CN110467657B - 柱型苹果MdCoL基因在提高植物抗逆性中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了柱型苹果MdCoL基因在提高植物抗逆性中的应用。本发明研究证明，MdCoL的转基因烟草幼苗和转基因苹果愈伤组织表现出更强的盐胁迫耐受性和对ABA更低的敏感性，具体表现为与WT相比：叶绿素含量升高，ROS积累减少，SOD活性升高，MDA含量降低，转录水平的应激相关基因如MdP5CS，MdRD22，MdDREB2，和MdNCED3升高。本发明为抗逆性植物培育提供了一种新途径，对探究MdCoL的功能，揭示柱型苹果柱型性状形成具有重要意义，并为柱型苹果的分子育种提供了重要的参考依据。

Description

柱型苹果MdCoL基因在提高植物抗逆性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体说是一种柱型苹果MdCoL蛋白及其编码基因在提高植物抗盐及ABA胁迫中的应用。

背景技术

柱型(Columnar)苹果(Malus×domestica Borkh)生长紧凑，节间短，它的腋芽萌发为大量的结果短枝。极少或没有侧生长延长新梢，树型呈现单独直立主干的性状，这种树型特别适合高密度种植且能减少人工劳动力，基本不需要果树修剪，更有利于机械化管理，另外柱型苹果还具有叶面积较大，叶片较厚、叶绿素含量高等特点，这样不但可以增强对光能的吸收和利用，而且可以一定程度上提高植株的抗性。高度密植的树型推广种植将会极大节省劳动力和生产成本，符合苹果省力化栽培的发展要求。

柱型性状是符合提高经济效益、省力化优化管理的优良性状，符合目前农业栽培管理模式的发展趋势。柱型苹果不仅能契合现代都市农业的发展趋势，而且可以满足家庭庭院栽培、阳台盆栽等景观绿化观赏，是值得推广的特色树种。有研究表明，苹果柱型性状是由显性柱型基因(Co)控制的质量性状，Co基因的表达受到一个或几个修饰基因共同作用的影响。通过Wolters等人(2013)对Co基因区域的精细定位，分析了插入片段周围50kb区域内的6个预测基因(MdCo27-32)的表达模式，发现与‘旭’相比在‘威赛克’的Co区域1969bp位置上存在一个编码20G-Fe(II)氧化酶的基因MdCoL(MdCo31)的表达是上调的，并将MdCoL(MdCo31)基因转到拟南芥中，得到了节间短、生长紧凑的性状表型，因此认为MdCoL(MdCo31/dmr-like)是调控柱型苹果性状形成的关键基因。

目前，对于MdCoL的功能研究并不深入，尚未有研究表明MdCoL与抗逆性尤其是与耐盐性相关。

发明内容

本发明的目的在于提供柱型苹果MdCoL基因在提高植物抗逆性中的应用，本发明为抗逆性植物培育提供了一种新途径，对探究MdCoL的功能，揭示柱型苹果柱型性状形成具有重要意义，并为柱型苹果的分子育种提供了重要的参考依据。

一方面，本发明提供了柱型苹果MdCoL蛋白或其编码基因在提高植物抗逆性中的应用。

另一方面，本发明还提供了一种提高植物抗逆性或培育抗逆性植物的方法，包括提高目的植物中柱型苹果MdCoL的蛋白表达水平或mRNA转录水平的步骤。

在一种优选的实施方式中，所述方法包括向所述目的植物中导入所述柱型苹果MdCoL蛋白的步骤。

在一种优选的实施方式中，所述导入通过含有重组载体的根癌农杆菌进行，所述重组载体上含有所述柱型苹果MdCoL蛋白的编码基因；

优选的，所述重组载体为在植物表达载体pRI101的多克隆位点处插入所述柱型苹果MdCoL蛋白的编码基因；

优选的，所述根癌农杆菌为根癌农杆菌EHA105。

在一种优选的实施方式中，所述提高植物抗逆性或抗逆性植物包括如下1)-7)变化中的至少一种：

1)盐或ABA胁迫下的种子萌发数量增多；

2)盐或ABA胁迫下的植株根长较长；

3)盐或ABA胁迫下的绿色植株数量或植株叶绿素含量增多；

4)盐或ABA胁迫下的愈伤组织生长较快或体积和/或重量较大；

5)盐或ABA胁迫下的抗氧化能力提高，优选为活性氧(ROS)积累减少和/或SOD活性升高；

6)盐胁迫下的膜系统受损程度降低，优选为膜脂过氧化降低，更优选MDA含量降低；

7)盐胁迫下的MdP5CS、MdRD22、MdDREB2和/或MdNCED3基因表达升高。

在一种优选的实施方式中，所述柱型苹果MdCoL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

在一种优选的实施方式中，所述柱型苹果MdCoL蛋白的编码基因如SEQ ID No.2所示。

在一种优选的实施方式中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选双子叶植物，更优选烟草和苹果。

在一种优选的实施方式中，所述抗逆性包括抗盐性、和/或抗ABA胁迫性。

本发明研究证明：

1、在盐胁迫诱导下的柱型苹果和普通型苹果中，MdCoL在柱型苹果中具有更高的耐盐性。MdCoL的转基因烟草幼苗和转基因苹果愈伤组织表现出更强的盐胁迫耐受性和对ABA更低的敏感性。

2、盐处理2周后MdCoL转基因烟草的叶绿素含量高于野生型烟草；在组织化学染色中MdCoL转基因苹果愈伤组织在胁迫条件下表现出比WT少的ROS积累，体现出更高的抗氧化能力；在盐胁迫下，MdCoL转基因烟草和转基因苹果愈伤组织表现出比WT更高的SOD活性和较低的MDA含量，即MdCoL减少了植物在盐胁迫下的损伤，降低了对ABA的敏感程度。

3、过表达MdCoL显著增加盐胁迫条件下转基因烟草和转基因苹果愈伤组织中转录水平的应激相关基因如MdP5CS，MdRD22，MdDREB2，和MdNCED3。

总之，本发明研究证明MdCoL可以提高植物抗逆性尤其是盐胁迫耐受性。

附图说明

图1为NaCl对柱型苹果和普通型苹果中MdCoL基因表达的影响。

图2为转基因烟草和野生型烟草对NaCl、ABA处理的敏感性。

图3为NaCl、ABA处理对转基因烟草和野生型烟草的根长表型影响。

图4为NaCl、ABA处理对转基因烟草和野生型烟草的叶绿素含量影响。

图5为转基因苹果愈伤组织和野生型苹果愈伤组织对NaCl、ABA处理的敏感性。

图6为NaCl、ABA处理对转基因烟草和转基因苹果愈伤组织中MDA含量影响。

图7为NaCl、ABA处理对转基因烟草和转基因苹果愈伤组织中SOD活性影响。

图8为NaCl处理对柱型苹果和普通型苹果中相关胁迫基因表达的影响。

图9为NaCl处理对转基因苹果愈伤组织和野生型苹果愈伤组织中相关胁迫基因表达的影响。

图中，*代表两组结果相比差异显著(p＜0.05)，**代表两组结果相比差异极显著(p＜0.01)，***代表两组结果相比差异极显著(p＜0.001)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、柱型苹果MdCoL蛋白及其编码基因获得

提取柱型苹果‘威赛克旭’的总RNA，反转录获得cDNA，以该cDNA为模板，进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，得到SEQ ID No.2所示的DNA片段。SEQ ID No.2所示的DNA编码SEQ ID No.1所示的柱型苹果MdCoL蛋白。

实施例2、柱型苹果MdCoL蛋白的编码基因导入植物

1、将SEQ ID No.2所示的DNA片段连接到植物表达载体pRI101的多克隆位点处，经测序验证，获得重组载体pRI101-MdCoL。

2、将重组载体pRI101-MdCoL转化根癌农杆菌EHA105(TaKaRa公司产品)，经质粒提取、菌落PCR证实，获得含有重组载体pRI101-MdCoL的重组农杆菌。

3、转基因烟草的获得

将含有重组载体pRI101-MdCoL的重组农杆菌侵染野生型本生烟草(Nicotianabenthamiana)，经基因组水平的PCR检测，获得含有SEQ ID No.2所示DNA片段的T0代转基因烟草。

将T0代转基因烟草进行连续自交，同时使用PCR检测每代烟草的基因组DNA，最后获得含有SEQ ID No.2所示的DNA片段为阳性纯合的转基因烟草株系若干，用于后续实验。

4、转基因苹果愈伤组织的获得

将含有重组载体pRI101-MdCoL的重组农杆菌侵染野生型‘王林’苹果(Malusdomestica)愈伤组织，经基因组水平的PCR检测，获得含有SEQ ID No.2所示DNA片段的T0代转基因‘王林’苹果愈伤组织。

将T0代转基因‘王林’苹果愈伤组织进行连续继代培养，同时使用PCR检测每代愈伤组织的基因组DNA，最后获得含有SEQ ID No.2所示的DNA片段为阳性纯合的转基因‘王林’苹果愈伤组织系若干，用于后续实验。

实施例3、NaCl处理影响苹果中MdCoL基因的表达水平

MdCoL是调节柱型性状的关键基因，为了研究MdCoL在响应盐胁迫中的作用，通过qRT-PCR检测了柱型苹果‘威赛克旭’(Wi)和普通型苹果‘旭’(Mc)中MdCoL基因对盐胁迫的表达情况。

结果：如图1所示，在盐胁迫下MdCoL表达量升高，在柱型苹果中处理24h后达到峰值，随着时间推移表达量有所下降。在无盐胁迫的情况处理下，MdCoL基因的表达水平相似，无明显差异，但是MdCoL基因在柱型苹果中表达量仍高于普通型苹果。

上述盐胁迫的处理方法如下：

利用100mM NaCl处理柱型苹果Wi和普通型苹果Mc的组培苗，处理12h、24h、48h后，取样并用液氮冻样后放到超低温冰箱(-80℃)中保存待用，以正常培养基培养的植株为对照组。

上述qRT-PCR检测MdCoL使用的引物(5’-3’)为：

MdCoL-F：ATGGAGACATTAGATCAGAA(SEQ ID No.3)；

MdCoL-R：GCTACTCGAGAGGCTTAAAA(SEQ ID No.4)。

实施例4、MdCoL的异源表达提高了转基因烟草的抗逆性

1、将实施例2步骤3获得的转基因烟草(L4、L5和L15)和野生型烟草(WT)的种子播种于灭菌土壤中，于恒温培养箱中，在每天光照16h黑暗8h、温度25℃的条件下培养，一周后发芽，每隔2天喷洒100mM的NaCl，定期观察。

结果：野生型烟草一段时间后全部死亡，而转基因烟草虽受到了一定的胁迫损伤，但是仍有保持生长活力的幼苗(图2A)。

2、将实施例2步骤3获得的转基因烟草(L4、L5和L15)和野生型烟草(WT)的种子播种于含有100mM NaCl的1/2MS和10μM ABA的MS培养基中，同时以播种于正常培养基为对照，于恒温培养箱中，在每天光照16h黑暗8h、温度25℃的条件下培养，一周后观察种子的发芽情况，并在播种15天后对野生型烟草和转基因烟草表现出的表型差异拍照记录。

结果：在100mM NaCl和10μM ABA胁迫下，野生型烟草和转基因烟草植株表现出不同程度的对胁迫的抵制作用，转基因烟草株系的种子萌发略多于野生型烟草，野生型烟草植株表现出严重的萎蔫和枯黄，但转基因植株仍保持鲜绿(图2B)。

步骤1和2的结果说明：MdCoL能够提高转基因烟草的抗逆能力。

3、根长表型测定

取经步骤2培养时间相同的野生型烟草和转基因烟草，观察根长表型，结果：播种于正常培养基(对照)的野生型烟草和转基因烟草的根长等长，无差异(图3A)，经NaCl和ABA处理后的转基因烟草的根长明显大于野生型烟草(图3B和图3C)，且差异显著(图3D)。

4、叶绿素含量测定

取经步骤2培养时间相同的野生型烟草和转基因烟草的叶片，进行叶绿素含量的测定，结果：如图4所示，在NaCl和ABA处理后转基因烟草的叶绿素含量均比野生型烟草高出2倍以上。由此进一步说明了MdCoL能够提高转基因烟草对胁迫的抵抗作用。

上述叶绿素含量测定的方法如下：

称取0.1～0.2g植物(烟草、苹果植株)样品，加入少量CaCO₃、石英砂研磨，加入2～3mL 80％丙酮，尽量研磨充分，研磨后加入到10mL离心管中，避光室温静置至材料无色，使用滤纸过滤植物残渣，过滤后的液体全部倒入新的离心管中，用80％丙酮定容至10mL。用80％丙酮作对照调零，分别测定波长为663nm和645nm的吸光值A663和A645，保证吸光值在0.2～0.8，若太大应用丙酮稀释。计算：Ca＝12.7×A663-2.59×A645、Cb＝22.9×A645-4.67×A663和Ct＝Ca+Cb，得到叶绿素含量CHI(mg/g)＝Ct(mg/L)×提取液体积×稀释倍数/样品重(g)/1000。

实施例5、MdCoL的异源表达提高了转基因苹果愈伤组织的抗逆性

取实施例2步骤3获得的大小相同的转基因苹果‘王林’愈伤组织系(L11、L12和L13)和野生型苹果‘王林’愈伤组织(WT)，分别用含有100mM NaCl的MS培养基平板和含有10μM ABA的MS培养基平板于黑暗条件下培养，以不另添加NaCl和ABA的正常MS培养基为对照，15～20天后观察表型拍照记录，并将经NaCl或ABA处理前后的野生型和转基因愈伤取样称量鲜重。

结果：正常MS培养基培养的野生型和转基因愈伤组织的生长状态均良好，形态大小也一致(图5A)；在含有NaCl或ABA的培养基中，野生型和转基因愈伤组织的生长状态则存在明显差异，野生型由于受到胁迫影响生长缓慢，活力下降，而转基因愈伤组织受胁迫影响较小，仍保持了原有的生长状态，表现出比野生型大很多(图5A)；为了更直观的表明野生型和转基因愈伤组织的差异性，分别称量NaCl或ABA处理前后愈伤组织的鲜重，结果表明，转基因愈伤组织的重量明显高于野生型(图5B)；在NBT(氯化硝基四氮唑蓝)组织化学染色情况下也可以看出转基因愈伤组织在NaCl或ABA处理后呈现出比野生型的颜色浅，说明转基因愈伤组织受到胁迫的影响要小(图5C)。

上述结果表明，MdCoL可以提高转基因苹果愈伤组织对NaCl和ABA胁迫的耐受性。

上述NBT组织化学染色方法如下：

(1)取0.2gNBT粉末，用配制好的50mM PBS(PH＝7.5)定容到100mL，磁力搅拌器搅拌至溶解，获得NBT溶液；

(2)将愈伤组织分别放到盛有NBT溶液的离心管中，室温染色1h，观察颜色变化，拍照记录。

实施例6、转基因烟草和转基因苹果愈伤组织在逆境胁迫下的受伤害程度测定

以实施例4中经NaCl或ABA处理的转基因烟草(L4、L5和L15)和野生型烟草(WT)播种后15天幼苗和实施例5中经NaCl或ABA处理15-20天的转基因苹果‘王林’愈伤组织系(L11、L12和L13)和野生型苹果‘王林’愈伤组织(WT)作为样品，分别进行如下测定：

1、MDA(丙二醛)含量的测定

植物在逆境下遭受伤害与活性氧积累诱发的膜质过氧化作用密切相关。MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，因此通过测定MDA可以了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。

方法：

1)称取约为0.1g的样品组织，加入1mL提取液(0.05mol/L pH7.8磷酸缓冲液)进行冰浴至匀浆；8,000g 4℃离心10min，取上清液到新的离心管中，置于冰上待测，即提取液混合液。

2)打开UVI200型紫外可见分光光度计(HITACHI)预热30min以上，利用蒸馏水调零。加试剂(0.5％硫代巴比妥酸溶液)和提取液混合液放在100℃水浴处理30min后(盖紧，防止水分散失)，置于冰上冷却，10,000g，在常温离心10min。取上清至1mL的玻璃比色皿中，测定各个样品在波长450nm、532nm和600nm处的吸光值A450、A532和A600。

3)计算：MDA含量(nmol/g)＝(6.45×(A532-A600)-0.56×A450)×V总/(W×V样品/V提取)＝5×(6.45×(A532-A600)-0.56×A450)/W；其中：V总：反应体系总体积；V样品：加入样品体积；W：样品质量，g；V提取：提取液体积。

结果：转基因烟草和转基因苹果愈伤组织的MDA含量明显低于野生型(图6A和图6B)。

2、SOD活性的测定

方法：具体如下：

1)样品处理：称取约0.1g样品，加入1mL提取液(0.05mol/L pH7.8磷酸缓冲液)，研磨后置于冰上匀浆8000g 4℃离心10min，取上清，置于冰上待测。

2)使用超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(索莱宝公司产品)中的试剂和UVI200型紫外可见分光光度计(HITACHI)，按照使用说明进行SOD活性的测定。

结果：转基因烟草和转基因苹果愈伤组织的SOD活性明显高于野生型(图7A和图7B)。

步骤1和2的结果表明，转基因烟草和转基因苹果愈伤组织较野生型相比表现出较强的抗胁迫能力。

实施例7、转基因苹果愈伤组织在盐胁迫下相关胁迫基因的表达量分析

为进一步揭示MdCoL对盐胁迫响应的作用，在正常和盐胁迫条件下分析了相关胁迫基因的表达。

1、柱型苹果和普通型苹果

方法：通过qRT-PCR检测柱型苹果‘威赛克旭’(Wi)和普通型苹果‘旭’(Mc)中相关胁迫基因MdP5CS、MdRD22、MdDREB2和MdNCED3对盐胁迫的表达情况，以不经过盐胁迫的正常条件下的结果为对照。盐胁迫处理按照实施例3的方法进行。

结果：如图8A-D所示，盐胁迫处理诱导了柱型苹果中MdP5CS、MdRD22、MdDREB2和MdNCED3的表达，而这些基因在普通型苹果中变化很小，在转录水平上显示柱型苹果的表达积累显著高于普通型苹果。

2、野生型和转基因苹果愈伤组织

方法：实施例5中经NaCl处理15-20天的转基因苹果‘王林’愈伤组织系(L11、L12和L13)和野生型苹果‘王林’愈伤组织(WT)作为研究对象，以不经过NaCl处理为对照(CK)，通过qRT-PCR检测相关胁迫基因MdP5CS、MdRD22、MdDREB2和MdNCED3对盐胁迫的表达情况。

结果：如图9A-D所示，在盐胁迫下，所述相关胁迫基因MdP5CS、MdRD22、MdDREB2和MdNCED3在转基因苹果愈伤组织中的有较高表达水平。

步骤1和2的结果表明，胁迫相关基因MdP5CS、MdRD22、MdDREB2和MdNCED3在柱型苹果和转基因苹果愈伤组织中的有较高表达水平，MdCoL正向调节盐耐受性。

上述qRT-PCR检测相关胁迫基因MdP5CS、MdRD22、MdDREB2和MdNCED3的引物(5’-3’)分别如下：

MdP5CS-F：CAGCTTAGCCGCTCTTCTGT；(SEQ ID No.5)

MdP5CS-R：AACAGGAACGCCACCATAAG；(SEQ ID No.6)

MdRD22-F：ACGGGTAAACCCGGTAAAAG；(SEQ ID No.7)

MdRD22-R：ATCGTCGTGGAGCTGAGTCT；(SEQ ID No.8)

MdDREB2-F：ATGGCCTATGACGATGCTGC(SEQ ID No.9)；

MdDREB2-R：GAAGTTCCAAATGGAAGTGG(SEQ ID No.10)；

MdNCED3-F：CCCGACTGCTTCTGCTTCCA(SEQ ID No.11)；

MdNCED3-R：AGCCGGATTTCTGACAAGACG(SEQ ID No.12)。

综述：柱型基因MdCoL是控制苹果柱型性状的关键基因，然而，MdCoL在苹果中的功能仍不清楚。在本申请中，我们研究发现MdCoL在盐胁迫诱导下柱型苹果与普通型苹果相比，柱型苹果具有更高的耐盐性。此外，转基因烟草幼苗和转基因苹果愈伤组织表现出更强的盐胁迫耐受性和对ABA更低的敏感性。

盐胁迫诱导下植物可以产生各种生理和生化变化，以抵消离子和渗透损伤。叶绿素含量积累，MDA含量，SOD活性以及活性氧(ROS)ROS积累被广泛研究，以此来表明耐受能力。我们试验结果表明，盐处理2周后转基因烟草的叶绿素含量高于野生型烟草，叶绿素含量的多少被认为是在不利环境条件下衡量植物生长活力重要指标。在植物中，ROS是应激信号传导中的关键因素。一般来说，ROS的含量受其生产的严格控制和清除抗氧化防御机制的调节。植物已经开发了几种清除ROS的解毒机制，例如抗氧化剂分子和各种酶的合成。我们的结果显示，在组织化学染色中MdCoL转基因苹果愈伤组织在胁迫条件下表现出比WT少的ROS积累，以此来体现出更高的抗氧化能力；在盐胁迫下，转MdCoL基因烟草和苹果愈伤组织表现出比WT更高的SOD活性和较低的MDA含量，这些结果表明MdCoL减少了植物在盐胁迫下的损伤，降低了对ABA的敏感程度。

在本申请中，通过生理和生化结果发现MdCoL可以降低ABA对转基因烟草和转基因苹果愈伤组织的敏感性。过表达MdCoL影响转录水平的应激相关基因如MdP5CS，MdRD22，MdDREB2，MdNCED3，在盐胁迫条件下，转基因烟草和转基因苹果愈伤组织中MdRD22，MdP5CS，MdDREB2和MdNCED3的表达显著增加。

总之，本申请证明了MdCoL可以提高苹果植株的抗逆性尤其是盐胁迫耐受性。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛农业大学

<120> 柱型苹果MdCoL基因在提高植物抗逆性中的应用

<130> JH-CNP190628

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 339

<212> PRT

<213> Malus×domestica Borkh

<400> 1

Met Glu Thr Leu Asp Gln Asn Leu Val Ser Ser Trp Phe Asp Val Gln

1 5 10 15

Ser Val Pro Gln Thr Phe Val His Pro Pro Glu Lys Arg Pro Gly Asn

20 25 30

Ser Ile Asp Val Pro Pro Cys Lys Asn Ile Pro Val Val Asp Leu Gly

35 40 45

Ser Arg Asp Arg Ser His Thr Ile Gln Gln Ile Ser Lys Ala Ser Gln

50 55 60

Asp Phe Gly Phe Phe Gln Val Phe Asn His Gly Val Cys Lys Lys Leu

65 70 75 80

Ile Asp Asp Ile Met Ser Ile Ser Lys Glu Phe His Lys Met Pro Arg

85 90 95

Lys Asp Lys Ile Ile Glu Gly Ser Lys Asp Pro Ser Gly Arg Cys Lys

100 105 110

Phe Tyr Thr Ser Ser Glu Asn Tyr Ala Asn Glu Glu Val His Tyr Trp

115 120 125

Arg Asp Ala Leu Thr His Pro Ala His Ser Ser Glu Asn Tyr Met Gln

130 135 140

Phe Leu Pro Gln Lys Pro Thr Gln Tyr Arg Glu Val Phe Lys Ala Tyr

145 150 155 160

Val Asp Glu Val Arg Asn Met Gly Ser Met Ile Leu Glu Met Leu Ala

165 170 175

Glu Gly Leu Gly Leu Ser Lys Glu Phe Phe Asn Gly Gly Leu Ser Glu

180 185 190

Asn Pro Thr Leu Leu Ser Asn His Tyr Pro Pro Cys Pro Asp Pro Thr

195 200 205

Leu Thr Leu Gly Leu Thr Lys His Arg Asp Pro Ser Leu Ile Thr Ile

210 215 220

Leu Leu Gln Asp Ser Glu Gly Leu Gln Val Phe Lys Asp Gly Asn Trp

225 230 235 240

Ile Gly Val Glu Pro Ile Ser Ser Gly Phe Val Val Asn Ile Gly Tyr

245 250 255

Val Met Gln Met Ile Ser Asn Ser Lys Phe Lys Gly Ala Asp His Arg

260 265 270

Val Val Thr Asn Ser Arg Ala Ala Arg Thr Thr Ile Ala Tyr Phe Ile

275 280 285

Tyr Pro Ser Asn Glu Thr Val Ile Glu Pro Ala Asn Val Leu Cys Asn

290 295 300

Pro Pro Leu Tyr Arg Ser Met Lys Phe Thr Glu Phe Leu Gln His Phe

305 310 315 320

Lys Ser Lys Ala Ala Asn Asp Glu Glu Met Ser Lys Val Leu Ser Leu

325 330 335

Ser Ser Ser

<210> 2

<211> 1020

<212> DNA

<213> Malus×domestica Borkh

<400> 2

atggagacat tagatcagaa tcttgtttca agctggtttg atgttcaatc tgttccccaa 60

acctttgtcc acccacctga aaagcggccc ggtaacagta ttgacgttcc tccgtgcaag 120

aacattccgg tagttgatct tggcagccgt gatcgcagtc acacaattca acaaatttcc 180

aaggctagcc aagacttcgg atttttccag gtcttcaatc atggggtttg caagaagttg 240

attgatgaca taatgagtat ttccaaggag tttcataaaa tgccccgaaa agataagata 300

attgaaggct caaaggaccc tagtggaaga tgcaagttct acacaagcag tgaaaactat 360

gcgaatgaag aggttcacta ttggcgagat gcattgactc accctgctca ttcttctgaa 420

aactacatgc agtttttgcc tcaaaaacct actcaatacc gagaagtttt caaggcatac 480

gtggatgagg taagaaacat gggttctatg attttggaga tgcttgctga agggttggga 540

ctgagcaaag agttcttcaa tggtggactt agtgaaaatc caacgctgct gtccaaccat 600

tatccgccat gcccagatcc tactttaacc ttgggattaa cgaaacaccg cgatccgagc 660

ctcataacca ttttacttca agattcagaa ggacttcaag tcttcaaaga tgggaattgg 720

attggtgttg agcctatttc tagtggcttt gttgttaaca taggctacgt catgcagatg 780

atcagcaact cgaagtttaa aggcgctgac catcgagtgg tgacaaattc aagagctgca 840

aggacaacga ttgcgtactt catttatccg tctaatgaga ccgttataga acctgcaaat 900

gttttgtgca atccaccact gtacagatcc atgaagttta cggagttcct tcaacacttc 960

aaatcgaaag ctgccaacga cgaagaaatg tcgaaggttt taagcctctc gagtagctaa 1020

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggagacat tagatcagaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctactcgag aggcttaaaa 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cagcttagcc gctcttctgt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aacaggaacg ccaccataag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acgggtaaac ccggtaaaag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atcgtcgtgg agctgagtct 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atggcctatg acgatgctgc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gaagttccaa atggaagtgg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cccgactgct tctgcttcca 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agccggattt ctgacaagac g 21

Claims (7)

1.柱型苹果MdCoL蛋白或其编码基因在提高植物抗盐性中的应用；

所述柱型苹果MdCoL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述柱型苹果MdCoL蛋白的编码基因如SEQ ID No.2所示；

所述植物为烟草和苹果。

2.一种提高植物抗盐性或培育抗盐性植物的方法，其特征在于：其包括提高目的植物中如权利要求1所述柱型苹果MdCoL的蛋白表达水平或mRNA转录水平的步骤；

所述目的植物为烟草和苹果。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法包括向所述目的植物中导入如权利要求1所述柱型苹果MdCoL蛋白的步骤。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述导入如权利要求1所述柱型苹果MdCoL蛋白通过导入所述柱型苹果MdCoL蛋白的编码基因来实现。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述导入通过含有重组载体的根癌农杆菌进行，所述重组载体上含有如权利要求1所述柱型苹果MdCoL蛋白的编码基因。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述重组载体为在植物表达载体pRI101的多克隆位点处插入如权利要求1所述柱型苹果MdCoL蛋白的编码基因。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述根癌农杆菌为根癌农杆菌EHA105。

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