CN110004158B - 一种毛竹基因PeLEA14及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种毛竹基因PeLEA14及其应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过对毛竹抗旱LEA蛋白基因的研究，以对植物的抗旱性能进行改良，提高植物的抗旱性能。

Description

一种毛竹基因PeLEA14及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种毛竹基因PeLEA14及其应用。

背景技术

干旱和盐渍化是当今植物面临的主要非生物胁迫，其主要作用机理是使植物内外渗透压不一致导致机体脱水、萎焉、甚至死亡。为了应对这种环境的变化，植物发展演变出了多种生存策略，而植物胚胎发育晚期丰富(LEA)蛋白的发展演变就是策略之一，在植物应对复杂多变的环境下起着至关重要的作用。研究表明，LEA蛋白在植物对抗逆境中发挥着重要的作用。

研究表明，大多数高等植物种子成熟的最后阶段脱去90％的水分，脱水状态将有利于种子在极端干旱的环境中生存和传播。LEA蛋白普遍出现在胚胎发育的晚期，其含量随种子的脱水程度的增加而积累，在种子吸水萌动的几个小时后便逐渐消失。此外，离体胚和许多营养组织在外源ABA、渗透或低温胁迫的诱导下也能产生特异的Lea mRNA和LEA蛋白。这表明，LEA蛋白虽是阶段发育专一的，但可以被诱导，且无组织专一性。LEA蛋白由于具有很高的亲水性和热稳定性，使它即使在煮沸条件下也能保持水溶状态。研究表明，植物在水分胁迫中面临的最主要的问题是细胞组成成分的晶体化，这将破坏细胞的有序结构，导致细胞脱水死亡，影响植株的正常生长。而LEA蛋白高度亲水性的特性，能把足够的水分捕获到细胞内，从而保护细胞免受干旱胁迫的伤害。LEA蛋白的另一个特点是它们中的有些成员可被ABA和水分胁迫因子诱导产生，有时二者的作用可相互代替，如：为发育成熟的小麦胚在体外培养时并不累积LEA蛋白，但若在培养基中加入ABA或施加渗透胁迫条件，则可诱导LEA蛋白的产生。总之，据已有的很有研究表明，LEA蛋白的存在似乎总与脱水耐受性有密不可分的关系。

毛竹是中国分布最广的竹种之一，是重要的园林观赏植物和经济植物。由于毛竹较高的经济价值和观赏价值，前人在毛竹应对逆境时的抗逆机制做了深入研究。漆酶(LAC)在植物的生长发育过程中起到重要作用，李利超等学者在对毛竹进行ABA处理时，发现PeLAC的表达量出现明显变化，这反映了PeLAC对外源ABA较为敏感，可能参与了ABA的响应。毛竹在经受盐胁迫时，其PeSCR基因的表达发生明显变化，表明该基因参与了毛竹对盐胁迫的响应。肖冬长等学者从毛竹中克隆出PeMYB2并转入拟南芥中，发现盐胁迫处理后的拟南芥转基因植株具有更好的耐受性，并且进一步实验结果表明PeMYB2能调控下游相关抗逆基因的表达。了解毛竹的抗逆机制在应对森林资源匮乏、能源危机、环境恶化等方面发挥着重要作用。因此，进一步了解毛竹的分子抗逆机制有着重要的意义。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种毛竹基因PeLEA14及其应用，该基因能在干旱胁迫下表达量明显上调，提高植物的抗旱性能。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种毛竹基因PeLEA14，该基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

其中，SEQ ID NO.1所示序列为从毛竹叶片RNA中通过PCR克隆得到的，核心编码区长度为456bp。

采用上述基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO.2所示氨基酸序列由151个氨基酸组成，分子量为37.48kD，等电点(pI)为5.14。通过NCBI上BLAST分析得知，PeLEA14蛋白基因有明显的5C亚族(LEA_2)的蛋白结构域，该蛋白结构域位于44-140个氨基酸的位置，可以看出PeLEA14蛋白基因属于5C亚族(LEA_2)蛋白家族。

包含上述毛竹PeLEA14基因的转基因细胞系。

包含上述毛竹PeLEA14基因的工程菌。

毛竹基因PeLEA14在植物抗旱过程中的应用。

本发明的有益效果为：

1.获得了对干旱及盐有较高耐受性的转基因烟草。

2.毛竹基因PeLEA14能在干旱胁迫下表达量明显上调，为利用该基因提高其他植物的干旱耐受性提供了理论依据及利用价值。

附图说明

图1为本发明的毛竹基因PeLEA14在不同脱水时期及低温下的表达量；

图2为转PeLEA14基因植株的阳性鉴定结果；

图3为野生型和转基因烟草植株在干旱胁迫处理后的生长状态；其中，图3a为野生型和转基因烟草组培苗在干旱胁迫处理后的植株生长状态；图3b为野生型和转基因烟草植株在干旱胁迫处理后的成株表型；

图4为野生型和转基因烟草植株在氯化钠胁迫处理后的生长状态；其中，图4a为野生型和转基因烟草组培苗在氯化钠胁迫处理后的植株生长状态；图4b为野生型和转基烟草植株在氯化钠胁迫处理后的成株表型；

图5野生型植株和转基因烟草植株在胁迫条件下的脯氨酸含量比较；其中，图5a为干旱条件下野生型和转基因烟草的叶片脯氨酸含量；图5b为氯化钠条件下野生型和转基因烟草的叶片脯氨酸含量；

图6为野生型植株和转基因烟草植株在胁迫条件下的叶绿素含量比较；其中，图6a为干旱条件下野生型和转基因烟草的叶片叶绿素含量；图6b氯化钠条件下野生型和转基因烟草的叶片叶绿素含量；

图7为野生型植株和转基因烟草植株在胁迫条件下的MDA含量比较；其中，图7a为干旱条件下野生型和转基因烟草的叶片MDA含量；图7b氯化钠条件下野生型和转基因烟草的叶片MDA含量；

图8为野生型植株和转基因烟草植株在胁迫条件下的可溶性蛋白含量比较；其中，图8a为可溶性蛋白的标曲；图8b为干旱条件下野生型和转基因烟草的叶片可溶性蛋白含量；图8c为氯化钠条件下野生型和转基因烟草的叶片可溶性蛋白含量；

图9为野生型植株和转基因烟草植株在胁迫条件下的SOD活性比较；其中，图9a为干旱条件下野生型和转基因烟草的叶片SOD活性；图9b氯化钠条件下野生型和转基因烟草的叶片SOD活性；

图10为野生型植株和转基因烟草植株在胁迫条件下的POD活性比较；其中，图10a为干旱条件下野生型和转基因烟草的叶片POD活性；图10b氯化钠条件下野生型和转基因烟草的叶片POD活性。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1克隆毛竹PeLEA14基因

1、取毛竹叶片，液氮速冻，放置-80℃冰箱中保存以备提取总RNA；总RNA提取使用Plant Total RNA Isolation Kit试剂盒(购自成都兰博生物科技公司)，按其产品说明书进行操作，进行第一链合成。

以上述试剂盒合成的cDNA第一链为扩增模板，以设计的F：5’-ACCAGTCTCTCTCTCAAGCTTCCATCAAACTAGCAGCACGC-3’(SEQ ID NO.3)和R：5’-GCTCACCATACTAGTGGATCCCTCGACCAGGCATGTTCCTT-3’(SEQ ID NO.4)为引物，为了后续的酶切及重组连接，在设计引物时加上HindIII和BamHI这两个酶切位点及接头序列，利用RT-PCR进行cDNA扩增，扩增体系见表1，扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min。

表1 PCR扩增体系

2、PCR结束后进行电泳分析，采用OMEGA公司的DNA回收试剂盒回收带大小正确的扩增片段，将扩增片段连接到pHB克隆载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取白色菌落进行菌落PCR以鉴定阳性克隆，将阳性克隆送到成都擎科生物科技有限公司测定毛竹基因PeLEA14的编码序列，其序如SEQ ID NO.1所示，再利用ORF Finder软件将所得基因的开放阅读框翻译成氨基酸序列，该氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2毛竹PeLEA14基因在不同脱水时期的表达量

使用TRIZOL RNA试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)分别提取经0，2h，8h脱水处理后的毛竹叶片总RNA，以提取的总RNA为模板，使用大连宝生物科技公司的ReverseTranscriptase M-MLV(RNaseH-)进行反转录并获取cDNA，通过成都Onmath Co.IlluminaHiSeq^TM4000平台进行cDNA文库构建和测序。测序结果表明，对毛竹叶片施以干旱的胁迫时，毛竹LEA蛋白家族中PeLEA14基因在脱水胁迫条件下基因表达量明显上调(见图1)。

实施例3：PeLEA14基因的遗传转化

将农杆菌GV3101感受态细胞置于冰上解冻，取5μL经鉴定为正确的表达载体质粒DNA于200μL感受态中，用枪头轻轻混匀，冰浴30min，液氮速冻1min，37℃水浴5min后，立即置于冰上2min后加入800μL LB液体培养基，在恒温培养箱中29℃，120r/min，培养2～4h。将上述菌液均匀涂布在含卡那霉素的LB固体培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养，然后挑取单菌斑接种于5mL LB液体培养基中，28℃，250r/min振荡培养24h。取1mL上述菌液转入50mL含卡那霉素的LB液体培养基中，于28℃，250r/min，振荡培养培养6～8h；菌液PCR检测阳性菌，电泳时加设蒸馏水作阴性对照。挑选5管阳性菌液加入50％甘油液氮速冻1min后于-80℃保存。

在超净台内，取野生烟草组培苗叶片于无菌的培养皿内，剪掉中脉和边缘，将叶片剪成1cm×1cm大小的块状。将烟草叶块在农杆菌重悬液中浸泡8～9min，期间不断摇晃以保证叶片与菌液充分接触。倒掉菌液，将叶块取出，用无菌滤纸吸干多余菌液。接种于烟草叶预培养基MS1中，每皿约接种5-6个烟草叶块，暗条件28℃培养3d。取出叶块，用500mg/L的Cef溶液清洗3-5次。无菌滤纸吸干叶块上多余水分，接种于烟草延迟培养基MS2中，每皿约接种6个叶块，25℃正常光照条件，延迟培养7d。叶块转移至烟草筛选分化培养基MS3中，相同条件培养，每15d更换一次培养基，直至分化出小苗(若中途叶块感菌严重及时更换培养基)。待小芽长出2cm或2-3片真叶，将芽切下接种于烟草幼苗生根培养基MS4中。选择根系发育良好，高度约10cm的烟草，开盖于培养室中炼苗3d，小心洗净根部培养基后移栽至花盆，土壤营养丰富且条件相同，先于光照培养箱中培养7d，以逐步适应外界环境，最后正常管理。最后对转基因烟草叶片提取DNA进行阳性鉴定，其结果见图2，其中，2～9和11～20泳道均扩增出456bp左右的条带，为含有目的片段的转基因烟草植株。

表2转化实验所用培养基及配方

实施例4：转基因烟草的胁迫处理

对于组培苗的处理，配置含有正常成分的1/2MS培养基于组培瓶中，记为对照组(CK)，再分别配置含100mM/L NaCl、200mM/L甘露醇的1/2MS培养基。将生长势一致的野生型烟草植株与转基因烟草植株分别转入MS培养基与胁迫处理培养基中放入22℃±1℃的光照培养箱正常培养。期间观察其长势并记录拍照。

干旱胁迫下的抗性表型如图3，其中，图3a为野生型和转基因烟草组培苗植株在干旱胁迫处理后的植株生长状态；图3b为野生型和转基因烟草成苗植株在干旱胁迫处理后的生长状态。

盐胁迫下的抗性表型如图4，其中，图4a为野生型和转基因烟草组培苗植株在氯化钠胁迫处理后的植株生长状态；图4b为野生型和转基因烟草成苗植株在氯化钠胁迫处理后的生长状态。

对于成苗的处理，是选取生长势一致的野生型烟草苗和转基因烟草苗，开盖炼苗3d后洗净根部转入无菌土放入22±1℃的光照培养箱正常培养。7天后进行胁迫处理。

盐胁迫处理：每盆烟草植株浇灌约300mL的300mM/L NaCl溶液，处理前对试验植株取样拍照记为为CK。随后在处理3d，7d，10d，15d天时分别取样以作后续生理指标测量(所有指标测量做三个重复)，期间观察其长势并记录拍照。

干旱胁迫处理：处理前将各试验植株浇水至完全湿润，并取样拍照，记为CK。随后对烟草植株进行自然干旱处理，在干旱处理3d，7d，10d，15d天时分别取样以作后续生理指标测量(所有指标测量做三个重复)，同时观察其长势并记录拍照。

通过研究野生型与转基因烟草组培苗和成苗在干旱及氯化钠胁迫下的表型，发现过表达PeLEA14基因烟草植株对干旱及盐的耐受性均明显强于WT，说明过表达PeLEA14基因提高了烟草对盐及干旱胁迫的抗性。

脯氨酸含量的测定

绘制标准曲线。称取不同处理的待测植物叶片各0.5g(三个平行)，加入石英砂用3％磺基水杨酸研磨提取。吸取2mL提取液，加入2mL冰醋酸及2mL酸性茚三酮试剂，在100℃沸水浴中加热1h(溶液呈红色)。放入冰水浴中终止反应，冷却后加入4mL甲苯，摇荡30s，静置2h后分层。吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在酶标仪上以520nm波长处比色，求得吸光度值，其计算公式如下：

脯氨酸含量(μg/g)＝C*V/(Vm*W)；

其中，C为脯氨酸浓度，V为提取液总体积，Vm为测定用提取液体积，W为样品鲜重。

检测结果如图5所示，其中，图5a为干旱条件下野生型和转基因烟草的叶片脯氨酸含量；图5b为氯化钠条件下野生型和转基因烟草的叶片脯氨酸含量。

叶绿素含量的测定

将不同处理的0.1克新鲜叶片剪成碎片，放在研钵中，加入乙醇10mL共研磨成匀浆，再加5mL乙醇，过滤，最后将滤液用乙醇定容到25mL。将叶绿素提取液注入酶标板放入酶标仪中进行测定，另加乙醇注入另一孔作为对照，分别以665nm和649nm波长测出该色素液的光密度，叶绿素含量计算公式如下：

叶绿素a浓度：Ca＝13.95A₆₆₅－6.88A₆₄₉；叶绿素b浓度：Cb＝24.96A₆₄₉－7.32A₆₆₅；叶绿素总浓度：C＝Ca+Cb；叶绿素总量(mg/g)＝C×25/1000×1/0.2。

检测结果如图6所示，其中，图6a为干旱条件下野生型和转基因烟草的叶片叶绿素含量；图6b氯化钠条件下野生型和转基因烟草的叶片叶绿素含量。

MDA(丙二醛)含量的测定

称取受胁迫处理的叶片0.5g，加入石英砂和10％三氯乙酸2mL，研磨至匀浆，再加8mL 10％三氯乙酸进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min，其上清液为丙二醛提取液。取3支样品管(三个重复)，各加入提取液2mL，对照管加蒸馏水2mL，然后各管再加入2mL 0.6％硫代巴比妥酸溶液。摇匀，混合液在沸水浴中反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液注入酶标板中放入酶标仪，分别在532、600和450nm波长下测定吸光度(A)值，其计算公式如下：

MDA浓度(μmol/L)＝6.45×(A₅₃₂-A₆₀₀)-0.56×A₄₅₀；MDA含量(μmol/g.F.W)＝C(μmol/L)×Vt/(Vm(mL)×W(g))；

其中，C为MDA浓度，Vt为提取液总体积，Vm为测定时提取液总体积，W为样品鲜重。

检测结果如图7所示，其中，图7a为干旱条件下野生型和转基因烟草的叶片MDA含量；图7b氯化钠条件下野生型和转基因烟草的叶片MDA含量。

可溶性蛋白质含量的测定

绘制标准曲线。称取鲜样0.2g，用5mL磷酸缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min离心10min，上清液备用。此为实验用植物酶液。吸取样品提取液1.0mL(视蛋白质含量适当稀释)，放入试管中(每个样品重复2次)，加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查找蛋白质的含量，蛋白含量的计算公式如下：

样品蛋白质的含量(mg/g)＝C×Vt/(1000×Vs×W)；

其中，C—查标准曲线值，μg；Vt—提取液总体积，mL；W—样品鲜重，g；Vs—测定时加样量，mL。

检测结果如图8所示，其中，图8a为可溶性蛋白的标曲；图8b为干旱条件下野生型和转基因烟草的叶片可溶性蛋白含量；图8c为氯化钠条件下野生型和转基因烟草的叶片可溶性蛋白含量。

SOD(超氧化物歧化酶)含量的测定

分别取Met：162mL，EDTA-Na2：6mL，NBT：6mL，核黄素：6mL于烧杯中混匀备用。吸取40μL的酶液，并分别加入3mL的混合反应液，同时取两支试管作对照，一支加入40μL磷酸缓冲液+3mL混合反应液作空白对照，一支40μL磷酸缓冲液+3mL混合反应液用锡箔纸包好避光以作测定时调零。将试管置于光照培养箱中4000Lux，25℃下反应20min。以黑暗处理下的试管调零，测定各反应液560nm下吸光度值，SOD总活性计算公式如下：

SOD总活性(U/g.FW)＝(Ack-AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt)；

其中，Ack为照光管吸光度值，AE为遮光管的吸光度值，V为样品液总体积(mL)，Vt为测定时样品用量(mL)，W为样品鲜重。(SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％作为一个酶活性单位(u))

检测结果如图9所示，其中，图9a为干旱条件下野生型和转基因烟草的叶片SOD活性；图9b氯化钠条件下野生型和转基因烟草的叶片SOD活性。

POD(过氧化物酶)含量的测定

配制POD反应液，保存于冰箱中备用。取40μL酶液+3mL反应液于试管中混匀，对照管加入40μL磷酸缓冲液+3mL反应液。在OD＝470nm下每隔1min读数一次，共读三次，以每分钟内△A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(u)，POD活性计算公式如下：

POD活性(U/g.FW.min)＝△A₄₇₀×Vt/(W×Vs×0.01×t)；

其中，△A₄₇₀为反应时间内吸光度的变化，Vt为提取液总体积(mL)，W为样品鲜重(g)，Vs为测定时取用酶液体积(mL)，t为反应时间(min)。

检测结果如图10所示，其中，图10a为干旱条件下野生型和转基因烟草的叶片POD活性；图10b氯化钠条件下野生型和转基因烟草的叶片POD活性。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种毛竹基因PeLEA14及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 456

<212> DNA

<213> 毛竹(Phyllostachys edulis)

<400> 1

atggcgcagc tgatggacaa ggcgaagggg ttcgtggcgg acaaggtggc gcgggtgcag 60

aagccggagg cggacctgtc cgacctgtcg gtgcagcacg tcggccgcga cggcgccact 120

ctgggcggcc gcctcgacgt ccgcaacccc tactcccact ccatcccaat ctgcgagatc 180

agctactcgc tcatgagcgc cgggcgggag gtcgcgtccg ggacgatgcc ggacccgggg 240

tcgctgacgg ccggcgacac gacgaggctg gacataccgg tgaaggtgcc gtacgacttc 300

ctcgtgagcc tggtgaagga cgtgggccgg gactgggacc tcgactacga gatgcgcgtc 360

gggctcaccc tcgacctccc catcgtcggc agctttaccc tgccgctcac caagtccggc 420

gagctcaagc tccccacgct ctccaccatc ttctaa 456

<210> 2

<211> 152

<212> PRT

<213> 毛竹(Phyllostachys edulis)

<400> 2

Met Ala Gln Leu Met Asp Lys Ala Lys Gly Phe Val Ala Asp Lys Val

1 5 10 15

Ala Arg Val Gln Lys Pro Glu Ala Asp Leu Ser Asp Leu Ser Val Gln

20 25 30

His Val Gly Arg Asp Gly Ala Thr Leu Gly Gly Arg Leu Asp Val Arg

35 40 45

Asn Pro Tyr Ser His Ser Ile Pro Ile Cys Glu Ile Ser Tyr Ser Leu

50 55 60

Met Ser Ala Gly Arg Glu Val Ala Ser Gly Thr Met Pro Asp Pro Gly

65 70 75 80

Ser Leu Thr Ala Gly Asp Thr Thr Arg Leu Asp Ile Pro Val Lys Val

85 90 95

Pro Tyr Asp Phe Leu Val Ser Leu Val Lys Asp Val Gly Arg Asp Trp

100 105 110

Asp Leu Asp Tyr Glu Met Arg Val Gly Leu Thr Leu Asp Leu Pro Ile

115 120 125

Val Gly Ser Phe Thr Leu Pro Leu Thr Lys Ser Gly Glu Leu Lys Leu

130 135 140

Pro Thr Leu Ser Thr Ile Phe

145 150

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

accagtctct ctctcaagct tccatcaaac tagcagcacg c 41

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctcaccata ctagtggatc cctcgaccag gcatgttcct t 41

Claims (1)

1.一种毛竹基因PeLEA14在提高烟草在盐胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示。

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