CN109182353A

CN109182353A - 一种密罗木基因MfWRKY17及其应用

Info

Publication number: CN109182353A
Application number: CN201811167796.4A
Authority: CN
Inventors: 黄卓; 蒋才忠; 郭涵度; 刘玲; 靳斯涵; 朱培蕾; 彭玉婷; 李西; 马均; 蔡仕珍; 邱嘉睿; 陈佳; 向香盈
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2018-10-08
Filing date: 2018-10-08
Publication date: 2019-01-11
Anticipated expiration: 2038-10-08
Also published as: CN109182353B

Abstract

本发明公开了一种密罗木基因MfWRKY17及其应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过对密罗木抗旱WRKY转录因子的研究，以对植物的抗逆性能进行改良，提高植物的抗逆性能。

Description

一种密罗木基因MfWRKY17及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种密罗木基因MfWRKY17及其应用。

背景技术

干旱和盐渍化是当今植物面临的主要非生物灾害之一，其主要作用机理是使植物内外渗透压不一致导致机体脱水。人口的增长，城镇建设的快速发展，不仅导致民用、工业、农业用水竞争日益激烈，也造成污染加剧，生态系统破坏，水资源短缺，土壤盐渍化现象日益加剧等现象。因此，发掘抗逆基因，培育抗逆性强的植物新品种，对加快建设资源节约型、环境友好型社会，大力发展绿色经济，增强可持续发展能力，实现经济发展和生态文明的有机统一具有重要作用。

基因工程技术是植物抗逆性改良的重要手段。目前，已有不少抗逆基因被报道和应用，其中转录因子基因通过与其调控的下游基因启动子区的顺式作用元件结合而调控靶基因的表达，以对外界不良环境做出响应。与植物抗逆性有关的转录因子很多，如MYB类、bZIP类、WRKY类、AP2/ERF类和NAC类等。WRKY转录因子在植物胁迫响应信号转导过程也扮演着重要角色。WRKY转录因子属于一类大的转录因子家族，参与调控植物生长发育中的多种信号途径，其典型特征为N端存在着由一段长度大约60个氨基酸所组成的保守WRKY结构域。已有大量研究表明WRKY转录因子可受到多种逆境条件如干旱、盐、低温、高温等的诱导，并在植物对逆境的抗性反应中发挥作用。

密罗木主要分布在南非，是地球上为数不多的极耐旱复苏植物之一，也是唯一的木本复苏植物。它能够像种子一样耐受高度脱水干燥，在组织含水量仅存7％-11％时仍能保持遇水复活的特性。因此，密罗木是一种理想地研究植物抗旱性的材料。然而过去，研究人员主要通过形态学、生理、生化等方面研究了该植物的抗旱机理，但对于其中与抗逆相关的基因及其分子机制还不清楚，也尚未见密罗木中抗逆WRKY转录因子及其应用的相关报道。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种密罗木基因MfWRKY17及其应用，该基因能在干旱脱水期快速响应，提高作物的抗旱性能。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种密罗木基因MfWRKY17，该基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

其中，序列表SEQ ID NO.1从密罗木叶片RNA中通过PCR克隆，全长1015bp，核心编码区长度为999bp。

采用上述基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO.2由332个氨基酸组成，有两个核定位信号：LSSSNKKR CHD和HCSKRRKNRV；其含有一个WRKY保守结构域，位于253～311个氨基酸的位置，并且还含有一个典型C2H2型锌指结构，为第二类WRKY转录因子家族。

包含上述密罗木MfWRKY17基因的质粒。

包含上述密罗木MfWRKY17基因的重组表达载体。

包含上述密罗木MfWRKY17基因的转基因细胞系。

包含上述密罗木MfWRKY17基因的工程菌。

密罗木基因MfWRKY17在作物抗旱过程中的应用。

本发明的有益效果为：

1.获得了对干旱及盐胁迫有较高耐受性的转基因拟南芥。

2.密罗木基因MfWRKY17能在干旱脱水期快速响应，为利用该基因提高其他植物的干旱耐受性提供了理论依据及利用价值。

附图说明

图1为密罗木基因MfWRKY17目的片段条带；

图2为本发明的密罗木基因MfWRKY17的系统进化树；

图3为本发明的密罗木基因MfWRKY17在不同脱水时期的表达量；

图4为本发明的密罗木基因MfWRKY17亚细胞定位的结果；

图5为野生型和转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株在干旱胁迫处理后的生长状态；其中，图5a为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的根部生长状态；图5b为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的根长；图5c为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的生长状态；

图6为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的生长状态；其中，图6a为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的根部生长状态；图6b为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的根长；图6c为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的生长状态；

图7为野生型和转基因拟南芥植株失水率测定；

图8为野生型和转基因拟南芥植株的脯氨酸含量测定；

图9为野生型和转基因拟南芥植株的气孔测定；其中，图9a为野生型和转基因拟南芥植株的气孔形状；图9b为野生型和转基因拟南芥植株的气孔闭合程度；图9c为野生型和转基因拟南芥植株的气孔数量；

图10为野生型和转基因拟南芥植株的叶绿素测定；

图11为在干旱条件下，转MfWRKY17基因在拟南芥株系中相关基因的表达量；其中，图11a为NCED3基因的表达量；图11b为RD22基因的表达量；图11c为P5CS5基因的表达量；图11d为RD29A基因的表达量；图11e为RAB18基因的表达量。

图12为在盐胁迫条件下，转MfWRKY17基因在拟南芥株系中相关基因的表达量；其中，图12a为NCED3基因的表达量；图12b为RD22基因的表达量；图12c为P5CS5基因的表达量；图12d为RD29A基因的表达量；图12e为RAB18基因的表达量。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1克隆密罗木MfWRKY17基因

1、取密罗木叶片，液氮速冻，放置-80℃冰箱中保存以备提取总RNA；总RNA提取采用成都兰博生物公司购买的Plant Total RNA Isolation Kit试剂盒来提取；密罗木cDNA的合成使用大连宝生物科技公司的Reverse Transcriptase M–MLV(RNaseH-)，按其产品说明书操作进行第一链合成。

以上述试剂盒合成的cDNA第一链为扩增模板，以设计的F：5’-TCCCCCGGGATGGCGGTTGACTTGCTC-3’(SEQ ID NO.3)和R：5’-GACTAGTTCATGGTGTTGACTCAAACA-3’(SEQ ID NO.4)为引物，为了后续的酶切及重组连接，在设计引物时加上SmaI和SpeI这两个酶切位点，利用PCR进行cDNA扩增，扩增体系见表1，扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min。

表1 PCR扩增体系

试剂	用量
		DNA	100～150ng
引物F	5pmol
		引物R	5pmol
Taq plus聚合酶	1U
		10×PCR缓冲液	2.5μL
Mg<sup>2+</sup>	1.5mM
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 25μL

2、PCR结束后进行电泳分析，采用OMEGA公司的DNA回收试剂盒回收约999bp的扩增片段(见图1)，将扩增片段连接到Peasy-T1Simple克隆载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取白色菌落进行菌落PCR以鉴定阳性克隆，将阳性克隆送到成都擎科生物科技有限公司测定密罗木基因MfWRKY17的编码序列，其序如SEQ ID NO.1所示，再利用ORF Finder软件将所得基因的开放阅读框翻译成氨基酸序列，该氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2密罗木MfWRKY17的序列同源与同源性分析

根据序列测序结果，在NCBI数据库里进行序列比对，发现克隆到的基因序列与WRKY家族转录因子同源关系最近，将该转录因子与其它WRKY转录因子家族成员的蛋白序列进行比对，发现其锌指结构类型为C2H2型，依据该DNA结合域的结构特征，该MfWRKY17蛋白属于第二类WRKY转录因子家族；进一步利用比对的同源性较高物种的氨基酸序列构建系统进化树(如图2)，发现密罗木MfWRKY17与其他物种的亲缘关系较远，其结构域较为保守。

实施例3密罗木不同脱水时期MfWRKY17的表达水平

采用Trizol法分别提取密罗木0，10％，25％脱水阶段叶片总RNA，以提取的总RNA为模板，使用大连宝生物科技公司的Reverse Transcriptase M-MLV(RNaseH-)进行反转录并获取cDNA。

其中Actin作为内参，MfWRKY17及Actin引物设计如下，

Actin引物：

F：5’-ATCACCATTGGGGCTGAACG-3’(SEQ ID NO.5)

R：5’-GTCGACCCACCACTAAGGAC-3’(SEQ ID NO.6)

MfWRKR17引物：

F：5’-TCCTCAATCGCAGACGTTCA-3’(SEQ ID NO.7)

R：5’-CTGCGATATGCTAACGCTCTC-3’(SEQ ID NO.8)

以上述引物为基础进行RT-PCR反应，每个反应3个技术重复，其检测结果如图3显示，从图3中可看出，密罗木MfWRKY17基因在密罗木脱水早期即快速响应，从而提高植物的耐旱性。

实施例4 MfWRKY17的亚细胞定位

根据亚细胞载体pHB-YFP上的碱基和酶切位点情况，以及ClonExpress II同源重组试剂盒的说明，选择HindШ和BamHI这两个酶切位点来设计引物；引物由成都擎科生物公司合成。

采用已合成的带有同源臂的引物，以密罗木cDNA为模板进行扩增，其引物的具体序列如下:

F：5’-ACCAGTCTCTCTCTCAAGCTTATGGCGGTTGACTTGCTC-3’(SEQ ID NO.9)

R：5’-GCTCACCATACTAGTGGATCCTGGTGTTGACTCAAACACC-3’(SEQ ID NO.10)

将扩增得到的PCR产物回收后，与经过HindШ和BamHI内切酶切除的pHB载体相连，构建融合载体35S:MfWRKY17-pHB-YFP；通过将转入pHB-YFP质粒的野生型本氏烟草和转入35S:MfWRKY17-pHB-YFP质粒的野生型本氏烟草叶片制成切片，在激光共聚焦显微镜下观察结果如图4所示；从图4中可看出，只转入pHB-YFP的烟草叶片的荧光信号分布在烟草细胞内的各个部位，而转入MfWRKY17-pHB-YFP质粒的烟草叶片的荧光信号则只出现在细胞核中，说明MfWRKY17基因定位于细胞核中，并在细胞核中起作用。

实施例5：密罗木基因MfWRKY17植物表达载体的构建

将上述经测序正确的菌液提取质粒，含MfWRKY17基因的克隆载体质粒经SmaI+SpeI双酶切后，利用DNA回收试剂盒回收999bp左右的DNA片段，将此片段与相应酶切的pGSA1403表达载体相连，获得的载体命名为35S:MfWRKY17-pGSA1403。

实施例6：MfWRKY17基因的遗传转化

将农杆菌LBA4404感受态细胞置于冰上解冻，取5μL重组质粒35S:MfWRKY17-pGSA1403于200μL感受态中，用枪头轻轻混匀，冰浴30min，液氮速冻1min，37℃水浴5min，冰上放置2min后加入800μL LB液体培养基，在恒温培养箱中29℃，120r/min，培养2～4h。将上述菌液均匀涂布在含10μg/mL氯霉素的LB固体培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养，然后挑取单菌斑接种于5mL LB液体培养基中，28℃，250r/min振荡培养24h。取1mL上述菌液转入50mL含10μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，于28℃，250r/min，振荡培养至OD₆₀₀≈1.5。将上述OD值达标的菌液4℃，8000r/min离心10min收集菌体，弃掉上清，用等体积的5％蔗糖溶液将菌体重悬，在菌液中加入Silwet-77并混匀，使溶液浓度达到0.02％且菌液OD₆₀₀≈0.8。

转化前需剪掉成熟的果荚，颠倒植株让植株浸入农杆菌细胞悬浮液2min，然后将浸好的植株用滤纸擦干并用塑料薄膜包裹，暗处理24h后于光照培养箱中正常培养，一周后可重复浸染一次。待种荚黄化后收种，记为T0代。继续将T0代拟南芥种子放入含有50μg/mL卡那霉素的培养基里，转入外源基因的植株能在含有卡那霉素的抗性培养基上生长，而非转基因植株则不能正常生长。因此筛选出能正常生长且颜色呈深绿色的植株，对深绿色植株提取DNA并进行PCR检测阳性，获得T₁代转基因植株，重复筛选步骤直至筛选出阳性过表达纯系植株。

实施例7：转基因拟南芥的胁迫处理

对于幼苗处理，是将野生型和过表达T3代纯系(Line-F，Line-M)分别播种于配置含NaCl(100mM，150mM)、甘露醇(200mM，250mM)的1/2MS培养基中，对照组只添加正常成分，记为CK。每个方形培养皿中三种株系分成两排点播，每排15株左右，每个处理重复三次，4℃暗处理2d后移入光照培养箱中垂直放置，继续培养2周，在根系分析仪下拍照并测量根长。

干旱胁迫下的幼苗表型如图5中的图5a和图5b，其中，图5a为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的根部生长状态；图5b为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的根长；图5c为野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的生长状态。

盐胁迫下的幼苗表型如图6中的图6a和图6b，其中，图6a为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的根部生长状态；图6b为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的根长；图6c为野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的生长状态。

对于成株的处理，是将野生型拟南芥(WT)和过表达T3代纯系(Line-F，Line-M)种子播种在1/2MS圆形培养皿，4℃暗处理3d后移入光照培养箱中培养至四叶期后移入花盆中，培养3周左右，选择长势一致的植株进行抗逆性分析。

干旱胁迫处理：对照组(记为CK)正常浇水管理，其余组均不浇水使其自然干旱失水，期间不断观察拍照并记录植株生长状况，失水3周左右开始复水，处理期间拍照观察。野生型和转基因拟南芥植株在干旱胁迫处理后的生长状态如图5c；每个株系10株重复。

盐胁迫处理：对照组不作处理，记为CK，其余组每隔3天浇一次300mM的氯化钠处理液。2周后观察WT与过表达植株表型差异。野生型和转基因拟南芥植株在氯化钠胁迫处理后的生长状态如图6c；每个株系10株重复。

通过研究野生型与过表达拟南芥幼苗和成株在干旱及氯化钠胁迫下的表型，发现过表达MfWRKY17基因株系Line-F和Line-M对干旱及盐的耐受性均明显强于WT，说明过表达MfWRKY17基因提高了拟南芥对盐及干旱胁迫的抗性。

实施例8：相关生理指标的测定

(1)拟南芥的培养

将野生型拟南芥(WT)和过表达T3代纯系(Line-F，Line-M)种子播撒在1/2MS圆形培养皿，4℃暗处理3d后转入光照培养箱中培养7天，移栽至50孔穴盘内(已等量分装好营养土并浇足水)，继续培养4周左右。

(2)失水率的处理及测定

将穴盘中培养的WT，Line-F，Line-M浇足水分，剪去莲座叶对其取样，在天平上用定量滤纸称取三个株系各0.5g叶片，此时叶片含水量为初始含水量，记为m0，此后将叶片放入恒温光照培养箱中让其自然干旱(25℃，60％相对湿度)，在0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h、6h、7h分别称取叶片即时重量。结果如图7所示。

(3)脯氨酸含量的测定

在天平上准确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内用少量蒸馏水溶解后倒入250mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100μg；取6个50mL容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3mL，用蒸馏水定容至刻度并混匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL。

拟南芥的培养同步骤(1)，4周后对WT，Line-F，Line-M三种植株进行自然干旱和浇灌300mM氯化钠溶液处理(自然干旱处理14d，氯化钠处理2d)，随后取正常条件和经过干旱、氯化钠处理的WT，Line-F，Line-M植株叶片鲜样各0.5g，加入少许石英砂和少许3％的磺基水杨酸溶液在研钵中磨碎，倒入10mL离心管并定容至10mL，4500r离心3min。取上清液并用3％的磺基水杨酸溶液定容至10mL。吸取2mL提取液至一洁净干燥玻璃试管中，加入2mL酸性茚三酮和2mL冰乙酸，100℃加热1h，放入冰水中终止反应，加入4mL甲苯，充分振荡15～20s，静置分层后用移液枪轻轻吸取上层红色溶液于比色皿中，以甲苯为对照，在分光光度计520nm波长处比色并求得吸光度值，此步骤重复两次，结果如图8所示。

(4)甘露醇处理下气孔开度的测定

拟南芥的培养同(1)，取WT，Line-F，Line-M的莲座叶叶片，每个株系撕取10块下表皮，置于100mL的MES-KCl缓冲液(50mM KCl，0.1mM CaCl₂，10mM MES，pH 6.15)中光诱导2.5h，然后每个株系取5块下表皮分别置于100mL不含以及含300mM甘露醇的MES-KCl缓冲液(50mM KCl，0.1mM CaCl₂，10mM MES，pH 6.15)中光下处理2h，处理完后放在荧光显微镜(10*40)下观察，气孔闭合程度(长与宽的比)作为统计气孔开度的指标，每个表皮条随机选取4个视野，每个视野随机测量10个气孔，总共统计100个气孔细胞，结果如图9所示，其中，图9a为野生型和转基因拟南芥植株的气孔形状；图9b为野生型和转基因拟南芥植株的气孔闭合程度；图9c为野生型和转基因拟南芥植株的气孔数量。

(5)盐胁迫下叶绿素含量的测定

拟南芥的培养同步骤(1)，4周后对WT，Line-F，Line-M三种植株浇灌200mM氯化钠溶液处理2天，随后取正常生长和经氯化钠处理的WT，Line-F，Line-M植株叶片鲜样各0.5g，将其叶中脉剪掉并剪碎叶片，加入到50mL的棕色容量瓶中，分别加入上述95％乙醇提取液50mL，将容量瓶加塞放入25℃的恒温培养箱中暗中提取48h。因为95％乙醇提取液在波长为649nm和665nm处具有最大吸光值A649和A665，所以用紫外分光光度计测量A649和A665，以95％乙醇提取液作为空白对照，此步骤重复两次；结果如图10所示。

实施例9：MfWRKY17转基因拟南芥中NCED3、RD22、P5CS5、RD29A、RAB18胁迫相关基因表达量测定

提前一天将培养4周的野生型拟南芥(WT)和过表达T3代纯系(Line-F，Line-M)的穴盘里浇足水分，此时对WT和过表达株系的叶片进行取样，记为CK，干旱处理按照自然干旱处理12h、24h、36h、48h共5个时间点对三个株系的叶片取样。氯化钠处理按照浇足200mM的氯化钠后的12h、24h、30h、36h共5个时间点对三个株系的叶片取样。分别提取各转基因株系拟南芥总RNA，利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，利用Primer5设计内参Actin以及NCED3、RD22、P5CS5、RD29A、RAB18基因的引物，具体引物序列如下:

Actin：

F：5’-GGAAGGATCTGTACGGTAAC-3’(SEQ ID NO.11)

R：5’-TGTGAACGATTCCTGGACCT-3’(SEQ ID NO.12)

NCED3：

F：5’-CGAGCCGTGGCCTAAAGTCT-3’(SEQ ID NO.13)

R：5’-GCTCCGATGAATGTACCGTGAA-3’(SEQ ID NO.14)

RD22：

F：5’-ACTTGGTAAATATCACGTCAGGGCT-3’(SEQ ID NO.15)

R：5’-CTGAGGTGTTCTTGTGGCATACC-3’(SEQ ID NO.16)

P5CS5：

F：5’-GGTGGACCAAGGGCAAGTAAGATA-3’(SEQ ID NO.17)

R：5’-TCGGAAACCATCTGAGAATCTTGT-3’(SEQ ID NO.18)

RD29A：

F：5’-GATAACGTTGGAGGAAGAGTCGG-3’(SEQ ID NO.19)

R：5’-TCCTGATTCACCTGGAAATTTCG-3’(SEQ ID NO.20)

RAB18：

F：5’-GCAGTATGACGAGTACGGAAATCC-3’(SEQ ID NO.21)

R：5’-CCTTGTCCATCATCCGAGCTAGA-3’(SEQ ID NO.22)

然后进行实时荧光定量PCR检测，其检测结果见图11；其中，图11a为NCED3基因的表达量；图11b为RD22基因的表达量；图11c为P5CS5基因的表达量；图11d为RD29A基因的表达量；图11e为RAB18基因的表达量。

从图11中可以看出，在自然干旱条件下，MfWRKY17基因的过表达影响了NCED3、RD22、RD29A、RAB18基因的表达，这表明MfWRKY17基因可能通过诱导这些基因的上调表达来提高过表达植株的抗旱能力。而在干旱24h和48h时过表达植株体内P5CS5基因的表达量显著低于WT，说明MfWRKY17基因可能对P5CS5基因起负调控作用。

而在氯化钠胁迫条件下的MfWRKY17基因的检测量如图12所示，其中，图12a为NCED3基因的表达量；图12b为RD22基因的表达量；图12c为P5CS5基因的表达量；图12d为RD29A基因的表达量；图12e为RAB18基因的表达量。

从图12中可看出，过表达MfWRKY17植株体内NCED3、P5CS5、RAB18基因的表达量都发生了显著上调，且高于WT，说明MfWRKY17基因可能通过诱导这三个基因的上调来应对高盐胁迫，而在处理前后的大多数时间点内，RD22和RD29A在过表达株系Line-F的表达量显著高于WT，而在过表达株系Line-M中却与WT几乎没有差异，这可能是由于MfWRKY17基因在野生型拟南芥中插入的位点不同导致了株系间的差异。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种密罗木基因MfWRKY17及其应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 999

<212> DNA

<213> 密罗木(Myrothamnus flabellifolia)

<400> 1

atggcggttg acttgctcgg gtatacaaag atggacgaac agatggcgat ccaagaggcc 60

gcttcagctg gattaaggag catggagcat ctgatccttg tattatcaca tcagtcacac 120

caatctaacc aattagattg caaagaaatc acagatttca ccgtctcaaa gttcaaaaag 180

gtcatctcca tcttaaatcg aacaggtcat gctcgatttc gccgtggtcc ttctcaatca 240

tcggcttcta cgtctgttcc tcaatcgcag acgttcaatc taacttcgac cgccttcgta 300

caatctaagc cacggccgca gcagcagcca cagccgcagc cacagccaca atatctaacg 360

ctcgacttca caaaacctaa tatgctgtct tcaaactgtg agcagcttac tgacgtagtt 420

tcgacgagtc aattcacaaa ggagagcgtt agcatatcgc agcctatgtc ttcgacaaac 480

tcgtccttca tgtcgtccat caccgaaaac ggaagtgttt cagacggaaa acaagggtcg 540

tctttgttct tagctccggc gccggcagtt tccgccggta aaccaccttt atcgtcgtcc 600

aataagaaga gatgtcatga tcatgatcat gatcattccg atgaactttc cgggaagcaa 660

tccagttccg gccgatgtca ctgctcgaaa agaaggaaaa atcgggtaaa gagtacgatt 720

agagtgccgg caattagttc aaaaatagcc gatattccgc cagacgaata ttcttggaga 780

aagtacggac aaaagccgat caagggttcg ccctacccaa ggggctatta taaatgcagt 840

agcttaaggg gctgtcctgc gagaaaacac gtcgagcgtg ctccagatga tccaacgatg 900

ttgatcgtca cctatgaagg ggagcaccgg cactcaaaac tcacatcgca ggagaatatt 960

tctggaggtg caggtttggt gtttgagtca acaccatga 999

<210> 2

<211> 332

<212> PRT

<213> 密罗木(Myrothamnus flabellifolia)

<400> 2

Met Ala Val Asp Leu Leu Gly Tyr Thr Lys Met Asp Glu Gln Met Ala

1 5 10 15

Ile Gln Glu Ala Ala Ser Ala Gly Leu Arg Ser Met Glu His Leu Ile

20 25 30

Leu Val Leu Ser His Gln Ser His Gln Ser Asn Gln Leu Asp Cys Lys

35 40 45

Glu Ile Thr Asp Phe Thr Val Ser Lys Phe Lys Lys Val Ile Ser Ile

50 55 60

Leu Asn Arg Thr Gly His Ala Arg Phe Arg Arg Gly Pro Ser Gln Ser

65 70 75 80

Ser Ala Ser Thr Ser Val Pro Gln Ser Gln Thr Phe Asn Leu Thr Ser

85 90 95

Thr Ala Phe Val Gln Ser Lys Pro Arg Pro Gln Gln Gln Pro Gln Pro

100 105 110

Gln Pro Gln Pro Gln Tyr Leu Thr Leu Asp Phe Thr Lys Pro Asn Met

115 120 125

Leu Ser Ser Asn Cys Glu Gln Leu Thr Asp Val Val Ser Thr Ser Gln

130 135 140

Phe Thr Lys Glu Ser Val Ser Ile Ser Gln Pro Met Ser Ser Thr Asn

145 150 155 160

Ser Ser Phe Met Ser Ser Ile Thr Glu Asn Gly Ser Val Ser Asp Gly

165 170 175

Lys Gln Gly Ser Ser Leu Phe Leu Ala Pro Ala Pro Ala Val Ser Ala

180 185 190

Gly Lys Pro Pro Leu Ser Ser Ser Asn Lys Lys Arg Cys His Asp His

195 200 205

Asp His Asp His Ser Asp Glu Leu Ser Gly Lys Gln Ser Ser Ser Gly

210 215 220

Arg Cys His Cys Ser Lys Arg Arg Lys Asn Arg Val Lys Ser Thr Ile

225 230 235 240

Arg Val Pro Ala Ile Ser Ser Lys Ile Ala Asp Ile Pro Pro Asp Glu

245 250 255

Tyr Ser Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Pro Ile Lys Gly Ser Pro Tyr

260 265 270

Pro Arg Gly Tyr Tyr Lys Cys Ser Ser Leu Arg Gly Cys Pro Ala Arg

275 280 285

Lys His Val Glu Arg Ala Pro Asp Asp Pro Thr Met Leu Ile Val Thr

290 295 300

Tyr Glu Gly Glu His Arg His Ser Lys Leu Thr Ser Gln Glu Asn Ile

305 310 315 320

Ser Gly Gly Ala Gly Leu Val Phe Glu Ser Thr Pro

325 330

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcccccggga tggcggttga cttgctc 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gactagttca tggtgttgac tcaaaca 27

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atcaccattg gggctgaacg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtcgacccac cactaaggac 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcctcaatcg cagacgttca 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctgcgatatg ctaacgctct c 21

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

accagtctct ctctcaagct tatggcggtt gacttgctc 39

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gctcaccata ctagtggatc ctggtgttga ctcaaacacc 40

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggaaggatct gtacggtaac 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgtgaacgat tcctggacct 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgagccgtgg cctaaagtct 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gctccgatga atgtaccgtg aa 22

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

acttggtaaa tatcacgtca gggct 25

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctgaggtgtt cttgtggcat acc 23

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggtggaccaa gggcaagtaa gata 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tcggaaacca tctgagaatc ttgt 24

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gataacgttg gaggaagagt cgg 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tcctgattca cctggaaatt tcg 23

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcagtatgac gagtacggaa atcc 24

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ccttgtccat catccgagct aga 23

Claims

1.一种密罗木基因MfWRKY17，其特征在于，所述基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

2.采用权利要求1所述基因编码的蛋白质，其特征在于，所述氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。

3.一种包含权利要求1所述密罗木MfWRKY17基因的质粒。

4.一种包含权利要求1所述密罗木MfWRKY17基因的重组表达载体。

5.一种包含权利要求1所述密罗木MfWRKY17基因的转基因细胞系。

6.一种包含权利要求1所述密罗木MfWRKY17基因的工程菌。

7.密罗木基因MfWRKY17在植物抗旱改良过程中的应用。