CN110117598B

CN110117598B - 芝麻SiKAS1基因在植物雄性不育中的应用

Info

Publication number: CN110117598B
Application number: CN201810119826.8A
Authority: CN
Inventors: 周婷; 赵应忠; 杨远霄; 刘红艳; 杨敏敏
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2018-02-07
Filing date: 2018-02-07
Publication date: 2021-05-25
Anticipated expiration: 2038-02-07
Also published as: CN110117598A

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及芝麻SiKAS1基因在植物雄性不育中的应用。本发明包括芝麻SiKAS1基因的分离克隆、载体构建、功能验证及在调控植物雄性不育中的应用。所述的芝麻SiKAS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；该基因编码的蛋白质如SEQ ID NO:2所示。本发明还公开了该基因影响拟南芥花粉发育进而导致雄性不育。

Description

芝麻SiKAS1基因在植物雄性不育中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及芝麻SiKAS1基因在植物雄性不育中的应用。本发明涉及从芝麻中分离、鉴定得到一个功能基因SiKAS1，利用该基因转化拟南芥，对该基因进行了生物学功能验证与应用。功能验证表明该SiKAS1基因能影响拟南芥花药的发育，导致拟南芥的花粉败育。利用本发明克隆的基因SiKAS1，通过遗传转化可应用于创制雄性不育植株，用于杂交育种。

背景技术

雄性生殖器官的发育是开花植物的一个重要生理过程，也是影响农作物产量的一个重要农艺性状。植株不能产生有功能的雄配子或者开裂的花药时，则导致雄性不育(Chenand Liu,2014,Male Sterility and Fertility Restoration in Crops.Annual Reviewof Plant Biology,65:579–606)。植物雄性不育既是影响作物产量的关键因子，也是作物杂种优势利用的重要途径。同时，雄性不育植株也是研究花药发育的重要材料。

花药发育是一个复杂的生物学过程，经历了一系列发育事件：雄蕊原基分化、造孢细胞的产生、花粉母细胞分化、有丝分裂、小孢子产生与成熟及授粉，涉及一系列基因以及基因与环境间的相互作用。目前对花药发育和雄性不育机理的研究主要依赖于模式植物雄性不育突变体，通过对这些突变体的研究，鉴定并克隆了一些花药发育关键基因(Ma,2005,Molecular genetic analyses of microsporogenesis and microgametogenesis inflowering plants.Annual Review of Plant Biololgy,56:393-434)。然而，在芝麻中，尚未有关花药发育基因的报道。

脂肪酸对花药的发育具有重要的作用。脂肪酸既是花粉壁的重要成分孢粉素的主要前体物质，也是蜡质和角质的重要前体物质。酮酰基载体蛋白合成酶(KASs)是脂肪酸合成的重要酶，对脂肪酸链的延伸至关重要。基于底物特异性，酮酰基载体蛋白合成酶被分为三类：KASI，KASII和KASIII(Yuan et al.,2015,Cloning and FunctionCharacterization of a β-Ketoacyl-acyl-ACP Synthase I from Coconut(Cocosnucifera L.)Endosperm.Plant Molecular Biology Reporter,33:1131–1140)。在脂肪酸合成过程中，乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化酰基辅酶A转变为丙二酰辅酶A，之后经过酮酰基载体蛋白合成酶(KASs)催化的一系列缩合反应，使碳链延伸。首先，KASIII催化起始缩合反应形成C4脂肪酸分子，随后，KASI催化脂肪酸链由C4向C16延伸，合成棕榈酰酰基载体蛋白(C16:0ACP)，最后，KASII催化最后一步缩合反应，合成硬脂酰酰基载体蛋白(C18:0-ACP)(Xiong et al.,2017,Molecular cloning and characterization of twoβ-ketoacyl-acyl carrier protein synthase I genes from Jatropha curcas L.Journal of PlantPhysiology,214:152-160)。

目前，KASI在植物生长发育中的作用以及分子机理的研究尚不清楚，只有少数物种中的KASI基因被克隆和鉴定。在拟南芥中，KASI的缺失导致极性脂质成分显著变化，导致叶片卷曲，叶色变黄，并且，KASI的缺失导致胚胎发育异常且种子中脂肪酸含量显著降低(Wu and Xue,2010,Arabidopsisβ-ketoacyl-acyl carrier protein synthase I iscrucial for fatty acid synthesis and plays a role in chloroplast division andembryo development,Plant Cell,22:3726–3744)。水稻中，KASI参与了根和种子的发育，KASI的突变导致了根长变短，根和种子中脂肪酸成分和含量显著变化(Ding et al.,2015,OsKASI,aβ-ketoacyl-acyl carrier protein synthase I,is involved in rootdevelopment in rice(Oryza sativa L.).Planta,242:203–213)。在烟草中，分离克隆了2个KASI基因，NtKASI-1和NtKASI-2。同时将这两个基因干涉后，植株表现出顶端优势缺失，茎秆发育不良以及叶片卷曲、叶绿体减少(Yang et al.,2016,β-ketoacyl-acyl carrierprotein synthase I(KASI)plays crucial roles in the plant growth and fattyacids synthesis in tobacco.International Journal of Molecular Sciences,17(8))。目前，尚未有关芝麻编码KASI基因的报道。

芝麻是我国传统的特色油料作物，具有重要的经济价值和营养价值。近年来，芝麻产量已无法满足日益增长的消费需求。因而，提高芝麻产量成为亟待解决的关键问题。杂种优势利用是作物提高产量，改善品质，增强作物抗病性的有效途径。目前，细胞核雄性不育系统是芝麻杂种优势利用的有效途径。运用细胞核雄性不育系已育成多个芝麻杂交品种，这些杂交种的产量均显著高于对照品种。因而，克隆育性相关基因，通过基因工程创制雄性不育材料，用于杂交育种，对于提高芝麻的产量具有重要的意义。

本发明通过克隆得到一种芝麻SiKAS1基因，该基因属于KASI类(家族基因)，该基因参与了花药发育，在拟南芥中超量表达SiKAS1导致花粉败育。利用本发明克隆的基因可望创制植物雄性不育材料，为杂交育种提供新的种质资源和育种材料。

发明内容

本发明的目的在于从芝麻中分离克隆一个与芝麻花药发育相关的酮酰基载体蛋白合成酶基因，通过转化拟南芥，验证其在花药发育以及花粉形成中的功能，进而用于转化芝麻，以期通过基因工程创制植物雄性不育材料，获得转基因芝麻植株，可用于芝麻的杂交育种，为芝麻杂种优势利用提供基础。

本发明的技术方案如下所述：

(1)本发明从芝麻中分离得到一个与芝麻花药发育相关的酮酰基载体蛋白合成酶基因，申请人将这个基因命名为SiKAS1，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ NO:1所示，该序列的第1-1416位所示的序列是该基因的编码区(CDS)。聚类分析表明该序列编码的蛋白属于KASI类，且与HaKASI同源度最高(图1)，故将这个基因命名为SiKAS1。根据测序验证后的该基因全长cDNA序列信息构建了该基因的超表达载体，该超表达载体含有序列表SEQ NO:2所示的氨基酸序列。

如SEQ ID NO:1所示的酮酰基载体蛋白合成酶基因SiKAS1来源于芝麻，由1416个碱基组成，推测的蛋白质编码序列为472个氨基酸，是序列SEQ ID NO:1自5’端第1位碱基到1416位碱基组成。该基因在芝麻中尚未有任何报道。通过对该基因的表达模式分析，发现该基因在营养器官和生殖器官中均有表达，并且在花药发育过程中，该基因在不育植株花药中的表达量显著高于可育植株花药中的表达量(图2)。构建该基因的超量表达载体，获得转化载体PRI101-AN-SiKAS1(图3B)，将该转化载体转化到哥伦比亚生态型拟南芥中，得到该基因的超表达转基因阳性拟南芥植株。在正常生长条件下，通过观察野生型(非转基因植株)和转基因植株的生长发育，发现转基因植株荚果瘦瘪，且荚果长度明显短于野生型(图4B中的a图-c图)。利用醋酸洋红染色分析发现，野生型植株花粉染色深，花粉形态饱满，为椭圆形(图4B中的d图)，而转基因植株的花粉染色浅，花粉变小，花粉皱缩，形态不一(图4B中的e图)。扫描电镜观察表明，可育花粉饱满，呈椭圆形或圆形，大小一致，花粉表面具有规则的立体纹饰结构(图5中的A图和图5中的B图)。转基因植株花粉皱瘪，呈不规则多边形，花粉的表面也没有规则的立体纹饰(图5中的C图和图5中的D图)。

具体操作步骤如下所述：

1)通过芝麻基因组信息，设计cDNA扩增引物SiKAS1-F和SiKAS1-R，以芝麻花药cDNA为模板，扩增SiKAS1的cDNA序列(如SEQ ID NO:1所示)。通过TA克隆的方法，将目标序列连接到PGEM-T载体上(购自Promega公司，美国)，通过测序获得无突变的阳性克隆T-SiKAS1。设计超量表达载体构建引物SiKAS1-MF和SiKAS1-MR，以获得的无突变的阳性克隆T-SiKAS1为模板进行扩增，获得带有酶切位点的目标片段，并通过TA克隆连接到PGEM-T载体上(购自Promega公司，美国)，测序获得无突变的阳性克隆T-ovSiKAS1。所用引物的DNA序列如下：

SiKAS1-F：5'-ATGCAATCCCTCCACTCCACC-3'(SEQ ID NO:3)

SiKAS1-R：5'-TCAGGGCTTGAATGCAGAAAACG-3'(SEQ ID NO:4)

SiKAS1-MF：5'-TCCCCCGGG(SmaI-一种限制性内切酶)ATGCAATCCCTCCACTCCACC-3'(SEQ ID NO:2)；

SiKAS1-MR：5'-CGAGCTC(SacI)TCAGGGCTTGAATGCAGAAAACG-3'(SEQ ID NO:3)；

2)将获得的T-ovSiKAS1质粒以及PRI101-AN载体质粒(购自宝生物工程公司,日本)(载体质粒见图3A)进行酶切连接反应，将目的基因片段连接到载体PRI101-AN上，再通过热激转化大肠杆菌感受态细胞TOP10中，获得含有目的基因的重组载体，申请人将这个重组载体命名为植物重组载体PRI101-AN-SiKAS1(载体构建图见图3B)。利用农杆菌介导的转基因方法，将所述的载体导入拟南芥中，获得转化植株。

3)借助卡那霉素抗性筛选及分离比统计的方法获得转基因阳性纯合植株，通过RT-PCR的方法，检测转基因植株的表达量，鉴定转基因植株的表型。

4)通过醋酸洋红染色法鉴定野生型植株花粉和转基因植株的花粉育性。

5)取生长7周的SiKAS1超表达转基因阳性植株和野生型植株的花粉，通过扫描电镜观察花粉的形态。

本发明的优点在于：

本发明克隆的SiKASI基因可影响花粉发育，超量表达SiKAS1导致花粉败育，因此能够利用基因工程技术的方法有目的创制植物雄性不育植株，可用于植物杂交育种，并能用于研究花药发育的分子机制。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是本发明分离克隆SiKAS1基因的核苷酸序(1-1416bp，)，其中该序列的1-1416bp是ORF(编码阅读框，即CDS)，该基因对应的氨基酸序列是该序列1-1416bp所示的序列。该基因编码472个氨基酸残基。

序列表SEQ ID NO:2是SiKAS1基因编码的蛋白质。

序列表SEQ ID NO:3是扩增SiKAS1基因的正向引物(SiKAS1-F)序列。

序列表SEQ ID NO:4是扩增SiKAS1基因的反向引物(SiKAS1-R)序列。

序列表SEQ ID NO:5是扩增超量表达载体的正向引物(SiKAS1-MF)序列。

序列表SEQ ID NO:6是扩增超量表达载体的反向引物(SiKAS1-MR)序列。

图1：采用ClustalW软件和MEGA4.0软件(公开使用软件)对SiKAS1编码序列与其它物种中的KASI和KASII类基因以及脂肪酸合酶基因(FAS)聚类分析的结果。通过聚类分析表明，SiKAS1属于KASI类，且与向日葵中的HaKASI同源性最高，申请人将该基因命名为SiKAS1。

图2：利用RT-PCR的方法检测SiKAS1基因的组织表达模式以及在芝麻可育植株与不育植株花药不同发育时期中的表达模式。附图标记说明：图2A为SiKAS1在芝麻根、茎、花蕾、叶中的表达情况；图2B为SiKAS1在芝麻可育植株与不育植株花药不同发育时期中的表达分析。通过表达分析表明：SiKAS1在芝麻不育植株花药发育过程中为异常表达，且SiKAS1在芝麻不育植株花药中的表达量高于芝麻可育植株花药中的表达量。

图3：构建超表达载体所用的起始载体。附图标记说明：图3A为本发明所使用的超量表达载体pRI101-AN的示意图；图3B为本发明所使用的超量表达载体pRI101-AN的构建示意图。

图4：SiKAS1超量表达转基因拟南芥的表达量及表型示意图。附图标记说明：在图4中：图4A为RT-PCR检测转基因拟南芥植株的表达量。其中，左起第一个泳道为SiKAS1在野生型植株中的表达，第二至第四个泳道为SiKAS1在三个不同超表达家系中的表达。以拟南芥Atactin2作为内参对照。图4B中的a图为生长7周的野生型拟南芥和转基因拟南芥的表型图，其中左边为野生型拟南芥植株，右边为超量表达转基因拟南芥植株。图4B中的b图为野生型拟南芥植株的荚果，图4B中的c图为超量表达转基因拟南芥植株荚果。图4B中的d图为野生型花粉醋酸洋红染色图，图4B中的e图为超量表达转基因拟南芥花粉醋酸洋红染色图。

图5：SiKAS1超量表达导致花粉败育。附图标记说明：图5中的A图，图5中的B图为野生型拟南芥成熟花粉扫描电镜图。图5中的C图，图5中的D图为转基因拟南芥成熟花粉扫描电镜图。

具体实施方式

以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离克隆包含有SiKAS1基因完整编码区段的核苷酸片段，以及验证SiKAS1基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。

实施例1 SiKAS1基因的分离克隆及表达模式分析

A.芝麻不同组织的总RNA的提取及cDNA的获得

RNA的提取采用Trizol试剂盒(购自Invitrogen公司，美国)，以芝麻隐性细胞核雄性不育系95ms-5(Zhao et al.,2013,Characterization and genetic mapping of anovel recessive genic male sterile gene in sesame(Sesamum indicum L；该生物材料同时在专利申请公开说明书中公开：申请人华中农业大学，专利申请号2016105286108；中国发明专利申请公报，第32卷，2602期，2017年06月30日公布).Mol Breeding,32:901-908)为材料，提取根、茎、花蕾、叶各组织样品的RNA以及95ms-5可育植株与不育植株四分体时期、小孢子时期和成熟花粉时期的花药样品的RNA，利用反转录酶SuperscriptⅢ(购自Invitrogen公司，美国)将其反转录合成cDNA，反应条件为：65℃5min，50℃ 60min，70℃10min。

B.SiKAS1基因的分离克隆

通过芝麻基因组数据库(http://ocri-genomics.org/Sinbase_v2.0/)，设计SiKAS1的cDNA扩增引物，引物序列为5'-ATGCAATCCCTCCACTCCACC-3'和SiKAS1-R：5'-TCAGGGCTTGAATGCAGAAAACG-3'。以95ms-5不育植株成熟花粉时期的花药cDNA为模板，通过PCR扩增SiKAS1的cDNA序列。通过TA克隆的方法，将目标序列连接到PGEM-T载体(购自Promega公司，美国)上，并通过测序获得无突变的阳性克隆T-SiKAS1，其序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

C.SiKAS1的表达模式分析

以上述反转录合成的根、茎、花蕾、叶的cDNA以及可育植株与不育植株四分体时期、小孢子时期和成熟花粉时期的花药cDNA为模板，采用RT-PCR检测SiKAS1的表达模式，所用引物为：SiKAS1-RT-F：(5'-CCAAGAAGCGGGTTGTTATCAC-3')和SiKAS1-RT-R：(5'-GTAAGACCGCCCATTCCTGTTC-3')。同时用引物SiUbiquitin6-F：(5'-CACCAAGCCGAAGAAGATCAAG-3')和SiUbiquitin6-R：(5'-CCTCAGCCTCTGCACCTTTC-3')对芝麻SiUbiquitin6(GenBank登陆号：JP631638)基因做特异扩增，作为内参对照进行相对定量分析。结果表明：SiKAS1基因在茎、叶以及花蕾中表达，(见图2A)。并且，SiKAS1在不育植株花药发育过程中异常表达，且在不育植株花药中的表达量高于可育植株(见图2B)。

实施例2：SiKAS1基因植物超量表达载体的构建

根据得到的SEQ ID NO:1的核苷酸序列设计引物用于构建表达载体，具体步骤是在引物两端分别加上酶切位点，所述的引物序列分别为SiKAS1-MF：5'-TCCCCCGGG(SmaI)ATGCAATCCCTCCACTCCACC-3'和SiKAS1-MR：5'-CGAGCTC(SacI)TCAGGGCTTGAATGCAGAAAACG-3'，以T-SiKAS1质粒为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为：10×buffer 2μl；dNTP 0.4μl；正，反向引物(上，下游引物)各0.2μM；pfu聚合酶0.2μl，加ddH₂O补足至20μl体系。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，共28个循环；72℃延伸至7min，PCR产物经TA克隆连接到PGEM-T载体上，连接产物经热激转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，以SiKAS1的特异引物SiKAS1-MF：5'-TCCCCCGGG(SmaI)ATGCAATCCCTCCACTCCACC-3'和SiKAS1-MR：5'-CGAGCTC(SacI)TCAGGGCTTGAATGCAGAAAACG-3'进行PCR检测来挑取阳性克隆，并活化提取质粒。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，25个循环；72℃延伸7min。通过测序获得无突变的阳性克隆T-ovSiKAS1。将T-ovSiKAS1和表达载体pRI101-AN(宝生物工程公司，日本)分别用SmaI和SacI限制性内切酶(购自宝生物工程大连有限公司)进行双酶切，酶切反应体系为：10×Fastdigest Buffer 2μl，DNA 1μg，SmaI和SacI各1μl，加ddH₂O至20μl，充分混匀后，于37℃恒温箱中放置1h，随后将酶切产物分别通过凝胶电泳检测，并使用DNA凝胶回收试剂盒(购自Axygen公司，美国)分别回收目的基因片段(目标片段为小片段)和目的载体片段(目标片段为大片段)，后将回收后的目标基因片段与目的载体片断进行连接反应，连接反应体系为：按目的载体片段100ng，目标基因片段50ng，加入10×T4连接酶Buffer 2μl，T4连接酶1μl(购自Thermo公司，美国)，无菌水补充至20μl混匀，22℃10min后，于4℃过夜连接反应。然后通过常规热激法转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，以SiKAS1的特异引物SiKAS1-MF：5'-TCCCCCGGG(SmaI)ATGCAATCCCTCCACTCCACC-3'和SiKAS1-MR：5'-CGAGCTC(SacI)TCAGGGCTTGAATGCAGAAAACG-3'进行PCR检测来挑取阳性克隆，将阳性克隆进行测序。PCR反应体系为：10×buffer 2μl；dNTP 0.4μl；上下游引物各0.2μM；Taq聚合酶0.2μl，加ddH2O补足至20μl体系。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃ 30sec，55℃30sec，72℃1min，25个循环；72℃延伸7min。确定为阳性的克隆即为获得了用于转化的重组载体PRI101-AN-SiKAS1(图3B)。

将构建的PRI101-AN-SiKAS1载体转化农杆菌菌株GV3101(Roger et al.,2000,Aguide to Agrobacterium binary Ti vectors.Trends in Plant Sci,5,1360-1385)，挑取单菌落接于含50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的LB液体培养基中于150rpm、28℃摇48h，按菌液和甘油体积比1：1加入1.5mL离心管混匀，-70℃保存。再通过农杆菌介导的转化方法转化拟南芥。

以上及以后所述的LB培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L；用5mM NaOH调pH＝7.2；用蒸馏水定容至1L；在高温121-125℃高压灭菌15-20min。LB固体培养基为每升加入8g琼脂。

实施例3 SiKAS1基因的遗传转化及筛选鉴定

A.拟南芥的准备

供试材料为野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana L.Columbia ecotype)。野生型拟南芥种子经过春化处理(按照常规方法)后点播入拟南芥种植专用营养土(商品营养土名称：培蕾，购自江苏镇江)并放入人工培养室(16小时光照，22±2℃)等拟南芥长到4叶左右进行定苗，以控制拟南芥的生长密度。待拟南芥生长6周左右开始开花时即可转化，转化前一天给拟南芥浇足水。

B.农杆菌的活化

从超低温冰箱内取出保存的含有目标基因(即本发明克隆的SiKAS1基因)的GV3101菌株的甘油管在冰上融化，后于含50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，28℃暗培养36-48h，待皿内长出清晰的单菌落，挑取单菌落在加50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养(26.5℃，100rpm)，其OD₆₀₀＝0.8-1.0时即可用于转化；

将菌液转移到离心管中5000rpm离心5min，弃上清培养基。加入100ml浓度为5％(W/V)的蔗糖溶液，重悬农杆菌GV3101，在28℃摇床中复苏1-2h。加入表面活性剂0.05％(V/V)Silwet L-77，震荡摇混匀。

C.农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥及转基因拟南芥的筛选

农杆菌介导的花器浸醮法转化拟南芥的转化方法和程序参照参考(Zhang etal.,2006,Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana usingthe floral dip method.Nature Protocols,1,641-646)。具体步骤如下：

(1)将拟南芥花器浸入农杆菌悬液，并轻轻搅动约30s，用纸巾吸掉过多的菌液，并用黑色塑料袋将拟南芥植株包裹起来，保湿避光处理24h。

(2)将塑料袋逐渐揭开透气，正常培养。

(3)一个星期之后重复上述(1)的操作。

(4)待种子成熟可以停止浇水并收获种子，即T₀代种子。

(5)将收获的种子消毒：先用70％(V/V)乙醇浸泡1min，在上述处理时要不时地使种子悬浮；然后用无菌水洗四次。

(6)处理后的种子用Top agar(0.1％(W/V)琼脂水溶液)均匀涂布在含卡那霉素的拟南芥生长培养基(含有100mg/L卡那霉素的1/2MS培养基)表面。

(7)4℃春化3天，移入培养室培养10天后，共选取具有卡那霉素抗性植株20株；

(8)将20株转基因T₁代拟南芥植株移栽到土壤培养，待成熟后按单株收取种子，即T₁代种子。

(9)将收取的T₁代种子按操作步骤(5)-(6)进行操作1次。

(10)4℃春化处理3天，正常培养10天后计算具有卡那霉素抗性植株与非抗性植株的分离比例，并进行统计分析。

(11)将符合抗性与非抗性植株的分离比为3:1的株系选为单拷贝株系，并移栽至土壤中培养，成熟后按单株收取种子，即为T₂代种子。

D.转基因拟南芥植株的纯系检测

将收取的T₂代种子按实施例3中农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥及转基因拟南芥筛选的操作步骤(5)-(6)操作1次；然后在4℃春化处理3天，移入培养室培养10天后查看转基因植株在固体筛选培养基(含有100mg/L卡那霉素的MS培养基)上是否发生抗性分离，不发生抗性分离的株系即认为是转基因纯系，用作下一步表型分析和功能鉴定。

实施例4：转基因拟南芥的表达分析

(1)收集T₃代拟南芥植株的地上部分以提取RNA，RNA的抽提采用Trizol试剂盒(购自Sigma公司，美国)(具体操作步骤见该试剂盒的说明书)。

(2)以3μg总RNA为模版合成cDNA，与1μl 500μg/ml oligo-dT(15)引物(购自Promega公司，美国)，1μl 10mM dNTP，DEPC水混合，总体积为12μl；然后65℃变性5min后冰上骤冷；再加入8μl含有4μl RT buffer，2μl 0.1M dithiothreitol，40units of

Ribonuclease Inhibitor(购自Promega公司，美国)，和200units of SuperscriptⅢ反转录酶(购自Invitrogen公司，美国)的混合液；50℃温浴1h合成第一链；反应结束后75℃处理15min使SuperscriptⅢ反转录酶失活。每份cDNA稀释到200μl后-20℃保存待用。

(3)以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物SiKAS1-F和SiKAS1-R对SiKAS1基因进行特异的PCR扩增(扩增产物长1416bp)。同时用拟南芥Atactin2(GenBank登陆号：NM_179953)基因作为内参基因做特异扩增(扩增产物长216bp)。PCR反应体系的总体积为20μl，DNA模板1μl(约50ng)、1×Taq酶反应缓冲液、25mM MgCL₂ 1.2μl、2mM dNTP 1.5μl、10μM引物0.2μl、0.3单位Taq酶，加ddH₂O至20μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃30s、55℃30s、72℃30s 30cycles，72℃延伸5min。获得的PCR产物取10μl以0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。

所用引物：

SiKAS1-F：5'-ATGCAATCCCTCCACTCCACC-3'

SiKAS1-R：5'-TCAGGGCTTGAATGCAGAAAACG-3'

Atactin-f：5'-CACTGTGCCAATCTACGAGGGT-3'

Atactin-r：5'-CACAAACGAGGGCTGGAACAAG-3'

实施例5：SiKAS1转基因拟南芥的表型鉴定及功能验证

A.SiKAS1转基因拟南芥的表型鉴定

将野生型(简称WT)和超表达家系的T₃代植株种于拟南芥种植专用营养土(商品营养土名称培蕾，产地：江苏，镇江)并放入人工培养室(16h光照，22±2℃)。通过与野生型芝麻植株相比，观察转基因植株整个发育期的地上部分表型。待植株生长7周，拍照。

B.醋酸洋红染色

取转基因植株和野生型植株各3朵当天开放的花朵，于载玻片上分离出花粉，采用0.5％醋

酸洋红染色花粉。每朵花观察3个视野。其中：饱满、暗红色的计为正常(可育)花粉；

瘦小、染色浅或未染上色的计为不育花粉。

C.利用扫描电镜观察芝麻的花粉形态

分别取转基因芝麻植株和野生型芝麻植株上各5朵成熟花的花药，用2.5％戊二醛固定，抽真空，各级酒精梯度脱水，每次30min。酒精梯度依次为30％、50％、70％、80％、90％、100％乙醇(共处理两次)。然后用液态CO₂进行临界点干燥法干燥(为常规方法)，将干燥的样品用导电性很好的粘合剂粘在金属品台上，用离子溅射镀膜机喷镀金属。最后在JSM-6390扫描电子显微镜下观察花药、花粉并拍照。

说明：在本说明书中，所述的上，下游引物与正，反向引物的指代定义相同。

序列表

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 芝麻SiKAS1基因在植物雄性不育中的应用

<141> 2018-01-26

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<211> 1416

<212> DNA

<213> 芝麻(Sesamum indicum)

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<221> gene

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<221> CDS

<222> (1)..(1416)

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atg caa tcc ctc cac tcc acc tcc ctc cgc cct tcc ccc ctc gac cgc 48

Met Gln Ser Leu His Ser Thr Ser Leu Arg Pro Ser Pro Leu Asp Arg

1 5 10 15

ctc cgc cga cct cgc cgc tcc acc atc ttt ccg gga aac aat gcc aag 96

Leu Arg Arg Pro Arg Arg Ser Thr Ile Phe Pro Gly Asn Asn Ala Lys

20 25 30

cct ccc cct caa agg ctc ccc ttc aaa gtc tcc tcc tcc gcc gtc acc 144

Pro Pro Pro Gln Arg Leu Pro Phe Lys Val Ser Ser Ser Ala Val Thr

35 40 45

gcg gcc ccc aag cgc gag act gac ccc aag aag cgg gtt gtt atc acg 192

Ala Ala Pro Lys Arg Glu Thr Asp Pro Lys Lys Arg Val Val Ile Thr

50 55 60

ggc atg ggt cta gtg tcg gtg ttc gga aac gat gtg gac gtg tac tac 240

Gly Met Gly Leu Val Ser Val Phe Gly Asn Asp Val Asp Val Tyr Tyr

65 70 75 80

gag aag ctg ctg agt ggg gag agc ggc atc act cta ata gat aga ttc 288

Glu Lys Leu Leu Ser Gly Glu Ser Gly Ile Thr Leu Ile Asp Arg Phe

85 90 95

gat gct tct aag ttc ccg acg cgc ttc ggc ggg cag att cgg ggg ttc 336

Asp Ala Ser Lys Phe Pro Thr Arg Phe Gly Gly Gln Ile Arg Gly Phe

100 105 110

aaa gcg gag gga tac att gac ggg aag aat gat cgt agg ttg gat gat 384

Lys Ala Glu Gly Tyr Ile Asp Gly Lys Asn Asp Arg Arg Leu Asp Asp

115 120 125

tgt ttg aga tac tgc att gtt gca ggg aaa aag gcg ctt gag ggt gcg 432

Cys Leu Arg Tyr Cys Ile Val Ala Gly Lys Lys Ala Leu Glu Gly Ala

130 135 140

gat ctc ggg ggt gac aag ctt gac aag ata gat aag att cgc gct ggt 480

Asp Leu Gly Gly Asp Lys Leu Asp Lys Ile Asp Lys Ile Arg Ala Gly

145 150 155 160

gtt ctg att gga aca gga atg ggc ggt ctt acg gtt ttc tcc gat ggt 528

Val Leu Ile Gly Thr Gly Met Gly Gly Leu Thr Val Phe Ser Asp Gly

165 170 175

gtt cag gct cta ata gag aaa ggt cac agg aaa ata act cca ttt ttc 576

Val Gln Ala Leu Ile Glu Lys Gly His Arg Lys Ile Thr Pro Phe Phe

180 185 190

ata cct tat gcc atc aca aac atg gca tct gcc ttg ctt gct att gat 624

Ile Pro Tyr Ala Ile Thr Asn Met Ala Ser Ala Leu Leu Ala Ile Asp

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ctt ggc ttt atg ggg cca aat tat tca att tca act gct tgt gct acc 672

Leu Gly Phe Met Gly Pro Asn Tyr Ser Ile Ser Thr Ala Cys Ala Thr

210 215 220

tcg aat tat tgc ttc tat gcc gct gca aat cac atc cgt cgg ggt gaa 720

Ser Asn Tyr Cys Phe Tyr Ala Ala Ala Asn His Ile Arg Arg Gly Glu

225 230 235 240

gct gat ttg atg att gct ggt gga act gaa gct gct att att ccc att 768

Ala Asp Leu Met Ile Ala Gly Gly Thr Glu Ala Ala Ile Ile Pro Ile

245 250 255

gga ttg ggt ggt ttt gtt gca tgc aga gct ttg tct caa aga aat gat 816

Gly Leu Gly Gly Phe Val Ala Cys Arg Ala Leu Ser Gln Arg Asn Asp

260 265 270

gac ccc caa act gct tct agg ccc tgg gac aaa gac cga gat ggt ttt 864

Asp Pro Gln Thr Ala Ser Arg Pro Trp Asp Lys Asp Arg Asp Gly Phe

275 280 285

gtt atg ggt gaa ggt gct gga gtg ttg gtg ctg gaa agt ttg gaa cat 912

Val Met Gly Glu Gly Ala Gly Val Leu Val Leu Glu Ser Leu Glu His

290 295 300

gct atg aaa cga ggg gca cca ata att gct gaa tac ttg gga ggt gca 960

Ala Met Lys Arg Gly Ala Pro Ile Ile Ala Glu Tyr Leu Gly Gly Ala

305 310 315 320

gtt aat tgt gat gct tat cat atg act gat cct aga tct gat gga ctt 1008

Val Asn Cys Asp Ala Tyr His Met Thr Asp Pro Arg Ser Asp Gly Leu

325 330 335

ggt gta tct tca tgt atc cag agt gca ctt gaa gat gct ggt gtt tca 1056

Gly Val Ser Ser Cys Ile Gln Ser Ala Leu Glu Asp Ala Gly Val Ser

340 345 350

cct gag gag gtg aac tac ata aac gcc cat gca act tcc acc ata gtt 1104

Pro Glu Glu Val Asn Tyr Ile Asn Ala His Ala Thr Ser Thr Ile Val

355 360 365

ggt gat tta gct gag gta aat gct att aag aag gta ttc aag aac aca 1152

Gly Asp Leu Ala Glu Val Asn Ala Ile Lys Lys Val Phe Lys Asn Thr

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tca gaa atc aag ata aat gca acg aag tca atg ata ggg cac tgt ctt 1200

Ser Glu Ile Lys Ile Asn Ala Thr Lys Ser Met Ile Gly His Cys Leu

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ggt gct gct ggt ggt tta gaa gct att gca aca gtg aaa gcc att aca 1248

Gly Ala Ala Gly Gly Leu Glu Ala Ile Ala Thr Val Lys Ala Ile Thr

405 410 415

acg ggc tgg ctt cat cct acc att aat caa ttt agc gca gag cct tct 1296

Thr Gly Trp Leu His Pro Thr Ile Asn Gln Phe Ser Ala Glu Pro Ser

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gtg gag ttt gat act gtt gca aat aaa aag cag gag cat gaa gtc aat 1344

Val Glu Phe Asp Thr Val Ala Asn Lys Lys Gln Glu His Glu Val Asn

435 440 445

gtt gct att tca aat tct ttt gga ttt ggt gga cac aac tct gtt gtc 1392

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gcg ttt tct gca ttc aag ccc tga 1416

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<212> PRT

<213> 芝麻(Sesamum indicum)

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1 5 10 15

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Pro Pro Pro Gln Arg Leu Pro Phe Lys Val Ser Ser Ser Ala Val Thr

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Glu Lys Leu Leu Ser Gly Glu Ser Gly Ile Thr Leu Ile Asp Arg Phe

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115 120 125

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130 135 140

Asp Leu Gly Gly Asp Lys Leu Asp Lys Ile Asp Lys Ile Arg Ala Gly

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Val Gln Ala Leu Ile Glu Lys Gly His Arg Lys Ile Thr Pro Phe Phe

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Ala Met Lys Arg Gly Ala Pro Ile Ile Ala Glu Tyr Leu Gly Gly Ala

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Gly Ala Ala Gly Gly Leu Glu Ala Ile Ala Thr Val Lys Ala Ile Thr

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cgagctctca gggcttgaat gcagaaaacg 30

Claims

1.芝麻SiKAS1基因过表达在植物雄性不育中的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.芝麻SiKAS1基因过表达在植物雄性不育中的应用，其特征在于，所述基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。

3.权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的应用植物是拟南芥。