JP6382846B2 - 形質転換植物、形質転換植物を用いた糖含有滲出物の製造方法 - Google Patents
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Description
(1)以下のアミノ酸配列:(L/I/V/M/F)x(G/A)xx(I/L/V/M/F)xxxx(L/I/V/F)(A/S)(P/S)(1-3aa)(P/S/T/A)T(F/L)xx(I/V)xxxKxxxxxxxxPYxxx(L/I)xxxx(L/I)x(I/L/M/V/F)xY(A/S/G)(7-13aa)(I/L/V/M)(1-2aa)(I/V)Nxxxxxx(E/Q)xxYxxx(Y/F)xx(Y/F)(A/G/S)(35-36aa)(R/Q/H)xxxxGx(V/I/L)xxxxx(V/M/L/I/F)xxxx(A/S/T)P(L/M)x(I/V)(I/M/V/L)(2-7aa)(V/I)(V/I/M)x(T/S)x(S/N)xx(F/Y)(M/L)(P/S)(F/I/V/L)xLSxx(L/I)(T/V)xx(A/G)xxW(F/L)xYGxxxxDxx(V/I)xxPNxxGxx(F/L)(G/S)xxQ(M/I)x(L/M/I/V/F)(Y/H/F)を含む共通配列を有する、糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする核酸を導入する及び/又は当該タンパク質の発現を強化した形質転換植物又は形質転換植物細胞。
(2) 上記トランスポータータンパク質は、SWEETタンパク質のアミノ酸配列に基づく分類群であるクレードI〜VのうちクレードIIIに属するタンパク質であることを特徴とする(1)記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
(3) 上記トランスポータータンパク質は、以下の(a)又は(b)のタンパク質であることを特徴とする(1)記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
(a)配列番号15〜137のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号15〜137のいずれかのアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
(4) 上記共通配列は、以下のアミノ酸配列:G(L/I/V/F/M)xGx(I/V/L)(I/V/L)(S/T)xxxxL(A/S)P(L/V/I/M)(P/S/T/A)TFxx(I/V)x(K/R)xK(S/T)xxx(F/Y)x(S/A)xPYxx(A/S/T)LxSxxLx(L/I/M/V)(Y/F)Y(A/G)(7-9aa)(L/I)(I/V/L)(T/S)INxx(G/A)xx(I/V/M)(E/Q)xxYxxx(F/Y)(L/I/V/F)x(Y/F)Ax(K/R/N)xxxxx(T/A)(7-8aa)(V/F/L/I/M)(18-19aa)(R/Q/H)xxxxGx(I/V)xxxxx(V/I/L/M)x(V/M)F(A/V)(A/S/T)PLx(I/V)(I/M/V/L)xxV(I/V)(K/R/Q)(T/S)(K/R)S(V/A)x(F/Y)MP(F/I/L)xLS(L/F/V)xL(T/V)(L/I)xAxxW(F/L)xYG(L/F)xxxDxx(V/I)xxPNxxGxx(L/F)(G/S)xxQMx(L/V/I)(Y/F)xx(Y/F)を含むことを特徴とする(1)記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
(5) 上記トランスポータータンパク質は、以下の(a)又は(b)のタンパク質であることを特徴とする(4)記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
(a)配列番号15〜35のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号15〜35のいずれかのアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
(6) 上記共通配列は、以下のアミノ酸配列:(A/V)xxxG(I/L/V)xGN(I/L/V)(I/L/V)S(F/L)x(V/T)xL(A/S)P(V/L/I)(P/A)TFxx(I/V)x(K/R)xK(S/T)xx(G/S)(F/Y)(Q/S/E)SxPYxx(A/S/T)LxS(A/C/S)xLx(L/I/M)(Y/F)Y(A/G)xx(K/T)(3-5aa)(L/M/P)(L/I)(I/L/V)(T/S)INxx(G/A)xx(I/V)(E/Q)xxY(I/L)x(L/M/V/I)(F/Y)(L/I/V/F)x(Y/F)Ax(K/R)xxxxx(T/A)xx(L/M/F/V/I)(L/F/V/I)xxx(N/D)(F/V/I/L)xx(F/L)xx(I/L/V)xxxxxx(L/I/V)(5-6aa)(R/Q)xxxxGx(I/V)xxxx(S/A)(V/L/M)(C/S/A)VF(A/V)(A/S)PLx(I/V)(I/M/V)xxV(I/V)(K/R/Q)(T/S)(K/R)S(V/A)E(F/Y)MP(F/I)xLS(L/F/V)xL(T/V)(L/I)(S/N)A(V/I)xW(F/L)xYGLxx(K/N)Dxx(V/I)xxPN(V/I)xGxx(F/L)(G/S)xxQMxL(Y/F)xx(Y/F)を含むことを特徴とする(1)記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
(7) 上記トランスポータータンパク質は、以下の(a)又は(b)のタンパク質であることを特徴とする(6)記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
(a)配列番号15〜26のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号15〜26のいずれかのアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
(8) 上記共通配列は、以下のアミノ酸配列:(M/L/V)xx(T/K/N/S)xxxxAxxFG(L/I/V)LGN(I/L/V)(I/V)SFxVxL(S/A)P(V/I)PTFxxIxK(K/R)K(S/T)x(E/K)(G/S)(F/Y)(Q/E)S(I/L)PYxx(A/S)LxS(A/C)xLx(L/I/M)YY(A/G)xxK(4-5aa)(L/M)(L/I)(I/V)(T/S)IN(A/S/T)(F/V)(G/A)x(F/V)(I/V)(E/Q)xxY(I/L)x(L/M/I)(F/Y)(F/V/I/L)x(Y/F)Ax(K/R)xx(R/K)xx(T/A)(L/V/M)K(V/L/M/F)(L/I/V/F)xxx(N/D)(F/V/I)xx(F/L)xx(I/L)(L/I/V/F)(L/M/V)(L/V)xx(F/L)(L/I/V)(5-6aa)(R/Q)x(K/S/Q)x(L/I/V)Gx(I/V)Cxxx(S/A)(V/L)(S/C/A)VF(A/V)(A/S)PLx(I/V)(M/I/V)xxV(I/V)(K/R)T(K/R)S(V/A)E(Y/F)MPFxLS(L/F)xLT(I/L)(S/N)A(V/I)xW(L/F)xYGLx(L/I)(K/N)Dxx(V/I)A(L/F/I/M)PN(V/I)(L/I/V)Gxx(L/F)GxxQM(I/V)L(Y/F)(V/L/I/M)(V/L/I/M)(Y/F)(K/R/Q)を含むことを特徴とする(1)記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
(9) 上記トランスポータータンパク質は、以下の(a)又は(b)のタンパク質であることを特徴とする(8)記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
(a)配列番号15〜21のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号15〜21のいずれかのアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質
(10) 顕花植物であることを特徴とする(1)記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
(11) 上記顕花植物が被子植物であることを特徴とする(10)記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
(12) 上記被子植物が単子葉植物であることを特徴とする(11)記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
(13) 上記単子葉植物がイネ科植物であることを特徴とする(12)記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
(14) 上記イネ科植物がOryza属植物であることを特徴とする(13)記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
(15) 上記被子植物が双子葉植物であることを特徴とする(11)記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
(16) 上記双子葉植物がアブラナ科植物であることを特徴とする(15)記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
(17) 上記アブラナ科植物がArabidopsis属植物であることを特徴とする(16)記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
(18) 上記(1)乃至(17)いずれかに記載の形質転換植物を栽培し、当該形質転換植物から滲出物を採取する工程を含む滲出物の製造方法。
(19) 上記形質転換植物を栽培する栽培条件を相対湿度80%RH以上とすることを特徴とする(18)記載の滲出物の製造方法。
(20) 上記滲出物が排水液であることを特徴とする(18)記載の滲出物の製造方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013-273128号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
本発明では特定の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする核酸を細胞内へ導入するか及び/又は当該タンパク質の発現を強化する。これにより当該核酸を細胞内へ導入した及び/又は当該タンパク質の発現を強化した形質転換植物からは、高糖濃度の滲出物を採取することができきる。ここで、滲出物とは、植物の組織から外部へとしみだす液体を意味し、例えば、根滲出液や、種子滲出液、排水組織からしみだす排水液を含む意味である。なお、排水組織(hydathode)から液体がしみだす現象は、溢液現象(guttation)とも称される。よって、排水液と溢液とは同義である。排水液特に、特定の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする核酸を細胞内へ導入するか及び/又は当該タンパク質の発現を強化した形質転換植物は、高糖濃度の排水液を産生することができる。
上述した「特定の糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする核酸」とは、以下のアミノ酸配列:(L/I/V/M/F)x(G/A)xx(I/L/V/M/F)xxxx(L/I/V/F)(A/S)(P/S)(1-3aa)(P/S/T/A)T(F/L)xx(I/V)xxxKxxxxxxxxPYxxx(L/I)xxxx(L/I)x(I/L/M/V/F)xY(A/S/G)(7-13aa)(I/L/V/M)(1-2aa)(I/V)Nxxxxxx(E/Q)xxYxxx(Y/F)xx(Y/F)(A/G/S)(35-36aa)(R/Q/H)xxxxGx(V/I/L)xxxxx(V/M/L/I/F)xxxx(A/S/T)P(L/M)x(I/V)(I/M/V/L)(2-7aa)(V/I)(V/I/M)x(T/S)x(S/N)xx(F/Y)(M/L)(P/S)(F/I/V/L)xLSxx(L/I)(T/V)xx(A/G)xxW(F/L)xYGxxxxDxx(V/I)xxPNxxGxx(F/L)(G/S)xxQ(M/I)x(L/M/I/V/F)(Y/H/F)を含む共通配列1を有する、糖輸送に関与するトランスポータータンパク質をコードする。
-Pairwise Alignment Parameters
--Alignment Type, Slow
--Slow Pairwise Alignment Options
---Protein Weight Matrix, Gonnet
---Gap Open, 10
---Gap Extension, 0.1
Multiple Sequence Alignment Parameters
-Protein Weight Matrix, Gonnet
-Gap Open, 10
-Gap Extension, 0.20
-Gap Distances, 5
-No End Gaps, no
-Iteration, none
-Numiter, 1
-Clustering, NJ
Output Options
-Format, Aln w/numbers
-Order, Aligned
このグループは、上記参考文献(1)で示された中性非極性アミノ酸のうち、脂肪属性の疎水性側鎖をもつアミノ酸のグループであり、V(Val、バリン)、L(Leu、ロイシン)、I(Ile、イソロイシン)及びM(Met、メチオニン)から構成される。参考文献(1)による中性非極性アミノ酸と分類されるもののうちFGACWPは以下理由で、この「脂肪族疎水性アミノ酸グループ」には含めない。G(Gly、グリシン)やA(Ala、アラニン)はメチル基以下の大きさで非極性の効果が弱いからである。C(Cys、システイン)はS-S結合に重要な役目を担う場合があり、また、酸素原子や窒素原子と水素結合を形成する特性があるからである。F(Phe、フェニルアラニン)やW(Trp、トリプトファン)は側鎖がとりわけ大きな分子量をもち、かつ、芳香族の効果が強いからである。P(Pro、プロリン)はイミノ酸効果が強く、ポリペプチドの主鎖の角度を固定してしまうからである。
このグループは、中性極性アミノ酸のうちヒドロキシメチレン基を側鎖に持つアミノ酸のグループであり、S(Ser、セリン)とT(Thr、スレオニン)から構成される。SとTの側鎖に存在する水酸基は、糖の結合部位であるため、あるポリペプチド(タンパク質)が特定の活性を持つために重要な部位である場合が多い。
このグループは、酸性であるカルボキシル基を側鎖に持つアミノ酸のグループであり、D(Asp、アスパラギン酸)とE(Glu、グルタミン酸)から構成される。
このグループは、塩基性アミノ酸のグループであり、K(Lys、リジン)とR(Arg、アルギニン)から構成される。これらKとRは、pHの広い範囲で正に帯電し塩基性の性質をもつ。一方、塩基性アミノ酸に分類されるH(His、ヒスチジン)はpH7においてほとんどイオン化されないので、このグループには分類されない。
このグループは、全てα位の炭素元素に側鎖としてメチレン基が結合しその先に極性基を有すると言う特徴を持つ。非極性基であるメチレン基の物理的大きさが酷似している特徴を持ち、N(Asn、アスパラギン、極性基はアミド基)、D(Asp、アスパラギン酸、極性基はカルボキシル基)とH(His、ヒスチジン、極性基はイミダゾール基)から成る。
このグループは、全てα位の炭素元素に側鎖としてジメチレン基以上の直鎖炭化水素が結合しその先に極性基を有すると言う特徴を持つ。非極性基であるジメチレン基の物理的大きさが酷似している特徴を持つ。E(Glu、グルタミン酸、極性基はカルボキシル基)、K(Lys、リジン、極性基はアミノ基)、Q(Gln、グルタミン、極性基はアミド基)、R(Arg、アルギニン、極性基はイミノ基とアミノ基)から成る。
このグループには、側鎖にベンゼン核を持つ芳香族アミノ酸であり、芳香族特有の化学的性質を特徴とする。F(Phe、フェニルアラニン)、Y(Tyr、チロシン)、W(Trp、トリプトファン)から成る。
このグループには、側鎖に環状構造を持つと同時に極性も持つアミノ酸で、H(H、ヒスチジン、環状構造と極性基は共にイミダゾール基)、Y(Tyr、チロシン、環状構造はベンゼン核で極性基は水酸基)から成る。
上述した「特定の糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸」としては、共通配列1、2、3又は4を有し、糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸であれば自然界に存在する核酸と同じ塩基配列を有する核酸に限らず、人工的に設計された塩基配列を有する核酸、つまり、人工遺伝子であってもよい。ここで人工遺伝子とは、人為的に設計したアミノ酸配列をコードする核酸であって、天然には存在しない塩基配列を有するDNAを意味する。人工遺伝子は、天然に存在するタンパク質の一部を改変(アミノ酸残基の欠失、置換、挿入等)したタンパク質をコードするものでも良いし、天然に存在するアミノ酸配列をつなぎ合わせたキメラタンパク質をコードするものでも良いし、N末端からC末端まで全配列を独自に設計したタンパク質をコードするものであっても良い。
発現ベクターは、恒常的な発現を可能とするプロモーター塩基配列を有する核酸と、上述した糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸(天然に存在する塩基配列を有する核酸及び人工遺伝子の両者を含む。以下同様)とを含むように構築する。発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、pBR322、pBR325、pUC19、pUC119、pBluescript、pBluescriptSK、pBI系のベクター等を挙げることができる。特に、植物細胞へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、pBI系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。pBI系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、pBIG、pBIN19、pBI101、pBI121、pBI221等を挙げることができる。
上述した発現ベクターは、一般的な形質転換方法によって対象の植物細胞に導入される。発現ベクターを植物細胞に導入する方法(形質転換方法)は特に限定されるものではなく、植物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接植物細胞に導入する方法を用いることができる。アグロバクテリウムを用いる方法としては、例えば、Bechtold, E., Ellis, J. and Pelletier, G. (1993) In Planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis plants. C.R. Acad. Sci. Paris Sci. Vie, 316, 1194-1199. あるいは、Zyprian E, Kado Cl, Agrobacterium-mediated plant transformation by novel mini-T vectors in conjunction with a high-copy vir region helper plasmid. Plant Molecular Biology, 1990, 15(2), 245-256.に記載された方法を用いることができる。
アカザ科:テンサイ(Beta vulgaris)
カエデ科:サトウカエデ(Acer saccharum)
トウダイグサ科:トウゴマ(Ricinus communis)
ナス科:タバコ(Nicotiana tabacum)、ナス(Solanum melongena)、ジャガイモ(Solaneum tuberosum)、トマト(Solanum lycopersicum)、トウガラシ(Capsicum annuum)、ペチュニア(Petunia hybrida)など。
マメ科:ダイズ(Glycine max)、エンドウ(Pisum sativum)、ソラマメ(Vicia faba)、フジ(Wisteria floribunda)、ラッカセイ(Arachis hypogaea)、ミヤコグサ(Lotus japonicus)、インゲンマメ(Phaseolus vulgaris)、アズキ(Vigna angularis)、アカシア(Acacia)、ウマゴヤシ(Medicago truncatula)、ヒヨコマメ(Cicer arietinum)など。
キク科:キク(Chrysanthemum morifolium)、ヒマワリ(Helianthus annuus)など。
ヤシ科:アブラヤシ(Elaeis guineensis、Elaeis oleifera)、ココヤシ(Cocos nucifera)、ナツメヤシ(Phoenix dactylifera)、ロウヤシ(Copernicia)など。
ウルシ科:ハゼノキ(Rhus succedanea)、カシューナットノキ(Anacardium occidentale)、ウルシ(Toxicodendron vernicifluum)、マンゴー(Mangifera indica)、ピスタチオ(Pistacia vera)など。
ウリ科:カボチャ(Cucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbita pepo)、キュウリ(Cucumis sativus)、カラスウリ(Trichosanthes cucumeroides)、ヒョウタン(Lagenaria siceraria var. gourda)など。
バラ科:アーモンド(Amygdalus communis)、バラ(Rosa)、イチゴ(Fragaria vesca)、サクラ(Prunus)、リンゴ(Malus pumila var. domestica)、モモ(Prunus persica)など。
ブドウ科:ブドウ(Vitis vinifera)
ナデシコ科:カーネーション(Dianthus caryophyllus)など。
ヤナギ科:ポプラ(Populus trichocarpa、Populus nigra、Populus tremula) など。
イネ科:トウモロコシ(Zea mays)、イネ(Oryza sativa)、オオムギ(Hordeum vulgare)、コムギ(Triticum aestivum)、ウラルツコムギ(Triticum urartu)、タルホコムギ(Aegilops tauschii)、ミナトカモジグサ(Brachypodium distachyon)、タケ(Phyllostachys)、サトウキビ(Saccharum officinarum)、ネピアグラス(Pennisetum pupureum)、エリアンサス(Erianthus ravenae)、ススキ(Miscanthus virgatum)、ソルガム(Sorghum bicolor)スイッチグラス(Panicum)など。
ユリ科:チューリップ(Tulipa)、ユリ(Lilium)など。
上述した形質転換処理後、植物体のなかから適切な形質転換体を選抜する選抜工程を、従来公知の方法で行うことができる。選抜の方法は特に限定されるものではなく、例えば、ハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性を基準として選抜してもよいし、形質転換体を育成した後に、植物体から滲出物を採取し、採取した滲出物に含まれる糖分を測定し、野生型と比較して糖濃度が有意に向上しているものを選抜してもよい。また、採取した滲出物に含まれる糖分測定は定量的でなく定性的に測定する方法でも良く、例えば糖に反応し呈色する試験紙を用いた呈色法で測定しても良い。
1.1 PCRによるAtSWEETタンパク質をコードするDNAの取得
1.1.1 AtSWEETタンパク質をコードするDNAの増幅
シロイヌナズナから調製したcDNAを鋳型にし、PCRによる評価用のAtSWEET1、AtSWEET2、AtSWEET3、AtSWEET4、AtSWEET5、AtSWEET6、AtSWEET7、AtSWEET9、AtSWEET11、AtSWEET12、AtSWEET13、AtSWEET15及びAtSWEET17タンパク質をコードするDNAの増幅を行った。評価用DNAをpRI201ANベクター(タカラバイオ社製、#3264)に挿入するため、5’末端にSal I制限酵素認識配列を付加したフォワードプライマーを、また3’末端にSac IまたはPst I制限酵素認識配列を付加したリバースプライマーを設計した(表6)。
PCRで増幅した各DNA断片をアガロースゲル電気泳動後、MagExtractor-PCR & Gel Clean up キット (TOYOBO、#NPK-601) を用いて、切り出し精製を行った。なお、切り出し精製は、キット添付のマニュアルに従って行った。
精製した増幅DNA断片を、TOPO TA Cloning (Invitrogen、#K4500-01) を用いてpCR2.1-TOPOベクターに導入した。反応液組成を表10に示した。表10に示した反応液を室温で5分間反応させた。
形質転換の結果、多数のコロニーが得られた。各コロニーについて挿入DNAの有無を確認するため、M13-F : 5’-GTA AAA CGA CCA GTC TTA AG-3’(配列番号164)及びM13-R : 5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’(配列番号165)を用いてコロニーPCRを行った。コロニーPCRの反応液組成を表11に示し、PCR条件を表12に示した。
挿入DNAが確認できたクローンからプラスミドDNAの精製を行った。プラスミドDNAの精製は、QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN、#27106) を用い、添付のプロトコルに従って行った。
1.1.5で得たプラスミドDNAを鋳型にし、M13-F及びM13-Rプライマーを用いてPCR増幅し、ダイデオキシ法(サンガー法)によるDNA断片の塩基配列の決定を行った。
AtSWEET8、AtSWEET10、AtSWEET14、AtSWEET16タンパク質をコードするDNAついては、5’末端にPst I制限酵素認識配列、3’末端にSal I制限酵素認識配列を付加するよう塩基配列を設計し、化学的に全合成した。その結果、pEX-Aベクター(オペロンバイオテクノロジー)に挿入されたAtSWEET8及びAtSWEET14タンパク質をコードするDNA、pCR2.1-TOPOベクターに挿入されたAtSWEET10及びAtSWEET16タンパク質をコードするDNAを得ることができた。
1.1.5と1.2で得られたプラスミドDNAからAtSWEETタンパク質をコードするDNA断片を取り出す為、二度の制限酵素処理を行った。各DNAに対する制限酵素の組み合わせを表13に記す。
Sac I(TaKaRa、#1078A)、Nde I(TaKaRa、#1161A)又はSal I(TaKaRa、#1080A)を用いて以下の反応液を作製し、37℃で一晩反応させ、1.1.5または1.2で得られたプラスミドを切断した。Sac Iの反応液組成を表14に、Nde Iの反応液組成を表15に、Sal Iの反応液組成を表16に示した。
次に、DNAを精製するため、PCI (フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール=24:24:1)抽出とエタノール沈殿を行った。反応液に等量のPCIを加えて攪拌し、5分間、15000 rpmで遠心して回収した上層に等量のクロロホルムを加え、同様に遠心し上層を回収した。回収した上層に二倍量のエタノールを加え、Pellet Paint NF Co-Precipitant (メルクバイオインサイト、#70748) を用いてエタノール沈殿を行った。乾燥後、得られたDNAは滅菌水44μlに溶解した。
次に、Sal I(TaKaRa、#1080A)、Xba I(TaKaRa、#1093A)又はSac I(TaKaRa、#1078A)を用いて以下の反応液を作製し、37℃で一晩反応させ、1.3.2で得られたプラスミドを切断した。Sal Iの反応液組成を表17に、Xba Iの反応液組成を表18に、Sac Iの反応液組成を表19に示した。
1.3.3で得られた反応液は1.1.2の手順と同様にアガロースゲル電気泳動後、MagExtractor-PCR & Gel Clean up キットを用いて切り出し精製を行った。
1.3で得られたAtSWEETタンパク質をコードするDNA断片とライゲーションを行うため、pRI201ANベクターを1.3と同様の手順で制限酵素処理を行った。
1.5.1 ライゲーション反応
1.3で得たAtSWEETタンパク質をコードするDNA断片を1.4で得たpRI201ANベクターへ挿入するため、ライゲーション反応を行った。反応にはDNA Ligation Kit Ver.2.1 (タカラバイオ、#6022) を用い、16℃で一晩反応させた。
上記ライゲーション反応の終了後、反応液2μlを用いて1.1.3と同様の方法で形質転換を行った。
コロニーPCRで増幅するDNA断片の長さをアガロースゲル電気泳動で可視化する事によって、AtSWEETタンパク質をコードするDNAのベクターへの挿入を確認した。
挿入DNAが確認できたコロニーからプラスミドDNAの精製を行い、目的のDNA断片を挿入したクローンを得た。プラスミドDNAの精製は、QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN、#27106) を用い、添付のプロトコルに従って行った。得られたDNAコンストラクト (AtSWEET / pRI201AN) の物理地図を図6に示す。図6において、LBはleft borderを、RBはright borderを、TNOSはAgrobacterium tumefaciens のTiプラスミド由来のノパリン合成酵素遺伝子NOSの転写ターミネーターを、NPTIIはEscherichia coli由来neomycin phosphotransferaseII遺伝子を、PnosはAgrobacterium tumefaciens のTiプラスミド由来のノパリン合成酵素遺伝子NOSの転写プロモーターを、THSPはArabidopsis thaliana由来のheat shock protein遺伝子HSPの転写ターミネーターを、AtSWEETはArabidopsis thaliana由来SWEETタンパク質をコードするDNAを、P35Sはカリフラワーモザイクウイルス35S転写プロモーターを、AtADH 5’-UTRはArabidopsis thaliana由来のalcohol dehydrogenase遺伝子ADHの翻訳エンハンサーを、ColE1 oriはEscherichia coliの複製起点を、Ri oriはAgrobacterium rhizogenesの複製起点をそれぞれ表す。
シロイヌナズナのコドン頻度を参考にしてアミノ酸配列が変わらないように新たに配列設計しなおしたOsSWEET5、OsSWEET11、OsSWEET12、OsSWEET13、OsSWEET14及びOsSWEET15タンパク質をコードするDNAの開始コドン側にNde I制限酵素認識配列、終止コドン側にSac I制限酵素認識配列を付加するよう設計した。そして、設計したDNAを化学的に全合成し、pRI201ANベクターに挿入することで各DNAコンストラクトを得た。なお、5’末端に付加したNde I制限酵素認識配列(5’CATATG3’)に含まれるATGがSWEETタンパク質をコードするDNAの開始コドンと一致するようにした。
共通配列1を有する糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸で、天然には存在しない塩基配列を有するDNA、すなわち共通配列1を有する糖輸送に関与するトランスポーターの人工遺伝子6種を以下のように作製した。先ず、配列番号132〜137のアミノ酸配列で示されるトランスポーターSWo1、SWo2、SWo3、SWo4、SWo5及びSWo6について、各トランスポーターをコードする核酸としてそれぞれ配列番号168、169、170、171、172及び173を設計した。そして、これら配列番号168、169、170、171、172及び173における、開始コドン側にNde I制限酵素認識配列、終止コドン側にSac I制限酵素認識配列を付加するようを設計した。次に、設計したDNAを化学的に全合成し、pRI201ANベクターに挿入することで6種のDNAコンストラクトを得た。なお、5’末端に付加したNde I制限酵素認識配列(5’CATATG3’)に含まれるATGが配列番号168、169、170、171、172及び173の開始コドンと一致するようにした。
1.5及び1.6.1並びに1.6.2で作製した植物発現用ベクターをエレクトロポレーション法(Plant Molecular Biology Mannal, Second Edition , B. G. Stanton and A. S. Robbert, Kluwer Acdemic Publishers 1994)により、Agrobacterium tumefaciens C58C1株に導入した。次いで植物発現用ベクターが導入されたAgrobacterium tumefaciensを、Cloughらにより記載された浸潤法(Steven J. Clough and Andrew F. Bent, 1998, The Plant Journal 16, 735-743)により、野生型シロイヌナズナ エコタイプCol-0に導入し、T1(形質転換(transformant)第一世代)種子を回収した。回収したT1種子は、カナマイシン(50 mg/L)、カルベニシリン(100 mg/L)及びベンレート水和剤(10 mg/L:住友化学社製)を含むMS寒天培地(寒天濃度は0.8%)に無菌播種し、約2週間培養し形質転換体を選抜した。選抜した形質転換体は、新しい上記MS寒天培地に植え換え、さらに約1週間栽培後、バーミキュライトとソイルミックス(サカタのタネ)を体積比で1:1に混合した土をいれた鉢に植え替えT2(形質転換第二世代)種子を得た。
AtSWEET、OsSWEET、SWo1、SWo2、SWo3、SWo4、SWo5及びSWo6タンパク質をコードするDNAによって形質転換されたシロイヌナズナのT1又はT2植物体の栽培を、18L/6D(18時間明条件の後6時間暗条件にする24時間光サイクル条件)、22℃で行った。馴化後、1〜2週間経過した植物体に1/1000ハイポネックスを与え、ラップフィルム(旭化成製、サランラップ)で湿度80%以上好ましくは90%以上になるように植物を包み込み、排水液を排出させた(図7)。おもに葉裏に付着した排水液を回収し、排水液中の糖濃度を分析した。なお、野生型シロイヌナズナにアグロバクテリウムを感染・栽培して収穫される種子をT1種子、T1種子を薬剤選抜するかPCRなどの方法により、細胞中へのDNA導入を確認した植物体をT1植物、T1植物を栽培して収穫される種子をT2種子と定義する。
2.1 AtSWEETタンパク質をコードするDNAの増幅
上記1.5.4で調製したシロイヌナズナ形質転換用DNAコンストラクト(AtSWEET8タンパク質をコードするDNA及びAtSWEET11タンパク質をコードするDNA及びAtSWEET12タンパク質をコードするDNA)を鋳型とし、PCRによりAtSWEET8タンパク質をコードするDNA及びAtSWEET11タンパク質をコードするDNA及びAtSWEET12タンパク質をコードするDNAをそれぞれ増幅した。なお、増幅産物をpENTR/D-TOPOベクターに導入するために、5’端にはCACC配列を付加している。
得られた反応液の一部をアガロースゲル電気泳動し、予定したサイズの増幅産物があることを確認したのち、pENTER Directional TOPO Cloningキット(インビトロジェン)を用いてpENTR/D-TOPOベクターに導入した。
コロニーPCRで増幅するDNA断片の長さをアガロースゲル電気泳動で可視化する事によって、AtSWEETタンパク質をコードするDNAのベクターへの挿入を確認した。
挿入DNAが確認できたクローンからプラスミドDNAの精製を行った。プラスミドDNAの精製は、QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN、#27106) を用い、添付のプロトコルに従って行った。
2.4で精製したプラスミドDNAを鋳型にし、M13-F及びM13-Rプライマーを用いて、DNAシーケンサ(ベックマンコールター CEQ8000)によりDNA断片の塩基配列の決定を行った。
2.4で得たAtSWEET8タンパク質をコードするDNA、AtSWEET11タンパク質をコードするDNA、AtSWEET12タンパク質をコードするDNAが挿入されたpENTR/D-TOPOプラスミドDNAとイネ形質転換用ベクター(pZH2B_GWOx)とを用いてGateway LR反応を行い、図8に示すように、イネ植物体内で過剰発現するためのコンストラクトを構築した。
コロニーPCRで増幅するDNA断片の長さをアガロースゲル電気泳動で可視化する事によって、AtSWEETタンパク質をコードするDNAのベクターへの挿入を確認した。
挿入DNAが確認できたクローンからプラスミドDNAの精製を行った。プラスミドDNAの精製は、QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN、#27106) を用い、添付のプロトコルに従って行った。
2.8で精製したプラスミドDNAを鋳型にし、以下のプライマーを用いて、DNAシーケンサ(ベックマンコールター CEQ8000)によりDNA断片の塩基配列の決定を行った。
Ubi3’F : 5’-TGC TGT ACT TGC TTG GTA TTG-3’(配列番号166)
UbiTseq3 : 5’-GGA CCA GAC CAG ACA ACC-3’ (配列番号167)
OsSWEET13、OsSWEET14或いはOsSWEET15タンパク質をコードするDNAに、pENTR/D-TOPOベクターに導入するため5’端にCACC配列を付加するよう設計した。設計したDNAを化学的に全合成し、pENTR/D-TOPOベクターに挿入した。
共通配列1を有する糖輸送に関与するトランスポーターをコードする核酸で、天然には存在しない塩基配列を有するDNA、すなわち共通配列1を有する糖輸送に関与するトランスポーターの人工遺伝子2種を以下のように作製した。先ず、配列番号132及び136のアミノ酸配列で示されるトランスポーターSWo1及びSWo5について、各トランスポーターをコードする核酸としてそれぞれ配列番号174及び175を設計した。そして、これら配列番号174及び175に対して、pENTR/D-TOPOベクターに導入するため5’端にCACC配列を付加するよう設計した。設計したDNAを化学的に全合成し、pENTR/D-TOPOベクターに挿入した。
2.10.1及び2.10.2で合成したDNAを用い、上記2.6〜2.9と同様にイネ形質転換用ベクターを構築した。
上記2.9及び2.11で作製した植物発現用ベクターを用いて、The Plant Journal (2006) 47, 969-976に記載の方法に従い、AtSWEET、OsSWEET、SWo1及びSWo5タンパク質をコードするDNAをイネ(日本晴)に導入した。
AtSWEET、OsSWEET、SWo1及びSWo5タンパク質をコードするDNAを導入したイネの形質転換第一世代を、直径6cmポットに8割程度バーミキュライトを入れたものに移し替えて馴化した。なおイネの栽培は、18L(30℃)/6D(25℃)(18時間30℃明条件の後6時間25℃暗条件にする24時間光サイクル条件)で行った。馴化後、1〜2週間経過した植物体に1/1000ハイポネックスを十分に与え、ラップフィルム(旭化成社製、サランラップ)で湿度80%以上好ましくは90%以上になるように植物を包み込み、イネの排水組織から排水液を排出させた(図9)。葉に付着した排水液を回収し、糖濃度を分析した。
3.1 排水液サンプルの希釈
1.8で得られたシロイヌナズナの排水液、2.13で得られたイネの排水液の体積をピペッターを用いて測定し、純水を加えて0.35mlに定容した。次に、10000xG、10分間の遠心分離を行ったのち、上清0.3mLをオートサンプラーバイアルに移してHPLC分析に用いた。
糖濃度の分析は以下の条件でHPLCを用いて行った。このとき標準物質としてグルコース、フルクトース、スクロースを各50μMになるよう混合した標準液を用いた。
分析カラム:CarboPac PA1(ダイオネクス)
溶離液:100mM NaOH
流量:1ml/min
注入量:25μl
検出器:パルスドアンペロメトリ検出器(ダイオネクス ED40)
1.8で得られたシロイヌナズナの排水液、2.13で得られたイネの排水液について糖濃度を測定した結果を表20及び21に示す。
Claims (20)
- 以下のアミノ酸配列:(L/I/V/M/F)x(G/A)xx(I/L/V/M/F)xxxx(L/I/V/F)(A/S)(P/S)(1-3aa)(P/S/T/A)T(F/L)xx(I/V)xxxKxxxxxxxxPYxxx(L/I)xxxx(L/I)x(I/L/M/V/F)xY(A/S/G)(7-13aa)(I/L/V/M)(1-2aa)(I/V)Nxxxxxx(E/Q)xxYxxx(Y/F)xx(Y/F)(A/G/S)(35-36aa)(R/Q/H)xxxxGx(V/I/L)xxxxx(V/M/L/I/F)xxxx(A/S/T)P(L/M)x(I/V)(I/M/V/L)(2-7aa)(V/I)(V/I/M)x(T/S)x(S/N)xx(F/Y)(M/L)(P/S)(F/I/V/L)xLSxx(L/I)(T/V)xx(A/G)xxW(F/L)xYGxxxxDxx(V/I)xxPNxxGxx(F/L)(G/S)xxQ(M/I)x(L/M/I/V/F)(Y/H/F)を含む共通配列を有する、糖輸送に関与するトランスポータータンパク質であって、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする核酸を導入した形質転換植物又は形質転換植物細胞。
(a)配列番号132又は137のアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号132又は137のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質 - 顕花植物であることを特徴とする請求項1記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
- 上記顕花植物が被子植物であることを特徴とする請求項2記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
- 上記被子植物が単子葉植物であることを特徴とする請求項3記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
- 上記単子葉植物がイネ科植物であることを特徴とする請求項4記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
- 上記イネ科植物がOryza属植物であることを特徴とする請求項5記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
- 上記被子植物が双子葉植物であることを特徴とする請求項3記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
- 上記双子葉植物がアブラナ科植物であることを特徴とする請求項7記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
- 上記アブラナ科植物がArabidopsis属植物であることを特徴とする請求項8記載の形質転換植物又は形質転換植物細胞。
- 以下のアミノ酸配列:(L/I/V/M/F)x(G/A)xx(I/L/V/M/F)xxxx(L/I/V/F)(A/S)(P/S)(1-3aa)(P/S/T/A)T(F/L)xx(I/V)xxxKxxxxxxxxPYxxx(L/I)xxxx(L/I)x(I/L/M/V/F)xY(A/S/G)(7-13aa)(I/L/V/M)(1-2aa)(I/V)Nxxxxxx(E/Q)xxYxxx(Y/F)xx(Y/F)(A/G/S)(35-36aa)(R/Q/H)xxxxGx(V/I/L)xxxxx(V/M/L/I/F)xxxx(A/S/T)P(L/M)x(I/V)(I/M/V/L)(2-7aa)(V/I)(V/I/M)x(T/S)x(S/N)xx(F/Y)(M/L)(P/S)(F/I/V/L)xLSxx(L/I)(T/V)xx(A/G)xxW(F/L)xYGxxxxDxx(V/I)xxPNxxGxx(F/L)(G/S)xxQ(M/I)x(L/M/I/V/F)(Y/H/F)を含む共通配列を有する、糖輸送に関与するトランスポータータンパク質であって、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする核酸を導入する及び/又は当該タンパク質の発現を強化した形質転換植物を栽培し、当該形質転換植物から滲出物を採取する工程を含む滲出物の製造方法。
(a)配列番号17、18、24、25、26、132及び137のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号17、18、24、25、26、132及び137のいずれかのアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖輸送に関与するトランスポーター活性を有するタンパク質 - 上記形質転換植物を栽培する栽培条件を相対湿度80%RH以上とすることを特徴とする請求項10記載の滲出物の製造方法。
- 上記滲出物が排水液であることを特徴とする請求項10記載の滲出物の製造方法。
- 顕花植物であることを特徴とする請求項10記載の滲出物の製造方法。
- 上記顕花植物が被子植物であることを特徴とする請求項13記載の滲出物の製造方法。
- 上記被子植物が単子葉植物であることを特徴とする請求項14記載の滲出物の製造方法。
- 上記単子葉植物がイネ科植物であることを特徴とする請求項15記載の滲出物の製造方法。
- 上記イネ科植物がOryza属植物であることを特徴とする請求項16記載の滲出物の製造方法。
- 上記被子植物が双子葉植物であることを特徴とする請求項14記載の滲出物の製造方法。
- 上記双子葉植物がアブラナ科植物であることを特徴とする請求項18記載の滲出物の製造方法。
- 上記アブラナ科植物がArabidopsis属植物であることを特徴とする請求項19記載の滲出物の製造方法。
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