CN107188929A - 一种酶响应性自组装肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种酶响应性的两亲性自组装多肽,该多肽序列为Nap‑Phe‑Phe‑Gly‑Pro‑Leu‑Gly‑Leu‑Ala‑Arg‑Lys‑Arg‑Lys‑NH₂（Nap为萘基），是一种阳离子型两亲性短肽。本发明抗菌肽具有良好的自组装能力，其自组装纳米纤维可以包结大量疏水性药物分子；其自组装结构在基质金属蛋白酶的作用下发生改变并释放出药物分子；相较于正常细胞，癌细胞过量表达基质金属蛋白酶，可以更有效地酶解多肽自组装结构释放出治疗药物，因此在合适给药量条件下，可以实现对癌细胞的选择性杀伤。

Description

一种酶响应性自组装肽及其应用

技术领域

本发明属于纳米材料研究领域，具体涉及一种阳离子型的两亲性自组装短肽及其作为酶响应性药物载体用于癌细胞靶向给药的应用。

背景技术

癌症是危害人类生命健康的重大疾病之一，严重威胁着人类健康。化学药物疗法是肿瘤治疗的重要手段，然而目前的抗肿瘤药物存在靶向性差、毒副作用大等缺点，易破坏人体免疫力，损伤正常机体，使病人产生恶心、呕吐、脱发、身体虚弱等症状。因此，通过合适的载体选择将药物富集于肿瘤组织而避免损伤其它正常组织，从而实现对肿瘤组织的靶向性给药是当今抗癌药物研发面临的巨大挑战之一。

多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质，是介于蛋白质和氨基酸之间的一类化合物。多肽由天然氨基酸残基组成，具有非常好的可降解性、生物相容性，且多肽分子可以通过非共价相互作用（如疏水作用、氢键、范德华力等）组装为纳米纤维、纳米胶束、纳米囊泡、纳米带、纳米管等各种结构。近年来，人工设计、合成自组装多肽的研究成为材料学和生物医药等领域的研究热点。其中，多肽分子自组装结构作为药物载体有着广泛的应用前景，通过在其中引入响应性基团或者片段，有望制备出智能型靶向给药体系。

对于酶响应型材料的设计，多肽具有特殊的优势，通过设计，将含有酶切位点的多肽序列引入到分子中，所得到的材料便具有酶响应活性，从而实现肿瘤的诊断或治疗。基质金属蛋白酶（MMPs）在多种肿瘤细胞中过量表达，它们能降解细胞外基质中的各种蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用，是肿瘤浸润转移过程中主要的蛋白水解酶。如果能够将可被MMPs酶解的多肽片段引入自组装多肽分子，有望制备出对MMPs具有响应性的多肽自组装体系，并用于肿瘤靶向给药和治疗。

现有技术中虽然存在大量多肽自组装的文献报道，但是由于多肽自组装的不可预期性，任何多肽分子细微结构的变化，都会导致自组装的失败，因此如何得到一种能够自组装，又具有靶向作用的多肽药物载体仍然是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是克服现有化疗药物难以实现靶向性给药和具有较高副作用的缺陷，提供一种能够包结疏水性癌症化疗药物分子的多肽自组装纳米药物载体，该药物载体具有基质金属蛋白酶的特异响应性、药物负载量高、癌细胞靶向性给药效果好且杀伤能力强，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：

本发明一方面涉及一种多肽，其特征在于其分子结构为下式所示，或者为下式的类似物：

Nap-Phe-Phe-Gly-Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂（Nap为萘基）。

本发明另一方面还涉及上述多肽形成的纳米纤维，优选的，所述的纳米纤维的直径介于6-8nm之间。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的纳米纤维是在磷酸缓冲溶液（PBS）中自组装形成。

本发明另一方面还涉及上述纳米纤维的酶解纳米纤维，所述的酶解是在基质金属蛋白酶存在下发生的，优选的，所述的基质金属蛋白酶为MMP7。

本发明另一方面还涉及一种药物组合物，所述的药物组合物包括上述多肽以及药物分子。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的药物分子为疏水性药物分子。

对于所述的疏水性药物分子而言，包括但不限于疏水性抗肿瘤药物，优选的，所述的疏水性药物分子选自阿霉素和/或紫杉醇。

本发明还涉及上述药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

本发明另一方面还涉及上述多肽的制备，所述的制备方法为固相合成法。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

（1）本发明多肽分子具有良好的自组装能力，其自组装行为呈现出对基质金属蛋白酶的响应性，自组装体结构在酶作用下发生显著改变。

（2）本发明多肽分子其自组装体结构可以包埋较高量的疏水性药物，并实现其在酶作用下的控制释放。

（3）本发明多肽分子的自组装结构作为药物载体可以实现对癌细胞的靶向性识别和药物控制释放，在特定浓度范围（换算为阿霉素浓度在50‒100 ng/μL范围）可实现对癌细胞的选择性杀伤而对人体细胞不具有毒性，有利于降低化疗药物的副作用。

附图说明

图1 （a）不同浓度溶液中多肽分子自组装结构的负染法透射电镜形貌：（A）0.25mM，（B）0.5 mM和（C）2.0 mM多肽溶液的自组装结构的；

图2 负染法透射电镜表征（A）0.5 mM多肽分子溶液自身的聚集体结构和（B）基质金属蛋白酶存在下0.5 mM多肽分子溶液中的组装体结构；

图3（A）0.25 mM多肽分子溶液自身和（B）基质金属蛋白酶存在下0.25 mM多肽分子溶液的质谱表征；

图4 负染法透射电镜表征（A）包埋阿霉素后多肽的自组装结构和（B）包埋紫杉醇后多肽的自组装结构；

图5 不同类型细胞在不同药物载体浓度（换算为阿霉素浓度）下的存活率表征。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。

实施例1：多肽和纳米纤维的制备

所述多肽的分子结构如下所示

其分子合成方法如下：

（1）称取MBHA树脂0.7861 g；配制浓度为0.2 mol/L的下列物质的DMF溶液：A）Fmoc-Phe-OH 体积21 mL ，质量1.63g；B）Fmoc-Lys(Boc)-OH体积 21 mL，质量1.97g；C）Fmoc-Pro-OH体积11 mL，质量0.74g；D）Fmoc-Leu-OH体积21 mL ，质量1.48g；E）Fmoc-Gly-OH体积11 mL ，质量0.65g；F）Fmoc-Ala-OH体积11mL， 质量0.68g；G）Fmoc-Arg(Pbf)-OH体积15mL，质量1.95g；H）Nap-CH₂COOH体积11mL， 质量0.41g。充分搅拌溶解，氨基酸均以2倍量计算，保证充分反应。

（2）配制下述合成试剂：①活化剂：0.45 mol/L，取HBTU 8.54g和HOBt 3.04g溶于50 mL DMF中；②活化碱：2 mol/L，取8.7 mL的二异丙基乙胺(DIEA)和16.3 mL的DMF混合；③脱保护剂：体积比20%哌啶及0.1 mol/L的HOBt溶于DMF中，取哌啶60 mL，4.05 HOBt溶于240 mL DMF中；④裂解剂：TFA∶TIS∶Water =95∶2.5∶2.5（体积比），配制15 mL溶液。

（3）利用CEM公司的Liberty微波多肽合成仪应用Fmoc固相合成法合成多肽，得到尚未裂解的连接有树脂的多肽粗产品。

（4）反应完成后将反应液转移到旋蒸瓶内，在35℃条件下真空旋转蒸发，除去DCM、TFA等残余液体。用滴管将旋转蒸发后的液体逐滴加入7-8倍残液体积的冰乙醚内，静置产生沉淀后，用高速冷冻离心机在9000 rpm、4 ℃条件下离心10 min，反复乙醚沉淀，离心5-6次。除去上层清液，保留沉淀，通风橱内待乙醚挥发完之后，向沉淀中加超纯水，超声摇匀，放入冰箱中预冻1 h，再使用冻干机-60 ℃冷冻干燥24 h左右，即得到纯化的产品，密封-20℃保存。

配制多肽分子Nap-Phe-Phe-Gly-Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂的磷酸缓冲液（pH 7.0，离子强度10 mM）溶液，其浓度为0.25 mM，0.5 mM和2.0 mM，室温放置3天，原子力显微镜结果（图1）显示，0.25 mM浓度以上多肽分子自组装为长的纳米纤维状结构，直径不随浓度改变，保持在6.8 nm左右。

配制多肽分子Nap-Phe-Phe-Gly-Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂的磷酸缓冲液（pH 7.0，离子强度10 mM）溶液，其浓度为0.25 mM，稳定后取出500 μL溶液向其中加入2uL基质金属蛋白酶（MMP7），37摄氏度水浴恒温放置3天，透射电镜结果显示0.25 mM多肽溶液在没有加酶条件下依然组装为直径7.0 nm左右的长纤维（图2A），而加入MMP7的溶液中，出现许多柔性的细小纤维通过侧向堆积形成的团簇状结构，单根纤维的直径在3.2nm左右。而对上述两种溶液的质谱表征结果（图3）显示，在MMP7存在下，Nap-Phe-Phe-Gly-Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂分子（分子量为1557.9）被有效酶解，释放出含有Nap-Phe-Phe-自组装基元的片段Nap-Phe-Phe-Gly-Pro-Leu-Gly-COOH（其分子量为827.9）。

实施例2：药物组合物的制备

该方法包括将药物分子溶液与Nap-Phe-Phe-Gly-Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂多肽分子接触。自组装结构对药物分子的增溶负载：

（1）将1 mg盐酸阿霉素或紫杉醇溶解在1 mL二甲基亚砜中，混合30 μL三乙胺，室温条件下避光放置8小时，得到溶液。

（2）取5 mg Nap-Phe-Phe-Gly-Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂多肽，加入到500 μL上述制备的盐酸阿霉素二甲亚砜溶液或者紫杉醇二甲基亚砜溶液中，用透析袋（截留分子量1 KDa）在磷酸缓冲液（pH 7.0，离子强度10 mM）中透析，每隔3小时换一次缓冲溶液，将未包埋的阿霉素或者紫杉醇清除，24小时候得到包埋有阿霉素或者紫杉醇的纳米药物载体。透射电镜结果（图4）显示，包载有阿霉素或者紫杉醇的多肽纤维直径增大，变为10‒11nm。

（3）将包埋有阿霉素或者紫杉醇的纳米药物载体溶解于2 mL二甲基亚砜中，利用紫外分光光度计测订阿霉素或者紫杉醇浓度（对阿霉素吸收峰定在480 nm，对紫杉醇吸收峰定在227 nm）进一步通过如下公式计算药物载体对阿霉素或者紫杉醇的负载效率：药物载体对阿霉素的负载效率 = （阿霉素浓度 × 溶液体积/阿霉素原始加入量）× 100%，测得药物载体对阿霉素的负载效率为45.2%，对紫杉醇的载药效率为28.7%。

实施例3：细胞实验

（1）细胞实验：首先在无菌的96孔板中接种100 uL密度为1×10⁵ cells/mL的Hela（宫颈癌细胞）、A549（非小细胞肺癌细胞）、NIH 3T3（小鼠胚胎成纤维细胞）和COS7（猴肾成纤维细胞）细胞，置于37℃培养箱中24h，待其贴壁后将孔板中的培养液吸出，向每个孔中加入100uL新鲜培养液和不同体积的包埋有阿霉素的多肽纳米载体溶液，每个浓度设立4个平行Abs _drug，另外用只加缓冲液Tris不加多肽的孔作为对照组Abs _Tris，之后将孔板重新置于37℃培养箱中24h，作用完成后，向每个孔中加入20 uL浓度为5mg/mL的MTT溶液，培养箱中继续培养4h，之后将孔板中的液体吸出，在每个孔中加入150uL的DMSO，并向空白孔中加入等量的DMSO作为调零孔Abs _blank，然后将孔板置于摇床上震荡10min使之充分混匀，最后用酶标仪测定570nm处的吸光值。细胞存活率的计算公式为：

Survival ratio=1-(Abs _Tris-Abs _drug)/( Abs _Tris-Abs _blank)。

图5可以看出，在不同细胞系中加入药物载体载药阿霉素体系，在50‒100 ng/μL阿霉素浓度范围，正常细胞（NIH 3T3和COS7）存活率保持在90%以上，也就是说，药物载体在此浓度范围对正常细胞基本没有毒性；而癌细胞（HeLa和A549）存活率低于40%，也就是说药物载体在此浓度范围可以显著杀伤肿瘤细胞。结果说明，Nap-Phe-Phe-Gly-Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂作为药物载体可以实现对癌细胞的靶向性药物输送和释放，具有非常好的选择性杀伤能力。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，以上实施例只能用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种多肽，其特征在于其分子结构为下式所示，或者为下式的类似物：

Nap-Phe-Phe-Gly-Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-NH₂，其中Nap为萘基。

2.权利要求1所述的多肽形成的纳米纤维，优选的，所述的纳米纤维的直径介于6-8nm之间。

3.根据权利要求2所述的纳米纤维，所述的纳米纤维是在磷酸缓冲溶液中自组装形成。

4.权利要求2或3所述的纳米纤维的酶解纳米纤维，所述的酶解是在基质金属蛋白酶存在下发生的，优选的，所述的基质金属蛋白酶为MMP7。

5.一种药物组合物，所述的药物组合物包括权利要求1所述的多肽以及药物分子。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，所述的药物分子为疏水性药物分子。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，包括但不限于疏水性抗肿瘤药物，优选的，所述的疏水性药物分子选自阿霉素和/或紫杉醇。

8.权利要求5-7任意一项所述的药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

9.权利要求1所述多肽的制备方法，所述的制备方法为固相合成法。