CN1602691A - 具有诱导植物广谱抗病性的有机高分子活性络合物 - Google Patents

Abstract

具有诱导植物广谱抗病性的有机高分子活性络合物，以植物必需营养元素作络合中心体，相关活性有机物质为配位化合物而形成的可使处理后的植物诱发产生显著的广谱抗病性，并有效促进生长的稳定、高效和功能活性更优的有机高分子活性络合物。有机高分子活性络合物在适当条件下处理植物，可诱发植物体内产生某些应激反应机制，如局部过敏反应或系统获得抗性反应，从而使植物对各种病原性细菌、真菌、病毒和昆虫等的侵害或进一步侵害产生抵抗，并有效促进植物生长。

Description

具有诱导植物广谱抗病性的有机高分子活性络合物

本发明涉及农药，尤其是环保型生物农药的开发、生产和应用领域。

植物广谱抗病性是植物体产生的抵抗细菌、真菌、病毒和有害昆虫等病原物侵染或进一步侵染的特性，通常表现为侵染或接种部位的过敏反应或系统获得抗性反应。该现象自1901年发现以来已被广泛研究，特别是20世纪80年代以后研究领域已涉及抗性反应信号传递的机理、信使物质的种类、诱导过敏反应或系统获得抗性反应的hrp基因族的克隆和转化、Harpin蛋白或多肽的结构和功能属性及其表达和调控等。研究表明，诱导植物广谱抗病性的生物诱导剂有真菌、细菌、病毒及其相关有机分子。真菌诱导剂包括病原性真菌和非病原性真菌，病原性真菌主要是弱致病力的真菌菌株，真菌中的某些有机成分如花生四烯酸、亚麻酸、亚油酸、油酸等也可诱导植物广谱抗性反应；细菌诱导剂包括死体或活体的病原性或非病原性细菌及其有关成分，如欧氏杆菌属Erwinia、假单孢杆菌属Pseudomonas、黄单胞杆菌属Xanthomonas中的细菌及其产生的Harpin蛋白或多肽均可诱导植物的广谱抗病性反应；病毒诱导剂包括病毒本身及其辅助因子，如烟草花叶病毒等。诱导植物广谱抗病性的非生物诱导剂主要是化学诱导剂，如水杨酸SA可诱导许多植物对不同病原性真菌、细菌、病毒产生抗性；二氯异烟酸DCINA及其酰胺在田间和温室条件下均能很好地使水稻和黄瓜等作物获得对真菌和细菌等病原物危害的抗性；新发现的苯并噻重氮BTH在小麦、水稻、烟草上应用也获得广谱抗病性；此外还有草酸、聚氨基葡聚糖等也能适度诱导植物产生系统获得抗性反应。以上植物广谱抗性诱导剂中，基于生物防治考虑的生物诱导剂的开发和利用是目前生物农药研究的热门领域，其中Harpin蛋白或多肽制剂在某些国家已获准商业化生产和应用。

核酸、蛋白质、多肽、寡多糖、有机酸等活性有机配位化合物在结构和性质上均具有功能性的亲水性和疏水性基团，以及带正电荷和负电荷的电性基团，在自然暴露情况下容易吸湿、光解和氧化；其次，这些活性有机配位化合物大多具有柔性结构，难以与作用靶点达到理想的匹配，这使得单纯活性有机配位化合物的生物活性受到一定限制。

本发明的目的是利用络合技术使Harpin蛋白或多肽及具有相关功能的其他活性有机分子获得更佳应用效果。

本发明的目的还在于摸索合理的工艺条件生产具有诱导植物广谱抗病性的有机高分子活性络合物，并利用络合物的一些显著化学性质，将稳定可靠又无毒无公害的活性络合物应用于现代高新农业生物技术领域，开辟一项新的络合物应用产业：即诱导植物广谱抗病性的稳定、高效和功能活性更优的环保型生物农药。

本发明的有机高分子活性络合物具有如下的结构。

具有诱导植物广谱抗病性的有机高分子活性络合物，以植物必需营养元素作络合中心体，相关活性有机物质为配位化合物而形成的可使处理后的植物诱发产生显著的广谱抗病性，并有效促进生长的稳定、高效和功能活性更优的有机高分子活性络合物。

有机高分子活性络合物是利用植物必需营养元素的相关离子或原子作中心离子或原子，以来源于生物体自身的两性活性有机物分子或活性有机复合物分子为配位体，在一定pH和温度条件下结合或键合形成的。其基本形成过程包括：首先形成“活性中间体”，然后循“多点挂钩、柔顺结合、最大成键”的反应原则，通过电荷控制和轨道控制这种电价性和共价性作用，最后结合形成稳定的络合物分子复合体。中心离子或原子也称络合物的形成体，是络合物的核心部分，位于络离子或络分子的中心，一般多是带正电荷的阳离子，但也有电中性原子甚至带负电荷的阴离子作为中心离子的。中心离子或原子绝大多数是金属离子，其中的过渡金属离子是较强的络合物形成体，而一些具有高氧化态的非金属元素的离子如Si⁴⁺和P⁵⁺等也是较常见的中心离子。配位体是络离子或络分子中同中心离子络合的离子或分子。在每一配位体中，直接同中心离子络合的原子称配位原子。经常作为配位原子的主要是非金属的N、O、S、C等原子和卤素原子等。配位体中所含配位原子的数目称为配位体基数，一个配位体中可能含有一个配位原子即单基配位体或多个配位原子即多基配位体。直接同中心离子或原子络合的配位原子的数目称为该中心离子或原子的配位数。一般中心离子或原子的配位数为2、4、6、8，其中最常见的是4和6。简单配位化合物由单基配位体与中心离子简单配位而形成，这类络合物一般没有环状结构，在溶液中容易发生逐级解离现象，称为维尔纳型络合物。螯合物又称内络合物，由中心离子和多基配位体络合而成，具有环状结构，稳定性高，很少发生逐级解离现象，是目前应用最广和在生物界普遍存在的一类络合物。如果一个配位体中有一个或两个配位原子同时与两个中心离子络合，从而使内界含有两个或两个以上的中心离子，这样的络合物称多核络合物。很多金属都能形成多核络合物，如饮用水工业常用的聚合氯化铝和聚合氯化铁等。植物在其正常生理活动中需要11种必需大量或常量营养元素和14种微量营养元素，这些元素的原子或离子既可充当中心离子，又可充当配位体中的配位原子。有机体中存在大量担负不同生命活动功能的两性有机化合物分子或两性有机复合物分子，如核酸、多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、蛋白质、多肽、寡多肽、二肽、氨基酸、糖、多糖、寡多糖、脂多糖、糖肽、糖蛋白、单糖、维生素、激素、有机酸等，这些化合物均可作为络合物的有机配位体。

有机高分子活性络合物基于其络合物的化学属性和活性有机配位化合物的特殊功能属性而表现出稳定、高效和功能活性更优的特点。经与中心离子发生络合反应以后，由于相互间依靠共价键、电荷转移、离子键、离子-偶极、偶极-偶极、氢键、范德华力、疏水作用等形成空间和电性上彼此互恰的和匹配更优的刚性结构，从而使其稳定性增强。鉴于有机高分子活性络合物的上述性质，降低了其不良的疏水-亲水相互作用，溶液状态构象和非溶液状态构象更趋一致，与靶点结合的区域增加，与靶点作用的构象匹配性增强，并使植物自催化的一系列生理生化反应的时间延长，从而使有机高分子活性络合物表现出更优的功能活性。

应用有机高分子活性络合物处理植物可诱发植物的广谱抗病抗虫性和其他生理生化活性，并促进植物生长。其适用植物包括各种自然条件和人工条件下的所有单子叶和双子叶植物，以及来自这些植物的种子、营养繁殖外植体、组织、细胞或原生质体培养的无性系再生植株等，如各种粮食作物、蔬菜作物、经济作物、果树、观赏性花卉和藤蔓植物、药用植物、经济或绿化用林木或苗木以及各种牧草和绿化用草皮等。该络合物对人、畜、禽、鸟、鱼、蜜蜂等无毒无害，在土壤和植物体内能自行降解或被光分解，无积留。其用药方法有喷、洒、浇、浸、涂、注射以及拌种、种子包衣、遗传转化或与其他肥料或杀菌杀虫剂一起混用等；用药时间一般宜选在植物1-5片真叶时期或植物疫病发生之前，一季作物可连续用药1-6次，每次间隔7-15天；用药效果以细胞分裂活动和生理生化事件最活跃的植物分生组织或器官生长点为最佳，如植物幼嫩叶片、茎尖、芽尖以及花芽形成、果实膨大、种子萌发等，通常用药12-24小时即可触发或激活药效反应，7天左右即可使被用药的植物产生新的广谱的系统获得抗性，从而使植物对病原性或致病原性的细菌、真菌、病毒或有害昆虫的侵染或进一步侵染产生抵抗。

有机高分子活性络合物诱发植物的广谱抗病性，基于植物体内在有机高分子活性络合物作用下建立起来的对各种病原物的系统获得抗性反应。植物的这种系统获得抗性具有以下显著特点：一、植物系统启动了防卫基因，而不是直接作用于病原物；二、无剂量效应，即抗性诱导与诱导物的浓度无关；三、抗性反应受多基因控制，故抗性稳定可靠持久；四、抗性反应具有广谱性而非专一性，即对不同病原物均可产生抗性；五、抗性反应是系统性的而非局部性的，即可在寄主植物体内传导，如对第一片真叶接种或诱导抗性反应，第三片真叶也会表现出抗性。

有机高分子活性络合物诱发植物的广谱抗病性，可能具有以下三种实现途径：一、抗性诱导包括从植物细胞壁到细胞内的一系列结构性抗性反应。细胞壁强化是第一个环节，包括木质素沉淀、乳突体形成、胶质体形成、侵填体产生等。木质素一方面增加了寄主细胞的机械强度，使寄主能抵抗病原物分泌酶的降解作用；另一方面木质素细胞壁限制了病原物对寄主营养物的利用，使其处于“饥饿”状态。再者植物细胞壁还可通过过氧化物酶POD的催化和富含羟辅氨酸胞壁糖蛋白的交联作用使细胞壁得到加强。二、与抗性诱导有关的生理生化反应包括可溶性碳水化合物和酚类物质含量的增加、植保素和病程相关蛋白PR的产生及多种酶活性的变化等。酚类物质可作为病原菌的拮抗剂，抑制孢子萌发和菌丝生长，同时还可抑制或钝化病原菌所分泌毒素或酶的活性；苯丙氨酸氨解酶PAL是植保素、木质素和酚类化合物等次生代谢物合成的关键酶和限速酶，其活性增强与抗性反应的激活和诱导呈明显的相关性。三、用有机高分子活性络合物或其他诱导物处理植物后首先在细胞膜上诱发一系列复杂的化学反应，从而形成一种或多种信号物质；然后这些信号物通过传导进入相邻细胞或其他未被诱导或接种的组织；收到信号的细胞或组织继而产生一系列非特异的广谱的防卫或抗性反应。这些抗性反应是受多基因族控制的，既有细胞结构上的表现，也有细胞生理生化反应上的变化，但其详细情况尚不十分清楚。目前已证实，水杨酸是植物抗性反应信号级联传导中的一种内源信号分子；细胞壁受体激酶Wakl参与了抗性诱导的信号传导途径；活性氧被认为与过敏反应时细胞的死亡有关。

有机高分子活性络合物诱发植物的广谱抗虫性，可能具有以下几种表现：一、阻止昆虫直接接触寄主植物的细胞或组织；二、阻止昆虫对植物体因啃食而造成的直接伤害；三、迫使昆虫离开其已经定殖的寄主植物；四、直接杀死定殖在寄主植物上的昆虫；五、干扰寄主植物上昆虫的幼虫发育；六、阻止昆虫在寄主植物上定殖；七、使昆虫在寄主植物上不释放有害的植物毒素。

有机高分子活性络合物促进植物生长表现在：一、提高种子萌发的百分率；二、使幼苗生长更快、更茁壮；三、增加植株的大小或生物产量；四、缩短生长发育周期，使植株提早成熟；五、促进果实或籽粒膨大，增加经济产量。

有机高分子活性络合物的功能活性主要取决于其活性有机配位化合物的属性。由于这些化合物在结构和性质上总是存在着亲水性和疏水性、正电性和负电性的两极，并且在等电点附近具有不同的荷电基团，易与带相反电荷的基团结合，从而产生对金属络合物的增敏作用，并进而发生多元络合反应，形成更稳定、高效和功能活性更强的多元络合物。

有机高分子活性络合物具有广泛的植物抗病、抗虫性，并有效促进植物生长。这些活性络合物首先与植物细胞表面的受体分子识别并结合，从而诱发一系列与抗性有关的生理生化事件，并同时产生一种或多种信号物质；这些信号物质经级联传导进入其他组织或细胞，进而诱发系统的抗性反应；抗性反应既有细胞壁结构上的表现，也有细胞内部生理生化反应上的变化。

我们对植物生长、代谢和发育必需的十一种大量元素氢、碳、氮、氧、钠、镁、磷、硫、氯、钾、钙和十四种微量元素氟、硅、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、硒、钼、锡、碘等元素的离子化合物、络合物或络离子进行了筛选试验，所筛选出的离子化合物、络合物或络离子包括：醋酸盐、磷酸盐、碳酸盐、可溶性碘化物、锰酸盐、高锰酸盐、硝酸盐、高氯酸盐、氯酸盐、次氯酸盐、硫酸盐、硫代硫酸盐、硒酸盐、亚硒酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、等金属离子化合物，以及它们形成的络合物或络离子。

这些金属离子化合物、络合物或络离子因其无毒无公害，并为生命活动所必需，目前已广泛用于各类无机复合肥料、医用药品、食品添加剂、饮用水处理、饲料添加剂等。但其效率或利用率较低。据调查，有效利用率大约20％-50％。

试验表明，碱土金属和过渡金属元素的离子化合物、络合物或络离子中的金属离子可作为首选的络合中心离子，它们能与作为配位体的活性有机物分子和有机复合物分子发生不同程度的络合反应或多元络合反应，并能形成稳定、高效和功能活性更优的二元至多元的有机高分子活性络合物。

充当络合中心离子或原子以及有机配位化合物中配位原子的植物必需营养元素包括植物正常生长、发育和代谢所必需的十一种大量营养元素和十四种微量营养元素，它们是：碳、氢、氧、氮、钠、镁、磷、硫、氯、钾、钙、氟、硅、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、硒、钼、锡、碘；其中，充当络合中心体的部分营养元素主要是：钙、镁、铁、钴、铜、锌、锰等碱土金属或过渡金属元素的离子或原子，以及这些元素的二元或多元结合态，即金属络离子或络合物；充当活性有机配位化合物中配位原子的部分营养元素主要是：氮、氧、硫、碳和卤素原子等。

我们对活性有机配位化合物进行了筛选试验。试验中，分别对天然来源的非病原性或非致病性的两性活性有机物分子或活性有机复合物分子，以及经人工或化学方法合成的同类或类似的两性活性有机物分子或活性有机复合物分子进行了配位筛选。

结果表明，许多生理活性物质如核酸、多核甘酸、寡核甘酸、核甘酸、蛋白质、多肽、寡多肽、二肽、氨基酸、糖、多糖、寡多糖、脂多糖、糖肽、维生素、生长发育调节激素、有机酸等，都能与金属离子化合物、络合物或络离子中的络合中心离子发生不同程度的络合反应或多元络合反应。其中，与诱导植物抗性反应直接有关的有机配位化合物Harpin蛋白或多肽等能形成稳定、高效和功能活性更优的有机高分子活性络合物。

广义地说，活性有机配位化合物包括来源于植物、动物和微生物体内天然存在的非病原性或非致病性的活性有机物分子或活性有机复合物分子，以及人工或化学方法合成的同类或类似的活性有机物分子或活性有机复合物分子；其中主要有：与诱导植物广谱抗病性直接或间接有关的天然或人工合成的DNA片段；与诱导植物广谱抗病性直接或间接有关的天然或人工合成的蛋白质、多肽及短肽；与诱导植物广谱抗病性有关的天然或人工合成的信号物质及信号传导物质；与诱导植物广谱抗病性有关的其他有机化合物分子等。

所述与诱导植物广谱抗病性有关的活性有机配位化合物涉及：来源于欧氏杆菌属Erwinia、假单孢杆菌属Pseudomonas、黄单胞杆菌属Xanthomonas、疫霉属Phtophthora或某些工程菌中的hrp基因及其载体分子；来源于欧氏杆菌属Erwinia、假单孢杆菌属Pseudomonas、黄单胞杆菌属Xanthomonas、疫霉属Phtoph thora或某些工程菌中的hrp基因产物，即Harpin蛋白或多肽；水杨酸及其类似物分子；植物病程相关蛋白PR-1、PR-2、PR-3、PR-4、PR-5分子等。

在生产方法上，采用如下步骤获得所述物质。

(1)对于天然致病细菌和人工构建的携带hrp基因族的工程细菌采用不同的处理方法：对于天然致病细菌Erwinia carotovorasubsp.cabbge和Erwinia aroideae subsp.rape，通过在特定的pH值段获得相应的蛋白质(或蛋白质复合物)；对于人工构建的携带hrp基因族的工程细菌，采用细胞破碎和常规的蛋白质分离制备技术，获得Harpin蛋白或多肽；

(2)将(1)得到的特定pH值段蛋白质(或蛋白质复合物)或Harpin蛋白或多肽在控制反应器内加入适量配比的金属络离子，调节适量的pH值，温度控制在45℃-55℃完成络合反应，从而获90％以上的活性Harpin蛋白或多肽络合物。

下面通过实施例对本发明的要点作进一步的详述。

实施例1、

用来源于白菜软腐病致病细菌Erwinia carotovora subsp.cabbage的蛋白质进行酸水解制取氨基酸或氨基酸复合物，然后与碱式碳酸铜反应制取氨基酸铜络合物，以此建立主要的工艺路线和操作条件及方法。

反应条件和方式：在多元络合反应中，控制好反应条件十分重要。主要是：氨基酸或氨基酸复合物与络离子的反应质量比、PH值、反应温度、静置处理时间、反应处理时间和反应器反应方式如静置、搅拌、回流、震荡、电磁场震荡等。进一步用正交试验设计，建立相应的优化条件组合。

操作步骤：在反应容器中，加入200ml水和12g硫酸锰，不断搅拌使其溶解；然后小心加入100ml浓硫酸和80g细菌蛋白质，加热振荡，其间用甲醛法测定氨基酸总含量，当氨基酸总含量不变时即为反应终点，水解反应约需5小时，冷却至70℃；分批加入8g碱式碳酸铜，加完后振荡1小时；滴加氢氧化钠溶液，调节PH至7.0～7.5进行络合反应；静置处理时间8-19小时，反应温度45℃-55℃，反应处理时间6-8小时，用EDTA法测定螯合率；反应产物经脱水干燥，获得最终产品氨基酸络合铜。络合产物经红外光谱KBr测定，COO(-1)和NH₃(+1)的伸展振动都向低波数位移，表明COO(-1)和NH₃(+1)与铜配位，形成了络合物。

实施例2

用来源于油菜软腐病的革兰氏阴性致病细菌Erwinia aroideaesubsp.rape和白菜软腐病的革兰氏阳性致病细菌Erwiniacarotovora subsp.Cabbage(这两类软腐性致病杆菌分离自四川省什邡市无公害蔬菜生产基地)的pH2.0-4.0、pH4.0-4.5、pH4.5-5.0、pH5.0-7.0、pH7.0-9.0区段蛋白质(或蛋白质复合物)与硫酸钙、硫酸铁、硫酸锌、硫酸锰、硫酸铜和硫酸钴分别以100∶10至100∶30的组合质量比进行不同组合的络合试验。

结果表明，共处理溶液的最适pH值为5-5.5，处于蛋白质(或其复合物)等电点碱性区，混合预处理时间8小时，在常压和45℃-50℃温度条件下，在反应器中回流处理6-8小时进行络合反应，以100∶15-20的组合质量比效果最佳，并分别得到了以上各pH区段蛋白质及其复合物的钙-络合物、铁-络合物、锌-络合物、锰-络合物、铜-络合物和钴-络合物，钙、铁、锌、锰、铜和钴的络合或螯合率达到92-95％％。其中，pH4.0-4.5区段的蛋白质及其络合物具有诱导植物广谱抗性反应的活性。

实际上，用硫酸钙、硫酸铁、硫酸锌、硫酸锰、硫酸铜和硫酸钴之一种或多种来完成络合，也可得到相似的结果。

实施例3

直接从稳定生长期的携带hrp基因族的RsmA^--RsmC^--Erwiniacarotovora subsp.cabbage、RsmA^--Erwinia carotovora subsp.cabbage和E.coli JM109工程菌中分离提取Harpin蛋白或多肽，然后让其分别与硫酸钙、硫酸铁、硫酸锌、硫酸锰、硫酸铜和硫酸钴进行不同条件组合的络合反应。按照正交试验设计，组合质量比的水平分别为100∶10、100∶15、100∶20、100∶25和100∶30，共处理溶液的pH值分别为3.5、4.5、5.5、6.5和7.5，混合预处理时间分别为0、5、10、15和20小时，络合反应温度分别为35℃、45℃、55℃、65℃和75℃，反应器中络合反应进行的时间分别是4、6、8、10和12小时，反应器中络合反应的方式分别是静置、回流、搅拌、振荡和电磁场振荡。

结果表明，组合质量比以100∶15和100∶20效果佳，共处理溶液的pH值以5.5和6.5效果佳，混合预处理时间以5和10小时效果佳，络合反应温度以45℃和55℃效果佳，反应器中络合反应进行的时间以6和8小时效果佳，反应器中络合反应的方式以回流、振荡和电磁场振荡效果佳，并获得了多组不同处理条件的适宜组合或配合的优化反应条件组合，并分别得到了Harpin蛋白或多肽的钙-络合物、铁-络合物、锌-络合物、锰-络合物、铜-络合物和钴-络合物，钙、铁、锌、锰、铜和钴的络合或螯合率达到90-95％％。

就实施例3获得的部分Harpin蛋白或多肽-络合物与相应的Harpin蛋白或多肽的稳定性进行了比较。结果如下：

在100℃条件下，Harpin蛋白或多肽10分钟后丧失活性，由它们作为配位体形成的钙-络合物、铁-络合物和锌-络合物30分钟仍保持活性，50分钟后才丧失活性。

在pH14条件下，Harpin蛋白或多肽100分钟后丧失活性，由它们作为配位体形成的钙-络合物、铁-络合物和锌-络合物100分钟仍保持活性，500分钟后才丧失活性。

在pH1条件下，Harpin蛋白或多肽200分钟后丧失活性，由它们作为配位体形成的钙-络合物、铁-络合物和锌-络合物200分钟仍保持活性，1000分钟后才丧失活性。

在10000Lux强光照条件下，Harpin蛋白或多肽60分钟后丧失活性，由它们作为配位体形成的钙-络合物、铁-络合物和锌-络合物60分钟仍保持活性，300分钟后才丧失活性。

以上结果表明，有机高分子活性络合物比其相应有机配位体更为稳定。

实施例4

就实施例3获得的部分Harpin蛋白或多肽-络合物与相应的Harpin蛋白或多肽在诱导植物抗性反应方面的活性效果进行了比较。

结果表明，在相同处理条件下，单纯的Harpin蛋白或多肽4小时后引起植物叶面明显出现枯萎斑，而被钙、铁或锌络合的Harpin蛋白或多肽仅1小时后就引起植物叶面明显出现枯萎斑；48小时后，前者出现枯萎斑的面积只有后者的二分之一；1周后，前者出现枯萎斑的面积只有后者的三分之一。说明Harpin蛋白或多肽被金属离子络合以后，能提早触发或诱发抗性反应事件，并且其维持抗性反应的时间和强度均优于单纯的Harpin蛋白或多肽。

实施例5

就实施例3中含携带brp基因族的pAKC930载体的E.coli JM109中制备的Harpin蛋白或多肽及其钙-、铁-、锌-络合物对种子萌发和幼苗生长的影响进行了比较。

以种子发芽率、幼苗株高和干重作为测定指标，Harpin蛋白或多肽及其钙-、铁-、锌-络合物的作用浓度均为100μg/ml，并以pH6.5的5mM磷酸钾缓冲液作对照处理，在28℃条件下分别对油菜种子、水稻种子和小麦种子浸种24小时，然后分别播于三组花盆中，7天后统计种子发芽率，15天后测量幼苗平均株高和平均干重。结果如下：

Harpin蛋白或多肽处理组，油菜种子发芽率92％、水稻种子发芽率90％、小麦种子发芽率86％；油菜平均株高4.7cm、水稻平均株高12.4cm、小麦平均株高13.5cm；油菜平均干物质重1.2g、水稻平均干物质重2.3g、小麦平均干物质重2.2g。

Harpin蛋白或多肽的钙-、铁-、锌-络合物处理组，油菜种子发芽率95％、水稻种子发芽率93％、小麦种子发芽率89％；油菜平均株高4.9cm、水稻平均株高14.1cm、小麦平均株高15.3cm；油菜平均干物质重1.3g、水稻平均干物质重2.7g、小麦平均干物质重2.5g。

磷酸钾缓冲液对照处理组，油菜种子发芽率90％、水稻种子发芽率88％、小麦种子发芽率84％；油菜平均株高4.5cm、水稻平均株高11.5cm、小麦平均株高12.6cm；油菜平均干物质重1.1g、水稻平均干物质重2.0g、小麦平均干物质重1.9g。

以上结果表明，Harpin蛋白或多肽及其钙-、铁-、锌-络合物与对照处理相比，对被处理种子的发芽率、株高和干物质积累方面均具有明显的促进作用，但Harpin蛋白或多肽的金属络合物比单纯的Harpin蛋白或多肽在这方面的功能活性更具优越性。

实施例6

就实施例3中从稳定生长期的工程菌RsmA^--RsmC^--Erwiniacarotovora subsp.cabbage中制备的Harpin蛋白或多肽及其钙-、铁-、锌-络合物对有害昆虫的防治作用进行了比较。

以烟草蚜虫为例，用100μg/ml浓度的Harpin蛋白或多肽溶液和100μg/ml浓度的Harpin蛋白或多肽的钙-、铁-、锌-络合物溶液在25℃条件下对烟草种子浸种24-48小时，并以pH6.5的5mM磷酸钾缓冲液作对照处理，然后分别播于三个培养盘中萌发，待出苗以后分组移栽于同一块大田中，随后每天观察记录感染蚜虫的数目。结果发现，对照处理组第1、2、3、6、7、8、9、10天单株感染蚜虫的平均数分别为：0、3、3、6、7、9、13、17；Harpin蛋白或多肽处理组第1、2、3、6、7、8、9、10天单株感染蚜虫的平均数分别为：0、0、0、1、0、0、2、2；Harpin蛋白或多肽的钙-、铁-、锌-络合物处理组第1、2、3、6、7、8、9、10天单株感染蚜虫的平均数分别为：0、0、0、0、0、0、1、0。

同样以烟草蚜虫为例，用25μg/ml浓度的Harpin蛋白或多肽溶液和25μg/ml浓度的Harpin蛋白或多肽的钙-、铁-、锌-络合物溶液对已严重感染蚜虫的烟草植株叶片进行渗透或喷洒处理，并以pH6.5的5mM磷酸钾缓冲液处理作对照，然后每天观察统计烟草植株上蚜虫的数目。结果发现，对照处理组的蚜虫数量在处理期间基本稳定或略有增加；Harpin蛋白或多肽处理组的蚜虫在处理的第2-3天开始离开该植株，到第10天左右蚜虫基本上消失，偶有个别蚜虫被杀死；Harpin蛋白或多肽的钙-、铁-、锌-络合物处理组的蚜虫在处理的第1-2天开始离开该植株，到第8-10天左右蚜虫基本上消失，偶尔也有少数蚜虫被直接杀死。

以上结果表明，Harpin蛋白或多肽及其钙-、铁-、锌-络合物与对照处理相比，均能有效防治植物有害昆虫的侵害，但Harpin蛋白或多肽的金属络合物比单纯的Harpin蛋白或多肽在控制害虫方面似乎更具优越性。

实施例7

就实施例3中从稳定生长期的工程菌RsmA^--Erwinia carotovorasubsp.cabbage中制备的Harpin蛋白或多肽及其钙-、铁-、锌-络合物在诱导植物广谱抗病性方面的作用进行了比较。

结果表明，用100μg/ml浓度的Harpin蛋白或多肽溶液和100μg/ml浓度的Harpin蛋白或多肽的钙-、铁-、锌-络合物溶液对植物种子浸种24小时以上，或在植物疫病发生前以稀释4-10倍的浓度每隔2周定期喷洒植物幼苗或叶片，均可有效防治油菜软腐病、白菜软腐病、蕃茄溃疡病、甘蓝黑腐病、辣椒疮痂病、水稻白叶枯病等细菌类病害和水稻稻瘟病、水稻纹枯病、玉米大斑病、玉米小斑病、玉米纹枯病、小麦赤霉病、小麦白粉病、小麦锈病、白菜霜霉病、黄瓜枯萎病、莴苣菌黑病、辣椒疫病、茄子绵疫病、马铃薯早疫病、马铃薯晚疫病等真菌类病害，以及油菜病毒病、马铃薯病毒病、蕃茄病毒病等病毒类病害。但Harpin蛋白或多肽的金属络合物比单纯的Harpin蛋白或多肽更能提早触发或诱发植物的抗性反应机制，并能使抗性反应维持更长的作用时间和强度。

本发明诱导植物广谱抗病性的有机高分子活性络合物可采用喷施、浸种、拌种、种子包衣、浸苗、涂茎叶、注射、渗透；或用携带hrp基因族的Ti或Ri质粒对无性培养的植物组织、细胞和原生质体进行遗传转化；或用含hrp基因族的DNA片断或质粒载体通过电激或注射对植物组织、细胞和原生质体直接进行转化，并将被转化的植物组织、细胞和原生质体再生成植株。

实验表明，本发明诱导植物广谱抗病性的有机高分子活性络合物适合用于多种植物，包括各种自然条件和栽培条件下的所有单子叶植物和双子叶植物，以及来自这些植物的种子和无性繁殖系，如营养繁殖器官或外植体、组织培养物、细胞或原生质体培养物及其再生植株等；其中，适用的粮食作物、蔬菜作物、经济作物和果树包括：水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、青稞、大豆、蚕豆、豌豆、绿豆、甘薯、马铃薯、莴苣、蕃茄、甘蓝、菠菜、萝卜、胡萝卜、洋葱、茄子、芹菜、大白菜、大蒜、小白菜、花椰菜、南瓜、冬瓜、西瓜、丝瓜、黄瓜、瓠瓜、空心菜、青菜、韭菜、辣椒、姜、葱、菜花、豇豆、四季豆、菜豆、甜菜、苜蓿、向日葵、花生、芝麻、蓖麻、油菜、棉花、亚麻、桑、甘蔗、烟草、胡椒、花椒、苹果、梨、柑桔、柚、橘、葡萄、草莓、桃、杏、李、枇杷、荔枝、桂圆、波萝、香蕉等；适用的室内室外观赏性花卉植物和藤蔓植物包括：兰花、牵牛、郁金香、风信子、百合、月季、玫瑰、菊花、牡丹、康乃馨、蔷薇等；适用的各种药用植物包括：川芎、天麻、当归、芍药、紫苏、薄荷、板兰根、连翘、金银花、薯蓣、山药、杜仲、丁香、人参、三七、贝母、枸杞子等；此外还适用于各种经济用林木或苗木、绿化用林木或苗木以及各种牧草和绿化用草皮等。

有高分子活性络合物诱导的植物广谱抗病性包括植物对各种病原性或致病原性的细菌、真菌、病毒和有害昆虫等的侵害或进一步侵害产生的过敏反应或系统获得抗性反应；其中，有机高分子活性络合物可有效防治的细菌性植物病害包括：各种蔬菜、粮食和经济作物的软腐病、环腐病、黑腐病、黑斑病、黑胫病、黑星病、黑粉病、叶枯病、青枯病、斑枯病、蔓枯病、纹枯病、枯萎病、炭疽病、角斑病、褐斑病、褐纹病、紫斑病、疮痂病、菌核病、白叶枯病、白粉病、白斑病、白锈病、锈病等；有机高分子活性络合物可有效防治的真菌性植物病害包括：多种蔬菜、粮食和经济作物的霜霉病、灰霉病、叶霉病、煤霉病、疫霉病、早疫病、晚疫病、绵疫病等；有机高分子活性络合物可有效防治的病毒性植物病害包括：白菜孤丁病、蕃茄花叶病、烟草花叶病、白菜褪绿斑驳病毒病、白菜花叶斑驳病毒病以及由X-和Y-病毒复合感染引起的马铃薯病毒病等；有机高分子活性络合物可有效防治的植物有害昆虫包括：蚜虫、菜蛾、菜粉蝶、棉铃虫、烟青虫、玉米钻孔虫、马铃薯瓢虫、甜菜甲虫、粉螨、金针虫、蝼蛄、蝇等。

在本发明产品的实际生产中，有机高分子活性络合物在制备、储存和应用中的剂型原药包括固体即原粉和液体即原油；储存和应用的产品剂型包括可湿性粉剂、水剂、缓释剂以及与其他肥料或杀菌剂、杀虫剂的混合制剂等。

Claims (11)

1、具有诱导植物广谱抗病性的有机高分子活性络合物，以植物必需营养元素作络合中心体，相关活性有机物质为配位化合物而形成的可使处理后的植物诱发产生显著的广谱抗病性，并有效促进生长的稳定、高效和功能活性更优的有机高分子活性络合物。

2、根据权利要求1所述的具有诱导植物广谱抗病性的有机高分子活性络合物，其特征在于，所述络合中心体为离子或原子，或含有这些离子或原子的基团或化合物。

3、根据权利要求1或2所述的具有诱导植物广谱抗病性的有机高分子活性络合物，其特征在于，充当络合中心离子或原子以及有机配位化合物中配位原子的植物必需营养元素包括植物正常生长、发育和代谢所必需的十一种大量营养元素和十四种微量营养元素，它们是：碳、氢、氧、氮、钠、镁、磷、硫、氯、钾、钙、氟、硅、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、硒、钼、锡、碘；其中，充当络合中心体的部分营养元素主要是：钙、镁、铁、钴、铜、锌、锰等碱土金属或过渡金属元素的离子或原子，以及这些元素的二元或多元结合态，即金属络离子或络合物；充当活性有机配位化合物中配位原子的部分营养元素主要是：氮、氧、硫、碳和卤素原子等。

4、根据权利要求1所述的具有诱导植物广谱抗病性的有机高分子活性络合物，其特征在于，所述活性有机配位化合物包括来源于植物、动物和微生物体内天然存在的非病原性或非致病性的活性有机物分子或活性有机复合物分子，以及人工或化学方法合成的同类或类似的活性有机物分子或活性有机复合物分子；其中主要有：与诱导植物广谱抗病性直接或间接有关的天然或人工合成的DNA片段；与诱导植物广谱抗病性直接或间接有关的天然或人工合成的蛋白质、多肽及短肽；与诱导植物广谱抗病性有关的天然或人工合成的信号物质及信号传导物质；与诱导植物广谱抗病性有关的其他有机化合物分子等。

5、根据权利要求4所述的具有诱导植物广谱抗病性的有机高分子活性络合物，其特征在于，所述与诱导植物广谱抗病性有关的活性有机配位化合物涉及：来源于欧氏杆菌属Erwinia、假单孢杆菌属Pseudomonas、黄单胞杆菌属Xanthomonas、疫霉属Phtophthora或某些工程菌中的hrp基因及其载体分子；来源于欧氏杆菌属Erwinia、假单孢杆菌属Pseudomonas、黄单胞杆菌属Xanthomonas、疫霉属Phtophthora或某些工程菌中的hrp基因产物，即Harpin蛋白或多肽；水杨酸及其类似物分子；植物病程相关蛋白PR-1、PR-2、PR-3、PR-4、PR-5分子等。

6、根据权利要求5所述的具有诱导植物广谱抗病性的有机高分子活性络合物，其特征在于，所述hrp基因及Harpin蛋白或多肽来源于白菜或甘蓝类软腐病致病细菌Erwinia carotovora subsp.cabbage和油菜软腐病致病细菌Erwinia aroideae subsp.rape。

7、根据权利要求1所述的具有诱导植物广谱抗病性的有机高分子活性络合物，其特征在于，有机高分子活性络合物在制备、储存和应用中的剂型原药包括固体即原粉和液体即原油；储存和应用的产品剂型包括可湿性粉剂、水剂、缓释剂以及与其他肥料或杀菌剂、杀虫剂的混合制剂等。

8、实现权利要求1或2或3或4或5或6所述具有诱导植物广谱抗病性的有机高分子活性络合物的生产方法，采用如下步骤获得所述物质：

(1)对于天然致病细菌Erwinia carotovora subsp.cabbage和Erwinia aroideae subsp.rape，通过在特定的pH值段获得相应的蛋白质(或蛋白质复合物)；对于人工构建的携带hrp基因族的工程细菌，通过细胞破碎和常规的蛋白质分离制备技术获得Harpin蛋白或多肽；

(2)将(1)得到的特定pH值段蛋白质(或蛋白质复合物)或Harpin蛋白或多肽在控制反应器内加入适量配比的金属络离子，调节适量的pH值，温度控制在45℃-55℃完成络合反应，反应混合液需用电磁场或超声波进行不间断的振荡或回流，必要时可间以适当时间的静置处理；络合反应时，络合中心离子或原子与活性有机配位化合物的质量配比依据二者的荷电属性、电荷当量以及络合反应的性质而定；从而获得90％以上的活性Harpin蛋白或多肽络合物。

9、权利要求1所述诱导植物广谱抗病性的有机高分子活性络合物的用途，采用喷施、浸种、拌种、种子包衣、浸苗、涂茎叶、注射、渗透；或用携带hrp基因族的Ti或Ri质粒对无性培养的植物组织、细胞和原生质体进行遗传转化；或用含hrp基因族的DNA片断或质粒载体通过电激或注射对植物组织、细胞和原生质体直接进行转化，并将被转化的植物组织、细胞和原生质体再生成植株。

10、根据权利要求9所述诱导植物广谱抗病性的有机高分子活性络合物的用途，其特征在于，适用的植物包括：各种自然条件和栽培条件下的所有单子叶植物和双子叶植物，以及来自这些植物的种子和无性繁殖系，如营养繁殖器官或外植体、组织培养物、细胞或原生质体培养物及其再生植株等；其中，适用的粮食作物、蔬菜作物、经济作物和果树包括：水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、青稞、大豆、蚕豆、豌豆、绿豆、甘薯、马铃薯、莴苣、蕃茄、甘蓝、菠菜、萝卜、胡萝卜、洋葱、茄子、芹菜、大白菜、大蒜、小白菜、花椰菜、南瓜、冬瓜、西瓜、丝瓜、黄瓜、瓠瓜、空心菜、青菜、韭菜、辣椒、姜、葱、菜花、豇豆、四季豆、菜豆、甜菜、苜蓿、向日葵、花生、芝麻、蓖麻、油菜、棉花、亚麻、桑、甘蔗、烟草、胡椒、花椒、苹果、梨、柑桔、柚、橘、葡萄、草莓、桃、杏、李、枇杷、荔枝、桂圆、波萝、香蕉等；适用的室内室外观赏性花卉植物和藤蔓植物包括：兰花、牵牛、郁金香、风信子、百合、月季、玫瑰、菊花、牡丹、康乃馨、蔷薇等；适用的各种药用植物包括：川芎、天麻、当归、芍药、紫苏、薄荷、板兰根、连翘、金银花、薯蓣、山药、杜仲、丁香、人参、三七、贝母、枸杞子等；此外还适用于各种经济用林木或苗木、绿化用林木或苗木以及各种牧草和绿化用草皮等。

11、根据权利要求9所述诱导植物广谱抗病性的有机高分子活性络合物的用途，其特征在于，有机高分子活性络合物诱导的植物广谱抗病性包括植物对各种病原性或致病原性的细菌、真菌、病毒和有害昆虫等的侵害或进一步侵害产生的过敏反应或系统获得抗性反应；可有效防治的细菌性植物病害包括：各种蔬菜、粮食和经济作物的软腐病、环腐病、黑腐病、黑斑病、黑胫病、黑星病、黑粉病、叶枯病、青枯病、斑枯病、蔓枯病、纹枯病、枯萎病、炭疽病、角斑病、褐斑病、褐纹病、紫斑病、疮痂病、菌核病、白叶枯病、白粉病、白斑病、白锈病、锈病等；有机高分子活性络合物可有效防治的真菌性植物病害包括：多种蔬菜、粮食和经济作物的霜霉病、灰霉病、叶霉病、煤霉病、疫霉病、早疫病、晚疫病、绵疫病等；有机高分子活性络合物可有效防治的病毒性植物病害包括：白菜孤丁病、蕃茄花叶病、烟草花叶病、白菜褪绿斑驳病毒病、白菜花叶斑驳病毒病以及由X-和Y-病毒复合感染引起的马铃薯病毒病等；有机高分子活性络合物可有效防治的植物有害昆虫包括：蚜虫、菜蛾、菜粉蝶、棉铃虫、烟青虫、玉米钻孔虫、马铃薯瓢虫、甜菜甲虫、粉螨、金针虫、蝼蛄、蝇等。