CN104684390B - 用于诱导植物对病原体例如致病疫霉的天然防御的包含至少一种酚类化合物的植物提取物 - Google Patents

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Abstract

在温室条件下和田间试验中诱导马铃薯植物防御的甜菜提取物(SBE)，对植物无明显毒性。用SBE处理导致致病疫霉(Phytophthora infestans)感染病变大小明显降低并降低孢子囊产生。SBE无明显毒性作用，无论是对病原体菌丝生长还是对孢子囊的萌发。SBE触发PR‑1蛋白诱导，这提示SBE赋予的防御机制可能为经由直接诱导的抗性。在SBE中发现了一批酚类代谢产物和矿物质，其构成了潜在的防御诱导物。

Description

用于诱导植物对病原体例如致病疫霉的天然防御的包含至少 一种酚类化合物的植物提取物
技术领域
本实施方案涉及一种植物提取物及其在保护植物免受病原体攻击中的用途。特别地，本实施方案涉及一种植物提取物，其在施用于植物或作物时帮助保护植物或作物免受感染而对导致感染的病原体无直接毒性。
背景
尽管全世界的植物疾病管理政策在持续发展，但现代农业仍面对破坏性的植物疾病。最重要的疾病之一为导致每年十亿美元损失的由卵菌纲致病疫霉所导致的马铃薯晚疫病。当前该疾病的控制策略主要为施用抗真菌剂和繁殖具有显性抗性基因的品种。该病原体因为其克服抗性的能力而众所周知，并且这是总是需要探究许多控制策略的原因。
现有技术教导了各种各样的植物保护材料。已经使用了对植物病原体生长具有作用的来自植物的天然抗微生物代谢产物。用牡丹(Paeonia suffruticosa)和常春藤(Hedera helix)的乙醇植物提取物达到了对马铃薯植物晚疫病发展的抑制，此二者均抑制致病疫霉游动孢子释放和萌发(Röhner等2004)。波叶大黄(Rheum rhabarbarum)和加拿大一枝黄花(Solidago canadensis)的植物提取物通过直接抑制致病疫霉生长降低马铃薯叶子上的致病疫霉生长(Stephan等 2005)。大蒜汁的抗细菌、抗真菌和抗卵菌活性已有报道，并且发现其降低马铃薯植物中的晚疫病严重性(Slusarenko等 2008)。显示抗马铃薯致病疫霉效能的一个市售产品为Elot-Vis®，其基于乙醇植物提取物(Stephan等 2005)。Elot-Vis®显示抗马铃薯作物致病疫霉的效果，但仅仅在致病疫霉接种前一天施用时减缓疾病(Stephan等 2005)。Elot-Vis®对病原体具有直接毒性(Stephan等 2005)。
施用一些植物防御诱导剂取得的有前景的结果提示在综合疾病管理程序中可利用诱导抗性的原理。
对致病疫霉的抗性已经与多种酚类化合物如绿原酸、对香豆酸、阿魏酸、迷迭香酸、水杨酸、4-羟基苯甲醛和4-羟苯酸盐的作用相联系(Coquoz等 1995; Widmer和Laurent2006)。已将文献中通常报道的酚类化合物功能归为两种主要功能。酚类化合物可对病原体具有直接毒性(抗微生物)作用，例如可溶性酚酸，或其可通过强化细胞壁使其更能抵抗细胞壁降解酶诱导对病原体的屏障，例如细胞壁-结合酚类。
发明简述
一个目标为提供可诱导植物对生物胁迫的防御的天然试剂。
一个特别的目标为提供这样的试剂，其可用于对抗植物病原体，特别是导致晚疫病的致病疫霉。
这些和其它目标通过本文所公开的实施方案满足。
实施方案的一个方面涉及包含至少一种酚类化合物并且可从碳酸化甜菜根汁的固体部分获得的植物提取物。
在一个特别的但任选的实施方案中，植物提取物通过使用溶剂从碳酸化甜菜根汁的固体部分提取获得。
在另一个特别的但任选的实施方案中，植物提取物包含浓度大于5 µg/ml、优选至少10 µg/ml的对羟基苯甲酸。
在一个进一步特别的但任选的实施方案中，植物提取物保护植物免受病原体感染，但在适合施用于植物的工作浓度对病原体无毒性。
实施方案的另一个方面涉及包含上述植物提取物和至少一种植物信号传导剂和/或杀真菌剂的组合物。
实施方案进一步的方面涉及诱导植物对生物胁迫的抗性的方法和治疗、抑制或减少植物晚疫病的方法。这些方法包括为植物施用上述植物提取物和/或组合物。
实施方案的又一个方面涉及制造包含至少一种酚类化合物的植物提取物的方法。所述方法包括混合溶剂与碳酸化甜菜根汁的固体部分。让混合物沉降以形成上清液和沉降固体。从沉降固体分离上清液并用于生产植物提取物。
本发明实施方案提供能够诱导植物对病原体感染的天然防御的免疫增强植物提取物。该植物提取物能够在植物中达到此保护效果而本身在用于治疗植物的浓度下不对病原体产生毒性。
附图简述
实施方案，以及进一步的目标和其优点，通过参考下列描述连同附图可最好地理解，其中：
图1a图解了用自来水(对照)、甜菜提取物(SBE) (20 %/自来水)和BABA (β-氨基丁酸，0.3 g/l/自来水)喷射、接种致病疫霉(15 000 孢子囊/ml)的Desiree植物感染后(dpi) 4-7天在温室生长植物离体叶片测定中病变大小的外观。BABA-处理叶片上的小坏死点仅在该处理中检测到。
图1b-1d图解了马铃薯植物感染后6天(6 dpi)病变大小的测量结果。叶片来自Desiree (图1b)、Bintje (图1c)和Ovatio (图1d)。数据显示每个基因型的两个组合实验的病变测量结果(以mm计)的平均值，误差棒代表两个组合实验(每个用12个叶片进行)的平均值的标准误差。不同字母代表根据Tukey多范围检验统计学上互不相同的数据(P <0.05)。
图2图解了Desiree感染后10天(10 dpi)的孢子囊产生。在离体叶片测定中，取用水、SBE和BABA (0.3 g/l)处理的Desiree植物的叶片并接种致病疫霉(15 000孢子囊/ml)。数据显示两个组合实验的孢子囊浓度的平均值，误差棒代表两个组合实验(每个用12个叶片进行)平均值的标准误差。不同字母代表根据Tukey多范围检验统计学上互不相同的数据(P < 0.05)。
图3a图解了SBE对病原体致病疫霉菌丝生长的直接作用。致病疫霉在豌豆琼脂上生长后7天，将无菌纸盘(直径12 mm)放置在豌豆琼脂培养基上所生长的致病疫霉菌丝集落对边外5 mm处。纸盘用80 μl水(A)或SBE (B)浸渍。2至3天后，检查浸渍纸盘位点周围的菌丝生长。
图3b图解了孢子囊溶液的显微镜检查所显示的孢子囊萌发百分比。用1 %乙醇(EtOH)和SBE处理的样品在培养箱中于21℃在黑暗中孵育1天后在4个随机选择的显微镜视野中估算萌发的孢子囊的百分比。实验以总体积1 ml (在Eppendorf管中)使用3个重复进行。孢子囊浓度为40 000 孢子囊/ml，SBE终浓度为20%，EtOH终浓度为1 %。数据显示两个组合实验的孢子囊萌发的平均百分比，误差棒代表两个组合实验(每个实验以每种处理3个重复进行)平均值的标准误差。
图4图解了马铃薯叶片中质外体蛋白的SDS-PAGE分析。分析了用水、BABA (0.3 g/l)和SBE处理的三个不同马铃薯基因型叶片的质外体液的PR-1蛋白诱导。从左至右M：分子大小标志；DC：Desiree对照(水)；DB：Desiree BABA (0.3 g/L)；DE：Desiree提取物(SBE)；OC：Ovatio对照；OB：Ovatio BABA；OE：Ovatio提取物(SBE)；BC：Bintje对照；BB：BintjeBABA；BE：Bintje提取物(SBE)。每孔上样每个样品的30 µl，等于从每个样品提取的总质外体液的1/6。
图5图解了SBE在280 nm处的HPLC概况和所检测到酚类化合物的紫外光谱实例(峰上的编号对应于在波长范围200-400 nm处扫描的紫外光谱编号)。峰1：对羟基苯甲酸；峰2：香草酸；峰3：表儿茶素没食子酸酯；峰4：异阿魏酸；峰6：肉桂酸。
图6图解了对照植物(C)和使用20 %甜菜提取物(SBE)喷射3次(间隔1周)的植物的田间试验。Bintje植物用20 % SBE再次喷射3次(间隔1周)。所给出的为Bintje和Ovatio感染后11天感染叶片的百分比。
图7A和7B图解了甜菜提取物(SBE) (图7A) 和Speedi-Beet提取物(图7B)的HPLC色谱图(280 nm处的吸光度)。
发明详述
本实施方案一般涉及可用作用于防御生物胁迫例如各种植物病原体的生物杀虫剂的植物提取物。本实施方案的植物提取物可因此用于通过诱导植物对此类生物胁迫的抗性刺激植物的防御。该植物提取物还可用于预防或治疗，或至少抑制或减轻植物疾病例如晚疫病。
本实施方案的植物提取物可视为能够诱导植物对生物胁迫例如各种植物病原体的防御的免疫增强组合物。所述植物提取物能够实施此有益作用而在用于治疗植物的工作浓度对植物病原体不产生毒性。因此，植物提取物本身，当施用于植物病原体时，将对植物病原体无毒，但当施用于植物时仍能够通过诱导和提升植物对病原体的天然防御保护植物免受植物病原体感染。
本实施方案的植物提取物为从甜菜(Beta vulgaris)获得的包含酚类的植物提取物。因此该植物提取物包含至少一种酚类化合物，但通常为多种酚类化合物的混合物。
所述植物提取物可从甜菜根原料和/或从处理的甜菜根产品获得。此种处理的甜菜根产品为典型地在从甜茶根生产糖期间获得的甜菜根的处理形式，例如副产品或废品。
典型的此种糖生产过程涉及清洗甜菜根和将其切割(典型地机械切割)为薄条(传统上称为甜菜丝)。然后将这些甜菜丝传送至所谓的浸提器(diffuser)，浸提器为将糖分提取至被水溶液中(称为原汁)的机器。
所使用的甜菜丝，或浆料，以高水分含量(湿度约95%)但低蔗糖含量离开浸提器。然后可例如在螺旋压榨机中压榨此湿浆料至减少的含湿量，例如湿度约65-75%，以及任选地干燥至甚至更低的含湿量。干浆料为通常用作动物饲料的副产品。
使原汁经受从原汁去除杂质的碳酸化过程，然后结晶。在典型的方法中，将原汁与热石灰乳(氢氧化钙在水中的悬浮液)混合。在多价钙阳离子存在下该处理使多种杂质作为其钙盐和大有机分子聚集体沉淀。
然后典型地向碱性糖溶液中鼓入二氧化碳，使石灰作为碳酸钙(白垩)沉淀。形成的白垩颗粒包入一些杂质并吸附其它杂质。白垩颗粒与杂质絮凝从而沉降至澄清器或槽底部。任选最后加入更多的二氧化碳从溶液沉淀更多的钙。滤出固体后，留下称为稀汁的金浅褐色糖溶液。例如通过改变pH、亚硫酸化和浓缩进一步处理该稀汁，然后结晶以形成糖。此碳酸化过程获得的固体部分为传统上用作肥料的副产品。
本实施方案的处理甜菜根产品可为在糖生产过程中从甜菜根获得的任何处理产品或副产品。在一个典型的实施例中获自碳酸化过程的固体部分可用作本实施方案的处理甜菜根产品。那么，该固体部分为在澄清器或槽中去除稀汁后的剩余材料。
备选地，处理的甜菜根产品为退出浸提器的使用过的甜菜丝，即浆料。处理的产品然后可为具有高含湿量的湿浆料、具有较低含湿量例如湿度约65-75%的压榨过的湿浆料或已经干燥至含湿量低于约65-75%的此种压榨过的湿浆料。
作为进一步的备选方案，获自碳酸化过程的固体部分可与浆料混合，此混合物构成用来获得植物提取物的处理的甜菜根产品。
本实施方案的一个优选方面涉及包含至少一种酚类化合物的植物提取物。该植物提取物可从碳酸化的甜菜根汁的固体部分获得。
因此，在该优选方面植物提取物可从碳酸化甜菜根汁固体部分形式的处理的甜菜根产品获得。
在一个实施方案中，植物提取物从碳酸化甜菜根汁的固体部分获得。
碳酸化甜菜根汁的固体部分优选，如上文所指出的，从包括切割甜菜根和从切割的甜菜根生产甜菜根汁的过程获得。然后将甜菜根汁碳酸化以形成碳酸化甜菜根汁的固体部分。
在一个特别的实施方案中，碳酸化甜菜根汁优选包括，如上文所指出的，混合甜菜根汁与氢氧化钙在水中的悬浮液以形成碱性糖溶液。向碱性糖溶液中鼓入二氧化碳使氢氧化钙作为包裹和吸附甜菜根汁中杂质的碳酸钙颗粒沉淀。然后去除液体部分形成碳酸化甜菜根汁的固体部分。
在一个实施方案中，本实施方案的植物提取物可根据包括混合溶剂与甜菜根和/或处理的甜菜根产品、优选碳酸化甜菜根汁的固体部分的过程获得。让该混合物在槽或其它储存器或容器中沉降以形成上清液和优选地，碳酸化甜菜根汁固体部分形式的沉降固体。例如通过从固体轻轻倒出上清液或吸出，即抽吸上清液，从沉降固体分离上清液，将固体留在槽底部。本实施方案包含酚类的植物提取物从该上清液生产。
在一个实施方案中，优选让提取持续至少30分钟，即优选至少提取30分钟后从碳酸化甜菜根汁固体部分与溶剂的混合物移去上清液。实验数据表明提取2小时与提取24小时相比甜菜提取物的酚含量基本相同。然而，盐通常以较低的速度提取，提取24小时获得的甜菜提取物与提取2小时获得的甜菜提取物相比通常具有较高的盐浓度，见表1。在一个优选的实施方案中，提取因此在至少30分钟至多24小时，优选1小时直至6小时，例如1小时直至4小时或1小时直至3小时的间隔内的时间段期间发生。
在一个实施方案中，上清液可直接用作本实施方案的植物提取物。
在另一个实施方案中，将上清液例如通过加入提取步骤(即与(处理的)甜菜根(产品)混合)期间使用的相同溶剂或另一种溶剂稀释，以形成植物提取物。
在进一步的实施方案中，将上清液例如通过蒸发一部分溶剂浓缩，以形成植物提取物。
在一个特别的实施方案中将上清液过滤一次或多次，例如2次，以从上清液去除任何悬浮颗粒。滤过的上清液可然后用作植物提取物。在一个任选但优选的步骤中将滤过的上清液离心以形成过滤步骤期间未除去的悬浮颗粒的沉淀。从该沉淀分离上清液并用作液体形式的植物提取物。可任选进行如上所述的稀释或浓缩。
生产植物提取物的方法中使用的溶剂优选选自水、乙醇、甲醇及其组合。在一个特别的实施方案中，所述溶剂为乙醇或水和乙醇的组合，例如99.9%乙醇。
如果将植物提取物如上所述稀释，溶剂可选自上述组，即水、乙醇、甲醇或其任何组合。
本实施方案的植物提取物包含至少一种从甜菜提取的酚类化合物。在一个特别的实施方案中，植物提取物包含不同酚类化合物的混合物。所述植物提取物优选包含对羟基苯甲酸、香草酸和表儿茶素没食子酸酯。所述植物提取物更优选包含此三种化合物作为主要的酚类化合物。
对羟基苯甲酸，也称为4-羟基苯甲酸，为苯甲酸的酚衍生物。对羟基苯甲酸为流行的抗氧化剂。香草酸，也称为4-羟基-3-甲氧苯甲酸，为传统上用作矫味剂的二羟苯甲酸衍生物。表儿茶素没食子酸酯为传统上存在于绿茶、荞麦和葡萄中的黄烷-3-醇(类黄酮)。
在一个实施方案中，除对羟基苯甲酸、香草酸和表儿茶素没食子酸酯外，植物提取物还包含异阿魏酸和肉桂酸的至少一种，优选异阿魏酸和肉桂酸二者。
在一个实施方案中，植物提取物包含浓度大于5 µg/ml的对羟基苯甲酸。在更优选的实施方案中，植物提取物包含浓度至少10 µg/ml的对羟基苯甲酸。如上所述的对羟基苯甲酸浓度优选为作为工作溶液，即适合或意在施用于植物的植物提取物中的酚类化合物浓度。
本文所呈现的实验数据表明5 µg/ml或更低的对羟基苯甲酸浓度将不诱导植物的任何积极作用，而5 µg/ml以上和特别地等于或高于10 µg/ml的浓度能够诱导对抗植物病原体的植物保护。
因此，本实施方案的另一个方面涉及包含浓度大于5 µg/ml并且优选至少10 µg/ml的对羟基苯甲酸的植物提取物。所述植物提取物可从甜菜根和/或处理的甜菜根产品，优选处理的甜菜根产品，并且更优选碳酸化甜菜根汁的固体部分获得。
除酚类化合物外，本实施方案的植物提取物优选还包含各种离子。在一个特别的实施方案中，主要的离子为钾(K+)和钙(Ca2+)离子。
在一个特别的实施方案中，植物提取物包含下列浓度的天然元素，见表1：
在未稀释形式的植物提取物中，浓度为0.02-0.03 mg/l的Al；
浓度为0.3-0.4 mg/l的B；
浓度为6-18 mg/ml的Ca；
浓度为0.05-0.11 mg/l的Cu；
浓度为0.10-0.18 mg/l的Fe；
浓度为34-68 mg/l的K；
浓度为0.33-1.1 mg/l的Mg；
浓度为0.03-0.06 mg/l的Mn；
浓度为0.0008-0.0017 mg/l的Mo；
浓度为3.4-6.5 mg/ml的Na；
浓度为4.4-4.8 mg/l的S；
浓度为0.8-1 mg/l的Se；和
浓度为0.05-0.15 mg/l的Zn。
在一个优选的实施方案中，植物提取物获自2小时的提取，对应于表1中SBE (100%)，2 h提取。
本实施方案的植物提取物适合保护植物免受植物病原体感染。然而，该植物提取物优选在适合施用于植物的工作浓度下对植物病原体无毒性。
本实施方案的另一个方面涉及包含至少一种酚类化合物并且可从甜菜根和/或处理的甜菜根产品，优选处理的甜菜根产品，并且更优选碳酸化甜菜根汁固体部分获得的植物提取物。在此方面，植物提取物适合保护植物免受植物病原体感染。然而，该植物提取物在适合施用于植物的工作浓度对植物病原体无毒性。
本实施方案的植物提取物可任选以稀释或浓缩形式直接用在本文进一步公开的各种方法中。备选地，植物提取物用于形成组合物，该组合物包含，除植物提取物外，至少一种植物信号传导剂和/或至少一种杀真菌剂和/或杀细菌剂。所述植物信号传导剂和/或杀真菌剂和/或杀细菌剂可选自传统上用于诱导植物对生物胁迫的抗性和/或治疗或抑制植物疾病例如晚疫病的试剂和/或杀真菌剂和/或杀细菌剂。此类试剂的非限制性实例包括杀真菌剂Shirlan®、Ranman®和Aliette®以及植物系统获得性抗性和疾病抗性的诱导剂苯并噻二唑(BTH)。
组合物可额外包含载体，优选液体载体。所述载体可为生产植物提取物时使用的溶剂。组合物优选配制为叶片喷雾剂。这样的组合物制剂可容易地施用到植物。其它制剂为可能的并且包括在实施方案中。
在一个方面，植物提取物或组合物用在诱导植物对生物胁迫的抗性的方法中。所述方法包括将植物提取物和/或组合物施用于植物。施用步骤可根据多个不同的实施方案进行。例如，植物提取物或组合物可喷射在植物上，浇在植物上，加在植物生长的底物例如土壤、泥炭、堆肥、蛭石、珍珠岩、沙土或粘土中等。
生物胁迫优选由疫霉属卵菌导致。疫霉属为植物-损伤水霉的一个属，其成员物种能够导致全世界作物的巨大经济损失。疫霉属疾病的实例包括：
导致杜鹃属根腐烂影响杜鹃属、杜鹃花和导致阔叶树伤流溃疡病的恶疫霉(Phytophthora cactorum)；
导致欧洲栗树黑水病的栗疫霉黑水病菌(Phytophthora cambivora)；
感染葫芦科果实例如黄瓜和南瓜的辣椒疫霉(Phytophthora capsici)；
导致肉桂根腐烂影响侧柏、杜鹃花、红桧、山茱萸、连翘、弗雷泽冷杉、铁杉、日本冬青、杜松、马醉木、杜鹃、紫杉、白松、美洲栗和澳大利亚Jarra的肉桂疫霉(Phytophthora cinnamoni)；
导致红根腐烂影响草莓属的草莓疫霉(Phytophthora fragariae)；
山毛榉和杜鹃属的病原体、还出现在其它树木和灌木包括橡树和冬青槲上的Phytophthora kernoviae；
可可黑荚病种类之一的Phytophthora megakarya；
导致椰子属和槟榔子果实腐烂的棕榈疫霉(Phytophthora palmivora)；
影响山毛榉树的Phytophthora plurivora；
感染超过60个植物属和超过100个寄种的Phytophthora ramorum；
导致橡树死亡的Phytophthora quercina；
导致大豆根腐烂的大豆疫霉(Phytophthora sojae)；和
导致马铃薯和番茄晚疫病也称为马铃薯疫病以及马铃薯块茎褐腐病的致病疫霉。
在一个优选的实施方案中，生物胁迫由致病疫霉导致。
本实施方案的另一个方面涉及治疗或预防、或至少抑制或减轻植物晚疫病的方法。所述方法包括为植物施用植物提取物和/或组合物。施用步骤可如上文所讨论的例如通过喷射或浇灌进行。
晚疫病优选由致病疫霉感染引起。
可根据本实施方案的方面处理的植物可为任何植物，包括单子叶(单子叶植物)和双子叶(双子叶植物)以及树木(tree)。在一个优选的实施方案中，植物属于茄科家族。所述植物更优选Solanum tuberosum，即马铃薯。
本实施方案的植物提取物与背景部分提及的现有领域技术不同，这是因为其使用甜菜根的提取物。甜菜提取物(SBE)包含减少马铃薯致病疫霉感染病变大小而对植物或病原体无毒性的酚类化合物与天然元素的混合物。由于SBE为透明液体，将其与杀真菌剂和/或杀细菌剂组合是可能的。一个额外的优点为SBE可基于已经在农业系统中循环的初级产品。也许与现存制剂最重要的不同在于SBE可基于可以大量获得的质量稳定的废弃植物材料。
实施方案进一步的方面涉及生产包含至少一种酚类化合物的植物提取物的方法。所述方法包括混合溶剂与甜菜根和/或处理的甜菜根产品，优选碳酸化甜菜根汁的固体部分。让混合物沉降以形成上清液和沉降固体，这在一个优选的实施方案中对应于碳酸化甜菜根汁的固体部分。从固体分离上清液并用于生产植物提取物。
所述方法任选包括先前讨论的过滤步骤和/或离心步骤。处理的甜菜根产品可如本文中先前所公开的获得。因此，切割任选清洗过的甜菜根以形成切割的甜菜根，即所谓的甜菜丝。甜菜根汁(原汁)从切割的甜菜根例如在浸提器中生产，留下剩余的半固体甜菜根材料。如果处理的甜菜根材料为碳酸化甜菜根汁的固体部分，所述方法包括使原汁碳酸化以形成碳碳酸化甜菜根汁作为可自其生产植物提取物的固体材料。碳酸化优选如本文先前所公开的使用热石灰乳和二氧化碳进行。
然而，如果处理的甜菜根产品为浆料形式，所述方法替代地包括将原汁移走后压榨切割的甜菜根材料以形成甜菜根浆料。此浆料可任选在从其提取植物提取物前进行干燥。
优选让溶剂与碳酸化甜菜根汁固体部分的混合物停留如本文先前所定义的所选择的提取时间段，然后从固体分离上清液。
下文所示的实施例具有例示实施方案多数结果中的一个的单一目的，然而，并不进行限制，这是因为相似的结果在实施方案的范围内。
实施例
提取过程
糖精制过程中，将甜菜清洗然后切割。其后，制备原汁，原汁在与石灰混合以沉淀养分和有机材料时得到纯化。将汁-石灰浆体碳酸化从而形成沉积的聚集体。压榨此固体部分至湿度65%。压榨过的固体部分通常卖回给农民作为主要用于增加pH的土壤改良剂和用作氮源。该固体材料通常在晚秋或冬天施于土壤中。在我们的研究中我们使用此固体作为提取的原材料。将其收集在袋中并储存在冷藏室(8℃)中直至使用。通过混合0.5 l 99.9%的乙醇与1 000 g该固体材料获得甜菜提取物(SBE)。将混合物彻底混合并在冷藏室中放置2小时沉降。沉降后，形成微黄色的上清液层，小心从浆体分离并用两层干酪包布过滤以清除液体中存在的悬浮颗粒。然后将滤液离心(3 000 rpm，5℃，3分钟)。离心后，将上清液储存在8℃螺旋盖容器中直至使用。处理植物前，将提取物用蒸馏水稀释5倍。
提取物组合物
为了调查SBE中存在的一些化合物，使用由D-7100泵、D-7200自动进样器、D-7300柱温箱(设置为40℃)和扫描220-400 nm之间的吸光度的D-7455 DAD检测器组成的MerckHitachi LaChrom HPLC系统对其进行HPLC分析。将500 µl提取物蒸发至干燥并溶解在100µl甲醇和50 µl水中。使用如下的水(用正磷酸酸化至pH 3；A)和甲醇(B)梯度实现在Aquasil C18柱(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)上的分离：0 % B (0-1分钟)；5-45 % B (1-15分钟)；45-85 % B (15-20分钟)；85 % B (20-23分钟)和85-100 % B (23-25分钟)，100 % B(25-27分钟)，接着平衡至起始条件。流速为0.8 ml/min，注入体积为40 µl。峰面积数据在280 nm处采集，允许定量简单的酚类、酚酸和类黄酮。将200-400 nm处采集的紫外光谱与标准化合物文库的光谱数据对比，若化合物的光谱显示与可信标准的光谱97%或更好地匹配，则对其进行试验性鉴定。
在提取物中检测到了几种在紫外范围内有吸收的化合物。SBE的HPLC分析鉴定了多种酚类化合物(图5)。在分析条件下分离的峰经鉴定为对羟基苯甲酸(峰1)、香草酸(峰2)、表儿茶素没食子酸酯(峰3)、异阿魏酸(峰4)和肉桂酸(峰6)。
在Lund大学根据(Tyler和Olsson 2006)通过标准方法分析了提取物中天然元素的浓度。在提取物中检测到了多种天然元素，在表1中所列通过以mg/l计的浓度示出。这些天然元素可有助于SBE的保护作用。
表1-通过标准方法分析SBE中的天然元素(以mg/l计)
治疗植物感染
植物栽培 – 本研究中使用3个马铃薯(Solanum tuberosum)品种：对致病疫霉敏感的Desiree和Bintje以及显示部分抗性的Ovatio。将块茎用添加3 kg/m3白云石石灰、3kg/m3石灰石、0.7 kg/m3 PG-mix™肥料(NPK+微量营养物)和120 kg/m3沙土(1-3 mm)的基于泥炭的土壤(Weibull Horto, Sweden)种植在5 l塑料盆中。将盆放置在控制条件的温室中。白天温度为20℃，夜晚温度为15℃，暴露在用高压钠灯补充的自然光中16小时。栽培4周后使用这些植物。对于PR-1蛋白分析，植物在20℃温室中生长4周，仅16 h人工光照(300 μmol/m2s)。
致病疫霉生长 – 使用的致病疫霉隔离群SE030558 (交配型A1，在携带R1、R3、R4、R7、R10、R11的植物上有毒力，R指示抗性基因)为高毒力的。根据标准方案将培养物保持在豌豆琼脂培养基上。为了获得有传染性的孢子囊，于含有湿滤纸的密封塑料盒中在马铃薯品种Desiree或Bintje的离体叶片上生长和保持致病疫霉。将盒子保持在15℃与下列光照管理下：16 h光照和8 h黑暗。通过在10-15 ml蒸馏水中剧烈摇晃一片感染的叶片释放孢子囊。使用Fuchs-Rosenthal计数板将孢子囊浓度设为15 000孢子囊/ml。接种实验之前将孢子囊溶液保持在4℃ 2 h，以促使游动孢子释放。
接种：将4周大植物完全扩展的叶片放置在盒中，通过加入20 μl孢子囊悬浮液接种致病疫霉，将盒子如早期所述保持。病变直径的测量在接种后(dpi)6天进行。
直接毒性生物测定 – 菌丝生长生物测定通过琼脂盘扩散生物测定(Rohner等2004)进行。转移已经在豌豆琼脂板上生长3周后的菌丝体塞(mycelia plugs)后在豌豆琼脂板上生长致病疫霉。菌丝开始生长后7天，将无菌纸盘(直径12 mm)放置在豌豆琼脂培养基上所生长致病疫霉的菌丝集落对边外5 mm处。将20 % SBE或蒸馏水的80 μl等分试样放在纸盘上，蒸发液体后用石蜡膜密封板。18℃黑暗中接种2和3天后，评估浸渍纸盘位点周围的菌丝生长。为了测量孢子囊萌发抑制，将包含在豌豆琼脂培养基上生长17-20天的致病疫霉的培养皿淹没在无菌去离子水中，用塑料刮棒轻轻刮下生长的菌丝以释放孢子囊。将该溶液首先用两层干酪包布过滤以除去菌丝材料，用Fuchs-Rosenthal计数板检查孢子囊密度，然后将溶液再次过滤通过100 μm细胞滤器。通过将孢子囊溶液3 000 rpm离心3分钟制作更浓缩的孢子囊悬浮液。为了检验SBE (终浓度20%)对孢子囊直接萌发的作用，首先将SBE溶液浓缩。将1 ml未稀释的SBE在旋转蒸发器中室温运行以将SBE浓缩至50 µl，通过加入无菌蒸馏水制成低乙醇浓度的30% SBE母液。为了检验SBE对孢子囊直接萌发的作用，在Eppendorf管中配制1 ml (每种处理三个重复)使得SBE的终浓度为20 % (与叶片处理相同)和孢子囊的终浓度为40 000 孢子囊/ml。乙醇的终浓度为最大值1%，因此使用1%乙醇(EtOH)作为对照处理。将样品放在盒子中并用湿纸包裹。然后将盒子包在铝箔中并放在21℃培养箱中一天。通过在4个随机选择的显微镜视野中计数萌发和未萌发的孢子囊计算孢子囊萌发的百分比。从每种处理的三个重复计算萌发的平均百分比。
感染叶片中的孢子囊产生 –在如早前所述的离体叶片测定中，用水、SBE或BABA最后喷射植物后一天分离完全伸展的叶片并接种致病疫霉(15 000 孢子囊/ml)。感染后10天，将每个感染叶片(总共12片)放置在包含15 ml蒸馏水的50 ml Falcon管中，摇动样品(3000 rpm 10分钟)以释放孢子囊。使用Fuchs-Rosenthal计数板计算孢子囊数目。该实验重复两次。
质外体液的提取 – 叶片取样通过从4周大植物取完全伸展的叶片进行。将叶片在1%吐温-20溶液中浸泡10秒然后在纸上快速干燥。然后将叶片背轴面向上放置在培养皿中并用磷酸盐缓冲液(150 mM磷酸钠和50 mM氯化钠)浸渍。将金属网放置在叶片上以更好地将叶片浸没在缓冲液中并放置在真空室中10分钟。然后，将叶片简单涂在纸上，滚动并小心插入冰上的15 ml Falcon管(每管底部加入3.5 μl蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich)和空心金属环)中。加入金属环从管底累积的质外体液中分离叶片。将样品4℃ 3 000 rpm离心3分钟，将质外体液储存在-80℃。该实验重复两次，结果相似。
SDS-PAGE分离 – 为了分离质外体蛋白，使用12 % SDS-PAGE。蛋白用6X上样缓冲液(0.5 M Tris，30 %甘油，10 % SDS和0.012 %溴酚蓝)和终浓度0.1 M的二硫苏糖醇通过在65℃加热10分钟变性。
用提取物处理植物 – 实验邻开始前，用蒸馏水将SBE稀释5倍。将每个马铃薯基因型暴露在4种不同的处理中。将三个基因型中每个的三个重复植物(每个不同的基因型用四种不同试剂喷射，总共12个植物)暴露在下列喷雾剂的一种中：SBE (稀释至20 %)、BABA(Sigma-Aldrich, 0.3 g/l)、20 %乙醇(EtOH)或蒸馏水。对于每个马铃薯植物，用手压式喷雾器喷射100-200 ml喷雾剂直至试剂流完。喷射进行两次，间隔1天。叶片取样在最后喷射处理后一天进行。将马铃薯以两组种植在田间。一半为未处理的对照植物，第二半用20%SBE喷射3次，间隔一周。对于每个变种和处理，随机挑选20个叶片用于在实验室中感染疫霉。Bintje植物用20% SBE喷射另外3次，间隔1周。
施用SBE降低感染病变的大小
施用SBE降低感染病变的宏观生长，如Desiree植物离体叶片的测定与仅喷射水的对照叶片相比所证明的(图1a)。定量后，发现在所有三个马铃薯基因型中使用SBE后感染病变显著减少(15-18%)(图1b、1c和1d)。用20%乙醇或水的对照无不同，并且SBE的作用与BABA-处理植物的结果无显著差异(图1b、1c和1d)。BABA处理特有的小坏死点或病变在BABA处理后2天在Desiree植物上可见，在Ovatio上的程度较轻，而在Bintje植物上未见此类病变。SBE-处理的叶片未显示坏死病变。
SBE降低孢子囊产生
SBE处理后观察到的降低的感染病变生长可由感染处理叶片上降低的孢子囊产生导致。孢子囊为自然中开始疾病循环的感染繁殖体。因此，孢子囊产生速率可具有重要含义，这是因为其有助于晚疫病的整体流行病学。估算了取自不同处理的感染叶片中的孢子囊产生。与水-处理植物的对照叶片相比，在取自SBE-处理Desiree植物的叶片中观察到孢子囊产生降低(图2)。
SBE对致病疫霉无直接毒性作用
SBE处理后观察到的降低病变发展和孢子囊产生的效果可由提取物对孢子囊萌发或菌丝生长的直接毒性作用导致是可能的。然而，加入SBE后，发现SBE对致病疫霉的菌丝生长无直接毒性作用(图3a)。此外，如萌发的孢子囊显微镜检查所显示的，在SBE存在下孢子囊正常萌发(图3b)。
SBE处理后的PR-1蛋白诱导
由于未检测到SBE处理对病原体的直接作用，我们检验了SBE处理后是否激活宿主内的诱导抗性途径。质外体中致病相关蛋白(PR-1)积累被用作此的标志。用SBE最后喷射处理后1天，发现PR-1蛋白诱导在Desiree叶片中最强，在Ovatio中较不强，在Bintje中最弱(图4)。BABA处理后类似的情况也很明显，尽管施用BABA后诱导整体较强。SBE和BABA处理后还发现其它分泌蛋白积累。因此，SBE能够诱导基于蛋白的防御途径。
在田间试验中施用SBE降低疫霉感染
将Bintje和Ovatio分两组种植在瑞典SLU Alnarp校园的田间。每个变种使用50个块茎。将50%的植物留作未处理对照植物，第二半喷射20 % SBE (甜菜提取物)3次，间隔一周。每个变种和处理随机挑选20个叶片用于疫霉感染(图6)。植物用SBE预处理导致感染后11天感染的叶片百分比降低。令人惊讶地，在Bintje中的作用最大，在部分抗性品种(Ovatio)中无作用。在用SBE额外喷射3次(间隔1周，总共处理6次)的Bintje中，成功感染的叶片分数降低的水平与3次处理后相似(图6)。
防御诱导剂可导致产率降低，这是因为这些试剂可影响植物的胁迫生理。然而，对照植物和喷射SBE的植物之间未检测到马铃薯块茎产率的减少(25对照Bintje (505块茎，29 Kg)和，25喷射的(507块茎，32 kg))。
SBE、Elot-Vis®和甜菜纤维提取物的对比研究
将瑞典SLU Alnarp校园生长cv Bintje的田地分为5个独立的区块，每个区块中处理独立地随机分为5列。总共使用25列，间隔70 cm。每列生长8株植物，间隔30 cm。处理为20%乙醇(对照)、SBE、半数剂量SBE (0.5×SBE)、Speedi-Beet提取物和Elot-vis® (制造商推荐的剂量)，每列使用400 ml处理溶液。第5次处理后一天，取样用于离体叶片测定。
Speedi-Beet提取物为Masham Micronized Feeds UK制造的产品Speedi Beet的20 %乙醇提取物。本质上，Speedi-Beet为经由独一无二的薄片生产过程加工的无糖浆的甜菜浆料。该产品具有高纤维含量但低糖和淀粉含量。Speedi-Beet被用作马饲料。所述提取物使用本文先前对于SEB所公开的同一提取方法制成。
下表2显示感染后7天所测量的致病疫霉病变大小。使用双尾Student-T检验用于统计分析(n=12, p<0.05视为统计上显著)。
表2 – 田间生长的cv Bintje的对比研究
因此，与对照相比从碳酸化甜菜根汁的固体部分获得的实施方案的SBE产品在减少Bintje致病疫霉感染症状方面具有显著效果。本田间实验中进一步显示从甜菜原材料的另一个部分获得的植物提取物(即Speedi-beet提取物)，与对照无显著差异。
因此，本田间研究显示从甜菜获得的不同植物提取物部分在诱导Bintje对致病疫霉感染的抗性中具有不同效果，因此具有不同成分。这在图7A和7B中进一步显示，其中SBE的高效液相色谱(HPLC)色谱图(280 nm处的吸光度)见图7A，Speedi-Beet提取物见图7B。HPLC分析如本文先前所公开的进行。
该图清楚地表明此两种不同的甜菜提取物，SBE和Speedi-Beet提取物，具有显著差异的成分和特别地不同的酚含量。从色谱图估算SBE的总酚含量为约674 µg/ml，而Speedi-Beet提取物经估算总酚含量仅为88 µg/ml。
该田间研究进一步显示本实施方案的SBE与可市售获得的Elot-vis®的技术效果无显著差异。然而，SBE与Elot-vis®的一个清楚差异为Elot-vis®对致病疫霉有毒性，而SBE无。因此，鉴于Elot-vis®通过对致病疫霉产生毒性实现症状减少，SBE替代地通过免疫增强Bintje对致病疫霉的天然防御而具有不同的作用模式。
通过积分HPLC色谱图中的pOHBA峰面积并与pOHBA标准品比较，测定SBE内含物中的对羟基苯甲酸(pOHBA)总浓度。结果表明在20% SBE中pOHBA的浓度为10 µg/ml。如表2中所示，pOHBA含量为至少10 µg/ml的实施方案的甜菜提取物(SBE)对Bintje的致病疫霉感染具有显著效果。此外，将20 %乙醇SBE稀释至一半浓度(0.5×SBE)导致与对照相比无显著差异。因此看来甜菜提取物(0.5×SBE)中5 µg/ml的pOHBA浓度可能太低而不能取得对Bintje致病疫霉感染的显著效果。
上述实施方案应理解为本发明的少数说明性实施例。本领域技术人员应理解的是，可对实施方案进行多种修饰、组合和变更而不脱离本发明范围。特别地，可将不同实施方案中不同的部分解决方案以技术上可能的其它形态组合。然而，本发明范围通过所附权利要求书定义。
参考文献
Coquoz等 (1995), Phytopathology, 85, 1219–1224
Röhner等 (2004), Journal of Plant Diseases and Protection, 111, 83–95
Slusarenko等 (2008), European Journal of Plant Pathology, 121, 313-322
Stephan等 (2005), European Journal of Plant Pathology, 112, 235–246
Tyler和Olsson (2006), Chemosphere, 65, 250-260
Widmer和Laurent (2006), European Journal of Plant Pathology, 115,377-388。

Claims (24)

1.一种植物提取物，其包含至少一种酚类化合物并且可根据包括下列步骤的方法获得：
通过以下获得碳酸化甜菜根汁的固体部分：
-切割甜菜根；
-从所述已切割的甜菜根生产甜菜根汁；
-混合所述甜菜根汁与氢氧化钙在水中的悬浮液以形成碱性糖溶液；
-向所述碱性糖溶液中鼓入二氧化碳以使所述氢氧化钙作为包裹和吸附所述甜菜根汁中杂质的碳酸钙颗粒沉淀；和
-去除液体部分以形成所述碳酸化甜菜根汁的所述固体部分；
混合溶剂与所述碳酸化甜菜根汁的所述固体部分，其中所述溶剂是乙醇或水和乙醇的组合；
让所述溶剂与所述碳酸化甜菜根汁的所述固体部分的所述混合物沉降，形成上清液和沉降固体；
从所述沉降固体分离所述上清液；和
从所述上清液生产所述植物提取物，
其中所述至少一种酚类化合物包含浓度大于5 µg/ml的对羟基苯甲酸；和
所述植物提取物能够治疗或抑制属于茄科的植物的晚疫病。
2.权利要求1的植物提取物，其中所述至少一种酚类化合物还包含香草酸和表儿茶素没食子酸酯中的至少一种。
3.权利要求1或2的植物提取物，其中所述植物提取物包含浓度至少10 µg/ml的对羟基苯甲酸。
4.权利要求1或2的植物提取物，其中
所述植物提取物适合保护植物免受植物病原体感染，和
所述植物提取物在适合施用到所述植物的工作浓度下对所述植物病原体无毒性。
5.权利要求1或2的植物提取物，其中让所述混合物沉降包括让所述混合物在从30分钟直至24小时的间隔内所选的提取时间期间沉降。
6.权利要求5的植物提取物，其中让所述混合物沉降包括让所述混合物在从1小时直至6小时的间隔内所选的提取时间期间沉降。
7.权利要求6的植物提取物，其中让所述混合物沉降包括让所述混合物在从1小时直至4小时的间隔内所选的提取时间期间沉降。
8.权利要求1或2的植物提取物，其中生产所述植物提取物包括以下步骤：
过滤所述上清液以从所述上清液去除悬浮颗粒；和
离心所述滤过的上清液以形成液体形式的所述植物提取物。
9.权利要求1或2的植物提取物，进一步包含：
未稀释形式的所述植物提取物中浓度为0.02-0.03 mg/l的Al；
浓度为0.3-0.4 mg/l的B；
浓度为6-18 mg/ml的Ca；
浓度为0.05-0.11 mg/l的Cu；
浓度为0.10-0.18 mg/l的Fe；
浓度为34-68 mg/l的K；
浓度为0.33-1.1 mg/l的Mg；
浓度为0.03-0.06 mg/l的Mn；
浓度为0.0008-0.0017 mg/l的Mo；
浓度为3.4-6.5 mg/ml的Na；
浓度为4.4-4.8 mg/l的S；
浓度为0.8-1 mg/l的Se；和
浓度为0.05-0.15 mg/l的Zn。
10.包含权利要求1-9中任一项的植物提取物和至少一种植物信号传导剂和/或杀真菌剂和/或杀细菌剂的组合物。
11.权利要求10的组合物，其配制为叶片喷雾剂。
12.诱导植物对生物胁迫的抗性的方法，包括给所述植物施用权利要求1-9中任一项的植物提取物和/或权利要求10或11的组合物。
13.权利要求12的方法，其中所述生物胁迫由疫霉属卵菌导致。
14.权利要求13的方法，其中所述生物胁迫由致病疫霉导致。
15.治疗或抑制植物晚疫病的方法，包括给所述植物施用权利要求1-9中任一项的植物提取物和/或权利要求10或11的组合物。
16.权利要求12或15的方法，其中所述植物属于茄科。
17.权利要求16的方法，其中所述植物为马铃薯。
18.制造包含至少一种酚类化合物的植物提取物的方法，所述方法包括以下步骤：
混合溶剂与碳酸化甜菜根汁的固体部分，其中所述溶剂是乙醇或水和乙醇的组合；
让所述溶剂与所述碳酸化甜菜根汁的所述固体部分的所述混合物沉降，形成上清液和沉降固体；
从所述沉降固体分离所述上清液；和
从所述上清液生产所述植物提取物，
其中所述至少一种酚类化合物包含浓度大于5 µg/ml的对羟基苯甲酸；和
所述植物提取物能够治疗或抑制属于茄科的植物的晚疫病。
19.权利要求18的方法，其中生产所述植物提取物包括以下步骤：
过滤所述上清液以从所述上清液去除悬浮颗粒；
离心所述滤过的上清液以形成液体形式的所述植物提取物；和
任选稀释所述离心的滤过上清液以形成液体形式的所述植物提取物。
20.权利要求18或19的方法，进一步包括步骤：
切割甜菜根；
从所述已切割的甜菜根生产甜菜根汁；和
碳酸化所述甜菜根汁以形成所述碳酸化甜菜根汁的所述固体部分。
21.权利要求20的方法，其中碳酸化所述甜菜根汁包括：
混合所述甜菜根汁与氢氧化钙在水中的悬浮液以形成碱性糖溶液；
向所述碱性糖溶液中鼓入二氧化碳以使所述氢氧化钙作为包裹和吸附所述甜菜根汁中杂质的碳酸钙颗粒沉淀；和
去除液体部分以形成所述碳酸化甜菜根汁的所述固体部分。
22.权利要求18或19的方法，其中让所述混合物沉降包括让所述混合物在从30分钟直至24小时的间隔内所选的提取时间期间沉降，形成所述上清液和所述沉降固体。
23.权利要求22的方法，其中让所述混合物沉降包括让所述混合物在从1小时直至6小时的间隔内所选的提取时间期间沉降，形成所述上清液和所述沉降固体。
24.权利要求23的方法，其中让所述混合物沉降包括让所述混合物在从1小时直至4小时的间隔内所选的提取时间期间沉降，形成所述上清液和所述沉降固体。
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