CN1055198C - 一种高效作物防病增产菌的选育方法 - Google Patents

一种高效作物防病增产菌的选育方法 Download PDF

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Abstract

一种高效作物防病增产菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。菌种筛选工艺中采用从双子叶植物丝瓜、大豆等；单子叶植物玉米、水稻等根围10cm土壤、地上茎、叶片、果实或穗表皮取样。分离时经煮沸，选取芽孢杆菌。选择生长快、抑菌活性强和抗菌谱广的菌株。经检测该菌株能分泌大量的抗菌蛋白，其菌剂对多种植物病原真菌和细胞有很强的抑菌活性。对目前已测定的三种植物病害有防治作用，并有明显的增产效果。

Description

一种高效作物防病增产菌的选育方法
本发明涉及一种作物防病增产菌，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TG26菌株及其筛选和菌剂的生产方法。
在世界范围内，植物病害始终严重而普遍地给农业生产造成严重的损失。化学农药在防病增产过程中虽然起到了显著作用，但也造成了环境污染和人畜中毒等弊端。因此近年来世界各国对微生物农药的发展及应用引起了广泛的重视，并取得了较好的成效。在拮抗菌利用方面以防虫为多(Hall，I.M.，1963，Fast，P.G.，1978-1981)，在防病利用上又以真菌居多(Macfarlane，G.，1984，Boland，G.J.1990)。目前世界上利用细菌及细菌素防治植物病害最成功的是用农杆菌K84(Kerr，A.1980)防治多种蔬菜、果树的根癌病，在澳大利亚已经商品化，在欧美有一定的推广面积。在作物增产菌方面，陈延熙(1984)提出了“植物体自然生态系”理论，Fokkema&Schippers(1986)和Inglis&Boland(1990)也提出了相似的理论。陈延熙等1990年根据上述理论从作物体中分离出了地衣芽孢杆菌(BacillusLichenif-ormis)和蜡质芽孢杆菌(Bacillus cerellus)并以多种菌株组合群体发展成具有保健作用的增产菌剂。
本发明的目的在于以植物生态学原理为基础，从根际土壤或植物组织上分离得到产细菌素的植物活性菌；并提供这种对植物病害有防治作用和对植物生长有促进作用的生物活性菌剂的生产方法。因此，本发明着眼点在于筛选对多种植物病原菌有抑菌活性并且可使作物增产的拮抗菌株。使其能防治多种病害，又有增产作用，在多效性及广谱性上优于目前的微生物农药制剂。经过大量筛选工作从丝瓜根部分离纯化出了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TG26菌株。
本发明的技术方案概况为以下具体步骤：
1.TG26菌株的分离纯化
从双子叶植物丝瓜、大豆、蕃茄，单子叶植物玉米、水稻、小麦等根围10cm土壤、地上茎、叶片、果实或穗表皮取样。从样品中随机取5g/份，各取20份。每份加入50ml无菌水，于75-100℃煮沸5-30分钟，沉淀8-12小时后，取上清释109倍，涂布于已涂有浓度适中的病原指示菌的培养基上，培养24-48小时，挑取周围有无菌区的单菌落。对初筛出的单菌落进一步分离纯化，并测定对各种植物病原菌的抑菌活性。从中选出菌落生长快、抑菌带宽、抗菌谱广的菌株。所选出的具有高效抑菌活性TG26菌株的抑菌活性及病原指示菌见表1。该菌株是从丝瓜根部土壤中分离得到的。
2.TG26菌株的鉴定
TG26菌株的群体特征：菌落在NUA平板上呈圆形，中间凸起，边缘整齐，表面皱褶，不透明，浅黄色。菌落直径为0.55cm/24h；在NUB液体培养基中静止培养时有菌膜形成，细胞稳定。
个体形态：细胞为直杆状，0.7-0.8×2.0-2.4μm，芽孢椭圆形近中生，孢囊不膨大，鞭毛周生，运动。原生质染色均匀。
理化特性：好氧，在pH5.7培养基上或7％的NaCl培养基中均生长。过氧化氢酶反应产气，甲基乙酰甲醇试验阳性，V.P培养液生长7天后pH为5.5。利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸。抗溶菌酶、不抗叠氮化钠，水解淀粉，利用柠檬酸盐，还原硝酸盐成亚硝酸盐，不利用丙酸盐。生长温度为8-50℃，最适生长温度为25-35℃；pH4-9都能生长，最适pH为6.5-7.5。
能产生大量有抑菌活性的孢外蛋白，几种抗菌蛋白经Sephadex-G150和FPLC的MonoQ柱已经纯化出来，其氨基酸组成见表2。
根据上述特征特性，该菌属于第八版“伯杰氏鉴定细菌学手册”中的芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌株已于1992年11月7日送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，简称CGMCC保存，保存号No0182。
3.TG26菌剂的生产工艺
将分离得到的TG26菌株按下述程序进行培养：见附图1。
上述原种培养基配方为：蛋白胨0.8-1.2％；葡萄糖0.4-0.8％；酵母膏0.4-0.8％；NaCl 0.4-0.8％；牛肉膏0.4-0.8％；以水补足体积；调初始pH7.0-7.4。
固体培养基加1.6-2.0％的琼脂。
(1)原种的培养
将配好的液体培养基以1/3容量盛装三角瓶，于121-125℃下灭菌20-30分钟，冷却后以1％的接种量接种。32-34℃培养24-36小时，做为原种。
(2)液体发酵
于发酵罐中盛2/3体积的液体培养基，灭菌(121-125℃，20-30分钟)，冷却后以1％的接种量接种，通气量为1∶1(V∶V)，30-32℃培养48-72小时，然后放罐混入轻质碳酸钙和0.1％的十二烷基硫酸钠(SDS)为乳化剂，喷雾干燥成可湿性粉剂。或直接包装即成产品。
(3)固体浅盘培养
培养基：蛋白胨1.2-1.6％，葡萄糖0.8-1.2％，酵母提取物0.8-1.2％，NaCl 0.6-1.0％，牛肉膏0.8-1.2％，水15-20％，SDS 0.1％；调pH7.0-7.4，其余为轻质碳酸钙(160-200目)。
将培养料混匀后于121℃下灭菌30-40分钟，铺入浅盘，厚1.5-3.0cm，接5-7％的原菌剂，拌匀，开放培养48-72小时，干燥后过筛包装成粉剂。含活细胞数大于100亿/g。
4.TG26菌剂的使用方法
(1)拌种：液体菌剂40-50ml/亩或固体粉剂10-15g/亩，加入适量水拌入种子，稍干后播种。
(2)浸种：适用于需发芽播种的作物，发好芽的种子，播种前用液体菌剂40-50ml/亩或固体粉剂10-15g/亩，加适量的水浸种40-50分钟后播种。
(3)浸根：适用于移栽作物前施用，在作物移栽前用菌剂50-60ml/亩或固体粉剂15-20g/亩，加适量水浸根40-60分钟后移栽。
(4)灌根：在作物生长期易感病害前用液体菌剂50-60ml/亩或固体粉剂15-20g/亩，加适量水灌根。
(5)喷雾：在作物生长期易感病害前，用液体菌剂30-50ml/亩或固体粉剂10-15g/亩，加适量水均匀喷到植株上。
目的为了防治植物根部病害或以单纯性增产为主要目的，应以浸种(拌种)、浸根和灌根的方法施用；如以防治植物地上部分病害应以喷雾施用效果为佳；也可两种以上方法配合使用。
5.TG26菌剂防病增产效果
对目前已经测试的小麦赤霉病、西瓜枯萎病和烟草青枯病都有良好的防病增产效果。实施实例中菌剂培养如前所述。
实施例：
实施实例1.小麦赤霉病
在感病程度不同的小麦品种开花前三天喷雾TG26菌剂，表现出很好的防病效果，病小穗数及防效见表3。在江苏小麦赤霉病常发区的防效为76.4％，并有明显的增产作用。
实施实例2.西瓜枯萎病
浸种处理对西瓜枯萎病苗期防效为100％，成株期防效83.3-93.3％，田间灌根防效为73.1％，增产65.5％。
实施实例3.烟草青枯病
浸根处理对烟草青枯病苗期防效为100％，田间成株期灌根防效79.6％，增产60.2％。
实施实例4.单纯性增产实验
灌根处理使烟草根长增加49.23％，叶干重增加22.92％，其相关指标也明显增加(见表4)。
6.TG26菌株防病增产性机制及优点
防病增产性机制的初步研究表明，TG26菌株分泌的抗菌蛋白对植物病原真菌的分生孢子及细菌细胞有溶解作用，对病原菌的生长有抑制作用。施入土壤后，能增加土壤中速效磷的含量，促进植物吸收土壤中的氮，使植物与土壤之间的良性循环性增强。没有污染和残毒，不影响生态环境，只是在作物生长的短期内，于局部位置上形成优势，发挥其积极作用。时间一延长，作物生长发育后施入的菌剂量就又很快恢复到使用前水平。
同时该菌剂还具有适用于大规模生产，有效菌株单纯，工艺简便，成本低廉，每亩地成本只需几角钱。使用方便，一般可以结合常规田间管理措施进行使用。
附图说明：
图1  菌剂的生产工艺图
表1  拮抗菌TG26及其粗蛋白的抗菌谱
                                     抗菌活性
    病原菌
                                 菌落       粗蛋白
小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)
JF3    (SV)                     +++        +++
F15    (SV)                     +++        +++
F17    (SV)                     +++        +++
F4     (SV)                     ++         ++
F10    (SV)                     ++         ++
F34    (SV)                     +++        +++
F23    (WV)                     ++++       ++++
F52    (WV)                     ++++       +++
H28    (MV)                     +++        +++
H20    (WV)                     ++++       +++  水稻稻瘟病菌(Piricularia oryzae)
91-78-1   (SV)                   +++++      ++++
91-3-1    (SV)                   ++++       ++++
2h2-1     (MV)                   +++++      ++++玉米小斑病菌(Helmin thosporium maydis)
T         (SV)                   +++++      ++++
O         (SV)                   +++++      ++++玉米大斑病菌(Helmin thosporium turcicum)
  No 1         (SV)              +          +棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.
    vasinfectum)(SV)             +++        +++西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.
   niveum)     (SV)              ++         ++蕃茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.
   lycopersici)(SV)              +++        +++小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)
      (SV)                       +++        +++烟草赤星病菌(Alternaria longipes)
      3.1015  (SV)               ++++       ++++
      3.4225  (SV)               ++++       ++++人参锈腐病菌(Ramularia panacicola)
     (SV)                        ++++       ++++水稻白叶枯病菌(Xanthomonas campestris)
   pv.oxyzae X61 (SV)            +++        +++烟草青枯病菌(Pseudomonas solalanacearum)
     T62P   (SV)                 +++++      ++++
     T62    (MV)                 +++++      ++++
     T64    (WV)                 +++++      ++++“+”：抑菌圈直径(mm)，+：10.0-15.0；++：15.1-20.1；+++：20.1-25.1；++++：25.1-30.1；+++++：＞30.1
表2.几种抗菌蛋白的氨基酸组成*
Amino acid  Pure protein BI  Pure protein BII  Pure protein BI
  Content    No.of(mol％)    residues   Content   No.of(mol％)    residues   Content   No.of(mol％)    residues
 Aspartic acidThreonineSerineGlutamic acidProlineGlycineAlanineValineMethionineIsoleucineLeucineTyrosinePhenylalanineLysineHistidineArginineCysteine     1.81    2.437.91    10.610.41    0.5634.70   46.5711.06   14.840.74    1.007.03    9.433.13    4.210.43    0.588.78    11.794.34    5.8318.73   25.140.00    0.000.64    0.860.00    0.000.00    0.000.00    0.00     15.00   18.602.70    3.405.10    6.5017.30   21.502.00    1.600.00    0.001.20    1.509.10    11.300.00    0.002.30    2.8039.90   49.505.30    6.500.00    0.000.40    0.500.00    0.000.00    0.000.00    0.00     9.15    5.596.14    3.7512.38   7.557.68    4.691.86    1.148.95    5.464.71    2.887.83    4.782.30    1.415.52    3.3721.04   12.843.71    2.272.45    1.502.65    1.621.64    1.001.99    1.210.00    0.00
*根据氨基酸组成计算的分子量：BI为13970；BII为14497；BIII为15345。
表3.TG26菌剂在不同小麦品种上对赤霉病的防治效果
             病小穗数(个)              防效(％)品种 抗感性
           CK  接种前处理  接种后处理  接种前处理  接种后处理荆州1号    MR  2.16    0.66      1.00        69.40       53.70新中长     MR  3.13    0.71      1.11        74.00       64.50扬麦5号    MS  3.25    0.78      1.11        76.00       65.80镇7495     MS  4.00    0.86      1.77        78.43       55.75Alondra″S″S  4.96    0.88      1.86        82.25       62.50Anhui11     S  6.00    0.81      2.40        86.46       60.00894037      S  4.87    0.55      1.83        88.70       62.40宁麦6号     S  7.78    0.79      1.86        89.80       65.80
表4.TG26菌剂在烟草上的增产指标*处  理    株高  增   茎粗  增    根长  增    叶数   增   叶芽  增   花数    增   花蕾数   增(cfu/g)   (cm)  (％)  (cm)  (％)  (cm)  (％)  (个)  (％)  (个)  (％) (个)    (％)  (个)   (％)5.0×105 60.8  5.37  1.18  1.50 23.13  49.23 22.0  1.0   5.3   1.0   25     400   374    30.42.5×105 53.7  -     1.18  1.50 17.58  13.42 21.3  0.0   5.3   1.0   15     200   346    23.4CK     57.7        1.17       15.50        21.3        4.3         5            280处  理            鲜重(g)                     干重(g)           叶绿素        叶打孔      增(cfu/g)    根  增(％)   叶  增(％)    根  增(％)   叶  增(96)  OD值  增(96)   鲜重(mg)    (％)5.0×105 12.4  20.4  29.30  27.12   5.20  18.2   5.90  22.92  0.114  6.5      68.8       5.92.5×105 11.8  14.6  26.50  14.97   5.10  15.91  5.31  11.04  0.114  8.5      67.0       3.1CK     10.3        23.05          4.40         4.80         0.107           65.0
*该表数据为20株平均值。

Claims (4)

1、一种高效作物防病增产菌的选育方法，其特征在于此增产菌是一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO 0182。
2、根据权利要求1所述的一种高效作物防病增产菌的选育方法，其特征在于将该菌从生活环境中分离筛选出来，即从双子叶植物丝瓜、大豆、蕃茄，单子叶植物玉米、水稻、小麦等根围10cm土壤、地上茎、叶片、果实或穗表皮取样，从样品中随机取5g/份，各取20份，每份加入50ml无菌水，于75-100℃煮沸5-30分钟，沉淀8-12小时，取上清稀释109倍，涂布于已涂有浓度适中的病原指示菌的培养基上，培养24-48小时，挑取周围有无菌区的单菌落，从中选出菌落生长快、抑菌带宽、抗菌谱广的菌株。
3、根据权利要求1所述的一种高效作物防病增产菌的选育方法，其特征在于对该菌进行的培养、繁殖的培养基配方为：蛋白胨0.8-1.2％；  葡萄糖0.4-0.8％；酵母膏0.4-0.8％；NaCl 0.4-0.8％；牛肉膏0.4-0.8％，以水补足体积；初始pH7.0-7.4；灭菌温度121-125℃，15-20分钟，接种量为1％；32-34℃培养24-36小时。
4、根据权利要求1所述的一种高效作物防病增产菌的选育方法，其特征在于选育出的增产菌的形态和生理特征及培养条件为：
(1)菌落在NUA平板上呈圆形，中间凸起，边缘整齐，表面皱褶，不透明，浅黄色，直径为0.55cm/24h；在NUB液体培养时有菌膜形成，细胞稳定，细胞为直杆状，0.7-0.8×2.0-2.4μm，芽孢椭圆形近中生，孢囊不膨大，鞭毛周生，运动，原生质染色均匀；
(2)好氧，在pH5.7培养基上或7％的NaCl培养基中均生长，过氧化氢酶反应产气，甲基乙酰甲醇试验阳性，V.P培养液生长7天后pH为5.5，利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸，抗溶菌酶、不抗叠氮化钠，水解淀粉，利用柠檬酸盐，还原硝酸盐成亚硝酸盐，不利用丙酸盐，生长温度为8-50℃，最适生长温度为25-35℃；pH 4-9都能生长，最适pH为6.5-7.5；
(3)能产生大量的有抑菌活性的孢外蛋白，三种经纯化的抗菌蛋白的氨基数组成特点如下： Amino acid  Pure protein BI  Pure protein BII  Pure protein BIII   Content   No.of(mol％)    residues   Content   No.of(mol％)    residues   Content   No.of(mol％)    residues  Aspartic acidThreonineSerineGlutamic acidProlineGlycineAlanineValineMethionineIsoleucineLeucineTyrosinePhenylalanineLysineHistidineArginineCysteine     1.81    2.437.91    10.610.41    0.5634.70   46.5711.06   14.840.74    1.007.03    9.433.13    4.210.43    0.588.78    11.794.34    5.8318.73   25.140.00    0.000.64    0.860.00    0.000.00    0.000.00    0.00     15.00   18.602.70    3.405.10    6.5017.30   21.502.00    1.600.00    0.001.20    1.509.10    11.300.00    0.002.30    2.8039.90   49.505.30    6.500.00    0.000.40    0.500.00    0.000.00    0.000.00    0.00     9.15    5.596.14    3.7512.38   7.557.68    4.691.86    1.148.95    5.464.71    2.887.83    4.782.30    1.415.52    3.3721.04   12.843.71    2.272.45    1.502.65    1.621.64    1.001.99    1.210.00    0.00
根据氨基酸组成计算的分子量：B I为13970；BII为14497；BIII为15345
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