CN117535318A - 一种大豆类受体蛋白激酶基因及其在改良大豆根系结构中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大豆类受体蛋白激酶基因及其在改良大豆根系结构中的应用。所述的大豆类受体蛋白激酶基因命名为GmHSL1b，其编码区序列如SEQ ID NO.1所示。作物根系结构是影响作物产量的重要因素，大豆根系的发达程度与产量呈正相关。本发明通过实验证明，相较于野生型植株，过表达该大豆类受体蛋白激酶基因GmHSL1b的大豆植株主根长度、侧根数量和密度均有所增加，因此最终可以提高大豆的粒重和产量。说明该类受体蛋白激酶基因GmHSL1b在提高大豆产量中具有应用价值。本发明的提出为培育优良大豆品种，提高大豆产量提供了有效的技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种分离自大豆的基因及其应用，特别涉及一种分离自大豆的类受体蛋白激酶基因及其在改良大豆根系结构中的应用。本发明属于农业技术领域。
背景技术
植物类受体蛋白激酶是一类包含胞外结构域、跨膜域和胞内激酶域的蛋白分子，它们通过胞外结构域与离子、小分子或多肽等胞外分子特异结合来激活胞内激酶域的自磷酸化和互磷酸化活性，完成跨膜传递信号的功能。植物类受体蛋白激酶广泛参与抗逆性反应、调节植物发育和介导植物激素信号转导等功能。例如，水稻Xa21保护水稻免受病原菌的侵害(Song等1995；Wang等2004)。花器官的脱落(HAESA)、表皮细胞特化(CRINKLY4)、调控长角果的成熟发育(TMKL1)、雄性器官的发育(RPK1)等均需要类受体蛋白激酶参与。拟南芥的FLOR1和AGAMOUS也参与花器官发育相关的信号转导(Acevedo等2004)。因此，与作物产量相关的发育生物学问题及相关基因具有重要应用潜力。
作物根系结构是影响作物产量的重要因素。大豆(学名：Glycine max(Linn.)Merr.)是一种重要的油料作物，具有主根入土浅，侧根不发达的特性，因而限制了养分吸收和利用的效率。养分吸收受限会导致大豆花荚脱落增加，从而降低产量。大豆根系的发达程度与产量呈正相关(金剑等，2004)。根系生物量大是各个高产大豆品种所共同具有的重要特征(杨光等，2013)。增加根系比例后可以有效增加种子的产量和数量(Sanders和Brown，1976)。由此可见，改良根系结构可以为大豆增产提供一种有效的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大豆类受体蛋白激酶基因及其在改良大豆根系结构中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明分离得到的一种大豆类受体蛋白激酶基因，所述的大豆类受体蛋白激酶基因命名为GmHSL1b，其编码区序列如SEQ ID NO.1所示。
含有所述的大豆类受体蛋白激酶基因的表达载体以及含有所述表达载体的宿主细胞也在本发明的保护范围之内。
其中，优选的，所述的表达载体为植物表达载体。
进一步的，本发明还提出了所述的大豆类受体蛋白激酶基因在改良大豆根系结构中的应用。其中，优选的，所述的改良大豆根系结构包括提高主根长度、侧根数量和密度。
进一步的，本发明还提出了所述的大豆类受体蛋白激酶基因在增加大豆种子粒重、提高大豆产量中的应用。
更进一步的，本发明还提出了一种获得根系发达且大豆产量高的转基因大豆品种的方法，其包括将含有所述的大豆类受体蛋白激酶基因的表达载体转化入萌发好的大豆以及筛选获得过表达该大豆类受体蛋白激酶基因GmHSL1b的大豆植株的步骤。
其中，优选的，所述的转化采用的是农杆菌介导的转化法。
其中，优选的，所述的方法包括以下步骤：
(1)GmHSL1b基因编码区序列的克隆
1)大豆栽培种东农50种子表面消毒后，播种于营养土中，28℃培养7-10天，使其长出幼嫩真叶后，收集2g鲜嫩幼根，用RNA小量提取试剂盒提取总RNA，进行反转录，得到的cDNA保存至-20℃备用；
2)设计克隆引物，F：ATGACCAAAATGCCCTTCACCTTCG；R：TTACACACTATATAAGCAGCTTTCT，以得到的cDNA为模板，用以上引物进行PCR反应，PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离，大小正确的目标条带用DNA胶回收试剂盒回收，把回收片段连接到载体pUC-GW中，鉴定阳性克隆送公司测序，测序正确的重组质粒命名为pUC-GW-HSL1b，其中克隆得到的GmHSL1b基因的编码区序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)植物表达载体pBWA(V)BII-HSL1b-Tnos的构建
1)设计GmHSL1b编码区序列的同源重组引物，OE-F：aacaaacaccatgaccaaaatgcccttcaccttcgtc，OE-R：cccagtactgaagacagttgttacagatcctcttcagagatgagtttctgc，以上述引物从质粒pUC-GW-HSL1b上扩增GmHSL1b基因编码区片段；PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离，大小正确的目标条带用DNA胶回收试剂盒回收；
2)植物表达载体pBWA(V)BII(购自武汉伯远生物科技有限公司)，经Sap I和Lgu I双酶切后用DNA胶回收试剂盒回收用于与扩增的GmHSL1b片段进行重组反应；然后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含卡那霉素的LB液体培养基培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法提取质粒；
3)设计鉴定引物，O-F：ATGATGACCAAAATGCCCTTCACCT；O-R：TAAAGACAAGAAAGGCACTGGCTA，进行PCR鉴定，鉴定正确的载体命名为pBWA(V)BII-HSL-Tnos；
(3)大豆遗传转化
1)将构建好的植物表达载体pBWA(V)BII-HSL-Tnos转化至农杆菌中，挑取农杆菌菌落，以鉴定引物OE-F/OE-R进行菌落PCR鉴定；
2)挑选健壮、成熟的成熟大豆种子，使用氯气消毒法，持续灭菌16-20h；将灭过菌的种子种脐朝下接种在萌发培养基上，置于25℃培养箱，暗培养1d；制备农杆菌菌液，将携带有pBWA(V)BII-HSL-Tnos质粒的农杆菌涂布于相应培养基上进行初次活化，培养48h后收集菌体再次于新的培养基上活化，培养24h后收集菌体于浸染液中，涡旋混匀，分光光度计调整菌液OD600＝0.5待用；所述的浸染液含有1/2MS液体，2mg/L BA，0.1mg/L NAA，100μM乙酰丁香酮，pH 5.2；
3)将萌发好的大豆，进行划伤处理后，倒入制备好的浸染液浸染10min，弃侵染液，再将外植体铺放到垫有滤纸的共培养培养基上，25℃避光共培养3-5d；选取共培养后长势良好无污染的外植体，切去胚轴末端，插入恢复固体培养基上，恢复培养7-10d；将恢复培养后长有丛生芽的外植体接种至筛选培养基上，16h/8h光照/黑暗培养,筛选培养21d；将经过筛选后长势良好的丛生芽，转移至伸长培养基中，16h/8h光照/黑暗培养,筛选培养21d；待幼芽生长至约5cm时，转移至生根培养基中进继续筛选；16h/8h光照/黑暗培养,筛选培养21d，洗干净幼苗根上附着的培养基，移载至装盛有营养土的育苗盘中，27℃16h/8h光照/黑暗培养，炼苗3～4周；采用Bar试纸法直接对转基因植物内有无bar/pat蛋白进行鉴定；将经过Bar试纸检测的阳性幼苗移出培养基栽种到温室中直至收种；
4)通过自交获得过表达该大豆类受体蛋白激酶基因GmHSL1b的大豆纯合植株，即为根系发达且大豆产量高的转基因大豆品种；
其中，所述的共培养培养基为含有30g/L蔗糖，2mg/LBA，0.1mg/LNAA，100μM乙酰丁香酮的1/2MS固体培养基，pH 5.2；
其中，所述的恢复固体培养基为含有30g/L蔗糖，2mg/LBA，0.1mg/LNAA，400mg/L头孢噻肟的MS固体培养基，pH 5.8；
其中，所述的筛选培养基为含有30g/L蔗糖，2mg/L BA，0.1mg/LNAA，400mg/L头孢噻肟，5mg/L草铵膦的MS固体培养基，pH 5.8；
其中，所述的伸长培养基为含有30g/L蔗糖，0.1mg/LNAA，400mg/L头孢噻肟的MS固体培养基，pH 5.8；
其中，所述的生根培养基为含有30g/L蔗糖，0.05mg/LNAA，400mg/L头孢噻肟，5mg/L草铵膦的MS固体培养基，pH 5.8。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明分离得到了一个能够改良根系结构的大豆类受体蛋白激酶基因GmHSL1b，过表达该基因的大豆植株主根长度、侧根数量和密度均有所增加，最终可以提高大豆的粒重和产量。说明类受体蛋白激酶基因在提高大豆产量中具有应用价值。本发明的提出为培育优良大豆品种，提高大豆产量提供了有效技术手段。
附图说明
图1为GmHSL1b编码区扩增结果；
M：DNAmarker；1和2：扩增条带；
图2为pUC-GW-HSL1b质粒酶切鉴定；
图3为超表达载体pBWA(V)BII-HSL1b-Tnos菌落PCR鉴定结果；
M：DNAmarker；1和2：鉴定的pBWA(V)BII-HSL1b-Tnos质粒；
图4为超表达载体pBWA(V)BII-HSL1b-Tnos图谱；
图5为pzmpl-bar-编辑HSL载体鉴定结果；
图6为pzmpl-bar-编辑HSL载体图谱；
图7为农杆菌菌落PCR结果；
A：pBWA(V)BII-HSL-Tnos载体鉴定结果；B：pzmpl-bar-编辑HSL载体鉴定结果。M：DNAmarker；1-3：菌落PCR产物；
图8为农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化；
图9为再生植株Bar试纸条检测；
图10为基因编辑株系靶点扩增结果；
图11过表达株系GmHSL1b基因表达量分析结果；
图12为GmHSL1b过表达及基因编辑植株根系结构；
Wt：野生型；OE17-1：GmHSL1b过表达；CR12：GmHSL1b基因编辑；
图13为GmHSL1b过表达和基因编辑植株百粒重统计；
Wt：野生型；OE17-1：GmHSL1b过表达；CR12：GmHSL1b基因编辑。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但该实施例仅用于说明本发明，并不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1、GmHSL1b基因编码区序列的克隆
大豆栽培种东农50种子表面消毒后，播种于营养土中，28℃培养7-10天，使其长出幼嫩真叶后，收集2g鲜嫩幼根，用RNA小量提取试剂盒提取总RNA。取2μg总RNA进行反转录，反应体系如下：5×gDNAClean Reation Mix，2μL；RNA，2μg；无RNA酶水补齐至10μL。42℃反应2min去除DNA。向装有10μL反应液的PCR管中再加入4μL 5×Evo M-MLVRT Reation Mix和6μLRNase free water，37℃金属浴中15min，再85℃，5s，得到的cDNA保存至-20℃备用。
设计克隆引物，F：ATGACCAAAATGCCCTTCACCTTCG；R：TTACACACTATATAAGCAGCTTTCT，用以上引物进行PCR反应，反应成分如下:LAtaq polymerase 0.5μL，GC buffer 5μL，dNTP1.5μL，F引物0.5μL，R引物0.5μL，Template cDNA2μL，ddH2O 10μL。
PCR反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，扩增35个循环，72℃延伸5min，4℃保存。PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离，100V恒压电泳30-40min后，用凝胶成像系统检测分析，扩增结果如图1所示。大小正确的目标条带用DNA胶回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收，把回收片段连接到载体pUC-GW中，连接体系为：连接buffer 5μL，pUC-GW 1μL，回收的GmHSL1b片段4μL，16℃连接过夜，连接产物转化到用CaCl2法处理的大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(终浓度100μg/mL)的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素(终浓度100μg/mL)的LB液体培养基培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法[Sambroook，etal.，1989，Molecular Cloning，a LaboratoryManual，Cold Spring HarborLaboratory，NewYork，p19-21]提取质粒进行酶切鉴定，鉴定结果如图2。鉴定阳性克隆送公司测序，测序正确的重组质粒命名为pUC-GW-HSL1b，其中克隆得到的GmHSL1b基因的编码区序列如SEQID NO.1所示。
实施例2.植物表达载体pBWA(V)BII-HSL1b-Tnos的构建
设计GmHSL1b编码区序列的同源重组引物，OE-F：aacaaacaccatgaccaaaatgcccttcaccttcgtc，OE-R：cccagtactgaagacagttgttacagatcctcttcagagatgagtttctgc，以上述引物从质粒pUC-GW-HSL1b上扩增GmHSL1b基因编码区片段。PCR反应体系如下：Nuclease-freewater 20μL，Pfu PCRMix 25μL，OE-F引物2μL，OE-R引物2μL，质粒模板1μL。
PCR反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性1min，50℃退火45s，72℃延伸155s，扩增35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离，100V恒压电泳30-40min后，用凝胶成像系统检测分析。大小正确的目标条带用DNA胶回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收。
植物表达载体pBWA(V)BII(购自武汉伯远生物科技有限公司)，经Sap I和Lgu I双酶切。酶切体系如下：Nuclease-freeWater13μL，10*Buffer2μL，Sap I 0.5μL，Lgu I 0.5μL，模板pBWA(V)BII 4μL，37℃酶切1h后用DNA胶回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收用于重组反应。重组反应体系如下：2*EASY Clone Mix 10μL，扩增的GmHSL1b片段5μL，回收的pBWA(V)BII片段5μL，37℃反应30h后转化到用CaCl2法处理的大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有卡那霉素(终浓度100μg/mL)的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含卡那霉素(终浓度100μg/mL)的LB液体培养基培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法[Sambroook，etal.，1989，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，ColdSpring HarborLaboratory，NewYork，p19-21]提取质粒。
设计鉴定引物，O-F：ATGATGACCAAAATGCCCTTCACCT；O-R：TAAAGACAAGAAAGGCACTGGCTA，进行PCR鉴定。PCR反应体系如下：Nuclease-free water 9.5μL，PCRMix 12.5μL，F引物1μL，R引物1μL，质粒模板1μL。
PCR反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性1min，54℃退火45sec，72℃延伸80sec，扩增35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离，100V恒压电泳30-40min后，用凝胶成像系统检测分析，鉴定结果如图3所示。条带正确的克隆进行测序。鉴定正确的载体命名为pBWA(V)BII-HSL-Tnos，载体图谱如图4所示。
实施例3、GmHSL1b基因编辑载体pzmpl-bar-编辑HSL的构建
基因编辑载体的构建采用武汉伯远生物科技有限公司基因编辑试剂盒完成(货号：#REC44-I)，具体操作为：选择TGAGGTTAGAGCAGTTGGAGAGG为靶点序列，设计基因编辑引物，CR-F：cagtGGTCTCatgcaTGAGGTTAGAGCAGTTGGAG，CR-R：cagtGGTCTCaaaacctccaactgctctaacctcatgcac，以pUC-GW-HSL1b为模板，扩增靶点序列。PCR反应体系如下：Nuclease-free Water20μL，Biorun Pfu PCRMix 25μL，引物CR-F 2μL，引物CR-F 2μL，模板1μL。
PCR反应程序如下：94℃5min，94℃30sec，50℃45sec，72℃16sec，72℃10min，16℃for 30min，扩增35个循环。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，5v/cm电压，20min，电泳片段在紫外灯下切取出来，进行溶胶回收，回收产物标记为：rDNAt1，检测无误后与载体进行连接。将试剂盒(武汉伯远生物科技有限公司)中各组分按照如下体系酶切连接：Nuclease-free Water 8μL，10*Buffer2μL，BsaI/Eco31I 1μL，T4ligase 1μL，pBK2-Cas9-U64μL，rDNAt14μL。酶切连接体系和反应条件如下：37℃20min，37℃10min；20℃10min，循环5次，37℃20min，80℃5min。将连接产物转化感受态细胞，将5-10μL连接产物转化大肠杆菌感受态，涂卡那霉素抗性平皿，37℃培养12h。
设计鉴定引物，Pbw2+:GCAACGCTCTGTCATCGTTACAAT，Pbw2-:gcgattaagttgggtaacgccaggg，按照如下体系进行，进行菌斑PCR鉴定：Nuclease-freeWater 9.5μL，Biorun Magic PCR Mix 12.5μL，Pbw2+1μL，Pbw2-1μL，模板1μL。PCR反应程序如下：94℃5min，94℃30s，50℃45s，72℃16s，72℃10min，16℃30min，扩增30个循环。PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离，100V恒压电泳30-40min后，用凝胶成像系统检测分析，检测结果如图5所示。取1-3个目标条带为9014bp左右的阳性质粒菌液送样测序，测序结果正确的质粒图谱如图6，命名为pzmpl-bar-编辑HSL。
实施例4、大豆遗传转化及分子检测
将构建好的植物表达载体pBWA(V)BII-HSL-Tnos和pzmpl-bar-编辑HSL分别转化至农杆菌中，具体方法为：取1μLpBWA(V)BII-HSL-Tnos或pzmpl-bar-编辑HSL质粒加入50μLEHA105农杆菌感受态细胞中，充分混匀后吸取至电转杯中，电转后加1mL LB液体培养基，充分混匀后吸取至1.5mL离心管中，于摇床30℃、180rpm振荡培养30min，将活化好的农杆菌菌液吸取50μL接种于LB固体培养基上，30℃暗培养48h。挑取农杆菌菌落，以鉴定引物OE-F/OE-R和Pbw2+/Pbw2-对过表达和基因编辑菌株进行菌落PCR鉴定。反应成分如下:LATaqpolymerase 0.5μL，GC buffer 5μL，dNTP 1.5μL，OE-F/OE-R或Pbw2+/Pbw2-引物各0.5μL，模板cDNA2μL，ddH2O 10μL。
PCR反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，扩增35个循环，72℃延伸5min，4℃保存。PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离，100V恒压电泳30-40min后，用凝胶成像系统检测分析，检测结果如图7所示。
采用农杆菌介导的方法对大豆遗传转化。挑选健壮、成熟的成熟大豆种子，使用氯气消毒法(100mL次氯酸钠(8％有效浓度)加入5mL浓盐酸)，持续灭菌16-20h。将灭过菌的种子种脐朝下接种在萌发培养基上，置于25℃培养箱，暗培养1d。制备农杆菌菌液，将携带有pBWA(V)BII-HSL-Tnos或pzmpl-bar-编辑HSL质粒的农杆菌涂布于相应培养基上进行初次活化，培养48h后收集菌体再次于新的培养基上活化。培养24h后收集菌体于浸染液(1/2MS液体，2mg/LBA，0.1mg/LNAA，100μM乙酰丁香酮，pH 5.2)中，涡旋混匀，分光光度计调整菌液OD600＝0.5待用。
将萌发好的大豆，进行划伤处理后，倒入制备好的菌液浸染10min。弃侵染液，再将外植体铺放到垫有滤纸的共培养培养基上(1/2MS固体，30g/L蔗糖，2mg/LBA，0.1mg/LNAA，100μM乙酰丁香酮，pH 5.2)，25℃避光共培养3-5d。选取共培养后长势良好无污染的外植体，切去胚轴末端，插入恢复固体培养基上(MS固体，30g/L蔗糖，2mg/LBA，0.1mg/LNAA，400mg/L头孢噻肟，pH 5.8)，恢复培养7-10d。将恢复培养后长有丛生芽的外植体接种至筛选培养基上(MS固体，30g/L蔗糖，2mg/LBA，0.1mg/LNAA，400mg/L头孢噻肟，5mg/L草铵膦，pH5.8)，16h/8h光照/黑暗培养,筛选培养21d。将经过筛选后长势良好的丛生芽，转移至新的伸长培养基中(MS固体，30g/L蔗糖，0.1mg/LNAA，400mg/L头孢噻肟，pH 5.8)，16h/8h光照/黑暗培养,筛选培养21d。待幼芽生长至约5cm时，转移至生根培养基中(MS固体，30g/L蔗糖，0.05mg/LNAA，400mg/L头孢噻肟，5mg/L草铵膦，pH 5.8)进继续筛选。16h/8h光照/黑暗培养,筛选培养21d，洗干净幼苗根上附着的培养基，移载至装盛有营养土的育苗盘中，27℃16h/8h光照/黑暗培养，炼苗3～4周，遗传转化过程如图8。采用Bar试纸法直接对转基因植物内有无bar/pat蛋白进行鉴定，有条带的为转基因阳性植株，鉴定结果如图9。将经过Bar试纸检测的阳性幼苗移出培养基栽种到温室中直至收种。
设计基因编辑植株靶点鉴定引物，BF:CCTCCGCTCATGGAAATCC、BR:ACGGCGTCTGGTTAACG。采用PCR结合测序的方法对靶点序列TGAGGTTAGAGCAGTTGGAGAGG的编辑情况进行分析。PCR结果如图10所示，可以扩增出630bp左右大小的目标条带。回收目标条带后进行TA克隆并测序。靶序列突变的纯合株系收获种子用于后续观察。
设计过表达株系表达量分析引物对过表达阳性植株中GmHSL1b基因的表达量进行分析，R1：TCCACCAGAATATGCCTATACAAC、R2：
CCCTTCCCTATAGTGCTGCC；内参基因引物如下：Gmactin1：CAGCATGAAAATCAAGGTGGT、Gmactin2：AGGGGACCTAACGGAGAAACT。提取转基因和采用RT-PCR的方法对过表达株系的表达量进行分析。反应体系如下：模板cDNA 50ng，定量或内参引物各0.5μL，dNTP 0.5μL，根据内参定量结果调整模板用量，最终ddH2O补齐至20μL。PCR反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃(内参)或58℃(GmHSL1b基因)退火1min，72℃延伸1min，扩增35个循环，72℃延伸5min，4℃保存。PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离，100V恒压电泳30-40min后，用凝胶成像系统检测分析，检测结果如图11所示。
实施例5、GmHSL1b过表达及基因编辑植株根系结构
对T2代纯合GmHSL1b过表达植株OE17-1和纯合GmHSL1b基因编辑植株CR12进行根系结构测定和观察。主根长度、侧根数量、侧根密度测量数据见表1、表2和表3。根系表型观察结果如图12A所示，过表达GmHSL1b的大豆植株OE17-1主根长度、侧根数量和密度高于野生型对照，而GmHSL1b基因编辑植株CR12主根长度、侧根数量和密度显著低于野生型对照植株。表型观察结果与根系指标统计结果相一致(图12B-12D)，说明GmHSL1b基因具有增加侧根数量，改善根系结构的功能。
表1、主根长度统计数据
表2、侧根数量统计数据
表3、侧根密度统计数据
实施例6、GmHSL1b过表达和基因编辑植株百粒重统计
在亩施氮磷钾缓释复合肥50kg的试验田中按小区播种野生型、GmHSL1b过表达和基因编辑植株，行长3m，行距60cm，株距15cm，每个小区播种20行。种子成熟后收获，自然干燥30天后随机挑选100粒种子测定百粒重，随机抽取三次，取平均值。测定数据见表4，统计分析结果如图13所示，野生型植株百粒重为6.27±0.17g，GmHSL1b过表达株系根系结构更加发达，植株百粒重较对照显著增加，达到7.41±0.09g。GmHSL1b基因编辑株系根系结构分支明显减少，种子百粒重较对照显著减少，为5.73±0.31g。
表4、不同大豆材料成熟种子百粒重
由此可知，GmHSL1b基因可以有效改善大豆根系结构，根系结构发达可有效增加种子粒重，进而提高大豆产量。
Claims (10)
1.一种大豆类受体蛋白激酶基因，其特征在于，所述的大豆类受体蛋白激酶基因命名为GmHSL1b，其编码区序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求1所述的大豆类受体蛋白激酶基因。
3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体为植物表达载体。
4.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求2或3所述的表达载体。
5.权利要求1所述的大豆类受体蛋白激酶基因在改良大豆根系结构中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的改良大豆根系结构包括提高主根长度、侧根数量和密度。
7.权利要求1所述的大豆类受体蛋白激酶基因在增加大豆种子粒重、提高大豆产量中的应用。
8.一种获得根系发达且大豆产量高的转基因大豆品种的方法，其特征在于，包括将含有权利要求1所述的大豆类受体蛋白激酶基因GmHSL1b的表达载体转化入萌发好的大豆以及筛选获得过表达该大豆类受体蛋白激酶基因GmHSL1b的大豆植株的步骤。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的转化采用的是农杆菌介导的转化法。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)GmHSL1b基因编码区序列的克隆
1)大豆栽培种东农50种子表面消毒后，播种于营养土中，28℃培养7-10天，使其长出幼嫩真叶后，收集2g鲜嫩幼根，用RNA小量提取试剂盒提取总RNA，进行反转录，得到的cDNA保存至-20℃备用；
2)设计克隆引物，F：ATGACCAAAATGCCCTTCACCTTCG；R：TTACACACTATATAAGCAGCTTTCT，以得到的cDNA为模板，用以上引物进行PCR反应，PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离，大小正确的目标条带用DNA胶回收试剂盒回收，把回收片段连接到载体pUC-GW中，鉴定阳性克隆送公司测序，测序正确的重组质粒命名为pUC-GW-HSL1b，其中克隆得到的GmHSL1b基因的编码区序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)植物表达载体pBWA(V)BII-HSL1b-Tnos的构建
1)设计GmHSL1b编码区序列的同源重组引物，OE-F：aacaaacaccatgaccaaaatgcccttcaccttcgtc，OE-R：cccagtactgaagacagttgttacagatcctcttcagagatgagtttctgc，以上述引物从质粒pUC-GW-HSL1b上扩增GmHSL1b基因编码区片段；PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离，大小正确的目标条带用DNA胶回收试剂盒回收；
2)植物表达载体pBWA(V)BII经Sap I和Lgu I双酶切后用DNA胶回收试剂盒回收用于与扩增的GmHSL1b片段进行重组反应；然后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含卡那霉素的LB液体培养基培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法提取质粒；
3)设计鉴定引物，O-F：ATGATGACCAAAATGCCCTTCACCT；O-R：TAAAGACAAGAAAGGCACTGGCTA，进行PCR鉴定，鉴定正确的载体命名为pBWA(V)BII-HSL-Tnos；
(3)大豆遗传转化
1)将构建好的植物表达载体pBWA(V)BII-HSL-Tnos转化至农杆菌中，挑取农杆菌菌落，以鉴定引物OE-F/OE-R进行菌落PCR鉴定；
2)挑选健壮、成熟的成熟大豆种子，使用氯气消毒法，持续灭菌16-20h；将灭过菌的种子种脐朝下接种在萌发培养基上，置于25℃培养箱，暗培养1d；制备农杆菌菌液，将携带有pBWA(V)BII-HSL-Tnos质粒的农杆菌涂布于相应培养基上进行初次活化，培养48h后收集菌体再次于新的培养基上活化，培养24h后收集菌体于浸染液中，涡旋混匀，分光光度计调整菌液OD600＝0.5待用；所述的浸染液含有1/2MS液体，2mg/L BA，0.1mg/LNAA，100μM乙酰丁香酮，pH 5.2；
3)将萌发好的大豆，进行划伤处理后，倒入制备好的浸染液浸染10min，弃侵染液，再将外植体铺放到垫有滤纸的共培养培养基上，25℃避光共培养3-5d；选取共培养后长势良好无污染的外植体，切去胚轴末端，插入恢复固体培养基上，恢复培养7-10d；将恢复培养后长有丛生芽的外植体接种至筛选培养基上，16h/8h光照/黑暗培养,筛选培养21d；将经过筛选后长势良好的丛生芽，转移至伸长培养基中，16h/8h光照/黑暗培养,筛选培养21d；待幼芽生长至约5cm时，转移至生根培养基中进继续筛选；16h/8h光照/黑暗培养,筛选培养21d，洗干净幼苗根上附着的培养基，移载至装盛有营养土的育苗盘中，27℃16h/8h光照/黑暗培养，炼苗3～4周；采用Bar试纸法直接对转基因植物内有无bar/pat蛋白进行鉴定；将经过Bar试纸检测的阳性幼苗移出培养基栽种到温室中直至收种；
4)通过自交获得过表达该大豆类受体蛋白激酶基因GmHSL1b的大豆纯合植株，即为根系发达且大豆产量高的转基因大豆品种；
其中，所述的共培养培养基为含有30g/L蔗糖，2mg/LBA，0.1mg/LNAA，100μM乙酰丁香酮的1/2MS固体培养基，pH 5.2；
其中，所述的恢复固体培养基为含有30g/L蔗糖，2mg/LBA，0.1mg/LNAA，400mg/L头孢噻肟的MS固体培养基，pH 5.8；
其中，所述的筛选培养基为含有30g/L蔗糖，2mg/L BA，0.1mg/LNAA，400mg/L头孢噻肟，5mg/L草铵膦的MS固体培养基，pH 5.8；
其中，所述的伸长培养基为含有30g/L蔗糖，0.1mg/LNAA，400mg/L头孢噻肟的MS固体培养基，pH 5.8；
其中，所述的生根培养基为含有30g/L蔗糖，0.05mg/LNAA，400mg/L头孢噻肟，5mg/L草铵膦的MS固体培养基，pH 5.8。
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