CN104604946A

CN104604946A - 一种用于防控柑橘黄龙病的生物蛋白制剂及其制备方法

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Publication number: CN104604946A
Application number: CN201510014206.4A
Authority: CN
Inventors: 邱德文; 符江华
Original assignee: Individual
Current assignee: Beijing Dongfang Xianke Technology Co ltd
Priority date: 2015-01-12
Filing date: 2015-01-12
Publication date: 2015-05-13
Anticipated expiration: 2035-01-12
Also published as: CN104604946B

Abstract

本发明公开了一种用于防控柑橘黄龙病的生物蛋白制剂及其制备方法，属于生物农药技术领域，采用的技术方案是，一种用于防控柑橘黄龙病的生物蛋白制剂，有效成分由NAC蛋白和吸水链霉菌代谢产物复配而成。其制备方法包括以下步骤：①选取吸水链霉菌菌种经活化、扩大培养及发酵罐培养至菌体浓度达60-80%时停止发酵，获得吸水链霉菌；②将①中所得吸水链霉菌进行细胞破碎，浓缩去除70-90%体积的水分，得浓缩发酵液；③以质量份数计，称取浓缩发酵液20-40份，NAC蛋白1-1.5份，载体20-30份，助剂5-8份，混合均匀，干燥，粉碎。本发明的制剂环境友好、制备工艺简单、无毒高效；不仅对柑橘黄龙病有很好的防治效果，还使病株叶片由黄转绿，对病株有一定的恢复效果。

Description

一种用于防控柑橘黄龙病的生物蛋白制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种用于防控柑橘黄龙病的生物蛋白制剂及其制备方法。

背景技术

柑橘黄龙病是由一种限于韧皮部内寄生的革兰氏阴性细菌引起，该病原菌目前全世界均无法分离和人工培养，测试具有一定难度，能够侵染包括柑橘属、枳属、金柑属和九里香等多种芸香科植物，是世界柑橘生产上的毁灭性病害，该病传染快，发病率高，损失惨重。目前，该病主要分布在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的近50 个国家和地区。我国是柑橘生产大国，2006年种植面积188.2万公顷，占世界柑橘种植面积的24%，居世界首位；总产量1842.5万吨，占世界总产量的16%，居世界第二位，但19 个柑橘生产省（市、自治区）中已有11 个受到该病危害，尤以主产区广东、福建、广西、江西南部、湖南南部、贵州南部、浙江南部等有柑橘木虱活跃的省（区）为重，严重制约柑橘产业的健康发展。人们已经取得共识，只有把黄龙病防治好，排除柑橘业发展中的这个最大障碍，保障安全生产，才能提高效益，使果品的数量和质量能满足消费者的需求，然而目前，对柑橘黄龙病以预防为主，对于染病植株大部分采取控制木虱或铲除植株方法或喷施有机杀虫剂，劳动强度大，影响收益且对果实、土壤、环境及人的健康影响较大，因此，研究制备环境友好、毒性小或无毒的有效控制黄龙病的制剂对柑橘产业至关重要。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种制备工艺简单、无毒高效的生物蛋白制剂及其制备方法，采用能够促进植物的生长、提高植物抗病害免疫能力的生物蛋白与包括多种抗生素和生物活性物质的微生物代谢产物作为有效组分并合理配伍，应用于柑橘上，不仅对柑橘黄龙病有很好的预防效果，还使病株叶片由黄转绿，对病株有一定的恢复效果，达到预防与治疗相结合，有效防治柑橘黄龙病的效果。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是，一种用于防控柑橘黄龙病的生物蛋白制剂，所述制剂的有效成分由NAC蛋白和吸水链霉菌代谢产物复配而成。

上述技术方案中，NAC蛋白，即初生多肽复合蛋白，具有提高植物免疫能力的效果，机理在于NAC蛋白通过增加植物的叶绿素，能够促进植物的生长、代谢，使用NAC蛋白后可以促进植物产生水杨酸、茉莉酸和乙烯等物质，进而促进植保素、抗病相关蛋白和酚类有机物等抗菌、抗病毒物质的合成，最终达到提高植物抗多种病害免疫能力的效果，因此还被称为植物免疫蛋白，本发明人所在的研究小组以此申请并获有发明专利ZL 201010528359.8，“一种植物免疫蛋白的制备方法”和ZL 201010528067.4，“NAC蛋白作为植物免疫蛋白的应用”。链霉菌是一类在自然界尤其是在土壤中广泛存在的微生物，是微生物中产抗生素最多的种属，目前已发现约有三分之二的天然抗生素都来自源链霉菌，随着天然化学和病理学研究的深入，链霉菌最引人关注的是它们不仅具有复杂的形态分化过程，而且能够产生多种包括抗生素和生物活性物质在内的次级代谢产物，这些次级代谢产物在医药、农业和畜牧业等领域起着巨大的作用。吸水链霉菌是链霉菌属中的一个比较常见种，据不完全统计，吸水链霉菌能够产生 100 多种不同的次级代谢产物，主要有酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等）、药理活性物质、杀虫杀螨和除草剂、抗菌剂等，在农业和医学等领域起到了重要作用。

将NAC蛋白与吸水链霉菌代谢产物作为制剂的有效成分，一方面促进植物生长、代谢，及抗菌、抗病毒物质的合成，进而提高植物抗多种病害的免疫能力；另一方面，可以有效控制已经被病菌感染的植株的病情，两者复配以预防和控制相结合的原则，协同调节植物的免疫及抗病能力，相比于只提高免疫能力或治标不治本的见病施药，其促进植株健康的效果更加显著。

本发明还提供上述一种用于防控柑橘黄龙病的生物蛋白制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：

①选取吸水链霉菌菌种经活化、扩大培养及发酵罐培养至菌体浓度达60-80%时停止发酵，获得吸水链霉菌；

② 将①中所得吸水链霉菌进行细胞破碎，浓缩去除70-90%体积的水分，得浓缩发酵液；

③ 以质量份数计，称取浓缩发酵液20-40份，NAC蛋白1-1.5份，载体20-30份，助剂5-8份，混合均匀，干燥，粉碎，得用于防控柑橘黄龙病的生物蛋白制剂粉末。

本发明的有益效果是：（1）本发明的生物蛋白制剂环境友好、制备工艺简单、无毒高效；（2）本发明的生物蛋白制剂不仅对柑橘黄龙病有很好的防治效果，还使病株叶片由黄转绿，对病株有一定的恢复效果。

下面结合附图对本发明进行详细说明。

附图说明

图1是本发明的生物蛋白制剂制备方法的工艺路线图；

图2是洋墩乡芦柑黄龙病植株照片；

图3是图2中的黄龙病植株两次喷施本发明的生物蛋白制剂稀释液后的照片；

图4是云坑镇南丰蜜桔黄龙病植株照片；

图5是图4中的黄龙病植株两次喷施本发明的生物蛋白制剂稀释液后的照片。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作详细说明，其中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明利用NAC蛋白与吸水链霉菌发酵后的代谢产物作为有效组分并合理配伍制成生物蛋白制剂应用于柑橘上，其配伍示例如下表1所示。

表1 用于防控柑橘黄龙病的生物蛋白制剂有效组分的质量份数组成示例

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生物蛋白制剂的制备方法以下将做具体说明，首先制备吸水链霉菌代谢产物，其中吸水链霉菌菌种由中国农业微生物菌种保藏管理中心（简称ACCC）获得，保藏编号为40473，保藏地址为：北京市海淀区中关村南大街12号。其代谢产物的制备方法包括如下步骤：

（1）菌种活化：将吸水链霉菌菌种的冻干粉溶于0.5ml生理盐水，采用接种针以平板划线法接种于固体培养基上，置入恒温培养箱中于温度28℃培养48h，得活化的菌种。所用培养基成分为硝酸钾1g、磷酸氢二钾0.5g、氯化钠0.5g、硫酸亚铁0.01g、玉米淀粉20g、硫酸镁0.5g、水1L、琼脂20g，pH 为7.0，经121℃灭菌30min。

（2）扩大培养：将（1）所得活化的菌种接入至摇瓶，置于恒温摇床以28℃，转速200rpm，培养48h，作为发酵罐种子液。培养所用的液体培养基成分为硝酸钾1g、磷酸氢二钾0.5g、氯化钠0.5g、硫酸亚铁0.01g、玉米淀粉20g、硫酸镁0.5g、水1L，pH为 7.0，经121℃灭菌30min，灭菌后常温冷却。

（3）发酵罐培养：将（2）中发酵罐种子液接入至发酵罐，接种量为1%，以温度28℃，搅拌转速200rpm，通气量1：1开始发酵。其中发酵罐培养基各成分比例为硝酸钾1g、磷酸氢二钾0.5g、氯化钠0.5g、硫酸亚铁0.01g、玉米淀粉20g、硫酸镁0.5g、蛋白胨10g、豆粕粉5g、水1L，pH为7.0，经121℃灭菌30min，灭菌后冷却至28℃。

（4）取15ml发酵液称总质量，然后以5000g离心5min，分离菌沉淀，计算菌沉淀所占发酵液总质量的质量百分比作为菌体浓度。待发酵罐中菌体浓度达60-80%时停止发酵并进行活菌细胞壁破碎，使得吸水链霉菌释放胞内物质，得到含有吸水链霉菌代谢产物的发酵液。

活菌细胞壁破碎是将发酵液转入高压均质机进行细胞破碎，高压均质机是利用高压条件下混悬液，通过一个可调节的限流缝隙过程中失压膨胀爆炸，剪切和高速撞击等综合效应，将存在于液体中的颗粒和油滴粉碎成很小尺寸，直径φ0.1-2μm，平均≤0.8μm，同时建立理想的乳化液或分散液。

得到含有吸水链霉菌代谢产物的发酵液后，浓缩去除总体积70-90%的水分，得浓缩发酵液；浓缩发酵液可直接用于制备本发明的生物蛋白制剂，也可经过喷雾干燥法制成吸水链霉菌代谢产物粉末。

发酵液浓缩是将发酵液转入降膜蒸发器，通过减低气压，加热至60℃蒸发，浓缩5倍，蒸发掉80%水份，获得浓缩发酵液，可直接用于制备防控柑橘黄龙病的生物蛋白制剂。降膜蒸发是将料液自降膜蒸发器加热室上管箱加入，经液体分布及成膜装置，均匀分配到各换热管内，在重力和真空诱导及气流作用下，成均匀膜状自上而下流动。流动过程中，被壳程加热介质加热汽化，产生的蒸汽与液相共同进入蒸发器的分离室，汽液经充分分离，蒸汽进入冷凝器冷凝（单效操作）或进入下一效蒸发器作为加热介质，从而实现多效操作，液相则由分离室排出。降膜蒸发器的优点在于适用于热敏的生物类物料，浓缩温度低，停留时间短，能最大限度保证热敏物料在浓缩过程中物料被加热失活。

NAC蛋白可通过市售获得，亦可采用本发明人所在研究小组常规方法获得，其制备步骤如下：

（1）发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）菌株的培养：将发酵毕赤酵母 CGMCC 2.1838用PDA培养基试管斜面培养，然后加50%液体石蜡油封存并置于-70℃超低温冰箱中保存，大量摇菌则采用 PDA 液体培养基培养；在紫外光照射 25min 后的洁净工作台上，先从低温保存的种管中挑取少量发酵毕赤酵母CGMCC 2.1838菌体，将该菌体转接到固体PDA培养基上，然后放置在37℃的恒温培养箱中培养24h，完成一级发酵，再从固体PDA培养基上挑取少量菌体接种到PDA液体培养基中，并置于 180rpm、 37℃条件下的振荡摇床中培养 24h，完成二级发酵；

（2）发酵毕赤酵母 CGMCC 2.1838 菌体细胞的破碎：通过上述步骤（1）的培养及发酵后， NAC 蛋白已包含于发酵毕赤酵母 CGMCC 2.1838菌体细胞内，离心得菌体沉淀，再以pH值为7.0～8.0的磷酸缓冲液重悬菌体，使菌体浓度 OD 值为600，菌体浓度为 10¹⁰～ 10¹²cfu/ml，然后采用胶体磨对菌体悬液进行剪切，以破碎其菌体细胞，得到粗蛋白溶液；该磷酸缓冲液中还添加有0.81g的Na₂HPO₃和0.125g的NaH₂PO₃；

（3）硫酸铵沉淀NAC蛋白：将盛有上述步骤（2）制得的粗蛋白溶液的烧杯置于冰盒内，以磁力搅拌器匀速搅拌，缓慢加入研磨过的硫酸铵粉末至其终浓度质量分数达到 20%，溶解1h 后以 4℃、13000 rpm离心20min，收集沉淀；

（4）喷雾干燥：将步骤（3）收集的蛋白沉淀加入到100ml、pH值为7.0～8.0的磷酸缓冲液中重新溶解，得到蛋白液，将该蛋白液按5:1的体积质量比例加入到300目的硅藻土载体中，混合均匀，再将混合物打入喷粉塔中，控制塔内温度为180℃，出风温度 85℃，在塔底得到 NAC 蛋白干粉，经测定该干粉中NAC蛋白的质量分数约为3%。

具体实施时，制备用于防控柑橘黄龙病的生物蛋白制剂可按如下方法操作：

选用上述浓缩发酵液和由普绿通（北京）生物科技有限公司提供的3%植物免疫蛋白（有效组分NAC蛋白占成品总质量的3%）为基础原料，按NAC蛋白与吸水链霉菌代谢产物的干粉质量比为0.1-10：10的总原则，计算并合理量取原料，参见表2所示质量份数组成示例，加入至搅拌机搅拌均匀，得浓稠的膏状固体，再进至烘箱60℃烘干，使含水量达3%以下，然后粉碎为80-200目、优选80-150目干粉，获得载有植物免疫蛋白与吸水链霉菌代谢产物的混合制剂，即用于防控柑橘黄龙病的生物蛋白制剂，为方便保存及出售，可分装为15g/袋的成品。

表2制备生物蛋白制剂的质量份数组成示例

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应用实施例

本发明用于防控柑橘黄龙病的生物蛋白制剂在使用时，以500倍-1000倍质量的清水稀释都有较好的效果，本实施例以600倍质量的清水稀释的生物蛋白制剂进行了柑橘黄龙病防治的试验，试验相关信息如下：

试验地点：福建省南平市顺昌县洋墩乡和云坑镇；

试验品种：芦柑(洋墩乡)和南丰蜜桔(云坑镇）；

试验时间：2014年6月27日 - 2014年7月30日；

试验面积：芦柑约0.7亩，共30棵果树；南丰蜜桔约1亩，共37棵果树；

处理方法：选定实验植株并标记，将植物免疫蛋白与吸水链霉菌代谢产物的生物蛋白制剂15g以600倍质量的清水稀释，在选定试验区进行叶面喷施，每15g制剂可喷施3~5棵植株，于2014年6月27日进行第一次处理，处理前的植株状况作为对照组CK，记录其病情，并测试叶片叶绿素含量；第一次处理后11d（2014年7月7日），调查相关数据，并进行第二次处理；第二次处理后23d（2014年7月30日），调查相关数据，黄龙病植株处理前和两次喷施本发明生物蛋白制剂的稀释液后的照片见附图2和3、4和5，柑橘黄龙病防治结果及果树叶绿素含量分别如下表3和表4所示。

表3生物蛋白制剂对柑橘黄龙病防治结果

表3中：病情指数Pt=×100

诱抗效果=×100%，

其中Pt₁表示一次处理后或二次处理后的病情指数；Pt_CK表示处理前的病情指数；各级代表值分别为0、1、2、3、4、5对应下述分级标准，最高级代表值为5。

柑橘黄龙病病情分级标准为：

0级：全树无病；

1级：书上有1~2个梢有斑驳黄化叶出现；

2级：部分侧枝或主枝有斑驳黄化症状，症状枝占全树的1/3以下；

3级：症状侧枝或主枝占全树的1/3以上和2/3以下；

4级：症状枝在2/3以上；

5级：全树死亡。

由表3可见，本发明的生物蛋白制剂能够增强芦柑和南丰蜜桔等柑橘果树自身对黄龙病的免疫力，应用本生物蛋白制剂处理后的柑橘类果树对黄龙病的抗性有显著增长；经过两次处理后，植株对黄龙病的抗性达到最高值，处理后的平均诱抗效果超过30%，其中芦柑为37.78%，南丰蜜桔为32.76%。结果表明，以本发明的生物蛋白制剂的稀释液处理柑橘果树后，能够诱导柑橘果树对柑橘黄龙病的抗性，并减轻病害的发生，使果树逐渐恢复健康生长状态。

表4柑橘黄龙病果树叶绿素含量

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通过表4的数据可以看出，经过本发明的生物蛋白制剂处理两次后，柑橘果树叶片的叶绿素含量显著提高，平均约提高16%，最多可提高26%，进而促进柑橘果树的光合作用，使果树健康生长。

通过附图2和3、图4和5的对比可见，两次喷施本发明的生物蛋白制剂600倍稀释液后，枯枝长出新叶。

综上可见，本发明的生物蛋白制剂制备工艺简单、无毒高效，不仅对柑橘黄龙病有很好的防治效果，还使病株叶片由黄转绿，对病株有一定的恢复效果。

Claims

1.一种用于防控柑橘黄龙病的生物蛋白制剂，其特征在于：所述制剂的有效成分由NAC蛋白和吸水链霉菌代谢产物复配而成。

2.根据权利要求1所述的一种用于防控柑橘黄龙病的生物蛋白制剂，其特征在于：NAC蛋白与吸水链霉菌代谢产物的质量比为1:1-50。

3.根据权利要求1所述的一种用于防控柑橘黄龙病的生物蛋白制剂，其特征在于：所述NAC蛋白由发酵毕赤酵母CGMCC 2.1838经菌体培养、细胞破碎、沉淀蛋白和喷雾干燥得到，所述吸水链霉菌代谢产物是由吸水链霉菌ACCC 40473经活化、发酵、细胞破碎、浓缩而成。

4.根据权利要求1所述的一种用于防控柑橘黄龙病的生物蛋白制剂，其特征在于：所述制剂的成分还包括载体硅藻土、高岭土或膨润土。

5.根据权利要求1所述的一种用于防控柑橘黄龙病的生物蛋白制剂，其特征在于：所述制剂的成分还包括助剂十二烷基苯磺酸钠或十二烷基硫酸钠。

6.一种用于防控柑橘黄龙病的生物蛋白制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

① 选取吸水链霉菌菌种经活化、扩大培养及发酵罐培养至菌体浓度达60-80%时停止发酵，获得吸水链霉菌；

7.根据权利要求6所述一种用于防控柑橘黄龙病的生物蛋白制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤①中菌种活化采用固体平板培养，培养基成分为硝酸钾1g、磷酸氢二钾0.5g、氯化钠0.5g、硫酸亚铁0.01g、玉米淀粉20g、硫酸镁0.5g、琼脂20g、水1L，pH 7.0，经121℃灭菌30min，冷却后采用划线法接种，于28℃恒温培养48h得活化的菌种；扩大培养采用摇瓶液体培养，培养基成分为硝酸钾1g、磷酸氢二钾0.5g、氯化钠0.5g、硫酸亚铁0.01g、玉米淀粉20g、硫酸镁0.5g、水1L，pH 7.0，经121℃灭菌30min，灭菌后常温冷却，挑取活化的菌种接入摇瓶，于恒温摇床上以转速200rpm、28℃培养48h，作为发酵罐种子液；将发酵罐种子液转至发酵罐进行发酵，接种量为1%，条件为温度28℃、转速200rpm、通气量1：1，发酵罐培养基成分比例为硝酸钾1g、磷酸氢二钾0.5g、氯化钠0.5g、硫酸亚铁0.01g、玉米淀粉20g、硫酸镁0.5g、蛋白胨10g、豆粕粉5g、水1L，pH为7.0，经121℃灭菌30min，灭菌后冷却至28℃。

8.根据权利要求6所述一种用于防控柑橘黄龙病的生物蛋白制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤③中载体为硅藻土、高岭土或膨润土。

9.根据权利要求6所述一种用于防控柑橘黄龙病的生物蛋白制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤③中助剂为十二烷基苯磺酸钠或十二烷基硫酸钠。

10.根据权利要求6所述一种用于防控柑橘黄龙病的生物蛋白制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤③所得生物蛋白制剂粉末粒度为80目-200目。