WO2009107822A1 - 種子内の油脂含量を調節する変異遺伝子、種子内油脂含量の調節方法 - Google Patents

種子内の油脂含量を調節する変異遺伝子、種子内油脂含量の調節方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2009107822A1
WO2009107822A1 PCT/JP2009/053784 JP2009053784W WO2009107822A1 WO 2009107822 A1 WO2009107822 A1 WO 2009107822A1 JP 2009053784 W JP2009053784 W JP 2009053784W WO 2009107822 A1 WO2009107822 A1 WO 2009107822A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
gene
mutant
plant
group
Prior art date
Application number
PCT/JP2009/053784
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
大音徳
光川典宏
林誠
Original Assignee
トヨタ自動車株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by トヨタ自動車株式会社 filed Critical トヨタ自動車株式会社
Priority to AU2009218032A priority Critical patent/AU2009218032A1/en
Priority to EP09715272A priority patent/EP2270168A4/en
Priority to CN2009801068102A priority patent/CN101960010A/zh
Priority to CA2717086A priority patent/CA2717086A1/en
Priority to US12/920,063 priority patent/US20110041220A1/en
Publication of WO2009107822A1 publication Critical patent/WO2009107822A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C12N15/821—Non-antibiotic resistance markers, e.g. morphogenetic, metabolic markers
    • C12N15/8212—Colour markers, e.g. beta-glucoronidase [GUS], green fluorescent protein [GFP], carotenoid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)

Definitions

  • Mutant gene that regulates oil content in seeds method for regulating oil content in seeds
  • the present invention relates to a mutated gene that regulates oil content in seeds, which is identified using changes in oil bodies present in seeds as an index, and to regulate oil content in seeds by mutating specific genes. I will explain how. Background art
  • Oil bodies are small organelles present in large amounts in the seed cells of plants, especially oil crops.
  • the oil body is formed of a single layer of phospholipid membrane containing a specific protein called oleosin, steroleosin and force leucine.
  • the vegetable oil is in the form of triacylglycerol (TAG, neutral fat, neutral lipid). In particular, it accumulates in large quantities in plant seeds.
  • TAG triacylglycerol
  • Non-Patent Document 1 discloses that the size of the oil body is affected by the abundance of oleosin.
  • Non-patent document 2 discloses that an oil body can be observed by fluorescence derived from GFP by fusing an oleosin gene and a GFP (green fluorescent protein) gene.
  • GFP green fluorescent protein
  • Non-Patent Document 1 Si loto, RMP Et al., Plant Cel 18, 18, 1961-1974, (2006) Non-Patent Document 2 Wahlroos et al., GENESIS, 35 (2): 125-132, (2003) Disclosure of the invention
  • the present invention establishes a system capable of measuring various properties such as the number and size of oil bodies in plant cells, and uses this to elucidate the correlation between oil body properties and fat content, It is an object of the present invention to provide a mutant gene having a function of regulating oil content and a method for regulating oil content in seeds.
  • the present inventors have intensively studied, expressed oleosin-GFP fusion protein, and found that there is a positive correlation between the sum of the GFP fluorescence intensity and the oil content. Based on this finding, the present inventors have found that a gene having a function of affecting the fat content in seeds and an amino acid substitution mutation in the gene affect the fat content in seeds. It came to be completed. That is, the mutant gene according to the present invention includes the following.
  • the mutant protein has a 12th amino acid residue from the N-terminal side as another amino acid.
  • the mutant gene according to (1) wherein the gene is derived from a plant gene belonging to one family selected from the group consisting of Gramineae, Brassicaceae and Willowaceae.
  • the mutant gene according to (1) which is obtained by mutating a plant-derived gene belonging to one species selected from the group consisting of barley, rice, Arabidopsis thaliana, Brassica rapa and poplar.
  • the present invention also includes a mutant protein encoded by the mutant gene described above, a transformed cell introduced with the mutant gene described above, and a transformed plant introduced with the mutant gene described above.
  • the method for adjusting the oil content in seeds according to the present invention includes the following.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a score matrix (BL0SUM) of substitution mutations of amino acid residues.
  • Fig. 2_1 is an alignment diagram showing the results of alignment analysis for 14 amino acid sequences.
  • Figure 2-2 is an alignment diagram showing the results of alignment analysis for 14 amino acid sequences.
  • Figure 2-3 is an alignment diagram showing the results of alignment analysis for 14 types of amino acid sequences.
  • Figure 2-4 is an alignment diagram showing the results of alignment analysis for 14 amino acid sequences.
  • FIG. 3 is a diagram showing a molecular evolutionary tree obtained from the alignment diagram shown in FIG.
  • FIG. 4 is a structural diagram schematically showing an oleosin-GFP fusion gene, and B to D are fluorescent photographs of cotyledons on day 6 of germination of 01eG, variant A, and variant B, respectively.
  • FIG. 5 is a characteristic diagram showing the relationship between the total GFP fluorescence% and the lipid content of seeds.
  • FIG. 6 is a characteristic diagram showing the results of fatty acid composition analysis of seed storage lipids in 01eG, Mutant A, and Mutant B.
  • Figure 7 shows the results of SDS-PAGE using protein samples extracted from seeds of wild-type Arabidopsis thaliana, 01eG, mutant A, and mutant B, the results of imunoguchi analysis using anti-oleosin antibody, and anti-GFP. This is a photograph showing an immunoblotting analysis using antibody (C).
  • FIG. 8 is a photograph showing the results of observation of seed cells of 01eG, Mutant A and Mutant B with an electron microscope.
  • Fig. 9 is a characteristic diagram showing the results of high-precision mapping to identify the causative gene in variant A, and B is the gene present at the mapped position.
  • a model plant Arabidopsis thaliana
  • an oil body-specific protein and a fluorescent protein specifically, an oleosin-GFP fusion gene
  • the oil body contained in the cotyledon collected from the transformed Arabidopsis thaliana is fluorescent.
  • Mutations were induced in the transformed Arabidopsis thaliana to observe changes in various properties such as the shape and number of oil bodies, as well as changes in oil content and oil composition.
  • the mutated gene according to the present invention is a protein obtained by substituting a predetermined amino acid in an evolutionarily conserved amino acid sequence called a diacylglycerol-acyltransferase domain with another amino acid. It encodes a protein that has the function of regulating the fat content and the amount of fat.
  • the mutated gene according to the present invention is a protein having an evolutionarily conserved amino acid sequence called a diacylglycerol acyltransferase domain consisting of an amino acid sequence in which a predetermined amino acid is substituted with another amino acid.
  • a consensus sequence an amino acid sequence constituting an evolutionarily conserved region called a diacylglycerol acyltransferase domain is referred to as a consensus sequence.
  • the consensus sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • consensus sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be rewritten as the following amino acid sequence (amino acid single letter code).
  • amino acid sequence a plurality of amino acids in the bracket are collected at the position. Variations of possible amino acid residues are shown.
  • X means that an arbitrary amino acid residue is taken at that position.
  • the possible amino acid residue variations at a given position are as follows. That is, the consensus sequence can be defined by performing multiple alignment analysis of amino acid sequences of homologous proteins derived from a plurality of plant species, as will be described later.
  • a score matrix (BL0SUM) of substitution mutations of amino acid residues was proposed and widely used (Fig. 1 in this specification).
  • Reference (2) is based on the finding that amino acid substitutions between similar side chain chemical properties result in fewer structural and functional changes to the protein as a whole.
  • the side chain groups of amino acids considered for multiple alignment can be considered based on indicators such as chemical properties and physical size. This is shown as a group of amino acids having a score of 0 or more of the scores shown in FIG.
  • the following eight are typical groups.
  • Other fine groupings may be an amino acid group of 0 or more, preferably 1 or more of amino acid groups, and more preferably of 2 or more amino acid groups of the values in FIG.
  • This group is a group of amino acids having a hydrophobic hydrophobic side chain among the neutral nonpolar amino acids shown in the above reference (1).
  • V Val, Valine
  • L Leu, Mouth
  • Isin Kile, isoleucine
  • M Metal;
  • FGACWP is not included in this “aliphatic hydrophobic amino acid group” for the following reasons. This is because G (Gly, dalysin) and A (Ala, alanine) are less than the methyl group and have a weak nonpolar effect. This is because C (Cys, cysteine) may play an important role in SS bonds, and also has the property of forming hydrogen bonds with oxygen and nitrogen atoms.
  • This group is a group of amino acids having a hydroxymethylene group in the side chain among neutral polar amino acids, and consists of S (Ser, serine) and T (Thr, threonine).
  • S Ser, serine
  • T Thr, threonine
  • the hydroxyl groups present in the side chains of S and T are sugar binding sites, so they are often important sites for certain polypeptides (proteins) to have specific activities.
  • This group is a group of amino acids having an acidic carboxyl group in the side chain, and is composed of D (Asp, aspartic acid) and E (Glu, glutamic acid).
  • This group is a group of basic amino acids and consists of K (Lys, lysine) and R (Arg, arginine). These K and R are positively charged and have basic properties over a wide pH range. On the other hand, H (His, histidine), which is classified as a basic amino acid, is not classified into this group because it is hardly ionized at pH7.
  • This group is characterized by the fact that a methylene group is bonded as a side chain to the carbon element at the ⁇ -position and has a polar group at the end.
  • the physical size of the methylene group which is a nonpolar group, is very similar to that of N (Asn, asparagine, polar group is amide group), D (Asp, aspartic acid, polar group is carboxyl group) and H (His, histidine, polar group is imidazole group).
  • This group consists of all carbon atoms in the ⁇ position and straight chain carbons with dimethylene groups or more as side chains. It has the feature that hydrogen fluoride is bonded and has a polar group at the end.
  • the dimethylene group which is a nonpolar group, has a similar physical size. E (Glu, glutamic acid, polar group is carboxyl group), K (Lys, lysine, polar group is amino group), Q (Gln, glutamine, polar group is amide group), R (Arg, arginine, polar group is imino group) Group and amino group).
  • This group is an aromatic amino acid with a benzene nucleus in the side chain and is characterized by aromatic chemical properties. It consists of F (Phe, phenylalanin), Y (Tyr, tyrosine), W (Trp, tryptophan).
  • This group includes amino acids that have a cyclic structure in the side chain as well as a polarity, and H (H, histidine, both cyclic structure and polar group are imidazole groups), Y (Tyr, tyrosine; The polar group consists of a hydroxyl group).
  • the mutated gene according to the present invention is obtained by substituting the second amino acid residue (threonine (T) or serine (S)) from the N-terminal side in the above consensus sequence with another amino acid, and controls the amount of oil and fat in plants. It encodes a protein having the function of
  • the 12th amino acid residue (threonine (T) or serine (S)) from the N-terminal side in the above consensus sequence is highly likely to be phosphorylated by threonine kinase or serine kinase. It is a group and has a high probability of being an amino acid residue that greatly contributes to diacylglycerol acyltransferase activity.
  • the gene according to the present invention is encoded by substituting the second amino acid residue (threonine (T) or serine (S)) from the N-terminal side in the consensus sequence with another amino acid.
  • the activity of the protein will change. Changes in the activity of the protein encoded by the gene include improving enzyme activity, suppressing enzyme activity, changing substrate specificity, and affinity with substrates, coenzymes, and other factors. Means to change.
  • the other amino acid after substitution is preferably a force S that can include isoleucine, valine, leucine and methionin, particularly isoloicin.
  • a force S that can include isoleucine, valine, leucine and methionin, particularly isoloicin.
  • the consensus sequence is a sequence consisting of 10 amino acid residues (xxx (N / H / E / D) (D / E) xx (N / K) on the C-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. ) Array with xP) appended
  • mutant gene according to the present invention has a predetermined sequence on the C-terminal side of the amino acid sequence shown in sequence number 1.
  • the gene encoding the protein having the above consensus sequence is not limited to a specific plant species, and can be identified and isolated from a wide variety of plant species.
  • the genes encoding the proteins having the above consensus sequences include Arabidopsis thal iana belonging to the Brassicaceae family, Hordeum vulgare belonging to the Gramineae family, Oryza sat iva, and Brassica. It can be identified and isolated from Brassica ica rapa belonging to the family and Poplar trichocarpa (sometimes called black cottonwood or cottonwood) belonging to the family Willow.
  • Brass ica rapa includes, for example, rapeseed, oilseed rape, nanohana, Chinese cabbage, chingensai, turnip, Nozana, Mizuna, Komatsuna and Pakuchiyo.
  • Atlg54570 gene identified by GenBank accession number NM_123478.3
  • At5g41130 gene identified by GenBank accession number AY09638.1
  • Mention may be made of the At3g26840 gene.
  • an example of a gene encoding a protein having the above consensus sequence is the FLbaf l27k09 gene identified by GenBank accession number AK251457.1.
  • As a gene encoding a protein having the above consensus sequence in rice The 0s01g0361500 gene identified by GenBank accession number ⁇ _001049558 ⁇ 1, the 0s01g0362100 gene identified by GenBank accession number ⁇ _001049562 ⁇ 1, the 0s01g0361700 gene identified by GenBank accession number NM_001049559.1, and the GenBank Mention may be made of the 0s09g0509500 gene identified by the accession number NM_001070165.
  • the gene coding for the protein having the above consensus sequence is GenBank accession number AC189616. And the KBrH099I08 gene identified in 1.
  • the gene encoding the protein having the above consensus sequence is a region between the 41811th base and the 50309th base in the complete base sequence of clone name P0P002-D20 registered as GenBank accession number AC213081.1. List the existing genes, the genes present in the region of bases 62687 to 71216, the genes present in the region of bases 89072 to 97258, and the genes present in the region of bases 75984 to 83278. I can do it.
  • the nucleotide sequence of the Atlg54570 gene and the amino acid sequence of the protein encoded by the Atlg54570 gene are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the At5g41130 gene is shown in SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the At5 g 41120 gene is shown in SEQ ID NO: 6.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the At3g26840 gene is shown in SEQ ID NO: 7.
  • SEQ ID NO: 8 shows the amino acid sequence of the protein encoded by the FLbafl27k09 gene.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the above 0s01g0361500 gene is shown in SEQ ID NO: 9.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the 0s01g0362100 gene is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the above 0s01g0361700 gene is shown in SEQ ID NO: 11.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the 0s09g0509500 gene is shown in SEQ ID NO: 12.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the KBrH099I08 gene is shown in SEQ ID NO: 13. Region of 41811th to 50309th bases in the complete base sequence of the name of P0P002-D20 registered as AC213081.1
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the gene present in is shown in SEQ ID NO: 14.
  • SEQ ID NO: 15 shows the amino acid sequence of the protein encoded by the gene existing in the region from base 62687 to base 71216 in the complete base sequence of clone name P0P002-D20.
  • SEQ ID NO: 16 shows the amino acid sequence of the protein encoded by the gene existing in the region from base 89072 to base 97258 in the complete base sequence of clone name P0P002-D20.
  • SEQ ID NO: 17 shows the amino acid sequence of the protein encoded by the gene present in the region of bases 75984 to 83278 in the complete base sequence of clone name P0P002-D20.
  • the CLUSTAL W (1.83) multiple sequence alignment program (available at the National Institute of Genetics DDBJ (http://clustalw.ddbj.nig.ac. jp / top-j.html)) shows the results of the alignment analysis (the amino acid sequence substitution matrix used was the default BL0SUM matrix).
  • the amino acid sequence substitution matrix used was the default BL0SUM matrix.
  • Fig. 2 these 14 types of proteins are found to have the above consensus sequence (underlined).
  • the mutated gene according to the present invention is obtained by substituting threonine (T) or serine (S) at the position indicated by an arrow in the multiple alignment shown in FIG. 2 with another amino acid.
  • Fig. 3 shows the molecular evolutionary tree obtained from the alignment results of the 14 types of amino acid sequences shown in Fig. 2.
  • a conventionally known genetic engineering technique is appropriately used. Can be used.
  • the base sequence of the wild-type gene that encodes the protein to be mutagenized is identified, and the mutation is introduced using the site-specific mutagenesis kit to code for the protein after substitution. You can.
  • the gene into which the mutation has been introduced can be recovered according to a conventional method, for example, in the state of being incorporated into an expression vector. To introduce a mutation into a gene,
  • a mutation introduction kit using site-directed mutagenesis for example, Mutant-K (manufactured by TAKARA Bio)). Or Mutan-G (TAKARA Bio), etc., or LA PCR in vitro Mutagenesis series kit from TAKARA Bio Is introduced.
  • the mutant gene according to the present invention comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 4 to 17 with the 12th amino acid residue (threonine (T) or serine (S)) from the N-terminal side in the consensus sequence. It is not limited to those encoding proteins containing amino acid sequences substituted with other amino acids.
  • the mutated gene according to the present invention comprises the amino acid residues shown in SEQ ID NOs: 4 to 17 in the consensus sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the second amino acid residue (threonine (T) or serine (S )) May be mutated by deletion, substitution, addition or the like in plural, preferably one or several amino acids, from the amino acid sequence in which is substituted with other amino acids. For example, 1 to 10, 1 to 8, and preferably 1 to 5 amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 4 to 17 may be deleted, added or substituted.
  • the similarity is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more.
  • the amino acid deletion, addition, and substitution can be performed by modifying the gene encoding the protein by a technique known in the art. Mutation can be introduced into a gene by a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method, or a method equivalent thereto. For example, a mutation introduction kit using site-directed mutagenesis (for example, Mutant -K (TAKARA Bio) or Mutan- G (TAKARA
  • Examples of the method for introducing a mutation into the mutant gene according to the present invention include EMS (ethyl methanesulfonic acid), 5-bromouracil, 2-aminopurine, hydroxylamine, N-methyl-N, -nitro_N nitrosoguanidine, Other methods that use chemical mutations such as those typified by carcinogenic compounds may be used, or radiation treatment or ultraviolet treatment typified by X-rays, alpha rays, beta rays, gamma rays, or ion beams. The method by may be used.
  • the mutant gene according to the present invention has a function of hybridizing with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 under stringent conditions and regulating the oil content in seeds.
  • stringent conditions refer to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, hybridization at 45 ° C, 6 X SSC (sodium sodium citrate), followed by washing at 50-65 ° C, 0.2-1 X SSC, 0.1% SDS Examples of such conditions include: hybridization at 65 to 70 ° C. and 1 ⁇ SSC, and subsequent washing at 65 to 70 ° C. and 0.3 ⁇ SSC.
  • the protein is then hybridized by chemical synthesis, by PCR using the cloned cDNA as a saddle, or by using a DNA fragment having the base sequence as a probe. It can be obtained from various plants.
  • the mutant gene according to the present invention described above represents a wild-type gene in the plant genome, and the 12th amino acid residue (threonine (T) or serine (S)) from the N-terminal side in the consensus sequence. By changing to substitute with other amino acids, it is functionally expressed in the desired plant. That is, a plant having a mutant gene according to the present invention may be produced by the site-directed mutagenesis method as described above, or a homologous pair between a previously prepared mutant gene and a wild-type gene in the genome. It may be created by replacement. Alternatively, a plant having a mutated gene according to the present invention may be produced by deleting a wild-type gene in the plant genome and introducing the mutated gene so that it can be expressed. Furthermore, a plant having a mutant gene according to the present invention may be produced by introducing a mutant gene so that the wild-type gene in the plant genome is not over-expressed.
  • T threonine
  • S serine
  • pBI vectors, pUC vectors, and pTRA vectors are preferably used as vectors for introducing and expressing the mutant gene of the present invention into plant cells.
  • the pBI and pTRA vectors can introduce a gene of interest into a plant via an agrobacterium.
  • pBI binary One vector or intermediate vector system is preferably used, and examples thereof include ⁇ 21, pBI101, ⁇ 101.2, ⁇ .3, and the like.
  • a pUC vector can directly introduce a gene into a plant, and examples thereof include pUC18, pUC19, and pUC9.
  • Plant virus vectors such as cauliflower mosaic virus (CaMV), kidney bean mosaic virus (BGMV), and tabaco mosaic virus (TMV) can also be used. Further, the mutant gene according to the present invention may be introduced directly into a plant cell by the particle gun method without being introduced together with DNA having a vector function.
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • BGMV kidney bean mosaic virus
  • TMV tabaco mosaic virus
  • the mutated gene according to the present invention is preferably contained in DNA constructed so that the function of the gene is exhibited. Therefore, in addition to a promoter, an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, a 5′-UTR sequence and the like can be ligated to the DNA for gene transfer as desired.
  • the selection marker include dihydrofolate reductase gene, ampicillin resistance gene, neomycin resistance gene, hygromycin resistance gene, and bialaphos resistance gene.
  • the “promoter” does not have to be derived from a plant as long as it functions in plant cells and can induce expression in a specific tissue of a plant or at a specific developmental stage.
  • Specific examples include the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, the promoter of nopaline synthase gene (Pnos), the maize rice-derived ubiquitin promoter, the maize rice-derived lactin promoter, and the tobacco-derived PR protein promoter.
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • Pnos nopaline synthase gene
  • Etc the tobacco-derived PR protein promoter
  • the “terminator” may be any sequence that can terminate transcription of a gene transcribed by the promoter. Specific examples include nopaline synthase gene terminator (Tnos :) and force reflower mosaic virus poly A terminator.
  • Enhancer is used to increase the expression efficiency of the target gene.
  • a transformed plant can be prepared according to a standard method.
  • a transformed plant can be obtained by introducing the expression vector into a host so that the introduced mutant gene can be expressed. it can. Further, if it is contained in a DNA fragment constructed so that the function of the mutated gene according to the present invention is exerted, a transformed plant can also be produced by the particle gun method while lacking DNA having a vector function. .
  • a transformed plant (transgenic plant) can be obtained as follows.
  • the target of transformation is plant tissue (eg, epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundle, etc., including plant organs (eg, leaves, petals, stems, roots, seeds, etc.)) or plant cells.
  • plant tissue eg, epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundle, etc., including plant organs (eg, leaves, petals, stems, roots, seeds, etc.)) or plant cells.
  • examples of the plant having a mutated gene according to the present invention include dicotyledonous plants, monocotyledonous plants, for example, plants belonging to Brassicaceae, Gramineae, Solanum, Legumes, Willowaceae, etc. (see below). However, it is not limited to these plants.
  • Brassicaceae Arabidopsis s thal iana, Brassica rapa, Brassica napus, Brassica oleracea var. Capitata, Brassica ica napus, Brassica ica rapa ⁇ Brassica napus, Brassica rapa var. Pekinens is, Chingensai (Brass ica rapa var. Chinens is)-Turnip (Brassica rapa var. Rapa) ⁇ Nozuna (Brass ica rapa var. Hakabura) N Misna (Brass ica. rapa var. lancinifol ia) N Komatsuna (Brassica rapa var. peruviridi s), Pakchi 3 (Brassica rapa var. chinens is), Japanese radish (Brassica Raphanus sativus) ⁇ Wabi (Wasabia japoni ca).
  • Solanum Ni'cotiana tabacum, Eggplant (Solanum melongena) N potatoes (Solaneum tuberosum), Lycopersicon lycopersicum, Capsicum annuum, Petunia, etc.
  • Legumes Soybean (Glycine max), Endo (Pi sum sat ivum), Broad bean (Vicia faba), Dung (Wi steria floribunda), Fukkasei (Arachi s. Hypogaea) N Yagoke (Lotus corniculatus var. Japonicus) Common bean (Phaseolus vulgaris) ) Az
  • Chrysanthemums Chrysanthemum morifol ium, Helianthus annuus, etc.
  • Noufu / ⁇ Mondo (Araygdalus communis, Nokufu (Rosa), Tychigo (Fragaria, Prunus, Rinco (Malus pumi la var. Domestical, etc.).
  • Dianthus Carnation (Dianthus caryophyllus).
  • Lily family Tulip (Tul ipa), Lily (Lil ium), etc.
  • Methods for introducing an expression vector or DNA fragment having a mutated gene according to the present invention into a plant include the agrobatterium method, the PEG-calcium phosphate method, the oral mouth method, the ribosome method, and the particle gun method ( Bombardment method) and microinjection method.
  • the agrobacterium method when used, there are cases where a protoplast is used and a tissue piece is used.
  • the method can be carried out by a method of infecting a sterile cultured leaf piece of a target plant with a leaf disc (leaf disc method), a method of infecting a callus (undifferentiated cultured cell), a method of directly infiltrating a flower tissue, or the like.
  • leaf disc method a method of infecting a sterile cultured leaf piece of a target plant with a leaf disc
  • a method of infecting a callus undifferentiated cultured cell
  • a method of directly infiltrating a flower tissue or the like.
  • Acetosylingon can be used to increase the transformation rate.
  • amplification products can be detected by performing PCR using primers previously labeled with a fluorescent dye or the like.
  • the amplification product may be bound to a solid phase such as a microplate and the amplification product may be confirmed by fluorescence or enzyme reaction.
  • Tumor tissue, shoots, hairy roots, seeds, etc. obtained as a result of transformation can be used for cell culture, tissue culture, or organ culture as they are, and conventionally known plant tissue culture methods can be used. It can be regenerated into plants by administration of an appropriate concentration of plant hormones (auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid, ethylene, brassinolide, etc.). In general, regeneration of plant bodies from cultured cells involves differentiation of roots on a medium containing an appropriate type of auxin and cytokinin, and then transplantation to a medium rich in cytokinin. This is done by differentiating shoots and then transplanting them into soil that does not contain hormones.
  • plant hormones auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid, ethylene, brassinolide, etc.
  • the total amount of fats and oils contained in the specific tissue is contained in the wild type specific tissue as compared with the plant before the introduction of the mutant gene.
  • the% fat content in a specific tissue shows a characteristic phenotype when the fat content in a specific wild type tissue decreases.
  • the specific tissue may be leaves, cotyledons, roots, root hairs, trichomes, flowers, seeds, fruits, flower stems, tuberous roots, tubers, corms, etc., preferably cotyledons, seeds, fruits, more preferably seeds.
  • the fat and oil components contained in seeds collected from plants can be quantitatively detected by a conventionally known method.
  • An example of a method for measuring the fat and oil components contained in a specific tissue is a method using a pulse NMR apparatus.
  • the mutant gene according to the present invention was identified by visualizing the oil body contained in cotyledons collected from transgenic Arabidopsis thaliana into which the oleosin-GFP fusion gene was introduced.
  • the oil body-specific protein is not limited to oleosin, and proteins existing specifically in the oil body can be widely used.
  • the fluorescent protein for visualizing the oil body in the cotyledon may be a fluorescent protein, such as GFP (green fluorescent protein), YFP (ye ⁇ ⁇ ow f ⁇ uorescent protein).
  • RFP vred fluorescent protein OFP ⁇ orange fluorescent protein
  • BFP blue fluorescent protein
  • the oil body in the cotyledon it is not limited to fluorescent proteins, and proteins that can be detected by visible light can be widely used. That is, as a protein that can be detected by visible light, for example, a photoprotein such as luciferase can be used.
  • Arabidopsis thaliana which is widely used as a model plant, was transformed to express the oleosin-GFP fusion gene, and a transformed plant capable of observing the oil body by fluorescence observation was created.
  • the obtained transformed plant was subjected to mutation treatment, and the mutant in which the amount of oil and fat in the seed was changed was identified using the change in the properties of the oil body as an index.
  • the causative gene in the identified mutant was identified, a gene having a function of changing the amount of oil and fat in the seed was identified, and an amino acid substitution mutation that changed the amount of oil and fat in the plant was identified.
  • the specific experimental flow and experimental results are described in detail below.
  • PCR was performed using CTCGCCCTTGCTCACCATAGTAGTGTGCTGGCCACC 3 ': SEQ ID NO: 19) to amplify a DNA fragment A having a part of the attBl sequence and a part of the GFP gene at both ends of the oleosin S3 cDNA.
  • cDNA and primer 3 (5 'GGTGGCCAGCACACTACTATGGTGAGCAAGGGCGAG 3' encoding green fluorescent protein GFP in Owankurage: SEQ ID NO: 2
  • primer 4 5 'AGAAAGCTGGGTCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT 3 ': SEQ ID NO: 2
  • amplified DNA fragment B in which part of oleosin S3 cDNA and part of attB2 sequence were added to both ends of GFP cDNA .
  • DNA fragments A DNA fragment B, primer 5 (5 'GGGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC T 3': SEQ ID NO: 2 2) and the primer 6 (5 'GGGG AC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG G 3 ′: SEQ ID NO: 2 3) were mixed and further PCR was performed to prepare an oleosin-GFP fusion gene having attBl and attB2 sequences on both sides.
  • the nucleotide sequence of the oleosin-GFP fusion gene and the amino acid sequence of the gene product are shown in SEQ ID NOs: 24 and 25, respectively.
  • the obtained fusion gene was cloned into a Ti vector having attRl and attR2 sequences downstream of the CaMV 35S promoter and containing a kanamycin resistance marker via the PD0NR221 vector according to the Gateway system protocol of Invitrogene.
  • the obtained plasmid was agrobacterium by electroporation.
  • the oleosin-GFP fusion gene was introduced into the genome of Arabidopsis thaliana using the Agrobacterium method.
  • A600 0. 8 t so that it can be infiltrated (10 mM MgCl 2 , 5% sucrose, 0.05% Si lwet
  • the flowering Arabidopsis flower stalks were immersed in this suspension for 1 minute, and then the seeds with fruit were collected. The collected seeds are sterilized after seed sterilization and sown on a sterile agar medium containing 25 mg / l kanamycin.
  • a transgenic Arabidopsis thaliana in which the -GFP fusion gene was inserted into the genome was isolated. Obtained The seeds were collected from the transformed Arabidopsis thaliana, and a transformant having homozygous kanamycin resistance was selected as a progeny and named OleG.
  • 2 Progeny seeds were collected for 16 hours at 2 ° C for 16 hours and 8 hours under drought conditions, and designated as M2 seeds.
  • a fluorescence stereomicroscope (Carl Zeiss SteRE0 Lumar V12) was used. OleG and M2 seeds were germinated for 6 days in a sterile agar medium upright and the oleosin-GFP fusion protein in the cotyledon cotyledon, hypocotyl and root cells under the fluorescence stereomicroscope (Carl Zeiss) GFP fluorescence was observed. OleG was identified as a mutant with a different GFP fluorescence intensity and distribution.
  • a 5 ⁇ l sample was electrophoresed on an SDS polyacrylamide gel, and then the protein in the gel was transferred to a two-trocellulose membrane using the semi-drive mouth method. Detection of proteins transferred to the nitrocellulose membrane using anti-protein antibodies follows the GE Healthcare Bioscience protocol.
  • ECL Western blotting detection reagents were used. In that case, primary antibody
  • Anti-oreosin antibody or anti-GFP antibody and secondary antibody are both diluted 1/5000. Used.
  • a luminescence image analyzer made by Fuji Film is used to detect luminescence.
  • Half-cut seeds were fixed with a fixative (4% paraformaldehyde, 1% dartaldehyde, 10% DMS0, 0.05M cacozinoleic acid buffer pH 7.4). After fixation, Sampnore was embedded in Evon 812 resin, and ultrathin sections were prepared using a Leica microtome Ultracut UCT. Ultrathin sections were electron-stained with 4% uranium acetate and 0.4% lead citrate, and then observed with an electron microscope (Hitachi Seisakusho H-7600).
  • the seeds were weighed with a precision electronic balance using a medicine wrapping paper while performing static neutralization, and weighed so that the seed weight would be 10-12 mg.
  • the seeds were placed in a test tube for pulsed NMR, and the fat content (% by weight) in the seeds was determined from the ⁇ -pulsed NMR relaxation time value using MASON-23 pulsed NMR manufactured by Resonance. The detailed measurement procedure followed the pulse NMR measurement manual.
  • Nitrogen gas purge was performed at 40 ° C to dry the fatty acid methyl ester. Dried fatty acid The chilled ester was dissolved in n- hexane 500 ⁇ 1, and various fatty acid methyl esters were separated and quantified by GC-FID. For quantification, the area value of the internal standard (C15: 0 fatty acid) was referred.
  • mutants with the Colombian ecotype as the background and wild-type Arabidopsis thaliana-Landberg erecta ecotype Were crossed to obtain 310 F2 generations with homozygous mutant genes.
  • Genes estimated to be the causative gene from OleG and mutant genomic DNA were amplified using PCR, and the nucleotide sequence was determined using a 3130x1 genetic analyzer manufactured by Applied Biosystems.
  • fusion Tanno ⁇ 0 click cytoplasm Oreoshin and GFP green fluorescent protein co prepare an dos Ru fusion gene (Oleosin- GFP), which was linked to the-derived 35S promoter DNA downstream cauliflower mosaic virus (Fig. 4 A ).
  • This DNA construct was introduced into the genomic DNA of Arabidopsis thaliana using the Agrobacterium method to produce transformed Arabidopsis and named oleG.
  • Figure 4B shows the result of observation of oleG cotyledons after germination for 6 days under drought conditions using fluorescence microscopy. From Fig. 4B, it can be seen that the oil body membrane is labeled with GFP fluorescence, and that many small oil bodies are present as aggregates. In addition to the cotyledons germinated under dark conditions, it was found that oil bodies also exist in green cotyledons, true leaves, and petals germinated under embryonic conditions.
  • oleG seeds were mutated with ethylmethanesulfonic acid to obtain progeny M2 seeds. Fluorescence microscopy of M2 plants germinated for 6 days under dark black was performed, and mutant A (Fig. 4C) and mutant B (Fig. 4D) differing in fluorescence intensity from oleG were obtained. These mutants had lower GFP fluorescence intensity in germinated cotyledons than oleG. ⁇ Relationship between GFP fluorescence and seed lipid content>
  • the lipid content in the seeds of 01eG, Mutant A and Mutant B was measured and found to be 34 ⁇ 66% ⁇ 0.43%, 26.91% ⁇ 0.34%, and 32.34% ⁇ 0.49%, respectively.
  • a positive correlation was found between the total GFP fluorescence and the lipid content of seeds (Fig. 5).
  • the fatty acid composition contained in the fat accumulated in the seeds of these mutants was analyzed (Fig. 6).
  • the content of C20: l (ll) cis was decreased compared to OleG.
  • the fatty acid in this specification is represented as follows.
  • Fig. 7 shows the results of analysis of the proteins contained in the seeds of wild-type Arabidopsis thaliana, 01eG, mutant A, and mutant B. From the kumashi primiant blue staining (Fig. 7A), the imunoblot analysis with anti-oleosin antibody (Fig. 7B) and the immunoblotting analysis with anti-GFP antibody (Fig. 7C), the seeds of mutant A and mutant B were It was revealed that endogenous oleosin levels and oporeosin-GFP levels were both decreased compared to OleG.
  • FIGS. 7 shows the results of analysis of the proteins contained in the seeds of wild-type Arabidopsis thaliana, 01eG, mutant A, and mutant B. From the kumashi primiant blue staining (Fig. 7A), the imunoblot analysis with anti-oleosin antibody (Fig. 7B) and the immunoblotting analysis with anti-GFP antibody (Fig. 7C), the seeds of mutant A and mutant B were It was revealed
  • lane 1 represents a sample derived from wild-type Arabidopsis thaliana
  • lane 2 represents a sample derived from OleG
  • lane 3 represents a sample derived from mutant A. A pull is shown
  • lane 4 shows a variant B-derived sample.
  • FIG. 8 shows the results of observation of the seed cells of 01eG, mutant A, and mutant B with an electron microscope.
  • OleG seed cells are packed with small oil bodies, similar to wild-type Arabidopsis thaliana.
  • Mutant A and Mutant B there is a gap that seems to be a cytosol between them, and the individual oil bodies are rounded. This is thought to be due to a decrease in the amount of stored fat in seeds. Also, some oil bodies in the seeds are enlarging. This was thought to be due to a decrease in the amount of oleosin in the oil body membrane.
  • Mutant A which has a Colombian ecotype in the background, and wild-type Arabidopsis thaliana in the Landsburg-Electa ecotype were crossed to perform high-precision mapping of the causative gene.
  • Figure 9A shows the results of scoring genetic background for 620 chromosomes using molecular markers. The number of chromosomes from the Landsburg-Electa indicates that recombination has occurred between the locus of the variant A causative gene and the molecular marker. As shown in FIG. 9 A, the high-precision mapping, locus mutant A causative gene is in the immediate vicinity of Atlg54560 of chromosome 1 was found to be located between the Atl g 54150 and Atlg54970. It is suggested that 87 genes including the unidentified gene Atlg54570 (Fig. 9B) exist in this region.
  • Atlg54570 encodes a polypeptide that includes a proposed portion of diacylglycerol acyltransferase (DAGAT) domain.
  • DAGAT domain is an amino acid sequence that is thought to exist in common with diacylglycerol acyltransferase, which is one of the enzymes involved in triacylglycerol synthesis, but it is based on base sequence information. Not all polypeptides with domains have DAGAT activity. Also, DAGAT research has been concentrated on budding yeast, and there is no known example in which a specific polypeptide in plant seeds has been identified as DAGAT.
  • the oil content and oil composition in the seed, the oil composition and the like can be regulated. Moreover, according to the method for adjusting the oil content in seeds according to the present invention, it is possible to provide a plant in which the oil content and the oil composition are adjusted.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

　種子内の油脂含量を調節する機能を有する変異遺伝子及び種子内油脂含量の調節方法を提供する。　配列番号１に示すアミノ酸配列において、N末端側から１２番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたコンセンサス配列を有する変異タンパク質であって、種子内の油脂含量を調節する機能を有する変異タンパク質をコードする変異遺伝子である。

Description

種子内の油脂含量を調節する変異遺伝子、 種子内油脂含量の調節方法 技術分野
本発明は、 種子内に存在するオイルボディの変化を指標にして同定された、 種 子内の油脂含量を調節する変異遺伝子、 及び、 特定の遺伝子を変異させることで 種子内油脂含量を調節する方法に関明する。 背景技術
書
オイルボディ （油体、 リ ピッドボディ （脂質体） と呼ばれる場合もある） は植 物、 特に油糧作物の種子細胞中に多量に存在する細胞内小器官である。 オイルボ ディはォレオシンゃステロレオシン、 力レオシンと呼ばれる特異的なタンパク質 を含んだ一層のリン脂質膜で形成され、 内部には植物油脂がトリアシルグリセ口 ール（TAG、中性脂肪、中性脂質）の形で、特に植物種子中に大量に蓄積している。 従来、 オイルボディに蓄積された油脂を分析する手法としては、 種子を破壊して 油脂成分を抽出し、 ガスクロマトグラフィーゃ液体クロマトグラフィ一等を用い た分析方法であった。このような分析方法においては、脂質分解阻害剤の添加や、、 処理温度に低温条件が必要であったり、 また、 油脂成分が分解してしまうおそれ 力 sあった。
一方、 非特許文献 1には、 オイルボディの大きさがォレオシンの存在量に影響 されることが開示されている。また、非特許文献 2には、ォレオシン遺伝子と GFP (緑色蛍光タンパク質、 green fluorescent protein) 遺伝子を融合させることに より、 GFP由来の蛍光によってオイルボディを観察できることが開示されている。 しかしながら、オイルボディを観察できたとしても、オイルボディの数や形状と、 オイルボディに蓄積される油脂量や油脂種との相関については未解明であった。
非特許文献 1 Si loto, R. M. P. Et al. , Plant Cel l 18, 1961-1974, (2006) 非特許文献 2 Wahlroos et al. , GENESIS, 35 (2)： 125-132， （2003) 発明の開示
そこで、 本発明は、 植物細胞中のオイルボディの数や大きさといった各種性状 を測定できる系を確立し、 これを用いてオイルボディ性状と油脂含量との相関関 係を解明し、 種子内の油脂含量を調節する機能を有する変異遺伝子及び種子内油 脂含量の調節方法を提供することを目的とする。
上述した目的を達成するため、 本発明者らが鋭意検討し、 ォレオシン- GFP融合 タンパク質を発現させ、 GFP 蛍光強度の総和と油脂含量との間に正の相関がある ことを見いだした。 この知見に基づいて、 本発明者らは、 種子中の油脂含量に影 響を与える機能を有する遺伝子及び当該遺伝子におけるアミノ酸置換変異が種子 中の油脂含量に影響を与えることを見いだし、 本発明を完成するに至った。 すなわち、 本発明に係る変異遺伝子は以下を包含する。
( 1 ) 配列番号 1に示すアミノ酸配列において、 N末端側から 1 2番目のアミ ノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたコンセンサス配列を有する変異タンパク質 であって、 植物種子内の油脂含量を調節する機能を有する変異タンパク質をコー ドする変異遺伝子。
( 2 ) 上記他のアミノ酸がイソロイシン、 バリン、 ロイシン及びメチォニンか らなる群から選ばれる一種のアミノ酸であることを特徴とする （1 ) 記載の変異 遺伝子。
( 3 ) 上記他のアミノ酸がイソロイシンであることを特徴とする （1 ) 記載の 変異遺伝子。
( 4 ) 上記変異タンパク質は、 配列番号 4〜 1 7のアミノ酸配列のうちいずれ か 1に示すアミノ酸配列に含まれる上記コンセンサス配列において、 N末端側か ら 1 2番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたものであることを特徴と する （1 ) 記載の変異遺伝子。
( 5 ) 植物由来の遺伝子を変異させたものであることを特徴とする （1 ) 記載 の変異遺伝子。
( 6 ) イネ科、 アブラナ科及びャナギ科からなる群から選ばれる 1つの科に属 する植物由来遺伝子を変異させたものであることを特徴とする （1 ) 記載の変異 遺伝子。 (7) 大麦、 イネ、 シロイヌナズナ、 Brassica rapa 及びポプラからなる群か ら選ばれる 1つの種に属する植物由来遺伝子を変異させたものであることを特徴 とする （1 ) 記載の変異遺伝子。
また、 本発明は、 上述した変異遺伝子によってコードされる変異タンパク質、 上述した変異遺伝子を導入してなる形質転換細胞、 上述した変異遺伝子を導入し てなる形質転換植物を包含する。
一方、 本発明に係る種子内油脂含量の調節方法は以下を包含する。
(8) 配列番号 1に示すアミノ酸配列からなるコンセンサス配列を有するタン パク質をコードする遺伝子に対して、 配列番号 1に示すアミノ酸配列の N末端側 から 1 2番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換する変異を導入する、 種子内 油脂含量の調節方法。
(9) 上記他のアミノ酸がイソロイシン、 バリン、 ロイシン及ぴメチォニンか らなる群から選ばれる一種のアミノ酸であることを特徴とする （8) 記載の種子 内油脂含量の調節方法。
( 1 0) 上記他のアミノ酸がイソロイシンであることを特徴とする （8) 記載 の種子内油脂含量の調節方法。
( 1 1 )
配列番号 4〜 1 7のァミノ酸配列のうちいずれか 1に示すァミノ酸配列に含ま れる上記コンセンサス配列において、 N 末端側から 1 2番目のアミノ酸残基が他 のアミノ酸に置換された変異タンパク質を発現させることを特徴とする （8) 記 載の種子内油脂含量の調節方法。
( 1 2) イネ科、 アブラナ科及びャナギ科からなる群から選ばれる 1つの科に 属する植物由来遺伝子を変異させることを特徴とする （8) 記載の種子内油脂含 量の調節方法。
( 1 3) 大麦、 イネ、 シロイヌナズナ、 Brassica rapa 及びポプラからなる群 から選ばれる 1 つの種に属する植物由来遺伝子を変異させることを特徴とする
(8) 記載の種子内油脂含量の調節方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2008-048612号の明細書 及び/又は図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 アミノ酸残基の置換変異のスコアマトリ ックス （BL0SUM) を示す模式 図である。
図 2 _ 1は、 1 4種のアミノ酸配列についてァライメント解析の結果を示すァ ライメント図である。
図 2— 2は、 1 4種のアミノ酸配列についてァライメント解析の結果を示すァ ライメント図である。
図 2— 3は、 1 4種のァミノ酸配列についてァライメント解析の結果を示すァ ライメント図である。
図 2— 4は、 1 4種のアミノ酸配列についてァライメント解析の結果を示すァ ライメント図である。
図 3は、 図 2に示したァライメント図から得られる分子進化系統樹を示す図で ある。
図 4は、 Aはォレオシン- GFP融合遺伝子を模式的に示す構成図であり、 B〜Dは それぞれ 01eG、変異体 A及び変異体 Bの喑所発芽 6日目における子葉の蛍光写真 である。
図 5は、 GFP蛍光総和％と種子の脂質含量との関係を示す特性図である。
図 6は、 01eG、 変異体 A及び変異体 Bにおける、 種子貯蔵脂質の脂肪酸組成解 析の結果を示す特性図である。
図 7は、 野生型シロイヌナズナ、 01eG、 変異体 A及び変異体 Bの種子から抽出 したタンパク質サンプルを用いた SDS-PAGEの結果、抗ォレオシン抗体を用いたィ ムノブ口ット解析の結果及び抗 GFP抗体（C) を用いたィムノブロッ ト解析を示す 写真である。
図 8は、 01eG、 変異体 A及び変異体 Bの種子細胞を電子顕微鏡で観察した結果 を示す写真である。
図 9は、 Aは変異体 Aにおける原因遺伝子を同定するための高精度マッピング の結果を示す特性図であり、 B はマッピングされた位置に存在している遺伝子
Atlg54570の構造を模式的に示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 図面を参照して本発明を詳細に説明する。
本発明では、 オイルボディ特異的タンパク質と蛍光タンパク質、 具体的にはォ レオシン- GFP 融合遺伝子を用いてモデル植物であるシロイヌナズナを形質転換 し、 形質転換シロイヌナズナから採取した子葉に含まれるオイルボディを蛍光に より可視化した。 この形質転換シロイヌナズナに突然変異を誘発してオイルボデ ィの形状や数といった各種性状の変化を観察するとともに、 油脂含量や油性組成 の変化を測定した。 驚くべきことに、 オイルボディの各種性状のうち子葉中の蛍 光総和 （換言すれば、 単位面積あたりの蛍光強度） と、 種子に含まれる油脂含量 との間に正の相関があることが明らかになった。 以上の知見に基づいて、 植物に おける油脂含量、 油脂量や油脂中の脂肪酸組成が変化した突然変異体の原因遺伝 子及び原因となる突然変異を特定した。
すなわち、 本発明に係る変異遺伝子は、 ジァシルグリセロールァシルトランス フェラーゼ · ドメインと呼ばれる進化的に保存されたアミノ酸配列中の所定のァ ミノ酸を他のアミノ酸に置換したタンパク質であって、 植物における油脂含量や 油脂量を調節する機能を有するタンパク質をコードしている。 本発明に係る変異 遺伝子は、 所定のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列からなるジァ シルグリセロールァシルトランスフェラーゼ · ドメインと呼ばれる進化的に保存 されたアミノ酸配列を有するタンパク質である。 以下の説明において、 ジァシル グリセロールァシルトランスフェラーゼ · ドメインと呼ばれる進化的に保存され た領域を構成するアミノ酸配列をコンセンサス配列と称する。 コンセンサス配列 を配列番号 1に示す。
詳細に、 配列番号 1に示すコンセンサス配列は、 以下のアミノ酸配列 （ァミノ 酸一文字表記） と書き換えることができる。
(D/E) xxxxxGxxxx (T/S) xxxx (Y/F) (R/K/N/Q) L (F/L) xxxx (F/H) VxL (Y/F) PGGxRE (A/S) LHx (K/R) (G/D) Ex (Y/H) (K/R/Q) L (F/I) WP (D/E) (Q/H/R) xEFVRxA (A/S) (R/K/Q) F (G/N) (A/V/T) (T/K) (I/V) (I/V) PFGxVGEDD (V/F/I/L/M) x (E/D/H) (L/V/M/I) x
上記ァミノ酸配列において、 力ッコ内の複数のァミノ酸は当該位置において取 り うるアミノ酸残基のバリエーションを示している。 また、 下記アミノ酸配列に おいて、 X は、 当該位置に置いて任意のアミノ酸残基を取り うることを意味して いる。 所定の位置において取り うるアミノ酸残基のバリエーションは以下の理由 によるものである。 すなわち、 上記コンセンサス配列は、 後述するように、 複数 の植物種由来の相同タンパク質のアミノ酸配列をマルチプルァラインメント解析 することで規定することができる。 ここで、 参考文献（1) (「マッキー生化学」 第 3版 5章アミノ酸.ペプチド.タンパク質 5. 1アミノ酸、 監修：巿川厚、 監訳： 福岡伸一、 発行者： 曽根良介、 発行所： （株）化学同人、 ISBN4-7598-0944 -9) で も記載されているように、 アミノ酸は同様の性質 （化学的性質や物理的大きさ） を持つ側鎖に従って分類される事がよく知られる。 また、 タンパク質の活性を保 持したまま、 所定のグループに分類されるアミノ酸残基間における分子進化上の 置換が頻度高く起こることがよく知られる。 この考えを基に、 参考文献（2) ： Henikof f S. , Henikoff J. G. , Amino-ac id substitut ion matrices from protein blocks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89， 10915—10919 (1992)中の、 Fig. 2 でアミノ酸残基の置換変異のスコアマトリックス （BL0SUM) が提唱され、 広く使 用されている （本明細書の図 1 )。 参考文献（2)では、 側鎖の化学的性質が似たも の同士のアミノ酸置換は、 タンパク質全体に与える構造や機能変化が少なくなる と言う知見に基づくものである。 上記参考文献（1)及び（2)によれば、 マルチプル ァラインメントで考慮するアミノ酸の側鎖のグループは、 化学的性質や物理的大 きさなどの指標を基にして考えることができる。 これは、 図 1に示されたスコア の 0以上の値を持つァミノ酸、 好ましくは 1以上の値を持つァミノ酸のグループ として示される。 代表的なグループとしては、 下記の 8つが上げられる。 その他 の細かいグループ分けは、 図 1の値の 0以上同士のアミノ酸グループ、 好ましく は 1以上同士のァミノ酸グループ、 さらに好ましくは 2以上のァミノ酸グループ であれば良い。
1 ) 脂肪族疎水性ァミノ酸グループ （ILMVグループ）
このグループは、上記参考文献（1)で示された中性非極性アミノ酸のうち、脂肪 属性の疎水性側鎖をもつアミノ酸のグループであり.、 V (Val、 バリン）、 L (Leu、 口 イシン）、 Kile, イソロイシン）及び M (Met；、 メチォニン）から構成される。 参考 文献（1)による中性非極性アミノ酸と分類されるもののうち FGACWPは以下理由で、 この「脂肪族疎水性アミノ酸グループ」には含めない。 G (Gly、ダリシン）や A (Ala、 ァラニン）はメチル基以下の大きさで非極性の効果が弱いからである。 C (Cys、 シ スティン）は S-S結合に重要な役目を担う場合があり、また、酸素原子や窒素原子 と水素結合を形成する特性があるからである。 F (Phe、フエ二ルァラニン）や W (Trp、 トリブトファン）は側鎖がとりわけ大きな分子量をもち、かつ、芳香族の効果が強 いからである。 P (Pro、 プロリン）はィミノ酸効果が強く、 ポリペプチドの主鎖の 角度を固定してしまうからである。
2 ) ヒ ドロキシメチレン基をもつグループ （STグループ）
このグループは、 中性極性アミノ酸のうちヒ ドロキシメチレン基を側鎖に持つ ァミノ酸のグループであり、 S (Ser、 セリン）と T (Thr、 スレオニン）から構成され る。 S と Tの側鎖に存在する水酸基は、 糖の結合部位であるため、 あるポリぺプ チド （タンパク質） が特定の活性を持っために重要な部位である場合が多い。 3 ) 酸性ァミノ酸 （DEグループ）
このグループは、 酸性であるカルボキシル基を側鎖に持つアミノ酸のグループ であり、 D (Asp、 ァスパラギン酸）と. E (Glu、 グルタミン酸）から構成される。
4 ) 塩基性アミノ酸 （KRグループ）
このグループは、塩基性ァミノ酸のグループであり、 K (Lys、 リジン）と R (Arg、 アルギニン）から構成される。 これら Kと Rは、 pHの広い範囲で正に帯電し塩基 性の性質をもつ。 一方、 塩基性アミノ酸に分類される H (His、 ヒスチジン）は pH7 においてほとんどイオン化されないので、 このグループには分類されない。
5 ) メチレン基 =極性基 （DHNグループ）
このグループは、 全て α位の炭素元素に側鎖としてメチレン基が結合しその先 に極性基を有すると言う特徴を持つ。 非極性基であるメチレン基の物理的大きさ が酷似している特徴を持ち、 N (Asn、 ァスパラギン、 極性基はアミ ド基）、 D (Asp、 ァスパラギン酸、 極性基はカルボキシル基）と H (His、 ヒスチジン、 極性基はイミ ダゾール基）から成る。
6 ) ジメチレン基 =極性基 （EKQRグループ）
このグループは、 全て α位の炭素元素に側鎖としてジメチレン基以上の直鎖炭 化水素が結合しその先に極性基を有すると言う特徴を持つ。 非極性基であるジメ チレン基の物理的大きさが酷似している特徴を持つ。 E (Glu、 グルタミン酸、 極性 基はカルボキシル基）、 K (Lys、 リジン、極性基はアミノ基）、 Q (Gln、 グルタミン、 極性基はアミ ド基）、 R (Arg、アルギニン、極性基はィミノ基とアミノ基）から成る。
7 ) 芳香族 （FYWグループ）
このグループには、 側鎖にベンゼン核を持つ芳香族アミノ酸であり、 芳香族特 有の化学的性質を特徴とする。 F (Phe、 フエ二ルァラニン）、 Y (Tyr、 チロシン）、 W (Trp、 トリプトファン）から成る。
8 ) 環状 &極性 （HYグループ）
このグループには、側鎖に環状構造を持つと同時に極性も持つアミノ酸で、 H (H、 ヒスチジン、 環状構造と極性基は共にイミダゾール基）、 Y (Tyr、 チロシン； 環状 構造はべンゼン核で極性基は水酸基）から成る。
本発明に係る変異遺伝子は、 上記コンセンサス配列における N末端側から 1 2 番目のアミノ酸残基 （スレオニン（T)又はセリン（S) ) を他のアミノ酸に置換して なり、植物における油脂量を調節する機能を有するタンパク質をコードしている。 ここで、上記コンセンサス配列における N末端側から 1 2番目のアミノ酸残基（ス レオニン（T)又はセリン（S) ) は、 スレオニンキナーゼゃセリンキナーゼにより リ ン酸化される可能性が高いァミフ酸残基であり、 ジァシルグリセロールァシルト ランスフェラーゼ活性に大きく寄与するアミノ酸残基である蓋然性が高い。 よつ て、 上記コンセンサス配列における N末端側から 1 2番目のアミノ酸残基 （スレ ォニン（T)又はセリン（S) ) を他のアミノ酸に置換することによって、 本発明に係 る遺伝子がコードするタンパク質の活性が変化することとなる。 該遺伝子がコー ドするタンパク質の活性が変化するとは、 酵素活性を向上させること、 酵素活性 を抑制すること、 基質特異性を変化させること、 及び、 基質や補酵素その他の因 子との親和性を変化させることを意味する。
ここで置換後の他のアミノ酸としては、 イソロイシン、 バリン、 ロイシン及び メチォ.ニンを挙げることができる力 S、特に、ィソロイシンであることが好ましい。 上記コンセンサス配列における N末端側から 1 2番目のアミノ酸残基 （スレオニ ン（T)又はセリン（S) ) をイソロイシンに置換した場合には、 種子一粒あたりに含 まれる油脂量が野生型と比較して増大するが、 種子一粒あたりの油脂含量％は減 少するといつた特徴的な表現型を呈する。
また、上記コンセンサス配列は、配列番号 1に示すアミノ酸配列の C末端側に、 1 0ァミノ酸残基からなる配列 (xxx (N/H/E/D) (D/E) xx (N/K) xP)を付加した配列
(配列番号 2に示す） であってもよい。 すなわち、 本発明に係る変異遺伝子は、 配 列 番 号 1 に 示 す ア ミ ノ 酸 配 列 の C 末 端 側 に 所 定 の 配 列
(xxx (N/H/E/D) (D/E) xx (N/K) xP) が付加されたコンセンサス配列における N末端 側から 1 2番目のアミノ酸残基 （スレオニン（T)又はセリン（S) ) を他のアミノ酸 に置換してなり、 植物における油脂量を調節する機能を有するタンパク質をコー ドするものを含んでいる。
上記コンセンサス配列を有するタンパク質をコードする遺伝子としては、 特定 の植物種に限らず、 広く種々の植物種から同定 ·単離することができる。 具体的 に、 上記コンセンサス配列を有するタンパク質をコードする遺伝子は、 アブラナ 科に属するシロイヌナズナ（Arabidopsis thal iana)、 イネ科に属する大麦 (Hordeum vulgare) , ィ 科【こ属するィ （Oryza sat iva)、 アブラナ科 ίこ属する Brass ica rapa 及びャナギ科に属するポプラ (Populus trichocarpa, ブラックコ ットンウッドやコットンゥッドと呼ばれる事もある）から同定'単離することがで きる。 ここで、 Brass ica rapa は、 同種に分類される亜種として、 例えば、 ナタ ネ、 アブラナ、 ナノハナ、 ハクサイ、 チンゲンサイ、 カブ、 ノザヮナ、 ミズナ、 コマツナ及ぴパクチヨィを含んでいる。
シロイヌナズナにおいて、 上記コンセンサス配列を有するタンパク質をコード する遺伝子と しては、 GenBank ァクセッショ ン番号 BT005958.で特定される
Atlg54570 遺伝子、 GenBank ァクセッショ ン番号 NM_123478. 3 で特定される
At5g41130 遺伝子、 GenBank ァクセッショ ン番号 AY09638. 1 で特定される
At5g41120 遺伝子及び GenBank ァクセッション番号 AF360145. 1 で特定される
At3g26840 遺伝子を挙げることができる。 また、 大麦において、 上記コンセンサ ス配列を有するタンパク質をコードする遺伝子としては、 GenBank ァクセッショ ン番号 AK251457. 1で特定される FLbaf l27k09遺伝子を挙げることができる。イネ において、 上記コンセンサス配列を有するタンパク質をコードする遺伝子として は、 GenBankァクセッション番号 ΝΜ_001049558· 1で特定される 0s01g0361500遺 伝子、 GenBank ァクセッション番号 ΝΜ_001049562· 1 で特定される 0s01g0362100 遺伝子、 GenBankァクセッション番号 NM_001049559. 1で特定される 0s01g0361700 遺伝子及び GenBank ァクセッショ ン番号 NM_001070165. 1 で特定される 0s09g0509500 遺伝子を挙げることができる。 Brass ica rapa (例えば、 ナタネ、 アブラナ、 ナノハナ、 ハクサイ、 チンゲンサイ、 カブ、 ノザヮナ、 ミズナ、 コマ ツナ及びパクチヨィ） において、 上記コンセンサス配列を有するタンパク質をコ 一ドする遺伝子としては、 GenBankァクセッション番号 AC189616. 1で特定される KBrH099I08遺伝子を挙げることができる。 ポプラにおいて、 上記コンセンサス配 列を有するタンパク質をコードする遺伝子としては、 GenBank ァクセッション番 号 AC213081. 1 として登録されたクローン名 P0P002- D20の完全塩基配列における 第 41811塩基〜第 50309塩基の領域に存在する遺伝子、 第 62687塩基〜第 71216 塩基の領域に存在する遺伝子、 第 89072塩基〜第 97258塩基の領域に存在する遺 伝子及び第 75984塩基〜第 83278塩基の領域に存在する遺伝子を挙げることがで きる。
上記 Atlg54570遺伝子の塩基配列及び Atlg54570遺伝子によってコードされる タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号 3及び 4に示す。上記 At5g41130 遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号 5に示す。 上 記 At5g41120遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号 6に示す。 上記 At3g26840遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配 列を配列番号 7に示す。 上記 FLbafl27k09遺伝子によってコードされるタンパク 質のァミノ酸配列を配列番号 8に示す。上記 0s01g0361500遺伝子によってコード されるタンパク質のァミノ酸配列を配列番号 9に示す。上記 0s01g0362100遺伝子 によってコードされるタンパク質のァミノ酸配列を配列番号 1 0に示す。 上記 0s01g0361700 遺伝子によってコードされるタンパク質のァミノ酸配列を配列番 号 1 1に示す。上記 0s09g0509500遺伝子によってコードされるタンパク質のァミ ノ酸配列を配列番号 1 2に示す。上記 KBrH099I08遺伝子によってコードされるタ ンパク質のアミノ酸配列を配列番号 1 3に示す。 AC213081. 1 として登録されたク 口一ン名 P0P002- D20の完全塩基配列における第 41811塩基〜第 50309塩基の領域 に存在する遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号 1 4に示す。 クローン名 P0P002- D20 の完全塩基配列における第 62687 塩基〜第 71216 塩基の領域に存在する遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸 配列を配列番号 1 5に示す。 クローン名 P0P002- D20 の完全塩基配列における第 89072塩基〜第 97258塩基の領域に存在する遺伝子によってコードされるタンパ ク質のアミノ酸配列を配列番号 1 6に示す。クローン名 P0P002-D20の完全塩基配 列における第 75984塩基〜第 83278塩基の領域に存在する遺伝子によってコード されるタンパク質のアミ'ノ酸配列を配列番号 1 7に示す。
これら配列番号 4〜 1 7に示したアミノ酸配列について、 CLUSTAL W (1. 83) multiple sequence alignmentプログラム （国立遺伝学研究所の DDBJで使用でき る （http : //clustalw. ddbj. nig. ac. jp/top-j. html) ) を用いてアラインメント解 析した結果を図 2に示す （使用したァミノ酸配列置換行列表はデフオルト値の BL0SUM マトリックスを使用した）。 図 2に示すように、 これら 1 4種類のタンパ ク質は、 上記コンセンサス配列を有することが判る （下線部）。 なお、 本発明に係 る変異遺伝子は、 図 2に示したマルチプルァライメントにおいて矢印で示した位 置におけるスレオニン（T)又はセリン（S)を他のァミノ酸に置換したものである。 なお、 図 2に示した 1 4種類のアミノ酸配列のァライメントの結果から得られる 分子進化系統樹を図 3に示す。
図 2に示した 1 4種類のタンパク質においてを矢印で示した位置におけるスレ ォニン（T)又はセリン（S)を他のアミノ酸に置換する手法としては、 従来公知の遺 伝子工学的手法を適宜使用することができる。 要するに、 変異導入対象のタンパ ク質をコードする野生型の遺伝子の塩基配列を特定し、 部位特異的突然変異導入 キッ ト等を用いて上記置換後のタンパク質をコードするように変異を導入するこ とができる。 また、 変異を導入した遺伝子は、 定法に従って、 例えば発現べクタ 一に組み込んだ状態で回収することができる。 遺伝子に変異を導入するには、
Kunkel法又は Gapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うこ とができ、 例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キッ ト （例え ば Mutant- K (TAKARA Bio社製）や Mutan- G (TAKARA Bio社製）などを用いて、 あるい は、 TAKARA Bio社の LA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキッ トを用いて変異 が導入される。
ところで、 本発明に係る変異遺伝子は、 配列番号 4〜 1 7に示したアミノ酸配 列において上記コンセンサス配列における N末端側から 1 2番目のアミノ酸残基 (スレオニン（T)又はセリン（S) ) を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を含む タンパク質をコードするものに限定されない。 本発明に係る変異遺伝子は、 配列 番号 4〜 1 7に示したアミノ酸配列において配列番号 1に示したコンセンサス配 列における N末端側から 1 2番目のアミノ酸残基（スレオニン（T)又はセリン（S) ) を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列から、 複数個、 好ましくは 1若しくは数 個のアミノ酸に欠失、 置換、 付加などの変異が生じてもよい。 例えば、 配列番号 4〜 1 7に示したアミノ酸配列において 1〜10個、 1〜8個、 好ましくは 1〜5個 のアミノ酸が欠失、 付加あるいは置換してもよい。
また、 配列番号 4〜 1 7に示したアミノ酸配列と 70%以上の相同性を有するタ ンパク質をコードする遺伝子であって、 上記コンセンサス配列における N末端側 から 1 2番目のアミノ酸残基 （スレオニン（T)又はセリン（S) ) を他のアミノ酸に 置換したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子でもよい。 前記相 同性は、 好ましくは 80%以上であり、 より好ましくは 85%以上であり、 さらに好 ましくは 90%以上であり、 最も好ましくは 95%以上である。
前記アミノ酸の欠失、 付加、 及び置換は、 前記タンパク質をコードする遺伝子 を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。 遺伝子に変異を導入するには、 Kunkel法又は Gapped duplex法等の公知手法又は これに準ずる方法により行うことができ、 例えば部位特異的突然変異誘発法を利 用した変異導入用キッ ト （例えば Mutant- K (TAKARA Bio社製）や Mutan- G (TAKARA
Bio社製）などを用いて、 あるいは、 TAKARA Bio社の LA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキッ トを用いて変異が導入される。 本発明に係る変異遺伝子への変異導 入方法としては、 EMS (ェチルメタンスルホン酸）、 5 -ブロモウラシル、 2-ァミノ プリン、 ヒ ドロキシルァミン、 N-メチル -N， -ニトロ _N ニトロソグァ二ジン、 そ の他の発ガン性化合物に代表されるような化学的変異剤を使用する方法でも良い し、 X 線、 アルファ線、 ベータ線、 ガンマ線、 イオンビームに代表されるような 放射線処理や紫外線処理による方法でも良い。 さらに、 本発明に係る変異遺伝子は、 配列番号 3に示す塩基配列からなる DNA と相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズ し、 かつ種子内の油脂含量を調節する機能を有する変異タンパク質をコードする DNA を含み。 ここで、 ストリンジェントな条件とは、 いわゆる特異的なハイブリ ッドが形成され、 非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。 例えば、 45°C、 6 X SSC (塩化ナトリウム クェン酸ナトリウム） でのハイブリダィゼーシ ヨン、 その後の 50〜65°C、 0. 2〜1 X SSC、 0. 1%SDSでの洗浄が挙げられ、 或いは そのような条件として、 65〜70°C、 1 X SSCでのハイブリダィゼーシヨン、 その後 の 65〜70°C、 0. 3 X SSCでの洗浄、 を挙げることができる。
なお、 本発明に係る変異遺伝子の塩基配列が確定されると、 その後は化学合成 によって、又はクローニングされた cDNAを铸型とした PCRによって、 あるいは該 塩基配列を有する DNA断片をプローブとしてハイプリダイズさせることによって、 種々の植物より得ることができる。
以上で説明した本発明に係る変異遺伝子は、 植物ゲノム中において野生型遺伝 子を、 上記コンセンサス配列における N末端側から 1 2番目のアミノ酸残基 （ス レオニン（T)又はセリン（S) ) を他のアミノ酸に置換するように改変することで、 所望の植物内で機能的に発現することとなる。 すなわち、 本発明に係る変異遺伝 子を有する植物は、 上述したような部位特異的突然変異誘発法によって作出して も良いし、 予め準備した変異遺伝子とゲノム中の野生型遺伝子の間の相同組換え によって作出しても良い。 或いは、 本発明に係る変異遺伝子を有する植物は、 植 物ゲノム内の野生型遺伝子を欠損させるとともに当該変異型遺伝子を発現可能な ように導入することで作出しても良い。 さらに、 本発明に係る変異遺伝子を有す る植物は、 植物ゲノム内の野生型遺伝子を欠損させず、 当該変異型遺伝子が過剰 発現するように導入することで作出しても良い。
なお、 本発明に係る変異遺伝子を植物内に導入する方法と従来公知の手法を適 宜採用することができる。例えば、本発明に係る変異遺伝子を植物細胞へ導入し、 発現させるためのベクターとしては、 pBI系のベクター、 pUC系のベクター、 pTRA 系のベクターが好適に用いられる。 pBI系及び pTRA系のベクターは、 ァグロパク テリゥムを介して植物に目的遺伝子を'導入することができる。 pBI 系のバイナリ 一ベクター又は中間ベクター系が好適に用いられ、 例えば、 ρΒΠ21、 pBI 101、 ρΒΙ101. 2、 ρΒΠΟΙ. 3等が挙げられる。 pUC系のベクターは、 植物に遺伝子を直接 導入することができ、 例えば、 pUC18、 pUC19、 pUC9等が挙げられる。 また、 カリ フラワーモザイクウィルス （CaMV)、 インゲンマメモザイクウイ ^/ス （BGMV)、 タ バコモザイクウィルス （TMV) 等の植物ウィルスベクターも用いることができる。 また、 本発明に係る変異遺伝子は、 ベクター機能を持つ DNAと共に導入しなく ても、 パーティクルガン法により、 植物細胞に直接導入しても良い。
本発明に係る変異遺伝子は、 その遺伝子の機能が発揮されるように構築された DNAに含まれることが好ましい。 そこで、 遺伝子導入用の DNAには、 プロモータ 一のほか、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシグナル、 ポリ A付加シグ ナル、 選択マーカー、 5' - UTR配列などを連結することができる。 なお、 選択マー カーとしては、 例えばジヒ ドロ葉酸還元酵素遺伝子、 アンピシリン耐性遺伝子、 ネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子、 ビアラホス耐性遺伝子 等が挙げられる。
「プロモーター」 としては、 植物細胞において機能し、 植物の特定の組織内あ るいは特定の発育段階において発現を導くことのできる DNAであれば、 植物由来 のものでなくてもよい。 具体例と しては、 カリ フラワーモザイクウィルス (CaMV) 35Sプロモーター、 ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター （Pnos)、 トウ モロコシゃイネ由来ュビキチンプロモーター、 トウモロコシゃイネ由来のァクチ ンプロモーター、 タバコ由来 PRタンパク質プロモーター等が挙げられる。
「ターミネータ一」 は、 前記プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終 結できる配列であればよい。 具体例としては、 ノパリン合成酵素遺伝子のターミ ネーター（Tnos：)、力リフラワーモザィクウィルスポリ Aターミネータ一等が挙げ られる。
「ェンハンサー」 は、 目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ、 例えば
CaMV35Sプロモーター内の上流側の配列を含むェンハンサー領域が好適である。 また、 本発明に係る変異遺伝子を有する発現ベクターを用いて、 形質転換植物 を定法に従って作製することができる。 形質転換植物は、 上記発現ベクターを、 導入した変異遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることが できる。 また、 本発明に係る変異遺伝子の機能が発揮される様に構築された DNA 断片に含まれるのであれば、 ベクター機能を持つ DNAを欠いたままパーティクル ガン法により形質転換植物を作製することもできる。 形質転換植物 （トランスジ エニック植物） は以下のようにして得ることができる。 形質転換の対象は、 植物 組織 (例えば表皮、 師部、 柔組織、 木部、 維管束等、 植物器官（例えば葉、 花弁、 茎、 根、 種子等）を含む）又は植物細胞である。
一方、 本発明に係る変異遺伝子を有する植物としては、 双子葉植物、 単子葉植 物、 例えばアブラナ科、 イネ科、 ナス科、 マメ科、 ャナギ科等に属する植物 （下 記参照） が挙げられるが、 これらの植物に限定されるものではない。
アブラナ科：シロイヌナズナ (Arabidopsi s thal iana)、アブラナ (Brassica rapa, Brassica napus) ヤへッ (Brassica oleracea var. capitataノ、フ タネ (Brass ica rapa^ Brass ica napus)、 ナノノヽナ (Brass ica rapa^ Brassica napus)、 ノヽクサイ (Brassica rapa var. pekinens i s)、チンゲンサイ (Brass ica rapa var. chinens is) - カブ (Brassica rapa var. rapa) ^ ノザヮナ (Brass ica rapa var. hakabura) N ミズナ (Brass ica. rapa var. lancinifol ia) N コマツナ (Brassica rapa var. peruviridi s)、 パクチ 3ィ (Brassica rapa var. chinens i s) ダイコン (Brassica Raphanus sativus) ヮサビ (Wasabia japoni ca) など。
ナス科： タノくコ (Ni'cotiana tabacum)、 ナス (Solanum melongena) N ンャガイモ ( Solaneum tuberosum)、 卜マ ト ( Lycopersicon lycopersicum)、 ト ウ フシ (Capsicum annuum)、 へテュ二/ (Petunia) など。
マメ科：ダイズ（Glycine max)、エンドゥ (Pi sum sat ivum)、ソラマメ (Vicia faba) 、 フン (Wi steria floribunda)、フッカセィ (Arachi s. hypogaea) N ヤコグケ (Lotus corniculatus var. japonicus) インゲンマメ (Phaseolus vulgaris) ァズ
(Vigna angulari s) N アカシア (Acacia) など。
キク禾斗： キク (Chrysanthemum morifol ium)、 ヒマヮリ (Hel ianthus annuus) な ど。
ヤン^ ： / ブフヤン (Elaei s guineens is Elaei s oleifera) ココャン (Cocos nucifera) ナツメヤシ (Phoenix dactyl ifera)、 口ゥャシ (Copernicia) ウノレシ科 ： ノ、ゼノキ ( Rhus succedanea ) N カシュ一ナツ 卜ノキ ( Anacardium occidentale)、 ウノレシ (Toxicodendron vernicif luum) マンゴ1 ~ (Mangif era indica) x ピスタチォ (Pistacia vera)
ゥ'リ科： カボチヤ (Cucurbita maxima^ Cucurbita raoschata Cucurbita pepo)、 キユウリ (Cucumis sativus)、 カラスゥリ (Trichosanthes cucumeroides)、 ヒョ ウタン (Lagenaria siceraria var. gourda)
ノヽフ ： / ~モンド (Araygdalus communisリ、 ノくフ. (Rosa)、 ィチゴ (Fragariaノ、 サクフ (Prunus)、 リンコ (Malus pumi la var. domestical など。
ナデシコ科： カーネーション (Dianthus caryophyllus) など。
"fナ 不斗 ： ポプフ (Populus tricnocarpa^ Populus nigraN Populus treraula) ィネ科 ： トウモロコシ (Zea mays)、 ィネ (Oryza sativa)、 ォォムギ (Hordeum vulgare)、 コムヤ u'riticum aestivum)、 タケ (Phyllostachys)、 サトウ =vヒ
(.Saccharum off icinarum) と。
ユリ科： チューリップ （Tul ipa)、 ユリ （Lil ium) など。
本発明に係る変異遺伝子を有する発現べクタ一または DNA断片を植物中に導入 する方法としては、 ァグロバタテリゥム法、 PEG-リン酸カルシウム法、 エレク ト 口ポレーシヨン法、 リボソーム法、 パーティクルガン法 （ボンバードメント法）、 マイクロインジェクション法等が挙げられる。 例えばァグロパクテリゥム法を用 いる場合は、 プロ トプラストを用いる場合と組織片を用いる場合がある。 プロ ト プラストを用いる場合は、 Tiプラスミ ドをもつァグロパクテリゥムと共存培養す る方法、 スフヱ口プラスト化したァグロパクテリゥムと融合する方法 （スフエロ プラスト法）、組織片を用いる場合は、 リーフディスクにより対象植物の無菌培養 葉片に感染させる方法 （リーフディスク法）、 カルス （未分化培養細胞） に感染さ せる方法、 直接花組織に浸透させる方法等により行うことができる。 また、 単子 葉植物のァグロパクテリゥム法による形質転換には、 ァセトシリンゴンが形質転 換率を高めるのに使用できる。
変異遺伝子が植物に組み込まれたか否かの確認は、 PCR 法、 サザンハイブリダ ィゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。 例えば、 形質転換植物から DNA を調製し、 DNA特異的プライマーを設計して PCR を行う。 PCR を行った後は、 増幅産物についてァガロースゲル電気泳動、 ポリア クリルアミ ドゲル電気泳動又はキヤピラリー電気泳動等を行い、臭化工チジゥム'、
SYBR Green液等により染色し、 そして増幅産物を 1本のバンドとして検出するこ とにより、 形質転換されたことを確認することができる。 また、 予め蛍光色素等 により標識したプライマーを用いて PCRを行い、 増幅産物を検出することもでき る。 さらに、 マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、 蛍光又は酵素反 応等により増幅産物を確認する方法でもよい。
形質転換の結果、 得られる腫瘍組織やシュート、 毛状根、 種子などは、 そのま ま細胞培養、 組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、 また従来知られ ている植物組織培養法を用い、 適当な濃度の植物ホルモン （オーキシン、 サイ ト カイニン、 ジベレリン、 アブシジン酸、 エチレン、 ブラシノライ ド等） の投与な どにより植物体に再生させることができる。 培養細胞か.らの植物体の再生は、 一 般的には、 適当な種類のオーキシンとサイ トカイニンを混ぜた培地の上で根を分 化させてから、 サイ トカイニンを多く含む培地に移植させシュートを分化させた 後にホルモンを含まない土壌に移植することによって行う。
このようにして、 上述した変異遺伝子が導入された形質転換植物は、 変異遺伝 子が導入される前の植物と比較して特定の組織に含まれる油脂全量が野生型の特 定の組織に含まれる油脂全量と比較して増大するが、 特定の組織中の油脂含量％ は野性型の特定の組織に含まれる油脂含量減少するといつた特徴的な表現型を示 す。 このとき特定の組織としては葉、 子葉、 根、 根毛、 トライコーム、 花、 種子、 果実、 花茎、 塊根、 塊茎、 球茎などで良く、 好ましくは子葉、 種子、 果実、 さら に好ましくは種子が望ましい。 なお、 植物から採取した種子に含まれる油脂成分 は、 従来公知の手法によって定量的に検出することができる。 特定の組織に含ま れる油脂成分を測定する手法としては、 一例としてパルス NMR装置を使用する方 法を挙げることができる。
なお、 本発明に係る変異遺伝子は、 ォレオシン- GFP融合遺伝子を導入した形質 転換シロイヌナズナから採取した子葉に含まれるオイルボディを蛍光により可視 化することで同定された。 しかしながら、 本発明において、 オイルボディ特異的 タンパク質としては、 ォレオシンに限定されず、 オイルボディ特異的に存在する タンパク質を広く使用することができる。 オイルボディ特異的タンパク質として は、 例えば、 ォレオシン、 ステロレオシンやカレオシンが挙げられる。 また、 本 発明において、 子葉中のオイルボディを可視化する蛍光タンパク質としては、 蛍 光能を持つタンパク質であれば良く、例えば、 GFP (green fluorescent protein) , YFP (ye丄丄 ow f丄 uorescent proteinノ、 RFP vred fluorescent proteinノ、 OFP ^orange fluorescent protein) 及び BFP (blue fluorescent protein)等を使用することカ できる。 但し、 子葉中のオイルボディを可視化できるのであれば蛍光タンパク質 に限定されず、 可視光によって検出可能なタンパク質を広く使用することができ る。 すなわち、 可視光によって検出可能なタンパク質としては、 例えばルシフヱ ラーゼなどの発光タンパク質を使用することもできる。
以下、 実施例により本発明をより詳細に説明するが、 本発明の技術的範囲は以 下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例 1〕
本実施例では、 モデル植物として広く利用されているシロイヌナズナを、 ォレ ォシン- GFP融合遺伝子を発現するように形質転換し、蛍光観察によりオイルボデ ィを観察できる形質転換植物を作出した。 その後、 得られた形質転換植物に変異 処理を施し、 オイルボディの性状の変化を指標にして、 種子内の油脂量が変動し た変異体を同定した。 その後、 同定した変異体における原因遺伝子を特定し、 種 子内の油脂量を変動させる機能を有する遺伝子を同定するとともに、 植物内の油 脂量を変動させるアミノ酸置換変異を同定した。 以下、 具体的な実験フロー及び 実験結果を詳述する。
材料と方法
ぐ植物材料 >
シロイヌナズナ（Arabidopsis thal iana) コロンビア生態型を用いた。植物は、 定法に従い、 種子滅菌、 無菌寒天培地 （1/2 ムラシゲスクーグ培地、 0. 8%寒天） で 7日間 2 2 °C明条件下で発芽させた。 その後、 バーミキユライ ト ：パーライ ト =1 ： 1を入れた鉢に植え、 2 2 °Cで 1 6時間明、 8時間喑条件下で育成した。 <ォレオシン- GFP遺伝子の作成 >
キアゲン社の RNeasy plant mini kitを用いてシロイヌナズナの鞘から RNAを 単離し、 インビ卜ロジェン社の Superscript III first strand synthesis system for RT-PCR を用いて逆転写反応を行った。 得られた cDNA とプライマー 1 (5'
AAAAAGCAGGCTCAATGGCGGATACAGCTAGAGGA3' ：配列番号 1 8 ) とプライマー 2 (5'
CTCGCCCTTGCTCACCATAGTAGTGTGCTGGCCACC3'：配列番号 1 9 ) を用いて PCRを行い、 ォレオシン S3 cDNAの両端に attBl配列の一部と GFP遺伝子の一部を持つ DNA断 片 Aを増幅した。 同時に、 ォワンクラゲの緑色蛍光タンパク質 GFPをコードする cDNA とプライマー 3 (5' GGTGGCCAGCACACTACTATGGTGAGCAAGGGCGAG3'：配列番号 2
0 )、 プライマー 4 (5' AGAAAGCTGGGTCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT3' ：配列番号 2 1 ) を用いた PCRにより、 GFP cDNAの両端にォレオシン S3 cDNAの一部と attB2配列 の一部が付加された DNA断片 Bを増幅した。 次いで、 DNA断片 Aと DNA断片 B、 プ ライマー 5 (5' GGGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC T3' ：配列番号 2 2 ) と プライマー 6 (5' GGGG AC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG G3' ：配列番号 2 3 ) を 混ぜ合わせ、 さらに PCRをおこなうことで、 両側に attBlおよび attB2配列を持 っォレオシン- GFP融合遺伝子を作成した。ォレオシン- GFP融合遺伝子の塩基配列 及び当該遺伝子産物のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号 2 4及び 2 5に示した。 得られた融合遺伝子は、インビトロジヱン社の Gateway systemプロ トコールに 従レ、、 PD0NR221ベクターを介して、 CaMV 35Sプロモーターの下流に attRl と attR2 配列を持ち、 カナマイシン耐性マーカーを含む Tiベクターにクローユングした。 得られたプラスミ ドは、 エレク トロポレーション法によりァグロバクテリ ゥム
(Agrobacterium tumef science C58C1 rifR) へ導入、 これを Ti- OleGとした。
<シロイヌナズナヘの形質転換 >
ォレオシン -GFP融合遺伝子は、 ァグロパクテリヴム法を用いてシロイヌナズナ のゲノムへ導入した。 まず、 Ti- OleGを YEB培地 （5 g/1 polypeptone、 5g/l beef extract, lg/1 yeast extract, 5 g/1 sucrose, 0. 5g/l MgS04) にて A600=0. 8-1. 0 になるまで 28°Cで増殖させた後、 遠心分離により集菌した。 得られた菌体は
A600=0. 8 tこなるよう ίこ infi ltration液 （10mM MgCl2、 5% sucrose, 0. 05% Si lwet
L-77)に懸濁した。開花中のシロイヌナズナ花茎をこの懸濁液に 1分間浸した後、 結実した種子を採取した。 採取した種子は、 種子滅菌処理後に 25 mg/l カナマイ シンを含む無菌寒天培地に播種し、 カナマイシン耐性を指標にしてォレオシン
-GFP融合遺伝子がゲノムに挿入された形質転換シロイヌナズナを単離した。得ら れた形質転換シロイヌナズナから種子を採取し、 後代でカナマイシン耐性マ一力 一をホモで持つ形質転換体を選抜し、 これを OleGと名付けた。
<形質転換体の変異原処理 >
OleGの種子を 0. 2%ェチルメタンスルホン酸液で 1 6時間処理後、バーミキユラ ィ ト ：パーライ ト =1： 1 を入れた鉢に播種した。 2 2 °Cで 1 6時間明、 8時間喑 条件下で後代の種子を採取し、 これを M2種子と,した。
< GFP蛍光観察 >
変異体のスクリーニングには、 蛍光実体顕微鏡 （Carl Zeiss SteRE0 Lumar V12) を用いた。 OleGおよび M2種子を垂直に立てた無菌寒天培地で喑所 6日間発芽さ せ、 蛍光実体顕微鏡 （Carl Zeiss) 下で黄化子葉、 胚軸および根の各細胞におけ るォレオシン- GFP融合タンパク質の GFP蛍光を観察した。 OleGとは GFP蛍光の強 度や分布が異なるものを変異体として同定した。
OleGおよび変異体におけるォレオシン- GFP融合タンパク質の GFP蛍光を比較す るためには、 共焦点レーザー顕微鏡 （Carl Zeiss LSM 510) を用いた。 喑所 6 日 間発芽させた OleGおよび変異体から、 黄化子葉、 胚軸、 根を切り取り、 スライ ド クラスにマウントした。 各細胞における GFP蛍光像を同一条件下で撮影し、 顕微 鏡付属の画像解析ソフトウエアを用いて、 同一面積内での画素に対する蛍光強度 の度数分布を計算し、 蛍光総和 a=sum (蛍光強度 X画素数）を算出した。
<種子タンパク質の電気泳動およびィムノブ口ット解析 >
20粒の種子を 1の SDSサンプルバッファ中で破砕した後、遠心上清を種子 タンパク質のサンプルとした。 定法に従い、 15 /X 1のサンプルを SDSポリアクリ ルアミ ドゲル電気泳動に供した。 電気泳動後のゲルは、 0. 2%クマシーブリ リアン トブルー R250溶液 （25%メタノール、 10%酢酸を含む） で染色した。
ィムノブ口ット解析には、 5 μ 1のサンプルを SDSポリアクリルァミ ドゲルで電 気泳動した後、 セミ ドライブ口ッ ト法を用いてゲル中のタンパク質を二トロセル ロール膜に転写した。 ニトロセルロール膜に転写されたタンパク質の抗タンパク 質抗体を用いた検出は、 GE ヘルスケアバイオサイエンスのプロ トコールに従い、
ECL Western blotting detection reagents を用レヽて行った。 その際、 1次抗体
(抗ォレオシン抗体もしくは抗 GFP抗体）および 2次抗体はともに 1/5000希釈し たものを用いた。 発光の検出には富士フィルム製の発光ィメージアナライザ一
LAS-1000 plusを用いた。
<種子細胞の電子顕微鏡観察 >
半切した種子を固定液 （4%パラホルムアルデヒ ド、 1%ダルタルアルデヒ ド、 10% DMS0、 0· 05Mカコジノレ酸バッファ pH7. 4) で固定した。 固定後のサンプノレをエボン 812樹脂に包埋、 Leica製ミクロ トーム Ultracut UCTを用いて超薄切片を作成し た。超薄切片は 4%酢酸ウランおよび 0. 4%クェン酸鉛で電子染色後、電子顕微鏡（日 立製作所 H-7600) にて観察を行った。
ぐ種子の油脂量測定 >
静電気除電処理を行いながら薬包紙を用いて種子を精密電子天秤で重量測定し、 種子重量が 10〜12mgになるように量りとった。種子は、パルス NMR用の試験管に 入れ、 Resonance製 MARAN- 23パルス NMRを用いて ^ -パルス NMR緩和時間値から 種子中の油脂含量 （重量％) を求めた。 詳しい測定手順についてはパルス NMR測定 マニュアルに従った。
<種子の油脂に含まれる脂肪酸組成分析 >
1 mg-5 mg程度の種子サンプルの重量を測定後、 1. 5 mlマイク口テストチュー ブに入れた。 マイク口テストチューブに 3 ΙΜΐ ψのタングステンカーバイ ドビーズ を 1粒添加後、 さらに 450 // 1のメタノール、 0. 2% (w/v)の濃度でメタノール溶媒 と混合したブチルヒ ドロキシトルエン溶液を 50 μ 1、 内部標準物質として 0. 2%
C15 : 0脂肪酸 10 μ 1 を加えた。 これら各種試薬とサンプルを加えたマイクロテス トチューブを Retsch製 Mixer Mill Type MM301を用いて l/20s頻度で 1分間振動 させ、 種子を粉砕した。 サンプルを、 10 ml のスクリューキャップ付試験管に移 した。 さらにマイクロテストチューブ内部をメタノール 250 μ 1で 2回洗浄し、洗 浄メタノ一ル液を上記試験管に加え、 試料液を約 1 ml とした。 これに 10%塩酸 Z メタノール液を 1 ml添加し、 80°Cで 1時間処理をした後、— 1. 5 mlの n-へキサン を加え、 ヴオルテックスミキサーで撹拌し、 n -へキサン層を 10 mlスピッツ管に 移した。 1 mlの n -へキサンでさらにメタノリシスに用いた試験管内部を洗浄し、 洗浄 n-へキサン液層を上記スピッヅ管に加えた。得られた n-へキサン溶媒溶液を
40°Cで窒素ガスパージし、 脂肪酸メチルエステルを乾固した。 乾固した脂肪酸メ チルエステルを n-へキサン 500 μ 1で溶解し、 GC- FIDにより各種脂肪酸メチルェ ステルを分離 ·定量した。 定量にあだっては、 内部標準（C15 : 0 脂肪酸）の面積値 を参照した。
ぐ変異遺伝子の同定 >
変異原処理した後、 種子中の油脂量が変動した変異体における原因遺伝子の高 精度マツビングを行うために、 コロンビア生態型をバックグラウンドに持つ変異 体と野性型シロイヌナズナであるランズバーグ · エレクタ生態型とを交配し、 変 異遺伝子をホモに持つ 310系統の F2世代を得た。 多数の分子マーカーを用いて、 定法に従い、 これら 310系統、 計 620染色体の遺伝的バックグラウンドのスコア リングを行った。 PCR法を用いて OleGおよび変異体のゲノム DNAから原因遺伝子 と推定した遺伝子を増幅し、アプライ ドバイオシステム製の 3130x1ジヱネティッ クアナライザを用いて塩基配列を決定した。
結果と考察
<オイルボディ形成不全変異体スクリ一二ング法の確立 >
ォレオシンと GFP (green fluorescent protein) の融合タンノヽ0ク質をコ一ドす る融合遺伝子 （Oleosin- GFP) を作製し、 これをカリフラワーモザイクウィルス由 来 35Sプロモーター DNA下流に連結した （図 4 A)。 この DNA コンス トラク トをァ グロバクテリウム法を用いてシロイヌナズナ （Arabidopsis thal iana) のゲノム DNA中に導入し、 形質転換シロイヌナズナを作製、 oleGと名付けた。 喑黑条件下 で 6 日間発芽後の oleG子葉を蛍光顕微鏡観察を用いて観察した結果が図 4 Bであ る。 図 4 B より、 オイルボディ膜が GFP蛍光で標識されており、 多数の小さなォ ィルボディが凝集体として集まった状態で存在していることがわかる。 また、 暗 黒条件下で発芽した子葉以外にも胚ゃ明条件下で発芽した緑色子葉中や本葉中 · 花弁中でもオイルボディが存在することがわかった。
オイルボディへの植物油脂蓄積メカニズムに関与する遺伝子を決定するために、 oleG種子をェチルメタンスルホン酸で変異処理し、 後代 M2種子を得た。 喑黒下 で 6 日間発芽した M2植物の蛍光顕微鏡観察を行い、 oleG と比較して蛍光強度の 異なる変異体 A (図 4 C) 及び変異体 B (図 4 D) を取得した。 これらの変異体は発 芽した子葉中の GFP蛍光強度が oleGよりも低下していた。 <GFP蛍光総和と種子の脂質含量の関係 >
01eG、 変異体 A及び変異体 Bについて、 暗黒下で 6日間発芽した子葉の GFP蛍 光を同一条件、同一面積、同一画素数のレーザー共焦点顕微鏡画像として取得し、 各画像の GFP蛍光強度に対する画素数の度数分布から GFP蛍光総和 a (a=sum (蛍 光強度 X画素数）） を求めた。 OleGの蛍光総和を 100%とすると、 変異体 Aの蛍光 総和は 37.9%、 変異体 Bは 85.1%となった。 一方、 01eG、 変異体 A及び変異体 B の種子に含まれる脂質含量を測定したところ、 それぞれ 34·66%±0.43%、 26.91%±0.34%、 32.34%±0.49%であった。 GFP 蛍光総和と種子の脂質含量に は正の相関が認められた （図 5)。 また、 これらの変異体の種子に蓄積している脂 質に含まれる脂肪酸組成を分析した （図 6)。 その結果、 変異体 Α 及び変異体 B ともに OleGと比較して C20:l(ll)cisの含量が低下していた。 本明細書中での脂 肪酸は次のように標記する。 C 炭素数：炭素同士の不飽和結合数 （不飽和結合が 存在するカルボキシル基側からの炭素番号） 不飽和結合の cis- trans幾何異性。 cic-trans 幾何異性が不明な場合は、 幾何異性に関する標記を行わない。 例えば ステアリン酸は、 C18:0で、 一般的なォレイン酸は、 C:18:l(9)cisと標記する。 一方で、 変異体 Aでは C18:3(9， 12, 15)、 変異体 Bでは C18: 1 (9)cisの増加が認め られた。 以上の結果から、 ォレオシン -GFP融合タンパク質の GFP蛍光総和を測定 することで、 植物油脂の蓄積メカニズムに異常のある変異体を生きたままで同定 することが可能になった。
なお、 図 6において、 各脂肪酸を示す棒グラフは、 左から 01eG、 変異体 A及び 変異体 Bの順で示している。
<種子タンパク質の解析 >
図 7は、 野生型シロイヌナズナ、 01eG、 変異体 A及び変異体 Bの種子に含まれ るタンパク質を解析した結果である。クマシ一プリ リアントブルー染色（図 7 A)、 抗ォレオシン抗体によるィムノブ口ッ ト解析（図 7B)および抗 GFP抗体によるィ ムノブロット解析 （図 7C) から、 変異体 A、 変異体 Bの種子では、 内在性ォレオ シン量おょぴォレオシン - GFP量がともに OleG よりも減少していることが明らか になった。 なお、 図 7A〜Cにおいて、 レーン 1は野生型シロイヌナズナ由来サン プルを示し、 レーン 2は OleG由来サンプルを示し、 レーン 3は変異体 A由来サン プルを示し、 レーン 4は変異体 B由来サンプルを示している。
くオイルボディの電子顕微鏡観察 >
図 8は、 01eG、 変異体 A及び変異体 Bの種子細胞を電子顕微鏡で観察した結果 を示している。 OleGの種子細胞中には、 野生型シロイヌナズナと同様、 小さなォ ィルボディがぎっしりと詰まっている。 一方、 変異体 A及び変異体 Bでは、 お互 いの間にサイ トゾルと思われる隙間が認められ、 個々.のオイルボディが丸くなつ ている。 これは、 種子の貯蔵脂肪量が減少しているためと考えられる。 また、 種 子中のいくつかのオイルボディが巨大化している。 これは、 オイルボディ膜のォ レオシン量が減少していることに起因すると考えられた。
ぐ原因遺伝子の同定 >
コロンビア生態型をバックグラウンドに持つ変異体 Aとランズバーグ ·エレク タ生態型の野生型シロイヌナズナを交配し、 原因遺伝子の高精度マッピングを行 つた。 分子マーカーを用いて 620個の染色体について遺伝的バックグラウンドの スコアリングを行った結果を図 9 A に示す。 ランズバーグ ·エレクタ由来の染色 体数は、 変異体 A原因遺伝子の遺伝子座と分子マーカーとの間で組換えが起こつ たことを示している。 図 9 Aに示したように、 高精度マッピングにより、 変異体 A 原因遺伝子の遺伝子座が第 1 染色体の Atlg54560 の極近傍で、 Atlg54150 と Atlg54970 の間に位置していることが分かった。 この領域には機能未同定遺伝子 Atlg54570 (図 9 B) を含む 87の遺伝子の存在が示唆されている。
Atlg54570はジァシルグリセロールァシルトランスフェラーゼ （DAGAT) ドメイ ンと提唱されている部分を含んだポリペプチドをコードしている。 DAGAT ドメイ ンは、 トリアシルグリセロール合成に関与する酵素の一つであるジァシルグリセ ロールァシルトランスフェラーゼに共通して存在すると考えられているアミノ酸 配列であるが、 塩基配列情報に基づく推察であるため、 DAGAT ドメインを持つポ リペプチドが全て DAGAT活性を有するとは限らない。 また、 DAGATの研究は出芽 酵母で集中して行われており、 植物種子中の特定のポリべプチドが DAGATである と解明された例は知られていない。
変異体 Aのゲノム DNAに存在する Atlg54570遺伝子領域の塩基配列を決定した ところ、 Atlg54570中の塩基配列に C3252Tの点変異があった （C3252Tの標記は、 mRNAに対する c DNAの開始コドン 5' ATG3'の Aを 1 としたときの第 3252番目の C が Tに置換変異した事を示す）。この点変異は第 1 0番目のェクソン中に位置して おり、 Atlg54570遺伝子産物ァミノ酸配列の DAGAT ドメィン内に T508Iのミスセ ンス変異を引き起こす （T508Iの標記は、 ポリペプチドの N末端から第 508アミ ノ酸残基目の T (Thr)が I (Ile)に置換変異した事を示す）。 以上の結果から、 変異 体 Aの原因遺伝子は Atlg54570であり、 Atlg54570遺伝子産物における T508I変 異が植物内の油脂量を変動させるアミノ酸置換変異であると結論付けられた。 産業上の利用可能性
本発明に係る変異遺伝子によれば、 種子内の油脂含量や油脂組成等を調節する ことができる。 また、 本発明に係る種子内油脂含量の調節方法によれば、 油脂含 量や油脂組成が調節された植物を提供することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号 1に示すアミノ酸配列において、 N 末端側から 1 2番目のアミ ノ酸残基が他のァミノ酸に置換されたコンセンサス配列を有する変異タンパク質 であって、 植物種子内の油脂含量を調節する機能を有する変異タンパク質をコー ドする変異遺伝子。
2 . 上記他のアミノ酸がイソロイシン、 バリン、 ロイシン及びメチォニンか らなる群から選ばれる一種のアミノ酸であることを特徴とする請求項 1記載の変 異遺伝子。
3 . 上記他のアミノ酸がィソロイシンであることを特徴とする請求項 1記載 の変異遺伝子。
4 . 上記変異タンパク質は、 配列番号 4〜 1 7のアミノ酸配列のうちいずれ か 1に示すアミノ酸配列に含まれる上記コンセンサス配列において、 N 末端側か ら 1 2番目のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたものであることを特徴と する請求項 1記載の変異遺伝子。
5 . 植物由来の遺伝子を変異させたものであることを特徴とする請求項 1記 載の変異遺伝子。
6 . イネ科、 アブラナ科及びャナギ科からなる群から選ばれる 1つの科に属 する植物由来遺伝子を変異させたものであることを特徴とする請求項 1記載の変 異遺伝子。
7 . 大麦、 イネ、 シロイヌナズナ、 Brass ica rapa 及びポプラからなる群か ら選ばれる 1つの種に属する植物由来遺伝子を変異させたものであることを特徴 とする請求項 1記載の変異遺伝子。
8 . 請求項 1乃至 7いずれか一項記載の変異遺伝子によってコードされる変 異タンノ、°ク質。
9 . 請求項 1乃至 7いずれか一項記載の変異遺伝子を導入してなる形質転換 細胞。
1 0 . 請求項 1乃至 7いずれか一項記載の変異遺伝子を導入してなる形質転 換植物。
1 1 . 配列番号 1に示すアミノ酸配列からなるコンセンサス配列を有するタ ンパク質をコードする遺伝子に対して、 配列番号 1に示すアミノ酸配列の N末端 側から 1 2番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換する変異を導入する、 種子 内油脂含量の調節方法。
1 2 . 上記他のアミノ酸がイソロイシン、 バリン、 ロイシン及びメチォニン からなる群から選ばれる一種のアミノ酸であることを特徴とする請求項 1 1記載 の種子内油脂含量の調節方法。
1 3 . 上記他のアミノ酸がイソロイシンであることを特徴とする請求項 1 1 記載の種子内油脂含量の調節方法。
1 4 . 配列番号 4〜1 7のアミノ酸配列のうちいずれか 1に示すアミノ酸配 列に含まれる上記コンセンサス配列において、 N 末端側から 1 2番目のアミノ酸 残基が他のァミノ酸に置換された変異タンパク質を発現させることを特徴とする 請求項 1 1記載の種子内油脂含量の調節方法。
1 5 . イネ科、 アブラナ科及びャナギ科からなる群から選ばれる 1つの科に 属する植物由来遺伝子を変異させることを特徴とする請求項 1 1記載の種子内油 脂含量の調節方法。
1 6 . 大麦、 イネ、 シロイヌナズナ、 Brassica rapa 及びポプラからなる群 から選ばれる 1つの種に属する植物由来遺伝子を変異させることを特徴とする請 求項 1 1記載の種子内油脂含量の調節方法。
PCT/JP2009/053784 2008-02-28 2009-02-23 種子内の油脂含量を調節する変異遺伝子、種子内油脂含量の調節方法 WO2009107822A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2009218032A AU2009218032A1 (en) 2008-02-28 2009-02-23 Mutant gene that regulates oil-and-fat content in seed and method for regulating oil-and-fat content in seed
EP09715272A EP2270168A4 (en) 2008-02-28 2009-02-23 MUTANT GENE FOR CONTROLLING OIL AND GREASE CONTENT OF A SEED AND METHOD OF CONTROLLING OIL AND GREASE CONTENT OF A SEED
CN2009801068102A CN101960010A (zh) 2008-02-28 2009-02-23 调节种子内油脂含量的突变基因、种子内油脂含量的调节方法
CA2717086A CA2717086A1 (en) 2008-02-28 2009-02-23 Mutant gene that regulates oil-and-fat content in seed and method for regulating oil-and-fat content in seed
US12/920,063 US20110041220A1 (en) 2008-02-28 2009-02-23 Mutant gene that regulates oil-and-fat content in seed and method for regulating oil-and-fat content in seed

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008-048612 2008-02-28
JP2008048612A JP2009201437A (ja) 2008-02-28 2008-02-28 種子内の油脂含量を調節する変異遺伝子、種子内油脂含量の調節方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009107822A1 true WO2009107822A1 (ja) 2009-09-03

Family

ID=41016206

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2009/053784 WO2009107822A1 (ja) 2008-02-28 2009-02-23 種子内の油脂含量を調節する変異遺伝子、種子内油脂含量の調節方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20110041220A1 (ja)
EP (1) EP2270168A4 (ja)
JP (1) JP2009201437A (ja)
CN (1) CN101960010A (ja)
AU (1) AU2009218032A1 (ja)
CA (1) CA2717086A1 (ja)
WO (1) WO2009107822A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102301994B (zh) * 2011-08-03 2013-07-10 刘卉秋 日本菟丝子标准样品及其制备方法
CN102323125B (zh) * 2011-08-03 2013-05-22 刘卉秋 齿裂大戟标准样品及其制备方法
CA3009880A1 (en) * 2015-12-28 2017-07-06 Idemitsu Kosan Co., Ltd. Peptide tag and tagged protein including same

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008048612A (ja) 2006-08-22 2008-03-06 Bio Taxol:Kk 糖転移酵素遺伝子

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU779969B2 (en) * 1998-12-17 2005-02-24 National Research Council Of Canada Diacylglycerol acyltransferase gene from plants
US20040031072A1 (en) * 1999-05-06 2004-02-12 La Rosa Thomas J. Soy nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription plants and uses thereof for plant improvement

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008048612A (ja) 2006-08-22 2008-03-06 Bio Taxol:Kk 糖転移酵素遺伝子

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Amino acid, Peptide, Protein, 5.1 Amino acid", vol. 3, KAGAKU-DOJIN PUBLISHING CO., INC., article "McKee's Biochemistry"
"Dai 49 Kai Proceedings of the Annual Meeting of the Japanese Society of Plant Physiologists", 15 March 2008, article HAYASHI M. ET AL.: "Oilbody Keisei no Seigyo ni Kakawaru Idenshi no Kaiseki", XP008143629 *
ABENES M ET AL.: "Transient expression and oil body targeting of an Arabidopsis oleosin-GUS reporter fusion protein in a range of oilseed embryos.", PLANT CELL REP., vol. 17, 1997, pages 1 - 7 *
DATABASE GENBANK [online] 10 August 2006 (2006-08-10), SEKI M ET AL.: "Arabidopsis thaliana At1g54570 mRNA for unknown protein", retrieved from http://www. ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?26451999: DDBJ:5688889 Database accession no. AK118486 *
DATABASE GENBANK [online] 18 March 2003 (2003-03-18), CHEUK R ET AL.: "Arabidopsis thaliana At1g54570 gene, complete cds.", XP008147512, Database accession no. BT005958 *
DATABASE GENBANK [online] 27 January 2006 (2006-01-27), HAAS B J ET AL.: "Arabidopsis thaliana clone 25383 mRNA, complete sequence.", retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ viewer.fcgi?21405201:NCBI:12632811 Database accession no. AY086491 *
HENIKOFF S.; HENIKOFF J. G.: "Amino-acid substitution matrices from protein blocks", PROC. NATL. ACAD. SCI., U.S.A., vol. 89, 1992, pages 10915 - 10919
REID A J: "Expression and subcellular targeting of plant and mammalian apolipoproteins in plants.", DISSERTATION ABSTRACTS INTERNATIONAL B, vol. 65, no. 12, 2005, pages 6134 - 6135 *
See also references of EP2270168A4
SILOTO R M P ET AL.: "The accumulation of oleosins determines the size of seed oilbodies in Arabidopsis.", PLANT CELL, vol. 18, 2006, pages 1961 - 1974, XP008143624 *
SILOTO, R. M. P. ET AL., PLANT CELL, vol. 18, 2006, pages 1961 - 1974
WAHLROOS ET AL., GENESIS, vol. 35, no. 2, 2003, pages 125 - 132
WAHLROOS T ET AL.: "Oleosin expression and trafficking during oil body biogenesis in tobacco leaf cells.", GENESIS, vol. 35, 2003, pages 125 - 132, XP008141026 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2270168A4 (en) 2011-07-20
AU2009218032A1 (en) 2009-09-03
CN101960010A (zh) 2011-01-26
EP2270168A1 (en) 2011-01-05
CA2717086A1 (en) 2009-09-03
JP2009201437A (ja) 2009-09-10
US20110041220A1 (en) 2011-02-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2009220650B2 (en) Gene that increases production of plant fat-and-oil and method for using the same
AU2018200858B2 (en) Transformed plant and method for producing exudate containing sugar using transformed plant
JP5672004B2 (ja) 植物のバイオマス量を増産させる遺伝子及びその利用方法
JP2011092122A (ja) 植物に環境ストレス耐性を付与する遺伝子及びその利用方法
WO2009107822A1 (ja) 種子内の油脂含量を調節する変異遺伝子、種子内油脂含量の調節方法
Li et al. An oleosin-fusion protein driven by the CaMV35S promoter is accumulated in Arabidopsis (Brassicaceae) seeds and correctly targeted to oil bodies
US8173435B2 (en) Method for evaluating oil-and-fat amount in seed and method for screening for plant exhibiting varied level of oil-and-fat content
US11613762B2 (en) Plants with modified lipid metabolism and methods for making the same
US20160319292A1 (en) Transformed plant and method for producing exudate containing sugar using transformed plant
JP5686977B2 (ja) 植物の油脂生産性を増大させる遺伝子及びその利用方法

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200980106810.2

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09715272

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009218032

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12920063

Country of ref document: US

Ref document number: 2717086

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2009218032

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20090223

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009715272

Country of ref document: EP