentration in Guttation auch in den Pflanzen erhöht werden kann, in die ein künstliches Gen eines an Zuckertransport beteiligten Transporters mit Konsenussequenz 1 eingeführt wird. Das Ergebnis hat gezeigt, dass die Zuckerkonzentration in Guttation in irgendeiner Pflanze erhöht werden kann, ohne durch die Host-Pflanze beschränkt zu sein, indem eine Nukleinsäure, die einen an Zuckertransport beteiligten Transporter mit Konsensussequenz 1 kodiert, eingeführt wird und/oder die Expression des Proteins verbessert wird.
  • Selbst bei den Pflanzen vom Wildtyp können bei einigen Individuen Zuckerkonzentrationen von etwa 50 µM in Guttation nachgewiesen werden. Es wurde jedoch festgestellt, dass die Wirkung des Einführens der DNA, die die in Klade III eingeordneten SWEET-Proteine kodiert, viel höher ist als die höchste in den Pflanzen vom Wildtyp detektierte Konzentration, wie in den Beispielen ersichtlich.

Claims (20)

  1. Transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle, bei der eine Nukleinsäure, die ein Transporterprotein kodiert, das eine die folgende Aminosäuresequenz umfassende Konsensussequenz besitzt: (L/I/V/M/F)x(G/A)xx(I/L/V/M/F)xxxx(L/I/V/F)(A/S)(P/S)(1-3aa)(P/S/T/A)T(F/L)xx(I/V)xxxKxxxxxxxxPYxxx(L/I)xxxx(L/I)x(I/L/M/V/F)x Y(A/S/G)(7-13aa)(I/L/V/M)(1-2aa)(I/V)Nxxxxxx(E/Q)xxYxxx(Y/F)xx(Y/F)(A/G/S)(35-36aa)(R/Q/H)xxxxGx(V/I/L)xxxxx(V/M/L/I/F)xxxx(A/S/T)P(L/M)x(I/V)(I/M/ V/L)(2-7aa)(V/I)(V/I/M)x(T/S)x(S/N)xx(F/Y)(M/L)(P/S)(F/I/V/L)xLSxx(L/I)(T/V)xx( A/G)xxW(F/L)xYGxxxxDxx(V/I)xxPNxxGxx(F/L)(G/S)xxQ(M/I)x(L/M/I/V/F) (Y/H/F) und das an Zuckertransport beteiligt ist, eingeführt ist: wobei das Transporterprotein ein Protein eines der folgenden (a) und (b) ist: (a) ein Protein, das eine in einer von SEQ ID NOs: 132 oder 136 aufgeführte Aminosäuresequenz umfasst; (b) ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die eine Identität von 90% oder mehr mit einer in einer von SEQ ID NOs: 132 oder 136 aufgeführten Aminosäuresequenz besitzt, und mit Transporteraktivität im Zusammenhang mit Zuckertransport.
  2. Transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle nach Anspruch 1, wobei die transformierte Pflanze eine Phanerogame ist.
  3. Transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle nach Anspruch 2, wobei die Phanerogame eine Angiosperme ist.
  4. Transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle nach Anspruch 3, wobei die Angiosperme eine Monokotyle ist.
  5. Transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle nach Anspruch 4, wobei die Monokotyle eine Pflanze aus der Familie der Poaceae ist.
  6. Transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle nach Anspruch 5, wobei die Pflanze aus der Familie der Poaceae eine Pflanze der Gattung Oryza ist.
  7. Transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle nach Anspruch 3, wobei die Angiosperme eine Dikotyle ist.
  8. Transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle nach Anspruch 7, wobei die Dikotyle eine Pflanze aus der Familie der Brassicaceae ist.
  9. Transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle nach Anspruch 8, wobei die Pflanze aus der Familie der Brassicaceae eine Pflanze der Gattung Arabidopsis ist.
  10. Verfahren zur Herstellung eines Exsudats, umfassend die Schritte des Kultivierens einer transformierten Pflanze, bei der eine Nukleinsäure, die ein Transporterprotein kodiert, das eine die folgende Aminosäuresequenz umfassende Konsensussequenz besitzt: (L/I/V/M/F)x(G/A)xx(I/L/V/M/F)xxxx(L/I/V/F)(A/S)(P/S)(1-3aa)(P/S/T/A)T(F/L)xx(I/V)xxxKxxxxxxxxPYxxx(L/I)xxxx(L/I)x(I/L/M/V/F)x Y(A/S/G)(7-13aa)(I/L/V/M)(1-2aa)(I/V)Nxxxxxx(E/Q)xxYxxx(Y/F)xx(Y/F)(A/G/S)(35-36aa)(R/Q/H)xxxxGx(V/I/L)xxxxx(V/M/L/I/F)xxxx(A/S/T)P(L/M)x(I/V)(I/M/ V/L)(2-7aa)(V/I)(V/I/M)x(T/S)x(S/N)xx(F/Y)(M/L)(P/S)(F/I/V/L)xLSxx(L/I)(T/V)xx( A/G)xxW(F/L)xYGxxxxDxx(V/I)xxPNxxGxx(F/L)(G/S)xxQ(M/I)x(L/M/I/V/F) (Y/H/F) und das an Zuckertransport beteiligt ist, eingeführt ist und die Expression des Proteins verbessert ist; und des Sammelns eines Exsudats von der transformierten Pflanze; wobei das Transporterprotein ein Protein eines der folgenden (a) und (b) ist: (a) ein Protein, das eine in einer von SEQ ID NOs: 132 oder 136 aufgeführte Aminosäuresequenz umfasst; (b) ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die eine Identität von 90% oder mehr mit einer in einer von SEQ ID NOs: 132 oder 136 aufgeführten Aminosäuresequenz besitzt, und mit Transporteraktivität im Zusammenhang mit Zuckertransport.
  11. Verfahren zur Herstellung eines Exsudats nach Anspruch 10, wobei die transformierte Pflanze unter Bedingungen einer relativen Luftfeuchtigkeit von 80% RH oder mehr kultiviert wird.
  12. Verfahren zur Herstellung eines Exsudats nach Anspruch 10, wobei das Exsudat Guttation ist.
  13. Verfahren zur Herstellung eines Exsudats nach Anspruch 10, wobei die transformierte Pflanze eine Phanerogame ist.
  14. Verfahren zur Herstellung eines Exsudats nach Anspruch 13, wobei die Phanerogame eine Angiosperme ist.
  15. Verfahren zur Herstellung eines Exsudats nach Anspruch 14, wobei die Angiosperme eine Monokotyle ist.
  16. Verfahren zur Herstellung eines Exsudats nach Anspruch 15, wobei die Monokotyle eine Pflanze aus der Familie der Poaceae ist.
  17. Verfahren zur Herstellung eines Exsudats nach Anspruch 16, wobei die Pflanze aus der Familie der Poaceae eine Pflanze der Gattung Oryza ist.
  18. Verfahren zur Herstellung eines Exsudats nach Anspruch 14, wobei die Angiosperme eine Dikotyle ist.
  19. Verfahren zur Herstellung eines Exsudats nach Anspruch 18, wobei die Dikotyle eine Pflanze aus der Familie der Brassicaceae ist.
  20. Verfahren zur Herstellung eines Exsudats nach Anspruch 19, wobei die Pflanze aus der Familie der Brassicaceae eine Pflanze der Gattung Arabidopsis ist.
DE112014006075.5T 2013-12-27 2014-12-25 Transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle und Verfahren zur Herstellung eines Exsudats Active DE112014006075B9 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013-273128 2013-12-27
JP2013273128 2013-12-27
PCT/JP2014/084316 WO2015099042A1 (ja) 2013-12-27 2014-12-25 形質転換植物、形質転換植物を用いた糖含有滲出物の製造方法

Publications (4)

Publication Number Publication Date
DE112014006075T5 DE112014006075T5 (de) 2016-09-22
DE112014006075T8 DE112014006075T8 (de) 2018-01-25
DE112014006075B4 DE112014006075B4 (de) 2022-10-06
DE112014006075B9 true DE112014006075B9 (de) 2022-12-08

Family

ID=53478887

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE112014006075.5T Active DE112014006075B9 (de) 2013-12-27 2014-12-25 Transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle und Verfahren zur Herstellung eines Exsudats

Country Status (8)

Country Link
US (2) US10494641B2 (de)
JP (2) JP6382846B2 (de)
CN (1) CN105848471B (de)
AU (2) AU2014370930B2 (de)
BR (1) BR112016014646A2 (de)
CA (1) CA2935104C (de)
DE (1) DE112014006075B9 (de)
WO (1) WO2015099042A1 (de)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110144358B (zh) * 2019-05-28 2021-01-01 华中农业大学 一种苜蓿SWEET1b基因及其在促进苜蓿根系菌根率中的应用
CN111154772B (zh) * 2020-02-09 2022-10-04 南京农业大学 梨糖转运基因PbSWEET4及其应用
CN112725375B (zh) * 2021-01-18 2024-02-13 沈阳农业大学 一种沉默载体及其在转基因植株中的用途
CN116200401B (zh) * 2023-03-23 2024-04-05 石河子大学 一种羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET13在促进植物根粘黏土壤中的应用
CN116286869B (zh) * 2023-03-23 2024-04-05 石河子大学 一种羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14在提高植物抗寒性中的应用
CN116875633B (zh) * 2023-09-06 2023-11-24 北京首佳利华科技有限公司 雄性不育基因ZmSWEET6及其在创制玉米雄性不育系中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002501755A (ja) 1998-01-30 2002-01-22 ボード オブ トラスティーズ， ラトガーズ， ザ ステイト ユニバーシティ オブ ニュー ジャージー 植物及び植物の部分からポリペプチドを回収するための方法
WO2010129540A2 (en) 2009-05-04 2010-11-11 Carnegie Institution Of Washington Novel sugar transporters
WO2013086494A1 (en) 2011-12-08 2013-06-13 Carnegie Institution Of Washington Sucrose transporters and methods of generating pathogen-resistant plants

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040168214A1 (en) 1997-08-07 2004-08-26 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Process for increasing the yield in plants by expressing stably integrated recombinant polypeptides
DE19734218A1 (de) * 1997-08-07 1999-02-11 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur Ertragssteigerung in Pflanzen
US6936467B2 (en) * 2000-03-27 2005-08-30 University Of Delaware Targeted chromosomal genomic alterations with modified single stranded oligonucleotides
FR2881143B1 (fr) * 2005-01-27 2010-12-17 Librophyt Systeme de production de terpenoides dans les plantes
JP5794606B2 (ja) * 2010-09-07 2015-10-14 国立大学法人東京農工大学 Ｌ−ｄｏｐａを蓄積する植物細胞及びその利用
CN105189759A (zh) 2013-03-13 2015-12-23 华盛顿卡内基研究所 调节植物种子和蜜腺内含物的方法
CN103725694B (zh) * 2013-04-16 2015-11-18 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT2类基因与应用
CN103204917B (zh) * 2013-04-17 2014-06-25 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT3及其编码基因的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002501755A (ja) 1998-01-30 2002-01-22 ボード オブ トラスティーズ， ラトガーズ， ザ ステイト ユニバーシティ オブ ニュー ジャージー 植物及び植物の部分からポリペプチドを回収するための方法
WO2010129540A2 (en) 2009-05-04 2010-11-11 Carnegie Institution Of Washington Novel sugar transporters
JP2012525845A (ja) 2009-05-04 2012-10-25 カーネギー インスチチューション オブ ワシントン 新規糖トランスポーター
WO2013086494A1 (en) 2011-12-08 2013-06-13 Carnegie Institution Of Washington Sucrose transporters and methods of generating pathogen-resistant plants

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BECHTOLD, Nicole ; ELLIS, Jeff ; PELLETIER, Georges: In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. In: Comptes rendus de l'Academie des Sciences / Série 3, Sciences de la vie, Vol. 316, 1993, S. 1194-1199. - ISSN 0249-6313
CHEN, Li-Qing [et al.]: Sugar transporters for intercellular exchange and nutrition of pathogens. In: Nature, Vol. 468, 2010, No. 7323, S. 527-532. - ISSN 0028-0836
CLOUGH, Steven J. ; BENT, Andrew F.: Floral dip: a simplified method for agrobacterium-mediated transformation of arabidopsis thaliana. In: The Plant Journal, Vol. 16, 1998, No. 6, S. 735-743. - ISSN 0960-7412
GELVIN, Stanton B. ; SCHILPEROORT, Robbert A.: Plant Molecular Biology Manual. 2. Ed. Dordrecht: Springer Science+Media, 1994. - ISBN 978-94-011-7654-5. - Deckblatt und Inhaltsverzeichnis
HENIKOFF, Steven ; HENIKOFF, Jorja G.: Amino acid substitution matrices from protein blocks. In: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS), Bd. 89, 1992, H. 22, S. 10915–10919. - ISSN 0027-8424
MCKEE, Trudy ; MCKEE, James R.: Biochemistry : the molecular basis of life. 3. ed. Boston : McGraw-Hill, 2003. S. 108-123. - ISBN 0-07-231592-X. - ISBN 0-07-112248-6
SAMBROOK, J. ; FRITSCH, E. F.: Molecular cloning. A laboratory manual. 2. Auflage. Plainview, N.Y., USA: Coldspring Harbor Laboratory Press, 1989. - ISBN 0-87969-309-6. - Deckblatt und Inhaltsverzeichnis
TAKANAGA, Hitomi ; FROMMER, Wolf B.: Facilitative plasma membrane transporters function during ER transit. In: The FASEB Journal, Vol. 24, 2010, No. 8, S. 2849-2858. - ISSN 0892-6638
TAKANAGA, Hitomi; FROMMER, Wolf B.: Facilitative plasma membrane transporters function during ER transit. In: The FASEB Journal, Vol. 24, 2010, No. 8, S. 2849-2858. - ISSN 0892-6638
TOKI, Seiichi [et al.]: Early infection of scutellum tissue with agrobacterium allows high-speed transformation of rice. In: The Plant Journal, Vol. 47, 2006, No. 6, S. 969-976. - ISSN 0960-7412
ZYPRIAN, Eva ; KADO, Clarence I.: Agrobacterium-mediated plant transformation by novel mini-T vectors in conjunction with a high-copy vir region helper plasmid. In: Plant Molecular Biology, Vol, 15, 1990, No. 2, S. 245-256. - ISSN 0167-4412

Also Published As

Publication number Publication date
BR112016014646A2 (pt) 2017-09-19
JP6382846B2 (ja) 2018-08-29
DE112014006075T8 (de) 2018-01-25
CN105848471B (zh) 2019-03-22
US20200071715A1 (en) 2020-03-05
DE112014006075B4 (de) 2022-10-06
JP2018139594A (ja) 2018-09-13
AU2018200858B2 (en) 2020-03-19
US10494641B2 (en) 2019-12-03
AU2014370930A1 (en) 2016-07-07
WO2015099042A1 (ja) 2015-07-02
US20160319293A1 (en) 2016-11-03
CN105848471A (zh) 2016-08-10
DE112014006075T5 (de) 2016-09-22
CA2935104C (en) 2022-07-12
JPWO2015099042A1 (ja) 2017-03-23
AU2018200858A1 (en) 2018-02-22
CA2935104A1 (en) 2015-07-02
AU2014370930B2 (en) 2018-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE112014006075B9 (de) Transformierte Pflanze oder transformierte Pflanzenzelle und Verfahren zur Herstellung eines Exsudats
Xu et al. A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato
WO2001014569A2 (de) Erhöhung des polysaccharidgehaltes in pflanzen
EP3129394B1 (de) Tonoplastidäre protonen/zucker-antiporter-proteine und deren verwendung zur erhöhung der saccharosekonzentration eines saccharosespeicherorgans von pflanzen
US9476059B2 (en) Gene capable of imparting environmental stress resistance to plants and method for utilizing the same
DE69333812T2 (de) Endo-Xyloglucan-Transferase
CA2737735C (en) Gene capable of increasing the production of plant biomass and method for using the same
DE10047286B4 (de) Isomalt produzierende transgene Pflanze
CN113801870A (zh) SiLCYB调控番茄红素等谷子类胡萝卜素合成代谢的功能及应用
DE112014006042T5 (de) Transformierte Pflanze und Verfahren zur Herstellung von zuckerhaltigem Exsudat unter Verwendung der transformierten Pflanze
US20110225677A1 (en) Gene for increasing the production of plant biomass and method of use thereof
EP1458230A1 (de) Produktion von rekombinanten antikörpern mittels fusion mit elastin-ähnlichen peptiden
EP1276882A2 (de) Verfahren zur genetischen modifizierung einer pflanze
WO2000060101A1 (de) Metabolische selektionsmarker für pflanzen
CN113122566A (zh) Hak基因在调控植物性状中的作用

Legal Events

Date Code Title Description
R012 Request for examination validly filed
R016 Response to examination communication
R016 Response to examination communication
R018 Grant decision by examination section/examining division
R020 Patent grant now final