CN111154768B

CN111154768B - 一种密罗木基因MfbHLH15及其应用

Info

Publication number: CN111154768B
Application number: CN202010044676.6A
Authority: CN
Inventors: 黄卓; 邱嘉睿; 蒋才忠; 向香盈; 徐文欣; 王嘉彤; 朱培蕾; 杨丽; 蔡仕珍
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2020-01-16
Filing date: 2020-01-16
Publication date: 2021-03-30
Anticipated expiration: 2040-01-16
Also published as: CN111154768A

Abstract

本发明公开了一种密罗木基因MfbHLH15及其应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过对密罗木抗旱bHLH转录因子的研究，以对植物的抗旱耐盐性能进行改良，提高植物的抗旱耐盐性能。

Description

一种密罗木基因MfbHLH15及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种密罗木基因MfbHLH15及其应用。

背景技术

干旱胁迫与盐胁迫是影响植物生长发育、地理分布和作物生产力的关键环境因素。长期以来，提高植物的耐旱性、耐盐性一直是广受关注的研究课题。而基因工程作为传统育种的补充，已被证明是培育具有较强耐旱性及耐盐性的新种质的有力方式。因此，研究具有耐旱性及耐盐性的基因显得尤为重要，通过这些优质基因可以进行基因工程改造，进而协助植物应对日益严峻的自然生长环境。

碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子(TF)是植物基因组中的一个大的基因家族。目前，拟南芥中已有167个成员，水稻中已有162个成员，它们在转录网络中均起着重要的作用。一些植物bHLH转录因子能够响应各类非生物胁迫。例如，AtMYC2，OsbHLH148和PIF3，分别参与了脱落酸(ABA)，茉莉酸酯和光诱导的信号转导；水稻(wild rice)的OrbHLH2基因提高了其对盐和渗透胁迫的耐受性；水稻(wild rice)bHLH基因OrbHLH001的过表达，在转基因拟南芥中显示出更好的抗冻性和耐盐性；水稻(Oryza sativa)中OsbHLH148的表达通过茉莉酸信号途径提高了植物的抗旱性。另外，梨(Pyrus ussuriensis)的ICE1基因通过与PuHHP1相互作用增强PuDREBa的转录水平，从而提高了植物对寒冷的耐受性。综上所述，这些结果均证实植物bHLH转录因子能够参与调节植物对非生物胁迫的反应。

密罗木(Myrothamnus flabellifolia Welw.)是香灌木科香灌木属中唯一的复苏植物种，也是迄今为止发现的唯一的木本复苏植物。密罗木具有一般复苏植物的特性，在植株本身生理机能接近中止的情况下，其体内活性氧以及有毒物质的产生量降到最低，同时它也具有其作为唯一木本复苏植物的特异生存能力，因此，密罗木作为一类复苏植物，在研究植物的抗旱功能分子机制上有重要研究价值。但是，迄今在非生物胁迫中有关密罗木bHLH转录因子的研究十分匮乏，因此对此类转录因子进行基因克隆及功能验证是十分重要的。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种密罗木基因MfbHLH15及其应用，该基因能在干旱脱水期快速响应，提高作物的抗旱性能。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种密罗木基因MfbHLH15，该基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

其中，序列表SEQ ID NO.1从密罗木叶片RNA中通过PCR克隆，核心编码区长度为1188bp。

采用上述基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO.2由395个氨基酸组成，其中有一个位于300aa的双分型核定位信号“KRSRAAEVHNLSERRRR”，对MfbHLH15氨基酸序列进行结构域分析，发现在142～158aa、239～253aa和277～288aa处各含有一个低复杂度区域(RTATPIAPRPPIPPARR，17aa)、(SVTSSPGVSGASASA，15aa)、(SDSEDAEFESAE，12aa)，HLH域位于309aa～358aa处，可以看出MfbHLH15具备HLH结构域，属于bHLH类转录因子。

包含上述密罗木MfbHLH15基因的转基因细胞系。

包含上述密罗木MfbHLH15基因的工程菌。

上述密罗木基因MfbHLH15在作物抗旱耐盐过程中的应用。

本发明的有益效果为：

1.获得了对干旱有较高耐受性的转基因拟南芥。

2.密罗木基因MfbHLH15能在干旱脱水早期快速响应，为利用该基因提高其他植物对干旱及盐的耐受性提供了理论依据及应用价值。

附图说明

图1为本发明的密罗木基因MfbHLH15亚细胞定位的结果；

图2为转MfbHLH15基因拟南芥植株的阳性鉴定结果；

图3为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的生长状态；其中，图3a为野生型和转基因拟南芥幼苗在氯化钠胁迫处理后的植株生长状态；图3b为野生型和转基因拟南芥成株在氯化钠胁迫处理后的生长状态；

图4为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的生长状态；其中，图4a为野生型和转基因拟南芥幼苗在干旱胁迫处理后的植株生长状态；图4b为野生型和转基因拟南芥成株在干旱胁迫处理后的生长状态；

图5为野生型和转基因拟南芥植株的气孔测定；其中，图5a为野生型和转基因拟南芥植株的气孔形状检测图；图5b为野生型和转基因拟南芥植株的气孔开闭度；

图6为野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的叶绿素含量；

图7为野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的脯氨酸(Pro)含量；

图8为野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的超氧化物歧化酶(SOD)含量；

图9为野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的过氧化物酶(POD)含量；

图10为野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的过氧化氢酶(CAT)含量；

图11为野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的丙二醛(MDA)含量；

图12为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫下的离体叶片自然失水率；

图13为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫下的可溶性蛋白含量；

图14为野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的二氨基联苯胺(DAB)染色结果；

图15为野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的氮蓝四唑(NBT)染色结果；

图16为野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的过氧化氢(H₂O₂)含量；

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1克隆密罗木MfbHLH15基因

1、取密罗木叶片，液氮速冻，放置-80℃冰箱中保存以备提取总RNA；总RNA提取采用成都兰博生物公司购买的Plant Total RNA Isolation Kit试剂盒来提取；密罗木cDNA的合成使用大连宝生物科技公司的Reverse Transcriptase M–MLV(RNaseH-)，按其产品说明书操作进行第一链合成。

以上述试剂盒合成的cDNA第一链为扩增模板，以设计的F：5’-TCCCCCGGGATGAATCACTGCGTTCCCGA-3’(SEQ ID NO.3)和R：5’-GACTAGTTTAAAATTTCTCATACCTGTG-3’(SEQ ID NO.4)为引物，为了后续的酶切及重组连接，在设计引物时加上SmaI和SpeI这两个酶切位点，利用RT-PCR进行cDNA扩增，扩增体系见表1，扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min。

表1 PCR扩增体系

2、PCR结束后进行电泳分析，采用OMEGA公司的DNA回收试剂盒回收约1188bp的扩增片段，将扩增片段连接到Peasy-T1 Simple克隆载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取白色菌落进行菌落PCR以鉴定阳性克隆，将阳性克隆送到成都擎科生物科技有限公司测定密罗木基因MfbHLH15的编码序列，其序如SEQ ID NO.1所示，再利用ORF Finder软件将所得基因的开放阅读框翻译成氨基酸序列，该氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2 MfbHLH15的亚细胞定位

根据亚细胞载体pHB-YFP上的碱基和酶切位点情况，以及ClonExpressII同源重组试剂盒的说明，选择HindIII和BamHI这两个酶切位点来设计引物；引物由成都擎科生物公司合成。

采用已合成的带有同源臂的引物，以密罗木cDNA为模板进行扩增，其引物的具体序列如下:

F：5’-ACCAGTCTCTCTCTCAAGCTTATGAATCACTGCGTTCCCGA-3’；

(SEQ ID NO.5)

R：5’-GCTCACCATACTAGTGGATCCAAATTTCTCATACCTGTG-3’；

(SEQ ID NO.6)

将扩增得到的PCR产物回收后，与经过HindIII和BamHI内切酶切除的pHB载体相连，构建融合载体35S::MfbHLH15-pHB-YFP，通过将转入pHB-YFP质粒的野生型本氏烟草和转入35S::MfbHLH15-pHB-YFP质粒的野生型本氏烟草叶片制成切片，在激光共聚焦显微镜下观察结果如图1所示；从图1中可看出，只转入pHB-YFP的烟草叶片的荧光信号分布在烟草细胞内的各个部位，而转入MfbHLH15-pHB-YFP质粒的烟草叶片的荧光信号则只出现在细胞核中，说明MfbHLH15基因定位于细胞核中，并在细胞核中起作用。

实施例3：MfbHLH15基因的遗传转化

将农杆菌LBA4404感受态细胞置于冰上解冻，取5μL重组质粒35S::pGSA1403-MfbHLH15于100μL感受态中，用枪头轻轻混匀，冰浴30min，液氮速冻1min，37℃水浴5min，冰上放置2min后加入800μL LB液体培养基，在恒温培养箱中29℃，120r/min，培养2～4h。将上述菌液均匀涂布在含10μg/mL氯霉素的LB固体培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养，然后挑取单菌斑接种于5mL LB液体培养基中，28℃，250r/min振荡培养24h。取1mL上述菌液转入50mL含10μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，于28℃，250r/min，振荡培养至OD₆₀₀≈1.5；将上述OD值达标的菌液4℃，8000r/min离心10min收集菌体，弃掉上清，用等体积的5％蔗糖溶液将菌体重悬，在菌液中加入Silwet-77并混匀，使溶液浓度达到0.02％且菌液OD₆₀₀≈0.8。

转化前需剪掉成熟的果荚，颠倒植株让植株浸入农杆菌细胞悬浮液2min，然后将浸好的植株用滤纸擦干并用塑料薄膜包裹，暗处理24h后于光照培养箱中正常培养，一周后可重复浸染一次。待种荚黄化后收种，记为T0代。继续将T0代拟南芥种子放入含有50μg/mL卡那霉素的培养基里，转入外源基因的植株能在含有卡那霉素的抗性培养基上生长，而非转基因植株则不能正常生长。因此筛选出能正常生长且颜色呈深绿色的植株，对深绿色植株提取DNA并进行PCR检测阳性(如图2)，获得T₂代转基因植株，其中，“H₂O”与“WT”为阴性对照，1～5、7～15为目的基因检测条带，为阳性植株，而6不含目的条带，为假阳性植株。后续需重复筛选步骤直至筛选出阳性过表达纯系植株。

实施例4：转基因拟南芥的胁迫处理

对于幼苗处理，是将野生型和过表达T3代纯系(Line D，Line N，Line Q)分别播种于配置含NaCl(50mM，100mM，150mM)、甘露醇(200mM，250mM，300mM)的1/2MS培养基中，对照组只添加正常成分，记为1/2MS。每个方形培养皿中三种株系分成两排点播，每排15株左右，每个处理重复三次，4℃暗处理2d后移入光照培养箱中垂直放置，继续培养2周，在根系分析仪下拍照并测量根长。

盐胁迫下的幼苗表型如图3，其中，图3a为野生型和转基因拟南芥植株幼苗在氯化钠胁迫处理后的植株生长状态；图3b为野生型和转基因拟南芥植株成株在氯化钠胁迫处理后的生长状态。干旱胁迫下的幼苗表型如图4，其中，图4a为野生型和转基因拟南芥植株幼苗在干旱胁迫处理后的植株生长状态；图4b为野生型和转基因拟南芥植株成株在干旱胁迫处理后的生长状态。

对于成株的处理，是将野生型拟南芥(WT)和过表达T3代纯系(Line D，Line N，Line Q)种子播种在1/2MS圆形培养皿，4℃暗处理3d后移入光照培养箱中培养至四叶期后移入花盆中，培养3周左右，选择长势一致的植株进行抗逆性分析。

(1)盐胁迫处理

对照组不作处理，记为CK，其余组每隔3天浇一次300mM的氯化钠处理液。2周后观察WT与过表达植株表型差异(如图3)；每个株系30株重复。

(2)干旱胁迫处理

对照组，记为CK，正常浇水管理，其余组均不浇水使其自然干旱失水，期间不断观察拍照并记录植株生长状况，失水3周左右开始复水，处理期间拍照观察(如图4)；每个株系30株重复。

叶绿素，脯氨酸(Pro)，超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(POD)，抗氧化酶(CAT)，丙二醛(MDA)，离体叶片自然失水率，可溶性蛋白，二氨基联苯胺(DAB)，氮蓝四唑(NBT)和过氧化氢(H₂O₂)测定，分别在氯化钠处理5d，干旱处理7d后进行样品取样。

通过研究野生型与过表达拟南芥幼苗和成株在干旱及氯化钠胁迫下的表型，发现过表达MfbHLH15基因株系Line D、Line N和Line Q对干旱及盐的耐受性均明显强于WT，说明过表达MfbHLH15基因提高了拟南芥对盐及干旱胁迫的抗性。

(3)甘露醇处理下气孔开度的测定

将野生型拟南芥(WT)和过表达T3代纯系(Line D，Line N，Line Q)种子播撒在1/2MS圆形培养皿，4℃暗处理3d后转入光照培养箱中培养7d，移栽至50孔穴盘内(已等量分装好营养土并浇足水)，继续培养4周左右。

取WT，Line D，Line N和Line Q的莲座叶叶片，每个株系撕取10块下表皮，置于100mL的MES-KCl缓冲液(50mM KCl，0.1mM CaCl₂，10mM MES，pH 6.15)中光诱导2.5h，然后每个株系取5块下表皮分别置于100mL不含以及含300mM甘露醇的MES-KCl缓冲液(50mMKCl，0.1mM CaCl₂，10mM MES，pH 6.15)中光下处理2h，处理完后放在荧光显微镜(10*40)下观察，气孔闭合程度(宽与长的比)作为统计气孔开度的指标，每个表皮随机选取4个视野，每个视野随机测量5个气孔，总共统计100个气孔细胞，结果如图5所示，其中，图5a为野生型和转基因拟南芥植株的气孔形状和气孔闭合程度；图5b为野生型和转基因拟南芥植株的气孔宽长比柱状图，图5b每组检测数据中，柱状图从左至右依次表示WT、Line D、Line N和Line Q的检测结果。

观察WT与过表达株系的气孔表型可知(如图5a)，在300mM甘露醇处理下，过表达植株Line D、Line N和Line Q的气孔闭合程度(宽与长的比值)要远小于野生型植株，统计100个气孔数据分析得知过表达植株的气孔闭合程度显著小于WT(如图5b)，表现为极显著。因此在300mM甘露醇模拟干旱处理的条件下，过表达MfbHLH15植株的抗失水能力要好于野生型植株。

(4)叶绿素含量的测定

将不同处理的0.5克新鲜叶片剪成碎片，将其叶中脉剪掉并剪碎叶片，加入到50mL的棕色容量瓶中，分别加入95％乙醇50mL，将容量瓶加塞放入25℃的恒温培养箱中暗中提取48h。将叶绿素提取液注入酶标板放入酶标仪中进行测定，另加乙醇注入另一孔作为对照，分别以665nm和649nm波长测出该色素液的光密度。

叶绿素a含量(mg/g)：Ca＝(13.7A665-5.76A649)*V/m；叶绿素b含量(mg/g)：Cb＝(25.8A649-7.6A665)*V/m；叶绿素总含量(mg/g)：Ca+b＝Ca+Cb；其中，Ca+b为叶绿素总含量，Ca为叶绿素a含量，Cb为叶绿素b含量，V为提取液体积，m为样品质量。结果如图6所示，即野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的叶绿素含量，图中每组检测数据中，柱状图从左至右依次表示WT、Line D、Line N和Line Q的检测结果。

过表达MfbHLH15株系Line D、Line N和Line Q在干旱处理七天及氯化钠处理五天的情况下仍能维持较高的叶绿素含量，且在受到干旱胁迫后各转基因的叶绿素含量有所上调，而WT叶绿素含量则明显降低。说明过表达MfbHLH15基因表现出优于野生型拟南芥对干旱及盐胁迫的耐受能力。

(5)脯氨酸(Pro)含量的测定

取不同处理的植株叶片鲜样各0.5g，加入少许石英砂和少许3％的磺基水杨酸溶液在研钵中磨碎，倒入10mL离心管并定容至10mL，4500r离心3min。取上清液并用3％的磺基水杨酸溶液定容至10mL。吸取2mL提取液至一洁净干燥玻璃试管中，加入2mL酸性茚三酮和2mL冰乙酸，100℃加热1h，放入冰水中终止反应，加入4mL甲苯，充分振荡15～20s，静置分层后用移液枪轻轻吸取上层红色溶液于比色皿中，以甲苯为对照，在分光光度计520nm波长处比色并求得吸光度值，此步骤重复两次。

脯氨酸含量P＝(μg/g)＝(c*v/a)/w，其中，c为根据标准曲线求出的脯氨酸待测液浓度，v为测定液体积，a为待测夜体积，w为样品质量。结果如图7所示，即野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的脯氨酸含量，图中每组检测数据中，柱状图从左至右依次表示WT、Line D、Line N和Line Q的检测结果。

在受到逆境胁迫时，WT体内脯氨酸积累量有一定的升高，但过表达MfbHLH15株系Line D、Line N和Line Q体内的脯氨酸合成量远高于野生型。说明在干旱和盐的逆境条件下，过表达MfbHLH15基因能使拟南芥更好地适应恶劣环境。

(6)超氧化物歧化酶(SOD)含量的测定

分别取Met：162mL，EDTA-Na2：6mL，NBT：6mL，核黄素：6mL于烧杯中混匀备用。吸取40μL的酶液，并分别加入3mL的混合反应液，同时取两支试管作对照，一支加入40μL磷酸缓冲液+3mL混合反应液作空白对照，一支40μL磷酸缓冲液+3mL混合反应液用锡箔纸包好避光以作测定时调零。将试管置于光照培养箱中4000Lux，25℃下反应20min。以黑暗处理下的试管调零，测定各反应液560nm下吸光度值。

SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％作为一个酶活性单位(u)，SOD总活性(U/g.FW)＝(Ack-AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt)，式中，Ack为照光管吸光度值，AE为遮光管的吸光度值，V为样品液总体积(mL)，Vt为测定时样品用量(mL)，W为样品鲜重。结果如图8所示，即野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的SOD含量，图中每组检测数据中，柱状图从左至右依次表示WT、Line D、Line N和Line Q的检测结果。

超氧物歧化酶可以清除植物体内的超氧阴离子自由基，提高植物的抗逆性。测量结果显示，干旱和盐胁迫下，WT、Line D、Line N和Line Q株系植株叶片的超氧物歧化酶活性均有不同程度的升高，且Line D、Line N和Line Q株系植株的超氧物歧化酶活性均高于WT株系，部分差异显著，部分差异极显著。

(7)过氧化物酶(POD)含量的测定

配制POD反应液，取0.1M pH 6.0的磷酸缓冲液50mL于烧杯中，加入愈创木酚28μL，磁力搅拌器加热搅拌使之完全溶解，冷却后加入30％H₂O₂ 19μL混合，保存于冰箱中。取40μL酶液+3mL反应液于试管中混匀，对照管加入40μL磷酸缓冲液+3mL反应液。在OD＝470nm下每隔1min读数一次，共读三次，以每分钟内△A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(u)。

POD活性(U/g.FW.min)＝△A470×Vt/(W×Vs×0.01×t)，式中，△A470为反应时间内吸光度的变化，Vt为提取液总体积(mL)，W为样品鲜重(g)，Vs为测定时取用酶液体积(mL)，t为反应时间(min)。

结果如图9所示，即野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的POD含量，图中每组检测数据中，柱状图从左至右依次表示WT、Line D、Line N和Line Q的检测结果。

过氧化物酶与植物的呼吸作用、光合作用等有十分紧密的联系，它可以反应出植物体内某一时期的代谢变化情况。测量结果显示，干旱和盐胁迫下，WT、Line D、Line N和Line Q株系植株叶片的POD活性均有不同程度的升高，且Line D、Line N和Line Q株系植株的POD活性均高于WT株系，部分差异显著，部分差异极显著。

(8)过氧化氢酶(CAT)活性测定

配制CAT反应液，取200mL PBS(0.15M，pH7.0)，加入0.3092mL 30％的H₂O₂(原液)摇匀。20μL酶液+3mL反应液于比色皿中，在470nm下每隔1分钟读数一次，共读三次，空白对照20μL蒸馏水+3mL反应液，作为对照调零，以每分钟吸光度变化值(ΔA470/mgFW)表示酶活力的大小。

CAT(ΔA470/mgFW)＝[ΔA240×Vt]/(W×Vs×0.01×t)，其中，ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积(mL)；Vs为测定时取用酶液体积(mL)。

结果如图10所示，即野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的CAT含量，图中每组检测数据中，柱状图从左至右依次表示WT、Line D、Line N和Line Q的检测结果。

过氧化氢酶活性可以反映出植物的代谢强度、以及自身的耐胁迫和抗病能力。测量结果显示，干旱和盐胁迫下，WT、Line D、Line N和Line Q株系植株叶片的CAT活性均有不同程度的升高，且Line D、Line N和Line Q株系植株的CAT活性均高于WT株系，差异极显著。

(9)丙二醛(MDA)含量的测定

称取受胁迫处理的叶片0.5g，加入石英砂和10％三氯乙酸2mL，研磨至匀浆，再加8mL10％三氯乙酸进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min，其上清液为丙二醛提取液。取3支样品管(三个重复)，各加入提取液2mL，对照管加蒸馏水2mL，然后各管再加入2mL 0.6％硫代巴比妥酸溶液。摇匀，混合液在沸水浴中反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液注入酶标板中放入酶标仪，分别在532、600和450nm波长下测定吸光度(A)值。

MDA浓度(μmol/L)＝6.45×(A532-A600)-0.56×A450；MDA含量(μmol/g.F.W)＝C(μmol/L)×Vt/(Vm(mL)×W(g))，式中，C为MDA浓度，Vt为提取液总体积，Vm为测定时提取液总体积，W为样品鲜重。结果如图12所示，即野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的MDA含量。

在逆境条件下，植物一般会发生膜脂过氧化，继而会产生丙二醛。丙二醛含量可以反映植物细胞膜脂过氧化的程度以及抗逆性的强弱。测量各株系植株叶片的丙二醛含量。结果如图11所示，图中每组检测数据中，柱状图从左至右依次表示WT、Line D、Line N和Line Q的检测结果

根据图11的检测结果可知，在干旱和盐的胁迫下，WT、Line D、Line N和Line Q株系植株叶片的MDA含量均有不同程度的升高，且Line D、Line N和Line Q株系植株的MDA含量均低于WT株系，部分差异显著，部分差异极显著。

(10)离体叶片自然失水率的测定

将穴盘中培养的植株浇足水分，用剪刀轻轻剪去莲座叶对其取样，在天平上用定量滤纸称取三个株系各0.5g叶片，此时叶片含水量为初始含水量，记为m₀，此后将叶片放入恒温光照培养箱中让其自然干旱(25℃,60％相对湿度)，在1h，2h，3h，4h，5h，6h，7h分别称取叶片即时重量。

每个时间点的实时失水率WR(Water lose rate)＝(m₀-m_t/m₀)*100％，其中m_t为每个时间点的即时含水量，m₀为初始含水量。结果如图12所示，即野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫下的离体叶片自然失水率。

在同等条件下，随着时间的推移各株系均有持续失水的趋势，而过表达MfbHLH15株系Line D、Line N和Line Q虽然失水率持续上升，但其失水率始终低于WT，且水分散失速率一直处于较为稳定平缓增长的状态，这说明转基因株系能够更好地控制自身机能适应环境的变化，将外部逆境胁迫对植株本身造成的伤害速率放缓，这能将一些不可逆的机体损伤降到最低。

(11)可溶性蛋白的测定

称取鲜样0.5g，用5mL磷酸缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min离心10min，上清液备用。此为实验用植物酶液。吸取样品提取液1.0mL(视蛋白质含量适当稀释)，放入试管中(每个样品重复2次)，加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查找蛋白质的含量。

样品可溶性蛋白的含量(mg/g)＝C×Vt/(1000×Vs×W)，式中：C—查标准曲线值，μg；Vt—提取液总体积，mL；W—样品鲜重，g；Vs—测定时加样量，mL。结果如图13所示，即野生型和转基因拟南芥植株在干旱及氯化钠胁迫下的可溶性蛋白含量，图中每组检测数据中，柱状图从左至右依次表示WT、Line D、Line N和Line Q的检测结果。

可溶性蛋白作为植物储存物质之一，是生物体内重要的营养物质和渗透调节物质，该物质的积累和增加对细胞的保水能力起到了重要的作用，也可以一定程度上的减少细胞膜受伤害的程度。在受到逆境胁迫时，WT体内脯氨酸积累量有一定的升高，但过表达MfbHLH15株系Line D、Line N和Line Q体内的可溶性蛋白合成量远高于野生型。说明在干旱和盐的逆境条件下，过表达MfbHLH15基因能使拟南芥更好地适应恶劣环境。

(12)二氨基联苯胺(DAB)和氮蓝四唑(NBT)染色

室温下将不同处理后的拟南芥叶片剪下，用含有1mg/mL DAB(NBT)的10mM磷酸缓冲液(pH＝7.8)将叶片完全浸泡，暗处理8-10h(光下处理24-30h)，直至叶片上出现深褐色(深蓝色)斑点，后将叶片置于95％的乙醇中进行脱色处理，待叶片趋于透明后拍照并记录。结果如图14、15所示，即野生型和转基因拟南芥植株在干旱和盐胁迫下的DAB与NBT染色结果。

根据拟南芥叶片上出现的深褐色(深蓝色)斑点的面积与深浅，可以看出，过表达MfbHLH15基因株系Line D、Line N和Line Q的叶片斑点要少于WT，说明转MfbHLH15基因能使拟南芥在干旱与盐胁迫下能够积累较少的活性氧，进而更好地抵御胁迫环境。

(13)过氧化氢(H₂O₂)含量的测定

过氧化氢含量的测定按照南京建成试剂盒说明书的方法进行。结果如图16、所示，即野生型和转基因拟南芥植株在干旱和盐胁迫下的过氧化氢含量，图中每组检测数据中，柱状图从左至右依次表示WT、Line D、Line N和Line Q的检测结果。

植物在胁迫下会积累过多的活性氧，而过量的活性氧会对植物蛋白造成严重损伤。在干旱和盐胁迫下，转MfbHLH15基因株系Line D、Line N和Line Q的活性氧积累量在不同程度上少于野生型拟南芥，说明MfbHLH15基因在拟南芥中的过表达能够帮助植株消除活性氧的累积，从而减轻过氧化物对其造成的损伤。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种密罗木基因MfbHLH15及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1188

<212> DNA

<213> 密罗木(Myrothamnus flabellifolia Welw)

<400> 1

atgaatcact gcgttcccga tttcgaaatg gacgacgagt actcgattcc atcatcctct 60

ggattttctc gtctgaaaaa accagcaccg gttgatgatg agataatgga gcttctatgg 120

caaaacggtc aagtagtttt gcagagccaa aaccagagat ctctcaagaa atcaacttcg 180

tcaaagtttc acacagtcga ggatgcagta attccggccg agagatcgac tgctaccgaa 240

attcgaacct ctcaagaaga agcaccaaat aatcttttca ttcaagagga tgaaatggcg 300

tcttggttgc attatcctct ggaagagtca ttcgatcgag acttctgtgc cgatctccta 360

tatccttccg agtccgcccc cgctgctaca gtttccgcgt ccacgcacca aattccggat 420

gtccgtacgg cgactccgat cgctcctcgg ccgccgattc caccagcaag gcggagcgag 480

gttttgcctc cctctaggtt gcctagcttt gcgcatttct caaggatgaa agcgagagtg 540

gacgaatctg gaccgtcggg ttctaacaag gtgagggatt cggcaattgt cgattcgagc 600

gagaccccaa agttaacgct ggaacctaac gctccgcaag ggcaggtttc tgcctgcgct 660

gcggcggccg tgccgtggtc tggtgtaggc agagacttgc tgaactgtga gcgttctgtg 720

acgtcatctc ccggcgtctc aggcgcaagc gccagcgccg agccgacgaa ggcgccggaa 780

ggggaaacga agcgcaaggg aagagaagcc gacgaaactg aatgccaaag tgacagtgag 840

gatgccgaat ttgaatctgc tgaggtgaag aaacaagttt gtggaccaac acctgcaaag 900

agatctcgtg ctgcggaggt ccacaacctt tcagagagga gacgtcgaga tagaataaat 960

gaaaagatga aggctttgca agaactcatt cctcgttgca gcaagtctga caaagcttca 1020

atgctggacg aggcaatcga gtacttgaaa tcacttcaat tacaagtgca ggttctcttt 1080

tgttataatt gtgtttctat gttttatttt gaaataatat gtcaagtaag tatgtcccac 1140

tcgatgataa atggcacatc aaagttacac aggtatgaga aattttaa 1188

<210> 2

<211> 395

<212> PRT

<213> 密罗木(Myrothamnus flabellifolia Welw)

<400> 2

Met Asn His Cys Val Pro Asp Phe Glu Met Asp Asp Glu Tyr Ser Ile

1 5 10 15

Pro Ser Ser Ser Gly Phe Ser Arg Leu Lys Lys Pro Ala Pro Val Asp

20 25 30

Asp Glu Ile Met Glu Leu Leu Trp Gln Asn Gly Gln Val Val Leu Gln

35 40 45

Ser Gln Asn Gln Arg Ser Leu Lys Lys Ser Thr Ser Ser Lys Phe His

50 55 60

Thr Val Glu Asp Ala Val Ile Pro Ala Glu Arg Ser Thr Ala Thr Glu

65 70 75 80

Ile Arg Thr Ser Gln Glu Glu Ala Pro Asn Asn Leu Phe Ile Gln Glu

85 90 95

Asp Glu Met Ala Ser Trp Leu His Tyr Pro Leu Glu Glu Ser Phe Asp

100 105 110

Arg Asp Phe Cys Ala Asp Leu Leu Tyr Pro Ser Glu Ser Ala Pro Ala

115 120 125

Ala Thr Val Ser Ala Ser Thr His Gln Ile Pro Asp Val Arg Thr Ala

130 135 140

Thr Pro Ile Ala Pro Arg Pro Pro Ile Pro Pro Ala Arg Arg Ser Glu

145 150 155 160

Val Leu Pro Pro Ser Arg Leu Pro Ser Phe Ala His Phe Ser Arg Met

165 170 175

Lys Ala Arg Val Asp Glu Ser Gly Pro Ser Gly Ser Asn Lys Val Arg

180 185 190

Asp Ser Ala Ile Val Asp Ser Ser Glu Thr Pro Lys Leu Thr Leu Glu

195 200 205

Pro Asn Ala Pro Gln Gly Gln Val Ser Ala Cys Ala Ala Ala Ala Val

210 215 220

Pro Trp Ser Gly Val Gly Arg Asp Leu Leu Asn Cys Glu Arg Ser Val

225 230 235 240

Thr Ser Ser Pro Gly Val Ser Gly Ala Ser Ala Ser Ala Glu Pro Thr

245 250 255

Lys Ala Pro Glu Gly Glu Thr Lys Arg Lys Gly Arg Glu Ala Asp Glu

260 265 270

Thr Glu Cys Gln Ser Asp Ser Glu Asp Ala Glu Phe Glu Ser Ala Glu

275 280 285

Val Lys Lys Gln Val Cys Gly Pro Thr Pro Ala Lys Arg Ser Arg Ala

290 295 300

Ala Glu Val His Asn Leu Ser Glu Arg Arg Arg Arg Asp Arg Ile Asn

305 310 315 320

Glu Lys Met Lys Ala Leu Gln Glu Leu Ile Pro Arg Cys Ser Lys Ser

325 330 335

Asp Lys Ala Ser Met Leu Asp Glu Ala Ile Glu Tyr Leu Lys Ser Leu

340 345 350

Gln Leu Gln Val Gln Val Leu Phe Cys Tyr Asn Cys Val Ser Met Phe

355 360 365

Tyr Phe Glu Ile Ile Cys Gln Val Ser Met Ser His Ser Met Ile Asn

370 375 380

Gly Thr Ser Lys Leu His Arg Tyr Glu Lys Phe

385 390 395

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcccccggga tgaatcactg cgttcccga 29

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gactagttta aaatttctca tacctgtg 28

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

accagtctct ctctcaagct tatgaatcac tgcgttcccg a 41

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctcaccata ctagtggatc caaatttctc atacctgtg 39

Claims

1.一种密罗木基因MfbHLH15，其特征在于，所述基因MfbHLH15的编码序列如SEQ IDNO.1所示。

2.采用权利要求1所述基因MfbHLH15编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种包含权利要求1所述密罗木基因MfbHLH15的工程菌。

4.如权利要求1所述密罗木基因MfbHLH15在植物抗旱耐盐改良过程中的应用。