CN102028000A - Nac蛋白作为植物免疫蛋白的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种初生多肽复合蛋白的具体用途，具体公开了一种NAC蛋白作为植物免疫蛋白的应用，其具体可以是指NAC蛋白对提高番茄抗灰霉病免疫力的应用，对提高番茄抗烟草花叶病毒免疫力的应用或者对提高辣椒抗疫霉菌病免疫力的应用，该应用过程的操作简单、成本低、效果好。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白质的用途，尤其涉及一种初生多肽复合蛋白的具体用途。
背景技术
初生多肽复合酶(Nascent polypeptide-associated complex)最早是通过亲合纯化的方法从牛脑中纯化出来的，也是最早报道该蛋白可以与信号识别颗粒SRP(signal recognition particle)竞争性结合刚从核糖体上合成的多肽。通过亲和纯化获得了两个初生多肽复合蛋白(简称NAC蛋白)，分别命名为α-NAC蛋白和β-NAC蛋白。此前根据SDS-PAGE电泳结果，初步确定这两个蛋白的分子量分别为33KD和22KD，但是直到2000年通过质谱分析才获得该蛋白的真实分子量分别为23.492KD和17.352KD。NAC类蛋白基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，其命名为ZmNAC1蛋白(GenBank登录号为EU224278)，该基因序列全长为1029bp，具有完整的开放阅读框架(ORF，26～907bp)，推测编码蛋白含有293个氨基酸，分子量为32.3KD，等电点为8.65。
NAC蛋白对真核生物是非常重要的，研究发现，在水稻中的NAC基因缺失突变可引起水稻的早期胚胎死亡，在果蝇(Drosophila)中的NAC基因突变可造成果蝇的二尾现象。因为NAC蛋白是一个异二聚体，所以在真核生物体内，它作为整体的功能是首要的，但是对NAC蛋白的亚细胞定位显示以及对亚基mRNA含量进行分析发现，NAC蛋白既可以发挥整体的功能，同时作为单个功能蛋白也可以起作用。
NAC蛋白的首要作用就是与信号识别颗粒SRP在与初生多肽结合时形成竞争，避免非正确折叠和缺少信号肽的蛋白序列被转运到内质网膜(ER membrane)。SRP是一种分子伴侣，在蛋白质的翻译过程中，SRP通过与新合成的多肽的信号肽序列结合而终止蛋白的翻译过程，并将新合成的蛋白质转运到亚细胞器上，从而使蛋白质在细胞内的运输以一个整体的形式(而非以单个氨基酸的形式)进行。尽管SRP与没有信号肽的蛋白结合和运输的效率很低，但一旦SRP与没有信号肽的蛋白结合并进行运输，这对细胞来说将是毁灭性的，因为很多的蛋白酶会把细胞本身降解。此种情况下就需要NAC蛋白的参与，在NAC复合物存在的情况下，缺少信号肽的初生多肽链首先与NAC复合物结合，从而避免其与SRP结合并发生转运；而含有信号肽的初生多肽链既可以与NAC复合物结合又可以与SRP结合，但是与SRP的结合能力更强。从这种意义上讲，NAC也是一种分子伴侣。NAC复合物通过其β亚基可以与核糖体结合，这应该与其行使分子伴侣的功能有关。
此外，由于α-NAC在细胞体内的表达量远超过了β亚基，因此它可以单体形式存在，目前已有越来越多的证据证明，α-NAC蛋白是一种新的“转录共激发子”。而最早从HeLa细胞中发现的β-NAC蛋白则被命名为BTF3(Basic Transcription Factor 3)，已有的研究认为该亚基具有刺激转录的作用，但是β-NAC蛋白本身不能结合DNA，它需要RNA聚合酶II的参与，与o-NAC蛋白的活性相比，目前对β-NAC蛋白刺激转录的活性多持怀疑态度。
约翰霍普金斯医学院Kimmel癌症中心的研究人员在对比338个卵巢癌患者的原发和次发性肿瘤样本后发现，次发性肿瘤样本中NAC1的含量比同一患者来源的原发性肿瘤样本中的含量明显高出许多；且原发性癌症患者如果NAC1含量高的话，接受手术一年后更易发生次发性癌症。换句话说，如果接受卵巢癌治疗的妇女其肿瘤细胞内含有大量的引发畸型生长、降低细胞死亡的结合蛋白——NAC1，则肿瘤复发的风险会增加。研究人员还表示，可以通过在手术摘除的癌症组织中检测NAC1蛋白的含量，来判断这些接受手术的妇女癌症复发的可能性，以提高医生和患者的可预见性，提高治疗效果。研究人员还强调，阻断NAC1的活性是预防、治疗卵巢癌复发的一种治疗方法。此外，通过应用免疫共沉淀、GST pull-down实验验证人Nanog基因与NAC1的相互作用，结果表明人Nanog基因与NAC1在体内、体外均能形成复合物，二者的相互作用对于人胚胎干细胞的自我更新及肿瘤的发生可能具有重要的影响。
目前还有研究发现，多个NAC蛋白可参与植物对逆境的响应。例如，利用盐溶液处理拟南芥，仅在其根中就发现有33个NAC基因的表达受到显著影响(Jiang and Deyholos，2006)，其中部分基因已经过功能鉴定。此外，过量表达OsNAC6基因的水稻虽然生长慢、产量低，但却显示出对干旱、高盐等逆境的较强抗性(Nakashima et al.，2007)。来自水稻的SNAC2(stress-responsive NAC 2)基因受到干旱、高盐、低温以及ABA的诱导表达，其过表达使植株耐冷、抗盐并能抵御干旱。基因表达分析揭示，SNAC2蛋白诱导了许多胁迫相关基因的表达，包括过氧化物酶、热激蛋白和鸟氨酸转氨酶基因等(Hu et al，2008)。
综上所述，对NAC蛋白已有的研究表明，除了其在生物遗传领域所具有的基本蛋白功能以外，NAC蛋白还可在人体中引发肿瘤细胞畸型生长、降低细胞死亡，其还可参与植物对逆境的响应，但从未有相关报道记载或表明NAC蛋白具有诱导或激活植物免疫反应的功能。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种操作简单、成本低、效果好的NAC蛋白作为植物免疫蛋白的应用。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种NAC蛋白作为植物免疫蛋白的应用。
作为对上述技术方案的进一步改进，上述的应用具体是指NAC蛋白对提高番茄抗灰霉病免疫力的应用。上述的应用还可以具体是指NAC蛋白对提高番茄抗烟草花叶病毒免疫力的应用。
以上针对番茄应用的具体操作优选为：先将所述NAC蛋白以清水稀释至5ppm～40ppm，然后用稀释后的蛋白液对番茄进行喷施处理，喷施时间至少提前于疫病高发期7d～30d。喷施处理可以是在番茄的全生育期施用，但经过我们的观察和长期研究，对番茄幼苗苗株进行喷施处理的效果更好，所述番茄幼苗苗株优选为长成至3～6片叶的幼苗。
作为对本发明上述技术方案的改进，所述应用还可具体是指NAC蛋白对提高辣椒抗疫霉菌病免疫力的应用。所述应用的具体操作优选为：先将所述NAC蛋白以清水稀释至5ppm～40ppm，然后用稀释后的蛋白液对辣椒进行喷施处理，喷施时间至少提前于疫病高发期7d～30d。该喷施处理同样可以是在辣椒的全生育期施用，但经过我们的观察和长期研究，对辣椒幼苗苗株进行喷施处理的效果更好，所述辣椒幼苗苗株优选为长成至8～9片叶的幼苗。
虽然上述技术方案主要列举了番茄、辣椒在抗灰霉病、抗烟草花叶病毒等疫病上的应用，但经过我们在其他植物上实验和观察，NAC蛋白对提高白菜抗软腐病的免疫力、提高黄瓜抗烟草花叶病毒的免疫力以及提高水稻抗稻瘟病的免疫力上均有很好的技术效果，因此，我们认为NAC蛋白在提高植物免疫力上具有普适性，是一种极具应用潜力和研究价值的植物免疫蛋白。
经过我们的反复实验和研究发现，NAC蛋白之所以具有提高植物免疫能力的效果，其原因在于NAC蛋白通过增加植物的叶绿素，能够促进植物的生长、代谢，使用NAC蛋白后可以促进植物产生水杨酸、茉莉酸和乙烯等物质，进而促进植保素、抗病相关蛋白和酚类有机物等抗菌、抗病毒物质的合成，最终达到提高植物抗多种病害免疫能力的技术效果。与现有植物抗病虫害的相关技术相比，本发明的优点在于：首先，本发明的适用范围广，普适性强，可广泛用于各种蔬菜(例如白菜、番茄)、瓜果(例如黄瓜、果树等)、粮食作物(例如水稻、小麦等)等各种植物；第二，本发明的应用效果稳定，由于是从提高植物自身免疫力的角度出发，相比普通的杀虫剂、杀菌剂等抗病虫害的处理方法，本发明的应用不存在耐药性问题，应用效果更加稳定；第三，相比农药喷施、生态处理等方法，由于本发明是内源性的抗病虫害机制，不会造成对生态环境的污染和破坏，不存在农药残留问题，更加的环保安全。此外，本发明的应用方法操作简单，成本低，更加有利于产业化推广和应用。
附图说明
图1为本发明实施例1中的双子叶植物灰霉病分级图。
图2为本发明实施例中NAC蛋白制备工艺的工艺流程图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1：NAC蛋白对提高番茄抗灰霉病免疫力的应用
将NAC蛋白以清水稀释至30ppm，用稀释后的蛋白液对番茄幼苗叶片(5～6片叶)进行喷雾处理，以清水作对照，每个处理用30株苗。处理7d、14d后，分别用喷雾法将番茄灰霉病菌孢子悬浮液(105个/ml)接种到番茄幼苗上，48h保湿，一周后进行病情指数调查，计算防治效果，各处理均重复三次，处理后的实验结果如下表1所示。
表1：NAC蛋白对番茄诱导抗病性的实验对照结果
上表1中：
(病叶的分级方法可参考图1)
结果与分析：由表1可见，NAC蛋白能够显著增强番茄自身对抗灰霉病的免疫力，应用本发明方法处理后的番茄对灰霉病的抗性有显著增长；经7天后，NAC蛋白处理过的番茄对灰霉病的抗性达到最高值，处理后的诱抗效果为67.1％。本实施例的应用结果表明，以NAC蛋白的稀释液处理番茄叶片后，在处理后的第7天番茄对灰霉病的诱抗效果达到最佳，而且番茄病情指数在第7天、第14天时均显著低于空白对照，其诱抗效果分别为67.1％和48.1％。
实施例2：NAC蛋白对提高辣椒抗疫霉菌病免疫力的应用
将NAC蛋白以清水稀释至25ppm，用稀释后的蛋白液对辣椒(品种：中椒三号)进行喷雾处理，以清水作对照，处理7d后用辣椒疫霉菌接种灌根，灌根接种后的第7天调查病情指数，计算防治效果如下表2所示。调查实验数据均采用DPS数据处理系统进行5％水平上的差异显著性分析。
表2：NAC蛋白对辣椒疫病诱抗效果的实验对照
上表2中：
辣椒疫霉菌病苗期病情分级标准为(以整株为单位)：
0级：无病；
1级：幼苗根茎部稍有变黑，叶片不萎蔫；
2级：幼苗根茎部变黑达1cm～2cm，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；
3级：幼苗根茎部变黑超过2cm，多数叶片明显萎蔫或落叶明显，植株不倒伏或稍倒伏；
4级：幼苗茎部变黑绕缩，除生长点外全部叶脱落或整株萎蔫，植株倒伏；
5级：植株枯死。
预防作用以处理第7d后NAC蛋白的处理效果好，防效为67.4％，说明NAC蛋白有进一步开发的价值。
实施例3：NAC蛋白对提高番茄抗烟草花叶病毒(TMV)免疫力的应用
首先用消毒土培育出3～4叶的番茄幼苗(长约6cm～8cm)，然后将NAC蛋白以清水稀释至30ppm，用稀释后的蛋白液对番茄幼苗(3～4片叶)进行喷雾处理，以清水处理作对照。喷药处理后的第7天、第14天接种烟草花叶病毒(TMV)，各处理均重复三次。接种病毒后的第7天调查各个番茄幼苗的病情指数，计算诱抗效果如下表3所示。
表3：NAC蛋白对番茄诱导抗病毒性的实验对照结果
上表3中病情指数和诱抗效果的计算方法参见实施例1。
由上表3的实验测定结果可见，经NAC蛋白喷施的番茄植株对烟草花叶病毒病抗性明显提高，防治效果达到57.1％。
以上各实施例中用到的NAC蛋白是通过以下步骤制备得到(参见图2)：
1、发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)菌株的培养
将发酵毕赤酵母CGMCC 2.1838(并不仅限于该种毕赤酵母菌株)用PDA培养基试管斜面培养，然后加50％液体石蜡油封存并置于-70℃超低温冰箱中保存，大量摇菌则采用PDA液体培养基培养。
在紫外光照射25min后的洁净工作台上，先从低温保存的种管中挑取少量发酵毕赤酵母CGMCC 2.1838菌体，将该菌体转接到固体PDA培养基上，然后放置在37℃的恒温培养箱中培养24h，完成一级发酵，再从固体PDA培养基上挑取少量菌体接种到PDA液体培养基中，并置于180rpm、37℃条件下的振荡摇床中培养24h，完成二级发酵。
2、发酵毕赤酵母CGMCC 2.1838菌体细胞的破碎
通过上述步骤1的培养后，NAC蛋白已包含于发酵毕赤酵母CGMCC 2.1838菌体细胞内，我们再采用胶体磨对该菌株的菌体进行剪切，以破碎其菌体细胞；剪切是在含该菌体的菌液(菌体浓度OD值为600，1010～1012cfu/ml)中进行，菌液是指含有毕赤酵母菌菌体的磷酸缓冲液(pH值为7.0～8.0)，该磷酸缓冲液中还添加有0.81g的Na2HPO3和0.125g的NaH2PO3；剪切完成后得到粗蛋白溶液。
3、硫酸铵沉淀NAC蛋白
通过上述步骤2制得的粗蛋白溶液用加入盐(也可加入有机溶剂)的方法进行分离。硫酸铵是蛋白质初级分离中广泛使用的盐类，它在使蛋白质与其他物质分离的同时，能较好的保持蛋白质活性。因此，我们采用向粗蛋白溶液中加入硫酸铵的方式对发酵后的粗蛋白溶液进行分离。硫酸铵沉淀的具体操作为：先将盛有发酵后粗蛋白溶液的烧杯置于冰盒内，以磁力搅拌器匀速搅拌，缓慢加入研磨过的硫酸铵粉末至其终浓度(质量分数)达到20％，溶解1h后以4℃、13000rpm的离心条件离心20min，收集沉淀。
4、喷雾干燥
将收集的蛋白沉淀加入到100ml的磷酸缓冲液(pH值为7.0～8.0)中重新溶解，得到蛋白液，将该蛋白液按5∶1的体积质量比例加入到300目的硅藻土载体中，混合均匀，再将混合物打入喷粉塔中，控制塔内温度为180℃，出风温度85℃，在塔底得到植物免疫蛋白干粉。
上述PDA培养基是通过以下方法制得：以削皮马铃薯200g、葡萄糖(或蔗糖)20g为原料，将马铃薯在水中煮沸30min后过滤取上清，在上清液中加入20g葡萄糖，再加1.5％的琼脂，并加水定容至1000mL，121℃湿热灭菌20min即可。
上述PDA液体培养基是通过以下方法制得：以削皮马铃薯200g、葡萄糖(或蔗糖)20g为原料，将马铃薯在水中煮沸30min后过滤取上清，在上清液中加入20g葡萄糖，并加水定容至1000mL，121℃湿热灭菌20min即可。
<110>符江华
<120>NAC蛋白作为植物免疫蛋白的应用
<160>1
<210>1
<211>1029bp
<212>DNA
<213>ZmNAC1蛋白
<400>1
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cgccattgt 1029
Claims (8)
1.NAC蛋白作为植物免疫蛋白的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用具体是指NAC蛋白对提高番茄抗灰霉病免疫力的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用具体是指NAC蛋白对提高番茄抗烟草花叶病毒免疫力的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述应用的具体操作为：先将所述NAC蛋白以清水稀释至5ppm～40ppm，然后用稀释后的蛋白液对番茄进行喷施处理，喷施时间至少提前于疫病高发期7d～30d。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述进行喷施处理的番茄为番茄幼苗苗株，所述番茄幼苗苗株为长成至3～6片叶的幼苗。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用具体是指NAC蛋白对提高辣椒抗疫霉菌病免疫力的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用的具体操作为先将所述NAC蛋白以清水稀释至5ppm～40ppm，然后用稀释后的蛋白液对辣椒进行喷施处理，喷施时间至少提前于疫病高发期7d～30d。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述进行喷施处理的辣椒为辣椒幼苗苗株，所述辣椒幼苗苗株为长成至8～9片叶的幼苗。
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Legal Events
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| COR | Change of bibliographic data |
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| TR01 | Transfer of patent right |
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