BRPI1014416A2 - nova variante de exendina e conjugado desta - Google Patents

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Abstract

NOVA VARIANTE DE EXENDINA E CONJUGADO DESTA. A invenção fornece uma nova variante de Exendina e um conjugado da variante de Exendina que conjuga o polímero neste, a composição farmacêutica compreendendo estes e o uso destes para tratar doenças tais como redução da glicose sanguínea, tratar diabete, especialmente diabete do tipo II. A invenção também fornece o uso do conjugado Exendina para baixar o peso corporal.

Description

. Relatório Descritivo da Patente de lnvenção para: "Nova varíante de exendina e conjugado desta". campo da invençÃO A presente invenção se relaciona às novas variantes de Exendina, aos conjugados destas com po1Ímeros, e a composição farmacêutica contendo estes, assim como ao uso das nvariantes de Exendina, conjugados, e composições farmacêuticas na redução da glicose sanguínea, especialmente no tratamento da diabetes (em particular a diabetes tipo ll)'. A presente invenção também se relaciona ao uso do conjugado de Exendina na redução do peso corporal. antecedentes da invençÃO Com o desenvolvimento social, o probngamento da expectativa de vida e modificação do estilo de vida, a diabete mellitus foi um dos principais problemas do serviço de saúde ao redor do mundo.
Tanto em países desenvolvidos como em países em desenvolvimento, a morbidez da diabete mellitus está crescendo rapidamente.
Em 2007, há aproximadamente 246 milhões de pacientes com diabete no mundo, e um paciente com diabete morre a cada 10 segundos ao redor do mundo.
É previsto que a população de pacientes com diabete no mundo alcançará 333 milhões até 2025. A China foi uma região severa para a diabete.
Na China, a população de pacientes com diabete tem atualmente 40 milhõeS, que é c) segundo maior número no mundo (o primeiro é a Índia), com a morbidez de aproximadamente 5 %. A diabete mellitus compreende dois tipos: um é a diabete mellitus dependente de insulina (diabete tipo 1) e o outro é a diabete mellitus "não dependente de insulina" (diabete tipo 2). Entre elas, a diabete tipo 2 contribui em mais de 90°6 de diabete.
A diabete tipo 2 é caracterizada por uma secreção não controlada de insulina ou função assim como a disfunção da célula 13, resuitando em doença do lipldio, carboidrato e metabolismo da proteína.
Pode levar a hiperglicemia crônica e eventualmente induz complicações ocorrendo na microvasculatura, macrovasculatura e vários órgãos.
Neste momento, há duas classes de medicamento para controlar a diabete mellitus: j) promotores de secreção da insulina, tal como sulfoniluréias, meglitinidas, e inibidores da dipeptidil peptidase, análogos de GLP-l; e 2) promotores de secreção de não-insulina, tal como insulina, inibidores de a- glucosidase, biguanidas, tiazolidinadionas, e análogos de insulina.
Atualmente, mais medicamentos anti-diabéticos geralmente usados em clínica são menos eficientes para a diabete tipo 2. Eles não conseguem parar o dano progressivo da célula Í3 do pâncreas, reduzir o nível de sangue de HbA1c, e prevenir complicações da diabete, tai como doença cardlaca e falha do rim.
Além d'isso, eles têm, até certo ponto, efeltos colaterais tóxicos.
Consequentemente, há uma necessidade de estudar um novo medicamento para o tratamento da diabete tipo 2. Em 1985, um hormonio intestinal, como o peptideo-l tipo Glucagon (GLP-l), foi descoberto.
GLP-l é expresso pelo gene dos proglucagons após comer, e é segregado principalmente por células L na mucosa intestinal.
GLP-l estimula a célula j3 da ilhota do pânçreas ao secretar insulina (J MED Chem,47, 4128-4134, 2004), e tem um papel importante no nlvel de estabilização da glicose sanguínea.
A administração de GLP-l pode
5 controlar a glicose sanguínea ao nlvel normal em pacientes com diabetes tipo 2 (Diabetes Care, 15, 270-276, 1992; Lancet, 359, 824-830, 2002; Endoer.
Rev, 16, 390-410, 1996; Diabetologia, 28, 565-573, 1985). GLP-l tem funções ccmo segue: ação dependente da glicose na célula j3 da ilhota do pâncreas para promover a transcrição do gene da insulina, e aumentar a biossíntese e a secreção da insulina; estimular a proliferação e a diferenciação
10 da célula j3 e inibir a apoptose da célula B para aumentar a quantidade de células f3 da ilhota do pâncreas; inibir a secreção dos glucaçons; aumentar a sensibilidade dos receptores de insulina em células periféricas; diminuir o nível de HbA1c; suprimir o apetite e a fome; ' atrasar o esvaziamento gástrico (Diabetic Med, 18, 144-149, 2001: Diabetes, 51, 1443-1452, 2002; Diabetobgia, 45, 1263-1273, 2002; Diabetes, 50, 525-529, 2001; Diabetes, 50, 725, 15 2001; Diabetes, 52, 365-371, 2003; Recent Prog.
Hormne Res. 56, 377-399, 2001; Disbetologia, 39, 1546-1 553, 1996; Am.
J.
Physicl Endocrinol.
Metab, 281, E242-247, 2001; U.S. patent 477967, 478017, 478425; Diabetes Care, 22, 403-408, 1999; J.
Clin.
Endocrinology and Metabolism, 88, 3082-3089, 2003; Diabetes, 44, 1295, 1995). Entretanto, GLP-l é degradado facilmente pelo dipeptidil peptidase (DPP lV) no corpo, e tem uma meia 20 vida de menos de 2 minutos, e assim os GLP-l não podem ser usados como uma droga anti-diabética eficaz.
Exendina-4 é um polipeptideo que é achado na saliva do monstro de Gila, um lagarto venenoso que vive no Arizona e rio Novo México dos Estados Unidos (J.' Biol.
Chem, 265, 20259-20262, 1990; j.
Biol.
Chem, 267, 7402-7405, 1992). Exendina-4 é altamente 25 homóloga com GLP-l (7-36) (53%). É informado que a Exendina-4 pode se Iigar ao receptor de GLP-l e exibir um efeito farmacológico agonistico semelhante ao de GLP-l, por exemplo, aumentando a sÍntese da insulina, promovendo a secreção de insulina de uma maneira dependente da glicose; estimulando a prdiferação e regeneração de células B e impedindo a apoptose cie células B a fim de aumentar a quantidade de células 13; impedindo a secreção 30 de glucagons; impedindo a geração de glicogênio sem induzir uma hipoglicemia severa; impedindo a motilidade e secreção gastrointestinal depois de comer; diminuindo o apetite e
. diminuindo a ingestão de comida; protegendo células nervosas (Nat.
Biotech, 23, 857-861, 2005; J.
Biol.
Chem., 266, 2897-2902, 1991; j.
Biol.
Chem., 266, 21432-21437, 1992; Diabetes, 44, 16-19, 1995; Nature, 379, 69-72, 1996). O efeito de Exendina-4 para promover 35 a secreção de insulina e para inibir a secreção do glucagon após comer é dependente da glicose sanguínea, que é vantajoso comparado com as sulfonilureias atualmente usadas, e em particular, a Exendina-4 é menos suscetível a induzir a hipoglicemia, e diminui extremamente a frequência da monltoração da glicose sanguínea e também abaixa o peso corporal.
A fórmulação b.i.d. de Exendina-4 (Exenatida, comercializada como "Byetta"), co- desenvolvida por Amylin e por Eli Lilly,'é aprovada para q mercado nos E.U.A e na Europa (patente US 5,424,286; 6,858,576; 6,872,700; 6,902,744; 6,956,026; 7,297,761). Como tal, 5 este tipo de medicação foi amplamente utilizado no tratamento da diabetes e da obesidade ao redor do mundo.
Os polipeptídeos farmacêuticos exiçem injeções múltipías diariamente, uma vez que estes fármacos têm a meia vida curta no corpo e estabilidade física e qulmica pobre, e eles estejam suscetíveis à degradação por várias proteases.
Exenatida é usado b.i.d como uma injeção de s.c., trazendo aos pacientes uma carga pesada no corpo, na psicologia e na economia, e assim a conformidade dos pacientes é limitada.
Consequentemente, os estudos atuais de drogas anti-diabéticas concentram-se na aiteração estrutural da Exendina-4 e no desenvolvimento de nova forma de dosagem, a fim de prolongar a meia vida plasmática da Exendina-4 e aumentar a exposição sistemática da droga.
A técnica de modificação do polímero é uma técnica de modificação poderosa que foi desenvolvida a partir dcs anos 70, onde a peguilação é uma técnica comum.
Esta técnica consiste em conjugar o PEG quimicarhente a uma proteína farmacêutica, a fim de modificar a superflcie da protelna.
Através da modificação do PEG, o peso molecular das proteínas é aumentado e a taxa de abertura no rim diminuído.
Além disso, uma cadeia do PEG conjugada resulta num obstáculo estérico na molécula da protelna modfficada, conduzindo à redução ' da hidrólise da proteína por proteases no sangue.
Assim, proionga-se eficientemente a residência das proteínas na circulação, resultando no prolongamento da meia vida pIasmática e a exposição sistemática da droga, tendo por resultado uma eficácia melhorada.
Atualmente, a peguilação progrediu em sua segunda geração, a peguilação de sÍtio específico.
A peguilação de sÍtio específico pode ser usada para modificar especificamente determinados aminoácidos nas protelnas, impedindo desse modo a modificação aleatória.
Como tal, a estrutura do centro ativo nas proteínas é menos influenciada. e determinados sítios antigênicos são submetidos a uma intervenção seletiva, tendo por resultado a diminuição de desvantagens tais como a atividade biológica reduzida e a heterogeneidade aumentada devido a peguilação não sÍtio específica.
Cientistas realizaram alguns estudos na modificação do polímero de Exendina-4. Young and Prickett (CN1372570A) mostraram que a Exendina-4 é metabolizada principalmente pela depuração renal.
Assim modificaram Exendin-4 usando o PEG com um peso mdecular que varia de 500 a 20.000 Dalton (Da). Wenchao Bao, Hongjing Xu, Gang Yu, Yajun Zuo (CN1O1125207A) realizaram a modificação de amina em Exendina-4 usando o PEG com um peso molecular que varia de 20kOa a 50kOa.
Entretanto, há uma desvantagem na Exendina-4 existente ou em variantes desta e várias formas mod'dicadas, incluindo a frequência de administração elevada, que traz aos pacientes cargas físicas, psicológicas e econômicas pesadas. Assim, a conformidade dos pacientes é limitada, e estas drogas não podem ser amplamente utilizadas.
Consequentemente, ainda precisa-se de novas variantes de Exendina-4 e variantes modificadas pelo polímero.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO Em um aspecto, a presente invenção fornece uma variante de Exendina que tem a atividade do agonista do receptor GLP-l, onde um ou mais reslduos de aminoácidos são substituldos pela cistelna. comparado com a sequência tipo selvagem da Exendina. Opcionalmente, um ou mais aminoácidos são deletados, adicionados e/ou substituídos na variante da Exendina, onde os amlnoácidos a serem incorporados por adição ou por substituição podem ser aminoácidos naturais ou não-naturais ou análogos do aminoácido. Em uma modalidade, a variante de Exendina tem uma sequência de aminoácidos na qual um ou mais reslduos de aminoácidos são substituídos pela cisteína e opcionalmente por outro aminoácido, comparado com tipo selvagem da Sequência da Exendina-4 His-G|y-G|u-GIy-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-G|n-Met-Glu-G|u-Glu-A|a-Vai- Arg-Leu-Phe-!|e-G|u-Trp-Leu-Lys-Asn-G|y-Gly-Pro-Ser-Ser-G|y-A|a-Pro-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 1), ou Sequência da Exendina-3 HisSerAspG|yThrPhe-ThrSerAspLeuSerLysGlnMetGluGluG|UA|aVal Arg-Leu-Phe-|le-G|U-Trp-Leu-Lys-A$n-Gly-G|y-Pro-Ser-Ser-G|y-A|a-Pro-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 2), Olj sua sequência similar. As substituições do aminoácido são cada uma situada independentemente no N-terminal, C-terminai e/ou na parte interna da sequência do aminoácido tipo selvagem. Em uma modalidade preferida, a variante de Exendina tem uma substituição da cisteina pelo menos no C-terminal da variante. Mais preferencialmente, a variante de Exendina tem uma substituição da cisteina no último aminoácido do C-terminal. Além disso, a variante de Exendina tem preferenciaimente uma substituição da cisteina pelo menos em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste nas posições que correspondem a Arg na posição 20, a Trp na posição 25, a Ala na posição 35 e a Ser na posição 39 da Exendina-4 ou da Exendina-3. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um conjugado da variante de Exendina, onde uma ou mais frações do polímero naturais ou sintéticas (preferencialmente pollmero fisiologicamente aceitável, tai como o po|ia|qui|enog[ico|, mais particularmente o PEG) é conjugado à variante de Exendina. Na modalidade que as partes múltiplas do polímero estão compreendidas no conjugado, cada uma das frações do polímero pode ser a mesma ou não.
Preferencialmente, a fração do pollmero é conjugada à variante da Exendina com uma ou mais cisteínas.
Em uma modalidade, a parte do pollmero é conjugada à variante de Exendina através da ligação do tioéter. 'É conhecido por um técnico no assunto, numa biomolecula conjugada com uma fração do pollmero, a biomolecula conjugada tem atividade biológica que é exponencialmente reduzida, a medida que o peso molecular da fração conjugada aumenta (por exemplo, começando de 4 kDa) (Baibn et al. .Rational design of potent, long-lasting form of interferon: A 40 kDa branched polyethylene glycol-conjugated interferon a-2a for the treatment of hepatitis C.
Bioconjugate Chem, 2001, 12:195-202; Bowen et al.
Relationship between molecuiar weight and duration of activity of polyethylene glycol conjugated . granulocyte colony-stimuiating factor mutein.
Experimental Hematology, 1999, 27:425-32; Bailon et al.
PEG-modified biopharmaceuticals.
Expert Opin Deliv., 2009, 6:1-16). É também conhecido por um técnico no assunto que a meia-vida biológica e/ou meia-vida plasmática assim como a explosão sistemática da droga da mdécula conjugada para prolongar ou aumentar gradualmente, a medida que q peso molecular da fração conjugada aumenta.
No entanto, os inventores surpreendentemente descobriram que, comparado com a variante de Exendina não conjugada, a motécula conjugada da variante de Exendina da presente invenção ainda retem a maioria atividade do agonista receptor de GLP-l, mesmo que o peso moiecular das frações do pdímero aumente até 30 kDa.
Ainda que o peso mdecular da fração de PEG aumente até 40 kDa ou mais, o conjugado da variante de Exendina da presente invenção ainda retem atividade substantiva de agonista receptor de GLP-l.
Em particular, quando o peso molecular da fração do pdímero aumenta de 5 kOa a 27 kDa, a atividade do agonista receptor de GLP-l do conjugado da variante de Exendina é substantivamente a mesma, comparado com a variante de Exendina não conjugada.
Assim, em uma modalidade preferida, a presente invenção fornece um conjugado da variante de Exendina com uma meia-vida biológica e/ou plasmática prolongada e a atividade substancial do agonista do receptor GLP-l.
Em uma modalidade, o polímero é po|ialqui|enQg|ico|, e inclui, por exemplo, o de polietilenoglicol, polipropilenoglicol entre outras coisas.
Uma ou mais frações do polímero podem ter algum peso motecuiar apropriado, por exemplo, 2 kOa a 50kOa, preferivelmente 5 kDa a 30kDa, mais preferencialmente 20 kOa'a 30 kDa, tal como 21 kOa, 22 kOa, 23 kDa, 24 kDa, 25 kDa 26kOa, 27 kDa, 28 kDa, 29 k0a,e 30 kDa assim como qualquer valor entre os peso moleculares acima.
Opcionalmente, o conjugado da variante de Exendina pode também ser conjugado com um ou mais pdlmeros acima que são ldênticos ou não, em um ou mais reslduos do aminoácido.
Estes um ou mais reslduos do aminoácido podem ser cada um situado.
independente no N-terminal, C-terminai e/ou dentro da fração interna da variante de Exendina. Na presente invenção, o polímero para a conjugação pode estar em qualquer configuração apropriada, incluindo, por exempb, ramificação única, ramificaão dupla, ramificação múltipla e/ou ramificado, onde uma das ramificações ou partes pode ser a mesma ou não. A presente invenção ainda fornece um método para preparar o conjugado .da variante de Exendina cÒmo acima, compreendendo contatar a variante de Exendina com o polímero, o pollmero é ligado preferencialmente com um grupo reativo ou ativado ao contatar, de forma a 'conjugar o poiímero ativado a um ou mais reslduos de cisteína da variante de Exendina. Em uma modalidade, as cisteínas na variante de Exendina são especificamente modlficadas por PEG com comprimento diferente da cadeia do poIímero e da estrutura do polímero, com a seleção do grupo de ativaçãc específica e pH apropriado. Em uma modalidade particuiar, c grupo de ativação específica é maleimida. A presente invenção ainda fornece uma composição farmacêutica, compreendendo a variante de Exendína e/ou conjugado da variante de Exendina da presente invenção, assim como opcionalmente um portador farmaceuticamente aceitável. A presente invenção ainda fornece um método para tratar doenças, ' ' compreendendo a administração terapêutica de uma quantidade eficaz da variante de Exendina e/ou conjugado da variante de Exendina e/ou composição farmacêutica da presente invenção a um sujeito na necessidade de tratamento. Similarmente, a presente invenção também fornece o uso da variante de Exendina e/ou conjugado da variante de Exendina e/ou composição farmacêutica da presente invenção para prcduzir um medicamento para o tratamento das doenças. As doenças podem ser selecionadas do grupo consistindo de: sÍndrome de dumping pós-prandial, hiperglicemia, intolerância da glicose, enfermidades ou doenças pós-prandiais que podem ser aliviadas inibindo a secreção do glucagon, regulando o nível de triglicerídeos, e/ou reduzindo a ingestão de alimentos, a obesidade, doenças de aiimentação, sÍndrome da resistência de insulina, diabetes, hiperglicemia, e hipoglicemia. Preferencialmente, a doença é diabetes. Mais preferencialmente, a doença é diabetes tipo 1 ou diabetes tipo 2, em particular diabetes tipo
2. É conhecido que a Exendina reduz o peso corporal de pacientes com obesidade e induz a náusea e vômito, onde o mecanismo de ação é associado com a inibição do centro de atimentação e centro de ativação de vômito no sistema nervoso centrai (Larsen. Mechanisms behind GLP-l induced weight loss. Br j Diabetes Vasc Dis 2008: 8: S34—S41; Schick et al. Glucagon like peptide 1 (7-36)-amlde acts at laterat and medial hypothalamic sites to suppress feeding in rats. Am J Physiol Regul lntegr Comp Physiol 2003: 284:R1427-
35). O conjugado de Exendina ou de variante deste não pode atravessar a barreira sangue- cérebro devido ao peso molecular aumentado, reduzindo assim o vômito induzido pela .Exendina. Consequentemente, antes da iniciação da presente invenção, os inventores nunca esperaram que o conjugado de Exendina ou da variante desta também teriam efeitos 5 reduzidos na redução da ingestão de alimentos e o peso corporal regulados pelo sistema nervoso centraf. Entretanto, os inventores encontraram inesperadamente que o conjugado de Exendlna ou variante desta aumentou significativamente os efeitos na redução da ingestão de alimentos e de peso corporal, embora a Exendina de tipo selvagem e a variante de Exendina não conjugada ambas reduziram a ingestão e de alimentos e do peso corporal. Assim, em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para reduzir o peso corporal administrando um conjugado de Exendina ou variante desta e/ou uma composição farmacêutica que compreende os mesmos. Além disso, a presente invenção também fornece o uso do conjugado de Exendina ou variante deste e/ou a composição farmacêutica que compreende os mesmos na produção de um medicamento para reduzir o peso corporai. Em uma modalidade, o conjugado de Exendins ou a variante desta é o conjugado da variante de Exendina da presente invenção como descrito acima.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figura 1 mostra o espectro de massa de PB-105 obtido no exemplo 1. Figura 2 mostra uma estrutura molecular de PEG. Figura 3 mostra o resultado da análise da pureza de PB-11O (PEG500O-PB-105) obtido no exempb 2 segundo a análise de HPLC. Figura 4 mostra a estrutura molecular de PEG50OOb Figura 5 mostra a estrutura moiecular de PEG500OC.
Figura 6 mostra (a) a imagem tingida por iodo e (b) imagem tingida por azul de Coomassie brilhante dci conjugado de PB-105 peguilado, com faixas respectivas: 1. padrão de peso molecular, 2. PB-106 (PEG2000O-PB-105), 3. PB-107 (PEG3000O-PB-105), 4. PB- 108 (PEG4000O-PB-105) e 5. PB-109 (PEG20000*2-PB-1 05). Figura 7 mostra o resultado da análise da pureza de ,PB-1 06 (PEG2000O-PB-105) obtido no exemplo 3 segundo a anáiise de HPLC. Figura 8 mostra a estrutura molecular de PEG200OOb. Figura 9 mostra a estrutura molecular de PEG200OOc. Figura 10 mostra a estrutura molecular de PEG200OOd. Figura 11 mostra a estrutura molecular dePEG200OOe. Figura 12 mostra o resultado da análise da pureza de PB-112 (PEG2000O-PB-111) obtido no exemplo 3 segundo a análise de HPLC. Figura 13 mostra o resultado da análise da pureza de PB-107 (PEG3000O-PB-105) obtido no exempio 4 segundo a análise de HPLC.
Figura 14 mostra o resultado da análise da pureza de PB-108 (PEG4000O-PB-105) obtido no exemplo 5 segundo a análise de HPLC.
Figura 15 mostra o resultado da análise da pureza de PB-114 (PEG4000O-PB-113) obtido no exempio 5 segundo a anáiise de HPLC.
Figura 16 mostra a estrutura molecular de PEG200OOx2. ·
, Figura 17 mostra o resultado da análise da pureza de PB-109 (PEG20000*2- PB- 105) obtido no exempio 6 segundo a análise de HPLC.
Figura 18 mostra a estrutura molecular de PEG200OOx2b.
Figura 19 mostra a estrutura molecular de PEG20C)OOx2C.
Figura 20 mostra a estrutura molecular de PEG200OOx2d.
Figura 21 mostra o resultado da análise da pureza de PB-119 (PEG2300O-PB-105) obtido'no exemplo 7 segundo a análise de HPLC.
Figura 22 mostra o resultado da análise da pureza de PB-120 (PEG2700O-PB-105) obtido no exemplo 8 segundo a análise de HPLC.
A figura 23A mostra o resultado da análise de HPLC de PB-106 (PEG2000O-PB- 105) armazenado em pH 4,5; -20"C por 60 dias.
A figura 23B mostra o resultado da análise de HPLC de PB-106 (PEG2000O-PB- 105) armazenado em pH 7,0; 4°C por 60 dias.
A figura 23C mostra Cl resultado da análise de HPLC de PB-106 (PEG2000O-PB- 105) armazenado em pH 7,0; -20"C por 60 dias.
Figura 24 mostra a relação resposta de dose dos efeitos de PB-lOl e PB-105 na CAMP intracelular das células PC12. Figura 25 mostra o efeito de PB-105 e do conjugado peguilado deste na atividade de CAMP intracelular in vitro.
Figura 26A mostra a relação entre o MW do PEG no conjugado peguifado e a atividade farmacológica in vitro (registro EC5q)- A figura 26B mostra a relação entre o MW do PEG no conjugado peguilado e na atividade farmacológica máxima (Emax)- Figura 27 mostra o efeito de PB-105 e o conjugado peguilado deste na atividade de CAMP in vitro.
Figura 28 mostra a relação tempo-resposta do efeito de diminuição de PB-1O1 e PB-105. Figura 29 mostra a relação dose-resposta do efeito da redução de gficose sanguínea de PB-1O1 e PB-105. Figura 30 mostra a relação dose-resposta do efeito da redução de glicose sanguínea de PB-1C)1 e sua variante PB-102. Figura 31 mostra a relação tempo-resposta do efeito da redução de giicose sanguínea de PB-105 e do conjugado peguilado deste.
A figura 32A mostra a reiação entre o peso molecular de PEG na variante de Exendina peguilada e a meia-vida biológica (T1/2). A figura 32B mostra a relação entre o peso molecular de PEG na variante de Exendina peguilada e o efeito de redução de glicose máxima (°6 de pré-dose da concentração da glicose sanguínea). A figura 32C mostra a relação entre o MW do PEG na variante de Exendina peguilada e a curva acima da área (AAC) da curva de redução da glicose.
Figura 33 mostra a relação tempo-resposta do efeito de redução da glicose sanguínea de PB-105 e de seu conjugado PB-107 peguilado (PEG30000). Figura 34 mostra a relação dose-resposta do efeito de redução da glicose sanguínea de PB-105 e seu conjugado PB-106 peguilado (PEG20000). Figura 35 mostra a reiaçãi tempo-resposta do efeito de redução da giicose sanguínea do PB-105, P8-111 e conjugados peguilados destes.
Os dados experimentais são mostrados como meios±SEM.
Figura 36 mostra a relação tempo-resposta do efeito equivalente da redução da glicose sanguínea de PB-lOl, sua variante PB-105, de PB-111 e PB-113 assim como o conjugado peguilado PB-106, PB-112 e PB-114. Os dados experimentais são mostrados como meios±SEM.
A flgura 37 mostra a relação te'mpo-resposta do efeito equivalente de redução da glicose sangulnea de PB-105 e seu conjugado peguilado.
Os dados experimentais são mostrados como meios±SEM. * representa a diferença significativa comparada com o grupo PB105 (p< 0,05). Figura 38 mostra os efeitos de PB-1O1, PB-105, PB-106 e PB-120 na Iatência de vomito respectivo (A) e tempos de vomito (B) do pombo.
Os dados experimentais são mostrados como meios±SEM. (a) representa estatisticamente a diferença significativa na dose de 3 mg/kg comparado com o grupo PB-105 p< 0,05); (b) representa estatisticamente a diferença signkicativa na dose de 6 mg/kg comparada com grupo PB-1O1 e o grupo PB- 105 (p< 0)05). Figura 39 mcjstra os efeitos de PB-lOi, PB-105, e PB-106 na resposta alérgica na cobaia sistematicamente imnunizada.
Os dados experimentais são mostrados como meios ± SEM. (a) representa estatisticamente a diferença significativa comparada com o grupo salino (P< 0,05); (b) representa estatisticamente a d iferença significativa comparado com o grupo PB-1O1 ou o grupo PB-105 (p< 0,05). Figura 40 mostra os efeitos no aumento de peso corporal na cobaia (A) 0-18 dias e (b).0-4 dias apÓs a dosagem de PB-1O1, PB-105 e PB-106. Os dados experimentais são mostrados como meios ± SEM. (a) representa estatisticamente a diferença slgnificativa comparada com o grupo salino (p< 0,05); (b) representa estatisticamente a diferença significativa comparada com a Exenatida ou o grupo PB-105 (p< 0,05). Figura 41 mostra efeitos no (a) peso corporal e na (c) ingestão de alimentos no rato após a dosagem de PB-105, PB-106, PB-119 e PB-120. Área B e de D mostram a área abaixo da curva para a curva de tempo do peso corporal e a curva de tempo da ingestão de ' alimento de grupos respectivos após a dose. Os dados experimentais são mostrados como meios ± SEM. (a) representa estatisticamente a diferença significativa comparada com o grupo salino (p< 0,05); (b) representa estatisticamente a diferença significativa comparada com o gr.upo PB-105 (p< 0,05). Figura 42 mostra a curva de tempo da concentração da injeção bolus de Exenatida e PB-105. ' A figura 43 mostra a curva de tempo da concentração da injeção da bolus de PB- 105 e seu conjugado de Exendina peguilado.' Figura 44A mostra a relação entre o MW de PEG no conjugado da variante de Exendina peguilada e a meia-vida plasmática. Fígura 44B mostra a relação entre o MW do PEG no conjugado da variante de Exendina peguilada e a área abaixo da curva (AUC) da curva de concentração-tempo.
DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES PREFERIDAS Definição Como usado aqui, o termo "aminoácido" inclui um aminoácido natural, aminoácido não natural, e análogo de aminoácido, assim como todos os D- e L- estereoisômeros destes Aminoácidos não naturais incluem, mas não são limitados a, ácido carboxílico de azetidirta, 2-ácido aminoadipico, ácido 3-aminoadipico, f3-alanina, alanina, ácido 2-aminobutlrico, ácido 4-aminobutlrico, ácido 6-aminocaproico, ácido 2- aminoheptanoico, ácido 2-aminoisobutirico, ácido 3-aminoisobutirico, ácido 2- aminoheptanedioico, tert-butil glicina, ácido 2,4-aminoisobutírico, ácido 2,2'-diamino- heptanedioico, ácido 2,3-diaminopropionicc, N-etil gtici,na, N-etil asparagina, homoprolina, hidroxilisina, allo-hidroxi4isina, 3-hidroxiproiina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, allo- isdeucina, N-metil alanina, N-metil glicina, N-metil isoleucina, N-metil-amil glicina, N-metil valina, alanina naftaleno, norvalina, norleucina, ornitina, glicina amil, ácido 2-piperidina e tbprdina. Analogo de aminoácido inclui aminoácido natural e aminoácido não-natural onde o grupo carboxi no C-terminai, grupo amino no N-terminai ou grupo de cadeia iaterat é quimicamente reversivelmente ou irreversivelmente bloqueado, ou quimicamente modificada para outro grupo funcionai, tais como sulfóxido de metionina, sulfona de metionina, S- (carboximetil)-cisteina, S-(carboximetil)- sulfoxido de cistelna e S-(carboximeti1)- sulfóxido de cisteína. Como usado aqui, o termo "polipepúdeo" ou "protelna" significam permutavelmente que uma sequência de pelo menos dois resíduos de aminoácido se liga através de Iigação r covalente (tal como a ligação de peptldeo), que pode ser um poiipeptideo recombinante, polipeptideo natural ou poiipeptideo sintético. Como usado aqui, o termo "substituição de cistelna" significa a substituição de um 5 ou mais reslduos de aminoácidos em um pdipeptídeo natural (tal como Exendina-4) pelo resíduo da cisteína através da engenharia genética ou sÍntese artificialmente qulmica.
Como usado aqui, o termo "variação de polipeptideo", a "variação" ou o "analogo" signlficam um polipeptídeo em que a sequência de aminoácido é diferente devido a uma ou mais substituições, deieções, inserções, fusões, truncamentos ou qualquer combinação destes. A variação do polipeptídeo pode ser inteiramente funcional ou faltando uma ou mais atividade funcionais. A variação inteiramente funcional pode conter a mudança tal como a mudança meramente conservada no resíduo não-essential ou na região não-essential. A variação funcional pode compreender a substituição do aminoácido similar, resultando em nenhuma mudança ou na mudança insignificantemente funcional. O aminoácido importante para funções pode serjdentificado por métodos conhecidos no estado da técnica, tal como o sÍtio de mutagenese específico cu a mutagenese de expbração da gfisina (Cunningham, B.
and Wells, J., Science, 244 : 1081-1085, 1989). A posição principal para a atividade dos polipeptídeos pode ser determinada, por exempb, pela análise estrutural tal como a cristalização, NMR ou marcação 'por fotoafinidade (Smith, L. et al., j.Md.8ioi., 224 : 899- 904, 1992; de Vos, A. et al., Science, 255 : 306-312, 1992)- O termo "variação do tiolato" signÊfica as variações do pdipeptídeo em que um tiolato está presente na sequência do aminoácido pela substituição, inserção, fusão ou por qualquer combinação destes. Como usado aqui, o termo "conjugado" significa um produto formado pela ligação covalente ou não-covalehte de um pdipeptldeo ou uma variação do polipeptídeo e o grupo da modificação da presente invenção. O grupo de modificação inclui mas não está limitado aos exemplos acima. Como usado aqui, o termo "um polipeptídeo modificado" ou "uma variaçào modificÜa do polipeptídeo" significam um polipeptÍdeo ou uma variação do pdipeptldeo onde um c)u mais aminoácidos são quimicamente modificados, onde a modificação é uma modificação covalente qu não-covafente de vários grupos, incluindo, mas não limitados a fosforilação, glicosilação, metilação, peguilação, biotinilação, SUMOiiação, acetilação, e o mesmo. 'Como usado aqui, o termo "alquil" significa o alquil de cadeia simples ou ramlficado substituído ou não-substituldo, tal como o alquil C1-C30, o alquil C1-C20, o alquil C2-C15 ou o alquil C3-C1O, onde é opcionalmente substituido por um ou mais substituintes selecionados independentemente do grupo consistindo de grupo halogênio, amino, nitro e o mesmo.
Como usado aqui, o termo "cicloalquil" significa o cicloalqui! C3-C8 substituldo c)u não-substituldo, onde é opcionalmente substituido por um ou mais substituinteS selecionados independentemente do grupo consistindo de alquil C1-C1O, o alquenil C2-C1O, o alquinil C2-C1O, halogênio, amino, e grupo nitro. 5 Como usado aqui, o termo "conjugado" significa um produto formado pela ligação covalente ou não-covalente de um poiipeptÍdeo ou uma variação do poIipeptídeo e o grupo da modificação da presente invenção.
O grupo de modificação inclui, mas não é limitado aos exemplos acima.
Como usado aqui, o termo "alquenil" significa alqueni! de cadeia simples ou ramificada substituída ou não-substituída tendo uma ou mais ligação duplas do carbono- *
carbcmo, onde 2-20, 3-1 5, 4-10 átomos de .carbono podem estar presentes, e substituído opcionalmente por um ou mais substituintes selecionados independentemente do grupo que consiste de grupo amino, nitro e halcgênio.
Como usacio aqui, o termo "arilo" significa o arilo C6-C1O, opcionalmente substituído por um ou mais substituentes selecionados independente do grupo que consiste de alquil Cl-ClC), alquenil C2-C1O, alquinil C2-C1O, grupo halogênio, amino, e nitro.
Como usado aqui, q termo "ligante" significa um grupo orgânico, que ligam PEG a Exendina.
Na presente invenção, Cl ligante pode ser alqui!, éter, amido, éster, tiolato e afins, e o ligante pode compreender, por exemplo, até 30 átomos de carbono, por exemplo 1-25, 2-20, 3-15 ou 3 a 10 átomos de carbono.
Geralmente, como usado aqui, o termo "po|ieti|enog|ico|" tem o significado que é compreendido geralmpnte por um técnico no assunto, incluindo o polietilenogHcol per se e os seus derivados com uma modificação terminal, a menos que especificado de outra maneira. ' Além disso, para c) poIímero tal como o po!ietifenoglico\, existe uma variedade de métodos para determinar o peso molecular.
O peso molecuiar médio (em particular peso molecular da média do número ou peso molecular de média do peso) é usado geralmente para representar o peso molecufar de um pollmero, uma vez que um pdlmero é formado por moléculas com graus de polimerização diferentes em uma escala de distribuição.
O peso molecuiar da média do número ou peso moiecular de média do peso tende a ser igual para polímeros com uma escala estreita de distribuição, embora possam ser diferentes até certo ponto quando o grau de poHmerização nos poíímeros difere na maior parte.
Para polímeros tais como o de polietilenoglicol mencionado aqui, o peso molecuiar pode ser peso molecular da média do número ou peso molecular de média do peso quando mencionado. h
Variantes de Exendina . Em um aspecto, a presente invenção se relaciona a uma variação de Exendina com atividade do agonista do receptor GLP-l, onde um ou mais (por exempio, 1, 2, 3, 4, 5 ou
·> é " 2 j 13/58 & . "
$ 7 &' mais) resíduos do aminoácido são substituídos pela cisteína comparado com a sequência &
,W b de Exendina tipo selvagem.
A substituição da cisteína é cada uma situada independentemente no N-terminal, C-terminal e/ou na parte interna da sequência da variante de Exendina.
Em algumas modalidades, a variante de Exendina tem a substituição
5 da cisteina em peb menos 1,- 2, 3, ou 4 resíduos do aminoácido do C-terminal desta.
Preferencialmente, a variação de Exendina tem uma substituição de cisteina no último aminoácido do C-terminal.
Em algumas outras modalidades, preferencialmente, a variação de Exendina tem uma substituição de cisteina em 1, 2, 3, 4, ou mais resíduos do aminoácido f dci C-terminal, N-terminal e/ou na parte interna da variante de Exendina. f
10 A sequência de Exendina do tipo selvagem ou sequência similar descrità na presente invenção pode ser qualquer seqüência conhecida no estado da técnica, incluindo várias variantes ou analogos ou sequências do agonista desta.
Com relação aos ensinamentos de Exendina, veja, por favor, por exemplo, Eng J. et a!., j.
Biol.
Chem., 265:
20259-62, 1990; Eng j. et al., J.
Biol.
Chem., 267: 7402-05, 1992; WOO0/66629 and
15 WOO0/41546, cada qual é incorporado aqui completamente por referência.
A variante de
Exendina pode também opcionalmente ter .uma ou mais (como 1, 2, 3, 4, 5, ou mais)
modificações adicionais do aminoácido, incluindo, por exemplo, substhuição, deleção,
inserção e/ou adição de amino ácidos.
Similarmente, a modificação adicional do aminoácido pode independentemente ser alocada no N-terminal, C-termina! e/ou dentro da parte interna
20 da sequência cie Exendina.
O aminoácido substituído, introduzido e/ou adicionado pode ser qualquer aminoácido natural, aminoácido não-natural ou analogo do aminoácido, ou D- OLl L- estereoisomero.
Em algumas modalidades, a modificação adicional do aminoácido é substituição conservada do aminoácido, por exemplo, substituição entre Ala/Giy, Ser/Thr,
G!u/Asp, Gln/Asn, AláNal/lle/Leu.
Arg/Lys, Phe/Tyr, etc.
Para a substituição conseNada do
25 amlnoácido, os vários ensinamentos estão presentes no estado da técnica, por exemplo, considerar a patente WO/2006/083301, que é incorporado aqui completamente por referência.
Na presente invenção, a Exendina de tipo selvagem pode ser a Exendina-3 ou
Exendiria-4. Assim, em algumas modalidades, a p.resente invenção refere-se a tais
30 variants de Exendina, onde um ou mais (such as 1, 2, 3, 4, 5, or more) resíduos de aminoácidos são substituidos pela cisteína, comparado com
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AIa- Va|-Arg-Leu-Phe-||e-G|u-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-G|y-A|a-Pro-Pro-Pro-
Ser (SEQ ID NO: 1; Exendina-4) ou
35 His-Ser-Asp-G|y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-G|n-Met-G|u-Gfu-G|U-A{a-. Vaf-Arg-Leu-Phejle-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro- Ser (SEQ ID NO: 2; Exendina-3) ou sequência similar.
Preferencialmente, a variante de
Exendina tem uma substituição de cisteína pelo menos emu ma ou mais posições selecionadas do grupo corisistindo de posições correspondendo a Arg (arginina) na posição 20, Trp (triptofano) na posição 25, Áfa (alanina) na posição 35 e Ser (serina) na posição 39 - da SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. 5 Na modalidade preterida, a variante de Exendina tem uma sequência de aminoácidos selecionados do grupo cortsistindo de: His-G|y-GIu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-G|n-Met-G|u-G|u-G|u-A|a- Va|-Arg-Leu-Phe-j|e-GlU-Trp-Leu-Lys-Asn-G!y-G|y-Pro-Ser-Ser-Gly-A|a-Prc-Pro-Pro- Cys (SEQ ID NO: 3); His-Gly-G ju-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-G|n-Met-G|u-G|u-Glu-A|a- Va|-Arg-Leu-Phe-|ie-Glu-Trp-LeU-Lys-Asn-G|y-G|y-Pro-Ser-Ser-G|y-Cys-Pro-Pro-Pro- Ser(SEQ ID NO: 4); His-Gly-Glu-G|y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-G|n-Met-Glu-G|U-G|u-A|a- Val Arg-Leu-Phe-lie-Giu-Trp-Leu-Lys-Asn-Giy- Cys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro- Ser(SEQ ID NO:5); His-G}y-G|u-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-G|n-Met-G|u-G|u-G|u-A|a- Vaj-Arg-Leu-Phe-lle-G|u-Cys-Leu-Lys-Asn-G|y-Giy-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro- Ser(SEQ ID NO: 6); His-Gly-G|u-G|y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-G|u-Glu-G|U-Ala- Va|-Arg-Leu-Phe-!le-G|u-Trp-Leu-Lys-Asn-Giy-G|y-Pro-Ser-Ser-G|y-A|a-Pro-Pro-Pro-
Cys-Tyr(SEQ ID NO : 7); ou His-dA!a-G!U-G|y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-G|u-Giu-Gfu-Ala- Va[-Arg-Leú-Phe-lle-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro- Cys (SEQ ID NO: 8). Como descrito acima, a variante de Exendina da presente invenção também pode ter opcionalmente uma ou mais (como 1, 2, 3, 4, 5, ou mais) modificações de aminoácidos adicionais, incluindo, por exempio, substituição, deleção, inserção e/ou adição de aminoácido.
A nova modificação do aminoácido pode ser independentemente Iocalizada no N-terminal, C-Êerminal e/ou dentro da parte interna da sequência Exendina.
O aminoácido substituido, inserido e/ou acrescentado pode ser quaiquer aminoácido natural, aminoácido não-natural Qü analogõ do aminoácido, ou D- ou L-estereoisomero.
Em algumas modalidades, a modificação adicional do aminoácido é a substituição conservada do aminoácido. por exemplo, substituição entre Alá/Gly, Ser/Thr, Glu/Asp, Gin/Asn, AláNalMe/Leu, Arg/Lys, Phe/Tyr, etc.
A variante de Exendina pode ser obtida por vários métodos conhecidos no estado da técnica, incluindo métodos de preparação da recombinação, a sÍntese química, etc.
Em uma modalidade, a varjante de Exendina é sintetizada pela qulmica da sÍntese
Ft L d g % "= .. 15/58 = % 3 .e , 3 .£ È do peptideo de fase sólida, e purificada então em escala cle laboratório, como pela única ·¥ í etapa de purificação de fase reversa na coluna HPLC ou em outros métodos apropriados de cromatografia. Em outra modalidade, a variante de Exendina é produzida pelo método de 5 recombinação, incluindo, por exemplo, a expressão em céluias procarioticas ou eucarioticas apropriadas, e a variante de Exendina de acordo com a presente invenção é então isolada por técnicas rotineiras. Por exemplo, na codificação da sequência do ácido nucleico o peptideo é sintetizado em primeiro Iuçjar peio método da sÍntese química, e a sequência é clonada em um vetor da expressão apropriado para a expressão sob o controle do promotor 10 apropriado. Alternativamente, a se!quência do ácido nucleico que codifica a variante de Exendina pode ser obtida da Exendina do tipo selvagem pela mutagenese tal como a mutagenese do PCR, e a sequência é cbnada então em um vetor apropriado da expressão para a expressão sob o controle do promotor apropriado. Estas técnicas estão dentro do escopo das habilidades de um técnico no assunto, e muitos ensinamentos estão presentes 15 no estado da técnica. As células do hospedeiro eucariotico apropriadas incluem células do mamlfero, por exempio, CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep e HepG2. As células são crescidas preferencialmente na condição que é apropriada para a expressão da variante de Exendina de acordo com a presente invenção. Em reiação aos reagentes e às condições para 20 prodüzir ou isolar a variante de Exendina de acordo com a presente invenção, não há nenhuma limitação particular, e qualquer slstema conhecido Olj comerciaimente disponível pode ser empregado. Na a modalidade preferida, a variante de Exendina é obtida pelo método que foi descrito ne estado da técnica.
Muitos vetores de expressão podem ser usados para preparar a Exendin e/ou a 25 variante desta, que podem ser seiecionados do grupo que consiste em vetores eucarióticos e procarióticos da expressão. Ós vetores procarióticos da expressão podem incluir, por exemplo, plasmldeo tais como o pRSET, pET e pBAD, etc., em que os promotores úteis incluem, por exempb, lac, trc, trp, c) recA ou araBAD etc. Os vetores eucarióticos da expressão incluem (i) os vetores usados para a expressão nos fermentos, tais como o pAO, 30 pPlC, pYES, pMET, em que qs promotores tais como AOXl, GAP, GALI, AUGI, etc. podem ser usados; (ii) vetores usados para a expressão em células do inseto tais como o pMT, pAc [delta], p1 B, pMi8, PBAC, etc., em que os promotores tais como o PH, plO, MT, AC5, OpIE2, o gp64, poih, etc. podem ser usadoq: e (iii) os vetores usados para a expressão em células do mamífero tais comc o pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV, etc., e os vetores 35 derivados de sistemas virais, tais como o vírus da vaccinia, vÍrus adeno-associado, vÍrus de herpes, retroviroses, etc., em que os promotores tais como CMV, SV40, EF-I, UbC, RSV, ADV, BPV e [3-actina podem ser usados. Em uma modalidade preferida, a variante de g' 7 , "à· .7 16/58 ·z 7 g
C · , " 4£ Exendina é expressa no sistema de células procarióticas ou eucarióticas, e as sequências ' t ? da codificação após a otimização do codon são usadas. Em uma modalidade preferida, a sequência para expressar a variação de Exendina compreende um peptideo principal e/ou peptideo de sinal, de forma a facilitar a secreçâo da variação de Exendina das células para 5 extracelular seguido pelo isclamento e pela purificação. Em outra modalidade preferida, a sequência para expressar a variante de Exendina não compreende nenhum peptideo principal e/ou peptideo de sinal. A variante de Exendina não é segregada à região extracelular, e é isolada e purificada pela lise da céluia, Conjugados da variante de Exendina 10 A variante de Exendina pode ser conjugada com uma ou mais frações do polímero, dando forma a um conjugado da variante de Exendina. Como usado aqui, o "poIímero" é preferencialmente fisioiogicamente aceitável, incluindo po1Ímeros que são solúveis na sdução aquosa ou na suspensão e não tem nenhum efeito negativo tal como o efeito secundário em mamíferos após ter aplicado o conjugado do polímero Exendina em uma 15 quantidade farmacêutica eficaz. Os po1Ímeros que podem ser usados na presente invenção não têm nenhuma Iimitação particular. Preferencialmente, os polímeros têm sempre 2 à aproximadamente 3000 unidade repetida. As frações do polímero não podem ser selecionadas dos pdímeros naturais ou sintéticos, por exemplo, incluindo, mas não limitadas a, por exempb, os pdissacarídeos, polialquüenoglicol, por exempio, 20 pcdietilenoglicol (PEG), polipropilenoglicol (PPG), óxido do polietileno (PEO), copdímero do de etüenoglicol e de propilenoglicol, álcool de polivinil, ou qualquer combinação destes. Em uma modalidade preferida, uma olj mais frações do PEG são usadas para a modhicação pefa conjugação nci conjugado da variante da Exendina da presente invenção. Na presente invenção, o pollmero não é iimitado à estrutura particular, e pode ser 25 linear (como o PEG alquoxi ou o PEG bifuncional), ramificado ou multi-ramificado (PEG bifurcado ou PEG ligado ao núcleo dos poliois), dendritico ou ter a ligação degradável. Além disso, a estrutura interna do polímero pode ser organizada em quaiquer número de padrões diferentes, em que pode ser selecionado do grupo que consiste em homopolímeros, copolímeros alternacbs, copollmeros aleatórios, copolímeros em bloco, terpolímeros 30 alternados, terpdimeros aleatórios e em trimero em bloco. O poilmero pode ainda incluir pollmeros poli (óxido de alquileno), ácido polimaleico, e poli (D, L-alanina). Em algumas modalidades, o polímero é de poIietiknoglicol (PEG) ou derivados deste, como o metoxi polietilenoglicol (MPEG). Como usado aqui, a menos que especificado de outra maneira, o polietilenoglicol (PEG) inclui aqueles com um grupo teminal hidroxil e 35 aqueles com o ouüo grupo terminal. Dito outro grupó terminal inclui, mas não é limitado a alqucixi, cicloalquoxi, cicbalquiloxi, alquenil, aribxi ou arilalquitoxi. Tais moléculas PEG são todas conhecidas no estado da técnica, e de uso geral na modificação de polipeptídeos. O
N
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, " &
S *à '-F 17/58 '"%.,- PEG de cadeia lateral pode ser linear, ramificado, bifurcado ou multi-ramificado, O de 4 --3" pdietüenoglicol dlferente pode ter o comprimento dherente da cadeia e da estrutura polimerizadas do polimero.
O peso molecular do PEG usado na presente invenção não é particular, podendo
5 estarnaesca|ade0,1a20ÓkDa,taicomo1a150kDa,2a100kDa,3a80kDaQu4a50 kOa, pode também ser de 5 a 40kC)a.
Um PEG particularmente útil tem o peso molecular na escala de 5 a 3Cl kOa.
Algumas outras molécuias úteis do PEG compreendem aqueles divulgados, por exemplo, nas patentes WO 03/040211, US 6,566,506; US 6,864,350 e US
6,455,639. Particularmente, Cl PEG tem uma fórmula geral HO-CH,CH2O- (CFl2CH,O)n-
10 CH,CH,-OH, em que n é cerca de 5 a 4000. Como descrito acima, o PEG usado na presente invenção inclui o PEG com outros grupos terminais, tais como o PEG metoxi, PEG ramificado, e PEG bifurcado, O PEG ramificado apropriado pode ser preparado como descrito na patente US 5,932,462, que é incorporado aqui por referência na totalidade.
O
PEG ramificado representa o PEG que é ramlficado no sÍtio perto do terminal da cadeia do
15 poiímero, e a cadeia principai do PEG ramificado pode ser linear ou ramlficada.
Como conhecido por um técnico no assunto, na molécula ativa biológica conjugada com partes do polímero, a atividade bídóçica da molécula conjugada diminui com o aumento do peso molecular das frações do poiímero (Bailon et al.
Rational design of potent, long-lasting form of intérferon: A 40 kOa branched polyethylene glycol-conjugated interferon a-2a
20 for the treatment of hepatitis C.
Bioconjugate Chem 2001 ; 12:195-202; Bowen et al.
Re|ationship between molecular weight and duration of activity of poIyethylene glycol conjugated granulocyte colony-stimulating factor mutein.
Experimental Hematology
1999; 27:425-32; Baibn et al.
PEG-modified biopharmaceuticals.
Expert Opin D.eliv. 2009: 6:1-16). Como também conhecido pcr um técnico no assunto, a meia-vida biológica
25 e/ou a meia-vida pIasmática aumenta com o aumento do peso molecular das frações do polímero.
Entretanto, é surpreendentemente encontrado aqui, na presente invenção, o conjugado da variante da Exendina da presente irtvenção conserva ainda a maior parte da atividade agonista do receptor GLP-l (tais como atividade in vivo) comparado com a 30 variante de Exendina nãci conjugada, mesmo se o peso molecular de frações do polímero (tais como PEG) aumentar até 30 kOa.
Mesmo se o peso molecular do PEG aumentar até 40 kOa ou ainda, a variante Exendina conjugada da presente invenção ainda conserva substantivamente a ativídade do ãgcínista do receptor GLP-l (tal como a atividade in vivo). Especialmente, quando o peso molecular do PEG aumenta de kOa 5 a kDa 27, a atividade 35 do agonista do receptor GLP-l do conjugado da variante de Exendina permanece substancialmente o mesmo com aquelas de variantes não-conjugadas de Exendina.
A fim de fornecer o efeito terapêutico estável pcir um longo período e reduzir a µ u ¢
A ,""s 18/58 .s 4 ,& .
F ") > :,e frequência a meia-vidada dosagem biológica dopara melhorar conjugado da avariante conformidade dos pacientes, de Exendina q máximoé possÍvel desejãvelenquanto profongar a atividade substantiva do agonista dci receptor GLP-I é retida. Consequentemente, em uma modatidade, a presente invenção fornece um conjugado da variante de Exendina com meia- 5 · vida biológica probngada e a atividade substantiva do agonista do receptor GLP-l. Em uma modafidade específica, o peso molecular de uma Olj mais frações do pclímero (tais como o PEG) no conjugado da variante de Exendina é de 2 kOa a 50 kDa, preferencialmente 3 kDa a 40 kDa, mais preferencialmente 4 kDa a 35 kDa, mais preferencialmente 5kOa a 30 kDa, tal como 5 kOa, 10 kOa, 15 kDa, 20 kDa, 30 kOa e 40 10 kOa, assim como qualquer valor entre qualquer valor do peso molecular como acima mencionado. Nota-se que o peso molecular das frações do polímero conjugadas a um conjugado da variante de Exendina é calculado como o peso molecular total de todas as frações conjugadas do polímero no conjugadc, se o conjugado compreende mais de uma fração do pollmero conjugado, a menos que especificado de outra maneira. 15 Em uma mcdalidade preferida, o peso molecular de uma ou mais frações do poilmero (tais como PEG) no conjugado da variante de Exendina é 20 kÒa a 30 kfja, preferencialmente 21 kOa a 29 kOa, mais preferencialmente 23 klja a 27 kOa, por exemplo 20 kOa, 21 kDa, 22 klja, 23 kDa, 24 kOa, 25 kOa, 2€ kOa, 27 kOa, 28 kDa, 29 kDa, 30 kOa, assim como qualquer valor entre quaiquer valor de peso molecular como 20 acima mencionado. O pdlmero usado na presente invenção é conhecido no estado da técnica, que pode ser obtida por vários meios, incluindo. por exemplo, meios comerciais, tais comc CarboMer, tnc., J.T. Baker, The Dow Chemical Company, etc., preparados alternativamente por métodos conhecidos no estado da técnica, tal como aqueles descritos 25 na' patente EPi 245608. A presente invenção não é limitada aos pollmeros preparados por nenhum método específlco. No conjugado de acordo com a presente invenção, peb menos um po1Ímero pode ser acoplado com a Exendina através do grupo amino, grupo carboxi, grupo de hidroxil e/ou grupo de tioiato, etc. na Exendina. Tais grupos são situados frequentemente em a-amino, a- 30 carboxi e na cadeia lateral do resíduo do aminoácido tal como a iisina, aspartato, glutamato, cisteína, etc. Em algumas modalidades. uma ou mais moléculas do po1Ímero são acopladas com uma variante de Exendina através do tiolato da cisteina na variante da Exendina. A modificação pelo poIlmero tai como q polietilenogliccl no tiolato do resíduo de cisteina nas 35 proteínas pode aumentar a seletividade da modificação, uma vez que há um número de reagentes que é especificamente reativo com g tiolato e o tiolato útil nas proteínas é muito menor do que amina livre tal como o resíduo de Iisina,
·7 +
W T 'K "- :ü . 19/58 2 n± g3 Consequentemente, em :jma modalidade preferida, uma ou mais frações do '* % g: # Á ? polímero podem ser conjugadas em um resíduo de cisteina da variante de Exendina, melhor conjugado em um resíduo de cisteina da variante de Exendina pelo tioéter.
P Preferencialmente, a variante de Exendina tem uma Olj mais substituições de 5 cisteina em posições correspondeRtes a posição 20, posição 25, posição 35 e/ou posição 39 do tipo selvagem de exendina-3 Olj exendina-4, e a variante de Exendina é ligada ao po1Ímero tal como o polieti|eRog|ico| através do grupo de tiolato. Mais preferencialmente, a variação de Exendina tem uma substituição de cisteina nas posições que correspondem a posição 35 e/ou posição 39 clo tipo seivagem de exendina-3 ou exendina-4. Mais 10 preferencia|meRte, a variante de Exendina tem uma substituição de cisteina nos posições que correspondem a posição 39 do tipo selvagem de exendina-3 ou exendina-4. Em uma modalidade específica, a parte do polímero é conjugada com resíduo de cisteína na variante de Exendina de acordo com a presente invenção através da ligação de tioléter. Por exemplo, em relação à molécuia do polietilenoglicol com um grupo de ativação 15 da maleimida, uma ligação cic) tioleter pode ser formada entre o alquenil do maleimida e o tiolato de cistelna, para conjugar uma ou mais frações do pdietilenoglicd ao resíduo de cistelna da variante de Exendina de acordo com a presente invenção. Em algumas outras modalidacies, a Peguilação de resíduos de cisteína pode ser realizada por, por exemplo, a sulfona de Peg-vini!, Peg-iodoacetamida ou bissulfeto de Peg-piridina. Um número de 20 métodos para conjugar frações do polímero tais como o PEG aos poiipeptídeos estão presentes no estadc da técnica, e todos estes métodos podem ser usados na presente invenção. Como usado aqui, "Exendina PEGuiiada", "O conjugado da variante-PEG de Exendina" ou "Exendina" compreendem a variante de Exendina conjugada com um ou mais 25 PEGS. Como usado aqui,"Peguilação" ou "modificação de PEG" compreendem a conjugação de uma ou mais frações do PEG com Exendina. Um método apropriado de Peguilaçãe é divuígado, por exempio, na patente US 5,122,614 e no US 5,539,063, onde todos os métodos divulgados de Peguilação sãcj incorporados aqui por referência na totalidade. Em algumas moáaficiacles, o conjugado tem uma estrutura da fórmula l como 30 abaixo: RPEG— X—CH— Z-- Fxendin
Y (j) cnde, a Exendina representa a varianíe de Exendina de acordo com a presente invenção, Y é H ou RPEG—X_ , e cada X e Z independente são ligantes, PEG representam - (OCH2CH2) n, n é uma integrina positiva, R representa o grupo terminal de PEG, cada R é 35 selecionado preferencialmente independente do grupo que consiste de hidrogênio, alquii, cjc|oa|qUi|, cic|oalqUl{aiqui|, alquenil, aril Qü arüalquil.
+ & ~ * Z " 20/58 e $ e, " & Em aigumas modalidacies específicas, c alquil pode ser alquil C1-C6, ¶ ,é. e preferencialmente alquil C1 -C4, tal como metil, etil, N-propii, isopropii, butil, isobutii e tert- butil; cicfoalquii pode ser o .cicbalquil C3-C7, tal como o cic|opropj|, cicbbutil, ciclopentil, ciclohexil e o ciclohepti!; o cicioaiquHa!quil pode ser alquil do cicloalquii C1-C4, tal como o 5 cicloalquilmetil e o cicloalquiietil, inciuindo o ciclohexilmetil e o clclohexiletil, etc., o aril pode ser fenil, metilfenil e nafti!, etc., o arilalquil pcide ser fenilmetil, feniletil e naftilmetil, naftiletil, moléculas do PEG etc. com vários grupos terminais são conhecidos no estado da técnica, e estes e outras moléculas do PEG podem ser selecionados como desejados. As moléculas do PEG com grupo terminai exiddo podem ser sintetizadas por métodos conhecidos no - 10 estado da técnica ccmo necessário.
Err, algumas modalidacies, cada " RPEG"n na fórmula ! como descrito independentemen'te tem uma estrutura como abaixo: CH3(CH2)k_(OCE2{:ll2),,—- (CH3)2CH—(OCH2CH2), y t (ch,),c—(och,ch,),,— )C:H7(OCH,CH,) t ? 15 \ ,P(OCH,CFi2)n F Ç j,)—cH2—(ocH,cH2)n— , , Cj(OCH,CH,)t— . l ' oride, k e n são ambas integrinas, k = C), 1, 2, 3, 4, 5 ou 6; n = 40, 41, ..., 45, 46, 47, 48, ......, 1200.
Em algumas outras modalidades preferidas, cada " RPEG"" na fórmula (I) 20 independentemente tem a estrutUra como abaixo: CH3(CFl2)k—(OCH2CH2)R (CH3)2CH—-(OCH2CH2)n . ? P J—ch2—(och2ch2)r— (CH3)3C (Q(:H2CH2)n_ \ / 7 ú J7- (och,ch,), jjj—cHr(ocH,cH?),,— cr 7 onde, k e n são ambas integrinas, k = 0, 1, 2 or 3: n = 40, 41, ..., 45, 46, 47, 25 48, ......, 1200.
Em a|gumas modalidades, cada " "X" " na fórmula (I) independentemente tem a estrutura como abaixo:
,X ¶ ? . """ 21/58 -> - üz "- í?. .
& . )- o e i! * ච—O—(CFl2)p—C:— NH—(CH2)m— _O—(CH2)m or ! onde, p e m são ambas integrinas, p = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, llou 12; m =0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11ou12.
Em algumas modalidades, cada ""X" " na Íórmufa (I) independentemente 5 tem a estrutura como abaixo: ·
O —O—(CH2)A—NH—(CH?)m— —O—(CH2)m— ou 7 onde, p e m são ambas integrinas, p = 0, 1, 2, 3, 4 ou 5; m = 0, 1, 2, 3 ou 4.
Em algumas outras modalidades, cada ,, 7. Exendin- na fórmula (I) independentemente possui a estrutura como qbaixo:
O )ÁJ O HOOC \\ "N)rj\E,,nd,n nÚ r Exe,,,h, "N) ) 10 O HOOC or O Exendin.
Preferenciahnente, " ""Z_Exerídin" na fórmula (I) tem a estrutura como abaixo: () O -—CH,O —(CH?),---N) F , ,, ,,, —CONH—(CH,),,.-N) , , ,, ,,,
O O ' O —CH,O —(CH2)r-NHCO—(CH,)q" Kq) Exendin
T
O —CONH—(CH2)w— NHCO—(CH2)q_N\ ,,A Exendin
O 15 n'.
A a 4 y , £ " :: 22/58 & '"- 2 2
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O —CON"—(CH2)\4'-NH'O—(NH)AUO) E,,,,,,,
O —CH,O (CH?), NJ)—Exendii]
HOOC HOOC · —CH2O —(cH2)i —NH O Exendin 5
O —"ONH (""2)w JJExend'n
HOOC —CONH—(CH2)w —NH ou O Exendin ? onde, i, j, q, w são inteyinas, i = 0 ou 1; j = 1, 2, 3, 4, 5 or 6: q = 1, 2, 3, 4, 5 ou6;w=1,2,3,4,5ou6. 10 Os conjugados da variante de Exendina de acordo com a presente invenção podem ser sintetizados por qualquer método apropriado. Um número de métodos para conjugar o polímero às proteinaS ou aos peptideos são conhecidos no estado da técnica, incluindo polímeros de incubação (polímeros preferencialmente ativados) com a variante de Exendina" de acordo com a pre<ente invenção. Em uma modalidade, o pollmero é o polietilenoglicd,
^ ,a· * " y d 23/S8 3 £ -£".? ,' ' n que pode ser ativado e conjugado à variante de Exendina, por exemplo, peto método do àé; ! ~ brometo ciano, método do carbonildiimidazole, método de N-hidroxisuccinirrnda, método cianúrico do cloreto de ureia, etc- Altemativamente, o PEG pode ser especificamente conjugado ao tiolato do reslduo de cisteína na variante de Exendina pela sulfona do Peg- 5 vinil, pelo Peg-iodoacetamida ou peto bissulfeto de Peg-piridina. Em algumas modalidades específicas, o PEG ativado pode ser incubado com a variante de Exendina de acordo com a presente invenção sob as condições abaixo: o pH 5,0-7,0, relação do molar do PEG aos peptideos é 1-10, 0,5-12 horas da reação, período, temperatura da reação é 0-50"C, por exemplo 2-40°C ou 4-37"C.
10 Após 'a ieação da conjugação, o conjugado pode ser isolado por métcdos apropriados. Os métodos apropriados incluem, por exemplo, a ultrafiltração, a diálise ou a cromatografia, etc., que estãc todos no escopo das habilidades para um técnico no assunto. Composição farmacêutica A variante de Exendina é/Olj conjugado da variante de Exendina segundo a 15 presente invenção pode ter muitos utilidades, inclusive reduzir, por exempio, a glicose sanguinea. Assim, a presente invenção, além disso, fornece uma composição farmacèutica para reduzir a glicose sanguínea, compreendendo a quantidade terapeuticamente eficaz da variante de Exendina e/ou conjugado da variante de Exendina segundo a presente invenção, bem como opcionalmente um portador farmacêuticamente aceltável. 20 Preferencialmente, a composição farmacêutica pode ser útil para tratar o diabetes, mais preferencialmente para tratar a diabetes tipo - 1 e/ou a diabetes tipo - 2, em particular, preferenciaimente para tratar a diabetes tipo - 2. A quantidade terapeuticamente eficaz da variante de Exendina e/ou do conjugado da variante de Exendina de acordo com a presente invenção é dependente da rota de administração, do tipo do sujeito e das características . 25 flsicas do mamífero especítico considerado. Estes fatores e a relação entre estes fatores e a quantidade dete.rminada são conhecidos por um técnico no assunto. A quantidade e a rota de administração podem ser ajustadas para aicançar q efeito ótimo, tendo por resultado a entrega dos peptideos ao sujeitcj. Entretanto, depende-se de fatores conhecidos tais ccimo o peso corporal, a dieta, a droga simultaneamente administrada e outros fatores, que são 30 conhecidos por um técnico no assuntol no campo da medicina. A composição farmacêutica pode ser administrada junto com o tratamento combinado, istci é a composição farmacêutica é aplicado em combinação com uma ou mais medicações, onde são aplicaaas juntas ou alternadas. Em outras imodalidades, ditas medicações podem ser adminlstradas antes, durante ou após a administração de uma ou 35 mais variantes de Exendina e/ou o conjugado da variante de Exendina de acordo com a presente invenção ou outra composiçço farmacêutica. Dita medicação que é utilizada na presente invenção compreeríde. por exemplo, a meciicação para reduzir a glicose
«= k q & * â
P . t 24/58 í Z ? 4 " :3 sanguíríea, tal como a irtsulina, os anaíogos da insuiina, os agonistas e o colecistocinina da À« Z dextrina, e/ou outros compostos ou composição que é usada para tratar doenças. Preferencialmente, tais doses combinadas podem alcançar um efeito combinado ou mesmo sinergistico. 5 Como usado aqui, "o portador farmaceuticamente aceitável" ou "o portador fisiologicamente aceitávei" podem permutavelmente ser usados, incluindo uma ou mais de qualquer e todos sais fisiologicamente compatíveis, solventes, meio distribuidor, revestimento, agentes e agentes antlfúngicos e agentes anti-bacterianos, agentes de atraso isotonicos e de absorçãc, etc. Em algumas modalidades, o portador é apropriado para a 10 dose intravenosa, intramuscular, subcutânea, espinhal ou da epiderme (tal como por injeção ou infusão). Dependendo das rotas de dose, o agente terapêutico pode ser revestido por determinado material, a fim de proteger o agente terapêutico dos ácidos e da outra condição natural que podem inativar o agente terapêutico- Ao administrar, a fcrmulação farmacêutica de acordo com a presente invenção é 15 administrada na composição farmacêutica em uma quantidade farmaceuticamente aceitável. O termo "fàrmaceuticamente aceitávei" piretende significar as substâncias não-tóxicas que não interferem na atividade biológica de componentes ativos. As formulações contem sempre os sais, tampões, preservativos, portador compatível e opcionalmente outros agentes terapêuticos, tais como os realçadores complementares da imunidade, incluindo 20 adjuvantes, quimiocinas e citocinas. Quando usado na medicação, o sal deve ser farmaceuticamente aceitávei, mas o sai não-farmaceuticamente aceitável pode prontamente ser usado preparancio o sal farmace'jticamente aceitávei, assim rjão são excluídos do escopo da presente invenção. Se requerido, a variante de Exendina ou g conjugado da variante de Exendina de 25 acordo com a presente invenção podem ser combinados com um portador farmaceuticamente aceitáve!. Como usado aqui, o termo "portador farmaceuticamente aceitável" significa um ou mais preenchedores sólidos ou líquidos compatlveis, diluentes ou substâncias de empacotamento, que são apropriacíos para se aplicar aos mamíferos tais como o ser humano. O termo "portador" representa componentes orgânicos ou inorgánicos, 30 naturais ou sintéticos, que Ao combinados com os componentes ativos a fim de facilitar a aplicação. Os comporientes da composição farmacêutica podem também ser misturados na forma na qual a interação que interrompe significativamente a eficácia exigida da medicação é ausente. Preferenciaimente, a composição farmacêutica de acôrdo com a presente invenção 35 .pode compreender o sistema de tampão, e preferenciaimente, Cl sistema de tampão é solução de tampão acetato com um PH de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 6,0, ou solução de tampão fosfato 'com um pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 9,0.
,
+ 'r " F ^ t 2 - i a 25/58 &. à ? Em algumas modalidades específicas, o tampão apropriado compreende o acetato, citrato, ? .:· l h! ít borato, fosfato. Opcionalmente, a composição farmacêutica pode também compreender um preservativo apropriado, tal como o cloreto de benzalcônio; álcoo! do cloreto tert-butílico; 5 parabenos e timerosal. A composição farmacêutica pode estar convienientemente sob a forma da unidade de dose, e pode ser preparada po' qualquer método conhecido no campo do produto farmacêutico. Todo o método compreende uma etapa de combinar o agente ativo com um portador, e o portador compreende um ou mais componentes auxiliares. Geralmente, o 10 agente ativo e o portador líquido, o portador sólido finamente dividido cu ambos são combinados para preparar a composiçãc, e se requerido, o produto é formado subseqüentemente.
A compcisição farmacêutica que é apropriada para a administração parenteral pode ser de formulação aquosa asséptica ou não-aquosa compreendendo uma ou mais variantes 15 de Exendina ou conjugado da variante de Exendina. Em algumas modalidades, a formulação é isotonica comparada com o sangue dos sujeitos. Um agente de dispensão ou e o agente de suspensão apropriado podem ser usados preparando a formulação de acordo com métodos conhecidos. A formuiação asséptica para a irijeção pode também ser solução . asséptica ou suspensão para a injeçào parenteralmente no diluente aceitável não-tóxico ou 20 solvente, por exempb, solução 1,3- butanediol- Os portadores e os solventes aceitáveis que são úteis compreendem a água, a solução de Ringer e a solução isotônica do cloreto de sódio. Além disso, o óleo permanente asséptico é usado rotineiramente como o meio sofvente ou de suspensão. Como tal, algum ófeo permanente suave pode ser usado, compreendendo o monoglicericlecí sintético ou diglicerida. Além disso, o ácido graxo tal 25 como o ácido deico pode ser usado na forma para a injeção. A forma dos portadores apropriados pode ser orai, sUbcL'târlea, intravenosa, intramuscular, etc. sendo encontrada em "Remingtori's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA".
A variante de Exendina ou o conjugado da variante de Exendina de acordo com a presente invenção podem ser preparados junto com o portador tal como a formulação de 30 liberação controlada que inclui sistemas de entrega por implantes, adesivos transdérmicos e microcapsula, que protege a variarite de Exendina ou o conjugado da variante de Exendina da degradação rápida. Polímeros biologicamente degradaveis, biclogicamente compatíveis, tais como o acetato do viníl de etiieno, pdi anidridos, ácido poHglicólico, colágeno, poliortoesteres e o ácido poli láctico podem ser úteis. Vários métodos para preparar tal 35 formulação são conhecidos no estado da técnica, veja, por exemplo, Sustained and Controlled Rdease Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, lnc., New York. 1978, etc.
A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser administrada por qualquer via ccmvencional, incluindo a injeção ou a infusâo sobre o tempo.
Por exempto, a administração pode ser realizada de forma oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, na intracavidade, intra-tumora!, ou transdermal. 5 A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção é administrada em uma quantidade eficaz. "uma quantidade eficaz" é a quantidade de qualquer variante de Exendina ciu conjugado da variação de Exendina fornecida aqui, que produzem a resposta desejável (pOr exemplo, reduzindo o nível de glicose sanguínea no sujelto) separada ou junto com o outro agente teragèutico. lsto pode compreender uin atraso meramente temporario nci desenvolvlmer.to do diabetes, e alternativamente, em algumas modalidades, isto pode compreender a erradicação permanente do desenvolvimento do diabetes.
Tal quantidade depende certamente da doença especlfica a ser tratada, da severidade das doenças, dos parâmetros pessoais dos pacientes (que incluem a idade, a corídição fisiológica, a altura e o peso), duração do tratamento, propriedades do tratamento simukaneamente em curso (eventualmente), rotas específicas de administração e dos fatores similares dentro do conhecimento para profissionais de cuidados médicos.
Estes fatores são conhecidos por um técrtico no assunto, e experiêncías convencionais diretas prcmtamente informadas.
Geralmente, a dose máxima para cada componente ou a combinação desta é usada preferencialmente, isto é, a dose segura mais elevada é determinada de acordo com â razão médica razoável.
Entretanto, um técnicô no assunto pode compreender que os pacientes podem pedir uma dose mais baixa ou a dose permissível baseada em razões médicas, psicdógicas ou substanciaimente quaisquer outras razões.
A composiçâo farmacêutica usada nos métodos anteriores é preferencialmente asséptica, e compreende uma quantidade eficaz da variante de Exendina ou conjugado da variante de Exendina em uma uni'dade de peso ou t'nidade do volume ccnveniente para administrar a pac'lentes, que é separado cju combinado com outra formulação, para produzir a resposta necessária, como redução da glicose sangulnea.
A dcse da variante de Exendina ou do conjugado da variante de Exendina administrada a sujeitos pocle ser selecionadacie de acordo com parametros diferentes, em particular rota da administração que é usada e a condição do sujeito.
Outros fatores compreendem o período nece3sário de tratamento.
Se a resposta no sujeito não for suficiente na dose original aplicada. uma dose mais elevada pode ser apiicada em uma escala permitida pelo grau da tolerâncla do paciente (ou para conseguir eficazmente a dose mais elevada através de uma rota diferente de entrega que é mais Iocal). Em aigumas modalidades, a composição farmacêutica compreende 0,20 mg/ml - 5 mg/mí da variante de Exendiria e/ou compreende 4mg/ml - 40 mg/ml do conjugado da variante de Exendina, preferencialmente 0,20 mg/ml - 5 mg/ml da variante de Exendina e/ou ' compreende 4mg/m! - 4(J mg/ml dci conjugado da variante de Exendina, mais preferencialmente 0,5 mg/ml - 2 mg/m! da variante deExeridina e/ou compreende iOmg/ml - 20 mg/mi do conjugado da variante cíe Exendina." Geralmente, a escala da dose da variante 5 de Exendina ou o corijugado da variante de Exenciina de acordo com a presente invenção. podem ser peso corporal de aproximaciamente 10 µg/kg de um paciente ao peso corporal de àproximadamente 100,(100 µg/kg de um paciente Em algumas modaiidades, a escala da dose pode serr aprcximadamente de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg.
Em out:as modalidades, a escala da dose pcde ser de aproximadamente 0,1 10 mg/kg a 5 mg/kg, 0,1 mg/kg eí 10 mg/kg, ou 0,1 mg/kg a 15 mg/kg.
Em outras modalidades. a escala da dose pode ser de aproximaclamente 1 mg/kg a 5 mg/kg, 5 mg/kg a 10 mg/kg, 10 mg/kg a 15 mg/kç, ou 15 mg/kg a 20 mg/kg.
Em outras modalidades, a escala da dose pode ser de aproximadamente 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 17 mg/kg, 15 20 mg/kg, 25 mg/kçj ou 30 mg/kg.
Em outras modalidades, a escala da dose pode ser ' de aproximadamente 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg or 6 mg/kg.
Baseado na composição, a dose pode ser continuamerite entregue (por exemplo pelo bombeamento contínuo), ou ser intermitentemente entregUp em um ciclo.
Em algumas modalidades, a dose da variante de Exendina ou o conjugado da variante de Exêndina de acordo com a 20 presente invenção podem ser C),i a 20 mg/kg cu quaiquer valor destes, quando ad'ministrada intravenosamente.
O intervalo desejávei entre a dose múltipla da composição particular pocie Sèr determinado por um técnico no assunto sem experimentação não realizada.
Outros protocolos para dosar as composições fornecidas aqui sãíj ccmhecidos por um técnico nci assunto, em que a dose, 25 programação de dosagem, local da administração. a rota de administração, etc. pode ser diferente daquelas descritas acima.
Em uma modalidade, a dose é admirtistrada através da rota intravenosa.
Em outra modalidade, o protocolc cie administração é dose de bolus intravenosa.
Um kit que compreende a variante de Exendina ou o conjugado da variante de Exendina (por exemplo, a comogsiçáo farmacêutica) e as instruçõ'es estão também no escopo da presente inverição.
O kit pode ainda compreender pelo menos outro um reagente, por exemplo, um ou'mais medicações para reduzir a glicose sanguínea.
Em outra modalidade, o kit oode compreender uma base, que é compartilhado a fim de acomodar firmemente um ou mais meios do recipiente ou uma série de recipiente 35 (como o tubo de teste, o tubo. a garrafa, o frasco, a seringa, etc.). Os componentes do kit podem ser embaiados em meio aqt.'oso o que esteja na forma liofilizada.
A composição da manelra prevista acjui pode estar na forma Iiofiiizado ou
't #''· ¥· 28/58 · & ,7 ',: fornecida no meio aquose. '·L ê r Preferencialmente, o sujeito é vertebrado.
Mais preferencialmente, o sujeito é mamlfero.
Mais preferencialmente, o sujeito é humano.
Entretanto, o sujeito pode ser outro animal, tal ccjmo Cl animal doméstico (por exemplo, cão, gato, etc.), o animal de
5 criação (por exemplo, gado, cabra, porco, cavalo, etc.) ou o animal experimental (por exemplo, macaco, rato, rato, c-oelho, ccbaia, etc.)- A variante de Exendina ei'ou o conjugado da variante de Exendina segundo a presente invenção podem ser aplicadas separadamente.
Contudo, é preferencialmente t
' aplicado como uma composição farmacêutica, que sempre compreende um excipiente
10 farmacêutico apropriado, c) diluente ou transportador selecionado dependendo da via de administraçác desejada.
Eies podem ser aplicados a pacientes/sujeitos na necessidade de tratamento por aualquer meiô conveniente.
A dose exata dependerá de vários fatores,
inclusive as prcpriedades exatas da variante de Exendina e o conjugado da variante de
Exendina. 15 Algumas rotas apropriadaq de administração compreendem {maS não limitadas) a administração oral, retal. nasal, local (compreendendo oral e sublingual), subcutânea,
virginal ou pareneral (compreendendo subcutanea, intramuscular, intravenosa, intradermica,
intratecal e epidural}. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica de acordo com a presente 20 invenção "ompreende um agente e/ou um preservativo isotonico, preferencialmente o agente isotonico é um OLí rnais da sacarina, manitol, cbreÊo de sódio e glicerol, e o preservativo é selecionado do grupo que' consiste de m-cresol, álcool benzhico, p-
hidroxibenzoatoparabenos metíiico, p-hidroxibenzoato de etila, p-hidroxibenzoato propílico e p-hidroxibenzoato butílico. ljm técnico no assunte pode preparar a solução apropriada da
25 variante de Exendina ou do conjugado da variante de Exendina de acordo com a presente invenção, empregando, por exemgio, excipiente isotonicci como a solução fisiológica salina, de Ringer ou a soluçã3 de Ririger do lactato, etc. como necessário, um agente de estabilização, um agente de proteção, antbxidante e/ou o ciutro aditivo pode ser adicionado.
A composição farmacêutica para a administração oral pode estar sob a forma de tabletes, 30 cápsula, pó ou líquido oral, etc.
Os tabletes podem compreender o portador sólido, tal como a gelatlna c9u urn adluvar}te. 'À corrposição farmacêutica' líquida compreende sempre o portador líquidô, tal como a água. petrdeo. óleo animal ou óleo do óleci vegetai, óIeo mineral ou sintético.
Pode também compreender soluções salinas flsiológicas, solução de glicose ou o outro carboidrato, ou es dióis, tais como c) etilenogâcol, q propüenoglicol ou q de 35 polietilenogkd.
Em aig'umas modalidades, a ccmposição farmacêutica está sob a forma da formulação líquida e/ou da TormUf&ção iiofiiizacia.
Preferencialmente, a formulação liofilizada compreende oprotetor de liofl|ização.
Mais preferencialmente, o protetor de liofiiização é t a
+ .. lf
*''O 29,'58 z 'e 9 - "., N - selecionado do grupo que consiste da sacarina, lactose, mannitol, tredÓse, e de outros [0 Y carboidratos. " A variante de Exenclirta e/ou o conjugado da variante de Exendina são administrados preferencialmente aos "ujeitos "em uma quantidade terapeuticamente eficaz" 5 ou "em uma quantidade eficez". A composição é administrada preferencialmente aos sujeitos "em uma quantidade terapeuticamenle eficaz", e a quantidade terzpeuticamente eficaz ou uma quantidade eficaz são suficientes para exibir lucros aos sujeitos. a quantidade real da administração, e a taxa e o processo de administração dependerão da própria condição e severidade dos sujeitos a serem tratados, A prescrição para o tratamento (tal 10 como a determinação de dose. etc.) é determinada pelos proflssionais médicos, em virtude das doenças a serem tratadas, cla condição pessoai dos pacientes, do iocal de entrega, do método de administração. e de outros fztores conhecidos por médicos.
Em algumas modalidades, a escala de dose para a variante de Exendina e/ou conjugado da variaríte de Exendina podem ser 30 mg/kg de peso corporal/dia a 0,00001 15 mg/kg de peso corporal/dia, ou 3 mg/kg/dia a 0,0001 mg/kg/dia, ou 0,3 mg/kç ldia a 0,0"1 mg/kg/dia.
A presente invenção ainda adicional fornece um método para tratar a doença, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da variante de Exendina e/ou do conjugado da variante de Exendina aos sujeitos em necessidade de 20 tratameEtcL Em algumas niocialidades, as doenças sâo selecionadas consistindc do grupo: sÍndrome de dumping pós-prandid, hiperglicemia pós-prandial, tolerância prejUdicada da glicose, obesidade, doenças de alimentação, síndrome da resistência de insulina, diabetes e hiperglicernia.
Em uma mocialidade preferida, a doença é diabetes tipo - 2. Como conhecidci, a Exendina pode reduzir q peso corpora! de pacientes com 25 obesidacie e induzír a náusea e vômito, onde q mecãnismo é associado com a inibição do centro de alimentacãe do slsterna neivoso centrai e ativação do centro de vômito (Larsen.
Mechanisms behind GLP-l incftjcèci weight bss.
Br J Diabetes Vasc Dis 2008: 8: S34- S41; Schick et al. '3|Ucagor).llke peptide 1 (7-36)-amide acts at laterd and medial hypothalamic Qtes to suppres:s fEediRg in rats.
Am J Physiol Regul lntegr Comp Physiol 30 2003; 284: R1427-35). Os conjugados de Exendina ou as variantes desta não podem ultrapassar a barreira sangue-cérebro devidc ao gesci mcilecular aumentado, e reduzem assim o vômito irduzido pela Exendina.
Ccnsequeritemente. o depesitante esperou que os conjugados de Exeridina Olj va:'ían?es desta também reduzií'iam os efeitos cig Exendina na redução da aiimentação e na redução de oeso corporal intermediado pelo sistema nervoso 35 centrd, antes do iníçio da presente invenção.
Entretanto, o depositante encontrou surpreendentenzerúe que os conjugados de Exendina c)ú variantes destas aumentaram significativa'mente os efeitos Exendina na tedução da dimeníaçâo e na redução de peso
.
> t @ , ' êz 30/58 s :5 jq " 'd corporal, embora a Exendina tipo setvagem e as variantes não-conjugadas ambas de :Ç ig' tí Exendina reduziram a alimentação e o peso corporal. Assim, em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para reduzir o peso corporal usando os conjugados de Exendina ou as variantes desta e/ou composição farmacêutica que compreende os 5 mesmos. Além disso,. a pgsente invenção também fornece a utilização dos conjugados de Exendina ou as variantes desta e/ou composição farmacêutica que compreende os mesmos para produzir um medicamento reduzindo o peso corporal. Em uma modalidade, os conjugados de Exendina ou as variantes desta são o conjugado da variante de Exendina de 10 acordo com a presente invenção, como descrito acima. A presente invenção será ilustrada pelos exemplos como abaixo, mas não deve ser interpretada como limitante de maneira nenhuma. Todas as referências mencionadas na presente pedido de invenção (que inclui as referências originais, patentes concedidas, os pedidos de patente publicada e os pedidos de patente em andamento) são incorporadas 15 explicitamente aqui por referência na totalidade. Os reagentes e os materiais usados nos exemplos como abaixo são produtos comercialmente disponiveis que são pelo menos puramente anallticos ou de nível comparável. Exemplo O número de série e a breve descrição para as de Exendinas, de variantes de 20 Exendina e os conjugadoa usados destas nos exemplos são fornecidos ria tabela abaixo, a fim de facilitar a compreensão de soluções técnicas nos seguintes exemplos. No. de Série Breve descrição PB-1O1 Exendina-4 tipo selvagem, também chamada Exenatida PB-102 Exendina-4, Cys substituida na posição 35 PB-103 Exendin-4, Cys substituida na posição 30 PB-104 Exendin-4, Cys substituida na posiçâo 25 PB-105 Exendin-4, Cys substituida na posição 39 PB-106 PB-105, conjugado com PEG20000 PB-106b PB-105, conjugado com PEG20000, dupla-ramificação PEGb PB-106c PB-105, conjugado com PEG20000, dupla-ramificação PEGC PB-106d PB-105, conjugado com PEG20000, dupla-ramificação PEGd PB-106e PB-105, conjugado com PEG20000, dupla-ramificação PEGe PB-107 PB-105, conjugado com PEG30000 PB-108 PB-105, conjugado com PEG40000 PB-109' PB-105, conjugado com PEG200OOx2, dupla-ramificação PEG PB-109b PB-105, conjugado com PEG200OOx2, dupla-ramificação PEGb PB-109c PB-105, conjugado com PEG200OOx2, dupla-ramificação PEGc k t ò
31/58 , . "%g 3 e e· . :-« PB-109d PB-I 05, conjugado com PEG200OOX2, dupla-ramificação PEGd : é PB-11O PB-105, con jugado com PEG5000
PB-11Ob PB-105, conjugado com PEG500Ob PB-11Oc PB-105, conjugado com PEG500Oc PB-111 PB-105, Tyr adicionado no C-terminal PB-112 PB-111, conjugado com PEG20000 PB-113 PB-105, Gly na posição 2 é substituída por dAla PB-114 PB-113, conjugado com PEG40000 PB-119 PB-105, conjugado com PEG23000 PB-120 PB-105, conjugado com PEG27000
Exemplo 1. SÍntese da fase sólida de Exendina-4 e variantes desia A síntese dos pdipeptldeos é uma técnica convencional no campo da bioquhiica e do produto farmacêutico.
Os vários tipos de sintetizadores dos poiipeptídeos estão comercialmente disponíveis de um número de organizações comerciais (tais como GE 5 HealthCare, Applied Biosystems lnc.), e muitas organizações comerciais (tais como Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd., Shanghai Biocolor BioScience&Technolgy Company) proporcionam seNiços para a sÍntese do pohpeptídeo de costume.
Por exemplo, os polipeptldeos com sequência especifica podem ser sintetizados por um sintetizador de pdipeptldeos usando o seguinte procedimento. 10 A Exendina-4 e as variantes desta com um tiolato foram sintetizados pela estratégia de proteção do grupD amino com Fmoc usando um tipo de suporte sólido da "resina do amido MBHA Fmoc-Rinker". A primeira etapa: o aminoácido protegido com Fmoc no solvente N,N-metilformamida (DMF) foi reagido por 1-5 horas usando HBTU/DIPEA como o agente de condensação, e a integralidade da reação de condensação foi mon itorada usando 15 o método de ninidrina.
A segunda etapa: a reação foi realizada em DMF usando a piperidina 10-30°6 como o agente de proteção por 10-30 minutos, e a integralidade da desproteção de grupos de proteção do aminoácido foi monitorada usando o método de ninidrina.
A terceira etapa: as primeiras e segundas etapas foram repetidas usando o aminoácido respectivo de acordo com a sequência do polipeptídeo alvo, até que Cl último aminoácido na sequência 20 estava acoplado.
A quarta etapa: a reação foi realizada usando o TFA como o agente de clivagem por 1-5 horas, para clivar os polipeptídeos de suporte sóiido e desproteger ao mesmo tempo.
A quinta etapa: a solução do polipeptídeo após ser clivado foi precipitada usando c) éter de etila e foi filtrada.
O filtrado foi coletado.
Depois a coluna de cromatografia do tipo C18 foi usada para a eluição com 0,1% TFNacetonitrila-água como a fase móvel, e 25 as frações foram coletadas, liofilizadas para obter o produto.
Etapa seis: a pureza do produto foi identificada usando o método de HPLC, e a estrútura do produto foi determinada pela anátise da sequência de aminoácido e pela espectometria de massa.
k ¥
32/58 'àt' ZE 4 O depositante pediu à empresa científica Chengdu Kaijie Biomedical para :4 A ^
2 :± sintetizar os poIipeptídeos com sequencias como abaixo de acordo com o método acima: PB-1O1 : Exendina-4 de tipo selvagem com uma sequência de aminoácidos como abaixo: 5 His-G|y-Glu-G!y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-G!n-Met-G|u-Gtu-G|u-Ala- Va|-Arg-Leu-Phe-||e-G|u-Trp-Leu-Lys-Asn-G|y-G|y-Pro-Ser-Ser-G|y-A|a-Pro-Pro-Pro- Ser(SEQ ID NO: 1); PB-102 : Variante de Exendina-4 com uma sequência de aminoácidos como abaixo, onde a posição 35 no C-terminal é Cys: 10 His-Gly-G|u-G|y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-G|n-Met-G|u-G|u-Glu-Aja-Va|-Arg- Leu-Phe-||e-G|u-Trp-Leu-Lys-Asn-G|y-G|y-Pro-Ser-Ser-G|y-Cys-Pro-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 3); PB-105 : Variante de Exendina-4 com uma sequência de aminoácidos como abaixo, onde a posição 39 no C-terminal é Cys: 15 His-Gly-G|u-G|y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-G|n-Met-G|u-G|u-G|u-Aja-Va|-Arg- Leu-Phe-|le-G|u-Trp-Leu-Lys-Asn-G|y-G|y-Pro-Ser-Ser-G|y-A|a-PrQ-Pro-Pro-Cys (SEQ ID NO: 4); "' PB-103 : Variante de Exendina-4 com uma sequência de aminoácidos como abaixo, onde a posição 30 no C-terminal é Cys: 20 H js-G|y-G[u-Gfy-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-G|n-Met-Glu-Glu-g|u-A|a-Va|-Arg- Leu-Phe-||e-G|u-Trp-Leu-Lys-Asn-G|y-Cys-Pro-Ser-Ser-G|y-Ala-Pro-pro-pro-Ser (SEQ ID NO: 5); PB-104 : Variante de Exendina-4 com uma sequência de aminoácidos como abaixo, onde a posição 25 no C-terminal é Cys: 25 His-G|y-GIu-G|y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-G|n-Met-G|u-GfU-g|u-A|a-Val-Arg- Leu-Phe-||e-Glu'-Cys-Leu-Lys-Asn-Giy-Gly-Prc-Ser-Ser-G|y-A|a-pro-pro-pro-Ser {SEQ ID NO: 6); P8-111 : Variante de Exendina-4 com uma sequência de aminoácidos como abaixo, onde a posição 39 no C-terminal é substituldo por Cys e ligado com Tyr: 30 His-G|y-G|u-G|y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-G|n-Met-G|u-g|u-glu-Ala-Va|-Arg- LeU-Phe-||e-G!u-TrP-Leu-Lys-Asn-G|y-G!y-Pro-Ser-Ser-G|y-Ala-pro-pro-pro-Cys-Tyr (SEQIDNO:7);e
PB-113 : Variante de Exendina-4 com uma sequência de aminoácidos como abaixo, onde Gly na posição 2 de N-terminal é substitulda por dAla e a posição 39 no 35 C-terminal é substituída por Cys: His-dAia-G|u-G[y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-glu-g|u-g|u-A|a-Va|-Arg-
tf h .
a , " " íí ' 33/58 ¥ EE "g Leu-phe-||e-G|u-Trp-Leu-Lys-AsrÈ-G|y-G|y-Pro-Ser-Ser-G|y-A|a-Pro-Pro-Pro-Cys (SEQ .£ & ID NO: 8)d Como um exemplo, a Figura 1 fornece a análise dos resultados do espectofotômetro de massa para PB-105, M+1 pico (peso de massa+1) de PB-105 é 5 4203.3 Da determinado por MALDI-TOF MS, q qual é correspondente com o peso de massa teórico (4202.8). Exemplo 2a. Preparação e análise de PÊ3-110 (PEG500O-PB-105) 2,0 mg de PB-105 foram dissotvidas em 1 ml de tampão fosfato de sódio 20 mM (pH 6,5), e 5 mg PEG5000 (fornecido por Peg8io Co., Ltda. (Suzhou), 5000 representa que 10 o peso molecular de PEG é 5 kDa, e a estrutura molecuiar é mostrada na Figura 2) foi pesada de acordo com uma relação molar de PEG ao peptldeo sendo 2:1 e adicionado a solução acima. A solução foi adequadamente agitada para dissolver o PEG e formar uma mistura homogênea com o peptideo. A reação foi realizada por 1 hora a 20°C e interrompida por uma sdução de excesso de cisteína (0,1 ml de solução de cisteína 0,5M), e finalmente 15 mantida a -20"C para purificação posterior. A amostra foi 5 vezes diluida em tampão de acetato de sódio de 50 mM (pH 4,5), e carregado na coluna cromatográfica de troca iônica SP (coluna XK16/20 macroCap SP packing, GE tnc.) equilibrado por volume de coluria de 5 vezes de tampão de acetato de sódio de 50mM (pH 4,5). Depois do carregamento, a coluna foi equilibrada por volume de 20 coluna de 2 vezes de tampão de acetato de sódio de 50 mM (pH 4,5), e o tampão foi então linearmente aumentado a 100°6 tampão B (tampão de acetato de sódio de 50mM (pH 4,5) contendo NaCl IM) em volumes de coluna de 20 vezes. O pico de eluição foi anotado no Purificador AKTA. Como determinado, aproximadamente 1 mg do peptídeo foi obtido. Como analisado num HPLC analítico {Agilent 1200) equipado com coluna analítica 25 de fase reversa C4 com um tamanho de poro de 30OA (Júpiter C4 30OA 4.6*250mm) e 0,1°6TFA solução aquosa de solução de acetonitrila /0.1°6TFA com um gradiente de 61/39 a 54/46 (10 min). A amostra foi analisada pelo HPLC analitico (Agilent1200), e o tempo de retenção foi 10,4 min, a pureza foi 100% (ver Figura 3). A análise de GPC foi empregada (SHIMADZU LC-20AD, SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804 HQ three comlumn tandem), 30 sob a condição da solução de nitrato de sódio 0,1 M, a eluição foi realizada num Índice de 1,0 ml/min, e a pureza foi 97°6.
F Exempfo 2b. Preparação e análise de PB-11Ob (PEG5000b-P8-105) * 2,0 mg de PB-105 foram dissolvidas em 1 mt do tampão de fosfato de sódio 20 mM (pH 6,5), e 5 mg de PEG500Ob (fornecido por Peg8io, Ltd. (Suzhou), e a estrutura molecular 35 mostrada na Figura 4) foi pesado segundo uma proporção molar do PEG aos peptídios em 2:1 e acrescentado à solução acima mencionada. A soIução foi apropriadamente agitada para dissolver o PEG e formar uma mistura homogênea com o peptldio. Outras etapas
* 2 & " " 'j 34/58 e # '.'
R W ·.. foram as mesmas que aquelas no exemplo 2a. Finalmente, a análise de GPC foi eTpregada a. & (SHIMADZU LC-20AD, 3 colunas em tandem HQ de SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804, sob a - condição da solução do nitrato de sódio de 0,1 M,a eluição foi realizado em uma taxa de 1,0 mf/min), e a pureza foi determinada em 96,7°C. 5 Exemplo 2c. Preparação e análise de PB-11Oc (PEG500Oc-PB-102) 2,0 mg de PB-105 foram dissolvidos em 1 ml do tampão de fosfato de sódio 20 mM (pH 6,5), e 5 mg de PEG500OC (fornecido por Peg8io CO.,O Ltd. (Suzhou), e a estrutura molecular são mostrados na figura 5) foram pesados de acordo com uma relação molar do PEG aos peptideos de 2:1 e adicionados à solução acima. A solução foi agitada 10 apropriadamente a fim de dissolver o PEG e formar uma mistura homogênea com o peptídeo. Outras etapas foram as mesmas que aquelas do exemplo 2a. Finalmente, a análise de GPC foi empregada (SHIMADZU LC-20AD, 3 colunas em tandem HQ de SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804, sob a condição da solução do nitrato de sódio de 0,1 M,a eluição foi realizado em uma taxa de 1 ,0 ml/min), e a pureza foi determinada em 97,8% 15 Exemplo 3a. Preparação e análise de PB-106 (PEG2000O-PB-105) 2,0 mg de PB-105 foram dissolvidos em 1 ml do tampão de fosfato de sódio 20 mlVl (pH 6,5), e 5 mg de PEG20000 (fornecido por Peg8io Co., Ltd. (Suzhou), 20000 representa 20klja do peso molecular de PEG e a estrutura molecular é mostrada na figura 2) foi pesado de acordo com uma relação molar do PEG aos peptides que é de 2:1 e adicionado à 20 solução acima. A sofução foi agitada apropriadamente a fim de dissolver o PEG e formar a mistura homogênea com o peptideo. A reação foi realizada por 1 hora a 20"C e interrompida posteriormente pela solução de cisteína (0,1 ml da solução de cisteína 0,5M), e mantida finalmente a -20°C para a purificação. A amostra foi dituída 5 vezes río tampão de acetato de sódio 50 mM (pH 4,5), e 25 carregada na coluna cromatográfica de troca iónica SP (coluna XK16/20, macroCap, GE lnc.) equilibrada em 5 vezes o volume da coluna com tampão acetato de sódio 50 mM (pH 4,5). Após o carregamento, a coluna foi equiiibrada em 2 vezes o volume da coluna com tampão acetato de sódio 50 mM (pH 4,5), e o tampão foi então aumentado linearmente para o tampão B de 100°6 (tampão acetato de sódio 50 mM (pH 4,5) que contém o NaCl 1 M) em 30 20 vezes o volume de coluna. O pico da eluição foi coletado no purificador AKTA. Como determinado, aproximadamente 1 mg do peptidço foi obtido. A solução coletada foi detectada pela electroforese em gel de SDS-PAGE, e corada Com azul de Coomassie Brilhante e tingido com iodo (veja por favor a figura 6A e 6B). A eíuição foi realizada usando a coluna analítica de fase reversa C4 com um tamanho do poro de 35 30OÂ (Jupiter C4 30OÂ 4.6*250mm) e 0,1°6 soluções aquosas TFA /0,1% da solução de acetonitrilo TFA com um gradiente de 61/39 a 54/46 (10 min). A amostra foi analisada por HPLC analítico (Agilent1200), e o tempo de retenção foi de 11,5 minutos, a pureza foi t e> %
K - = 8 ?" t 35/58 'k? 2 ·? " :. determinada em 100°6 (veja figura 7). A análise de GPC foi empregada (SHIMADZU LC- ± = ± d 20AD, colunas HQ in tandem de SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804), sob a condição da solução do nitrato de sódio 0,1 M, a eluição foi realizada em uma taxa de 1,0 ml/min, e a pureza foi determinada em 98,9%. 5 Exemplo 3b. Preparação e análise de PB-106b (PEG20000b-P8-105) 1,0 mg de PB-105 foram dissolvidos em 1 mi do tampão fosfato de sódio 20 mM (pH 6,5), e 2,5 mg de PEG200OOb (fornecido por Peg8io Co-, Ltd. (Suzhou), 20000 representa 20kDa de peso molecular do PEG e a estrutura molecular é mostrada na figura 8) foi pesado de acordo com uma relação molar do PEG aos peptideos que é de 2:1 e 10 adicionado à solução acima. A solução foi agitada adequadamente a fim de dissolver o PEG e formar a mistura homogênea com o peptideo As outras etapas foram as mesmas utilizadas no exemplo 3a. Finalmente, a análise de GPC foi empregada (SHIMADZU LC- 20AD, colunas HQ in tandem de SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804), sob a condição da solução do nitrato de sódio 0,1 M, a eluição foi realizada em uma taxa de 1,0 ml/min, e a 15 pureza foi determinada em 98.2°6. Exemplo 3c. Preparação e análise de PB-106C (PEG200OOc-PB-105) 2,0 mg de PB-105 foi dissolvido em 1 ml do tampão de fosfato de sódio 20 mM (pH 6,5), e magnésio 20 de PEG200OOc (fornecido por Peg8io Co., Ltd. (Suzhou), 20000 representa 20kOa do peso molecular de PEG e a estrutura molecular é mostrada na figura 20 9) foi pesado de acordo com uma relação molar do PEG aos peptideos que é de 2:1 e .adicignado à solução acima. A solução foi agitada adequadamente a fim de dissolver o PEG e formar uma mistura homogênea com o peptideo. As outías etapas foram as mesmas utilizadas no exemplo 3a. Finalmente, a análise de GPC foi empregada (SHIMADZU LC- 20AD, colunas HQ in tandem de SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804), sob a condição da 25 solução do nitrato de sódio 0,1 M, a eluição foi realizada em uma taxa de 1,0 ml/min, e a pureza foi determinada em 97,2%. Exemplo 3d. Preparação e análise de PB-106d (PEG20000d-P8-105) 2,0 mg de PB-105 foram dissolvidos em 1 ml de tampão fosfato 20 mM (pH 6,5), e 20 mg de PEG200OOc (fornecido por Peg8io Co., Ltd. (Suzhou), 20000 representa 20kDa de 30 peso molecular do PEG e a estrutura molecular é mostrado na figura 10) foi pesado de acordo com uma relação molar do PEG aos peptideos que é de 2:1 e adicionado à solução acima. A solução foi agitada adequadamente a fim de dissolver o PEG e formar uma mistura homogênea com o peptideo. As outras etapas foram as mesmas utilizadas no exemplo 3a. Finalmente, a análise de GPC foi empregada (SHIMADZU LC-20AD, colunas HQ in tandem 35 de SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804), sob a condição da solução do nitrato de sódio 0,1 M, a eluição foi realizada em uma taxa de 1,0 ml/min, e a pureza foi determinada em 97.5%. Exemplo 3e. Preparação e análise de PB-106e (PEG200OOe-PB-105)
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U . 3 ," , 3 36/58 m' M 2.0 mg de PB-105 foi dissolvido em 1 ml de tampão fosfato 20 mM (pH 6,5), e 20 , " » t ± mg de PEG200OOe (fornecido por Peg8io, Ltd. (Suzhou), 20000 representa representa 20kDa de peso molecular do PEG e a estrutura molecular é mostrado na figura 10) foi pesado de acordo com uma relação molar do PEG aos peptideos que é de 2:1 e adicionado 5 à solução acima. A solução foi agitada adequadamente a fim de dissolver o PEG e formar uma mistura homogênea com o peptideo. As outras etapas foram as mesmas utilizadas no exemplo 3a. Finalmente, a anáfise de GPC foi empregada (SHIMADZU LC-20AD, colunas HQ in tandem de SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-8Q4), sob a condição da soIução do nitrato de sÓdio 0,1 M, a eluição foi realizada em uma taxa de 1,0 ml/min, e a pureza foi determinada 10 em 95,8 %. Exemplo 3f. Preparação e análise de PB-112 (PEG2000O-PB-111)
2.0 mg P8-111 foi dissolvido em 1 ml de temapão fosfato de 20 Mm (pH 6,5), e 19 mg de PEG20000 (fornecido por Peg8fo Co., Ltd. (Suzhou), 20000 representa o 20kDa do peso molecular de PEG e a estrutura molecular é mostrada na figura 2) foi pesado de 15 acordo com uma relação molar de PEG aos peptideos que é de 2:1 e adicionado à solução acima. A solução foi agitada adequadamente a fim de dissoiver o PEG e formar uma mistura homogênea com o peptideo. A reação foi realizada por 1 hora a 20"C e interrompida posteriormente por uma solução (0,1 ml da solução de cisteína 0,5M), e mantlda finalmente a -20"C para a purificação. 20 A amostra foi diluída 5 vezes usando q tampão acetato de sódio de 50 Mm (pH 4,5), e aplicada à cofuna cromatográfica de troca iónica SP (GE, coluna XK16/20, macroCap SP packing) equilibrada em 5 vezes o volume da coIuna com tampão acetato de sódio 50 mM {pH 4,5). Após o carregamento, a coluna foi equilibrada em 2 vezes o volume da coluna com tampão acetato de sódio 50 mM (pH 4,5), e o tampão foi então aumentado linearmente para 25 o tampão B de 100% (tampão acetato de sódio 50 mM (pH 4,5) que contém NaCl 1 M) em 20 vezes o volume de coluna. O pico da eluição Íoi coletado no purhicador AKTA. Como determinado, aproximadamente 1 mg do peptideo foi obtido. A solução foi eluída em coluna analítica de fase reversa C4 com um ta"manho do poro de 30OÂ (Jupiter C4 30OÂ 4.6*250mm) e 0,1°6 soIuções aquosas TFA /0,1% da 30 solução de acetonitrilo TFA com um gradiente de 61/39 a 54/46 (10 min). A amostra foi analisada por HPLC analítico (Agilent1200), e o tempo de retenção foi de 10,6 minutos, a pureza foi determinada em 98,5°6 (veja figura 12). A análise de GPC foi empregada (SHIMADZU LC-20AD, colunas HQ in tandem de SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804), sob a condição da solução do nitrato de sódio 0,1 M, a eluição foi realizada em uma taxa de 1,0 35 mi/min, e a pureza foi determinada em 98,7°6. Exemplo 4. Preparação e análise de PB-107 (PEG3000O-PB-105) 2,0 mg de PB-105 foi dissolvido em 1 ml de tampão fosfato 20 mM (pH 6.5), e 30 i ¶ 3 P' - % - 37/58 f s € , " +D mg de PEG30000 (fornecido por Peg8io Co., Ltd. {Suzhou), 30000 representa 30kDa do £ = peso molecular de PEG e da estrutura molecular é mostrado na figura 2) foi pesado de acordo com uma relação molar do PEG aos peptides que é de 2:1 e adicionado à solução ' acima. A soíução foi agitada adequadamente a fim de dissolver o PEG e formar uma mistura 5 homogênea com o peptideo. A reação Íoi realizada por 1 hora a 20°C e interrompida posteriormente por uma soluçãc' (0,1 ml da solução de cisteína 0,5M), e mantida finalmente a -20°C para a purificação. A amostra foi diluída 5 vezes usando o tampão acetato de sódio de 50 Mm (pH 4,5), e aplicada à coluna cromatográfica de troca iónica SP (GE, coluna XK16/20, macroCap SP 10 packing) equilibrada em 5 vezes o volume da coluna com tampão acetato de sódio 50 mM (pH 4,5). Após o carregamento, a coIuna foi equilibrada em 2 vezes o volume da coIuna com tampão acetato de sódio 50 mM (pH 4,5), e o tampão foi então aumentado linearmente para o tampão B de 100% (tampão acetato de sódio 50 mM (pH 4,5) que contém NaC! 1 M) em 20 vezes o volume de coluna. O pico da eluição foi coletado no purificador AKTA. Como 15 determinado, aproximadamente 1 mg do peptideo foi obtido A solução coletada foi detectada pela electroforese em gel de SDS-PAGE, e corada com azul de Coomassie Brilhante e tingido com iodo (veja pot favor a figura 6A e 6B). A eluição foi realizada usando a coluna analítica de fase reversa C4 com um tamanho do poro de 30OÂ (Jupiter C4 30OÂ 4.6*250mm) e 0,1% soluções aquosas TFA /0,1°6 da solução de 20 aceton itrilo TFA com um gradiente de 61/39 a 54/46 (10 min). A amostra foi analisada por HPLC analltico (Agilent1200), e o tempo de retenção foi de 11,5 minutos, a pureza foi determinada em 100°6 (veja figura 7). A análise de GPC foi empregada (SHIMADZU LC- 20AD, colunas HQ in tandem de SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804), sob a condição da solução dci nitrato de sódio 0,1 M, a eluição foi realizada em uma taxa de 1,0 ml/min, e a 25 pureza foi determinada em 98,7°6. Exemplo 5a. Preparação e análise de PB-l 08 (PEG4000O-PB-105)
2.0 mg de PB-105 foram dissolvidos em 1 ml de tampão fosfato 20 mM (pH 6,5), e 40 mg de PEG40000 (fornecido por Peg8io Co., Ltd. (Suzhou), 400OOrepresenta 40kDa do peso molecular de PEG e a estrutura molecular é mostrada na figura 2) foi pesada de 30 acordo com uma relação molar do PEG aos peptides que é de 2:1 e adicionada à solução acima. A solução foi agitada adequadamente a fim de dissolver o PEG e formar uma mistura homogênea com o peptideo. A reação foi reaiizada por 1 hora a 20°C e interrompida posteriormente por uma solução (0,1 ml da soluçãci de cisteína 0,5M), e mantida finalmente a -20°C para a purlficação. 35 A amostra foi diluída 5 vezes no tampão acetato de sódio 50 mM {pH 4,5), e carregada na coluna cromatográfica de troca iónica SP (coluna XK16/20, macroCap, GE lnc.) equilibrada em 5 vezes o volume da coluna com tampão acetato de sódio 50 mM (pH
= " a ^ ± 38/58 = = .¶ 4,5). Após o carregamento, a coluna foi equilibrada em 2 vezes o voIume da coluna com , '=· 4í4ç' 3,g tampão acetato de sódio 50 mM (pH 4,5), e o tampão foi então aumentado linearmente para o tampão B de 100°6 (tampáo acetato de sódio 50 mM (pH 4,5) que contém o NaCl 1 M) em 20 vezes o volume de coluna. O pico da eluição foi coletado no purificador AKTA. Como 5 determinado, aproximadamente 1 mg do peptideo foi obtido- A solução coletada foi detectada pela electroforese em gel de SDS-PAGE, e corada com azul de Coomassie Brilhante e tingido com iodo (veja, por favor, a figura 6A e 6B). A eluição foi realizada usando a coluna analítica de fase reversa C4 com um tamanho do poro
Q de 30OA (Jupiter C4 30OÂ 4.6*250mm) e 0,1% soluções aquosa TFA /0,1% da solução de 10 acetonitrilo TFA com um gradiente de 61/39 a 54/46 (10 min). A amostra foi analisada por HPLC analítico (Agilent1200), e o tempo de retenção foi de 11,4 minutos, a pureza foi determinada em 100°4 (veja figura 14). A análise de GPC foi empregada (SHIMADZU LC- 20AD, colunas HQ in tandem de SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804), sob a condição da solução do nitrato de sódio 0,1 M, a eluição foi realizada em uma taxa de 1,0 ml/min, e a 15 pureza foi determinada em 97,2%. Exemplo 5b. Preparação e análise de PB-114 (PEG4000O-PB-113) 2,0 mg de PB-113 foram dissolvidos em 1 ml de tampão fosfato 20 mM (pH 6,5), e 40 mg de PEG40000 (fornecido por Peg8io Co., Ltd. (Suzhcu), 40000 representa 40kOa do peso molecular do PEG e a estrutura molecular é mostrada na figura 2) foi pesado de 20 acordo com uma relação molar do PEG aos peptides que é de 2:1 e adicionado à solução acima. A solução foi agitada adequadamente a fim de dissolver o PEG e formar uma mistura homogênea com o peptideo. A reação foi realizada por 1 hora a 20°C e interrompida posteriormente por uma solução (0,1 ml da solução de cisteína 0,5M), e mantida finalmente a -20°C para a purificação. 25 A amostra foi diluída 5 vezes no tampão acetato de sódio 50 mM (pH 4,5), e carregada na coluna cromatográfica de troca iónica SP (coluna XKl 6/20, macroCap, GE lnc.) equilibrada em 5 vezes o voiume da coluna com tampão acetato de sódio 50 mM (pH 4,5). Após o carregamento, a coluna foi equilibrada em 2 vezes o volume da coluna com tampão acetato de sódio 50 mM (pH 4,5), e o tampão foi então aumentado linearmente para 30 o tampão B de 100% (tampão acetato de sÓdio 50 mM (pH 4,5) que contém NaCl 1 M) em 20 vezes o volume de coluna. O pico da eluição foi coietado no purificador AKTA. Como determinado, aproximadamente 1 mg do peptideo foi obtido.
. A eluição da solução coletada foi realizada usando a coluna analltica de fase reversa C4 com um tamanho do poro de 30OÂ (Jupiter C4 30OÂ 4.6*250mm) e 0,1°6 35 soluções aquosa TFA /0,1°6 da soIução de acetonitrilo TFA com um gradiente de 61/39 a 54/46 (10 min). A amostra foi analisada por HPLC analítico (Agilent1200), e o tempo de retenção foi de 12,6 minutoS, a pureza foi determinada em 97,9% (veja figura 15). A análise
!
a' § a 39/58 z -t:i Ô l"" ". de GPC foi empregada (SHIMADZU LC-20AD, colunas HQ in tandem de SB-802 HQ/SB- D &
c 2 803 HQ/SB-804), sob a condição da solução do nitrato de sódio 0,1 M, a eluição foi realizada em uma taxa de 1,0 ml/min, e a pureza foi determinada em 98,4%. Exemplo 6a.
Preparação e análise de PB-109 (PEG200OOx2 (dobro-braço PEG) - 5 PB-105) 2,0 mg de PB-105 foram dissolvidos em 1 ml de tampão fosfato 20 mM (pH 6,5), e 40 mg de PEG200OOX2 (fornecido por Peg8io Co., Ltd. (Suzhou), 20000 representa 20 kDa de um peso molecular de um braço no PEG e a estrutura molecular é mostrada na figura 16) foi pesado de acordo com uma relação molar do PEG aos peptideos que é de 2:1 e 10 adicionada à solução acima.
A solução foi agitada adequadamente a fim de dissolver o PEG e formar uma mistura homogênea com o peptideo.
A reação foi realizada por 1 hora a 20"C e interrompida posteriormente por uma solução (0,1 ml da solução de cisteina 0,5M), e mantida Íinalmente a -20°C para a purificação.
A amostra foi diluída 5 vezes no tampão acetato de sódio 50 mM (pH 4,5), e 15 carregada na coluna cromatográfica de troca iónica SP (coluna XKl 6/20, macroCap, GE Inc.) equilibrada em 5 vezes c) volume da coluna com tampão acetato de sódio 50 mM (pH 4,5). Após o carregamento, a coluna foi equilibrada em 2 vezes o volume da coIuna com tampão acetato de sódio 50 mM (pH 4,5), e o tampão foi então aumentado linearmente para o tampão B de 100°6 (tampão acetato de sódio 50 mM (pH 4,5) que contém NaCl 1 M) em 20 20 vezes o volume de coluna.
O pico da eluição foi 'coletado no purificador AKTA.
Como determinado, aproximadamente 1 mg do peptideo foi obtido.
A solução coletada foi detectada pela electroforese em gel de SDS-PAGE, e corada com azul de Coomassie Brilhante e tingido com iodo (veja, por favor, a figura 6A e 6B). A eluição foi realizada usando a coluna analítica de fase reversa C4 com um tamanho do poro 25 de 30OÂ (jupiter C4 30OÂ 4.6*250mm) e 0,1% sofuções aquosa TFA /0,1°6 da solução de acetonitrilo TFA com um gradiente de 61/39 a 54/46 (10 min). A amostra foi analisada por HPLC analítico (Agilent1200), e o tempo de retenção foi de 11,5 minutos, a pureza foi determinada em 100% (veja figura 17). A análise de GPC foi empregada (SHIMADZU LC- 20AD, colunas HQ in tandem de SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804), sob a condição da 30 solução do nitrato de sódio 0,1 M, a eluição foi realizada em uma taxa de 1,0 ml/min, e a pureza foi determinada em 99,3%. Exemplo 6b.
Preparação e análise de PB-109b (PEG200OOx2 (PEG duplo-braço) b- PB-105) 2,0 mg de PB-105 foram dissolvidos em 1 ml de tampão fosfato 20 mM (pH 6,5), e 35 40 mg de PEG200OOx2b (fornecido por Peg8io Co., Ltd. (Suzhou), 200OOx2 representa 20x2 kDa do peso molecutar de PEG e a estrutura molecular é mostrada na figura 18) foi pesado de acordo com uma relação molar do PEG aos peptideos que é de 2:1 e adicionado
$ " a -: < 40/58 2 ·í 3 âi. " ", à solução acima.
A solução foi agitada adequadamente a fim dedissolver o PEG e formar ,,? f uma mistura homogênea com o peptideo.
As outras etapas foram as mesmas utilizadas no exemplo 6a.
Finalmente, a análise de GPC foi empregada (SHIMADZU LC-20AD, 3 colunas HQ in tandem de SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804), sob a condição da solução do nitrato de 5 sódio 0,1 M, a eluição foi realizada em uma taxa de 1,0 ml/min, e a pureza foi determinada em 99,2°6. Exemplo 6c.
Preparação e análise de PB-109C (PEG200OOx2 (PEG dupb-braço) de C-PB-105) 2,0 mg de PB-105 foi dissolvido em 1 ml de tampão fosfato 20 mM (pH 6,5), e 40 10 mg .de PEG200OOx2C {fornecido por Peg8io Co., Ltd. (Suzhou), 200OOx2 representa 20x2 kOa do peso molecular de PEG e a estrutura molecular é mostrada na figura 19) foram
' pesados de acordo com uma relação mdar do PEG aos peptides que é de 2:1 e adicionados à solução acima.
A solução foi agitada adequadamente a fim de dissolver o PEG e formar uma mistura homogênea com o peptideo, As outras etapas foram as mesmas .15 utilizadas no exemplo 6a.
Finalmente, a análise de GPC foi empregado (SHIMADZU LC- 20AD, 3 colunas HQ in tandem de SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804), sob a condição da solução do nitrato de sódio 0,1 M, a eluição foi realizada em uma taxa de 1,0 ml/min, e a pureza foi determinada em 98,8°6. Exemplo 6d.
Preparação e análise de PB-109d (PEG200OOx2 (PEG duplo-braço) d- 20 PB-105) 2,0 mg de PB-105 foi dissolvido em 1 ml de tampão fosfato 20 mM (pH 6,5), e 40 mg de PEG200OOx2C (fornecido por Peg8io Co., Ltd. (Suzhou), 200OOx2 representa 20x2 kOa do peso molecular de PEG e a estrutura molecular é mostrada na figura 20) foram pesados de acordo com uma relação motar do PEG aos peptides que é de 2:1 e 25 adicionados à solução acima.
A solução foi agitada adequadamente a fim de dissolver o PEG e formar uma mistura homogênea com o peptideo.
As outras etapas foram as mesmas utilizadas no exemplo 6a.
Finalmente, a análise de GPC foi empregado (SHIMADZU LC- 20AD, 3 colunas HQ in tandem de SB-802 HQ/SB-803 HQ/SB-804), sob a condição da solução do nitrato de sódio 0,1 M, a eluição foi realizada em uma taxa de 1,0 ml/min, e a 30 pureza foi determinada em 99,2%. Exemplo 7. Preparação e análise de PB-119 (PEG2300O-PB-105) 2,0 mg de PB-105 foram dissolvidos em 1 ml de tampão fosfato 20 mM (pH 6,5), e 22 mg de PEG23000 (fornecido por Peg8io Co., Ltd. (Suzhou), 23000 representa 23 kOa de um peso molecular de um braço no PEG e a estrutura molecular é mostrada na figura 2) foi 35 pesado de acordo com uma relação molar do PEG aos peptideos que é de 2:1 e adicionada à solução acima.
A solução foi agitada adequadamente.a fim de dissolver o PEG e formar uma mistura homogênea com o peptideo- A reação foi realizada por 1 hora a 20°C e
& .¶ 'e 41/58 jt ± e interrompida posteriormente por uma solução de excesso de cisteína (0,1 ml da solução de <í . :" císteína 0,5M), e mant da hna mente a 20°C para a purrhcaçao A amostra foi diluída 5 vezes no tampão acetato de sódio 50 mM (pH 4,5), e carregada na coIuna cromatográfica de troca iónica SP (coluna XK16/20, macroCap, GE 5 Inc.) equilibrada em 5 vezes o volume da coluna com tampão acetato de sódio 50 mM (pH 4,5). Após o carregamento, a coluna foi equilibrada em 2 vezes o volume da coluna com tampão acetato de sódio 50 mlVl (pH 4,5), e o tampão foi então aumentado linearmente para o tampão B de 100% (tampão acetato de sódio 50 mM (pH 4,5) que contém NaCl 1 M) em 20 vezes o voIume de coluna. O pico da eluição foi coletado no purificador AKTA. 10 Aproximadamente 1 mg do peptideo foi obtido como determinado. A eluição da solução cdetada foi realizada usando'a coluna analítica de fase reversa C4 com um tamanho do poro de 30OÂ (Jupiter C4 30OÂ 4.6*250mm) e 0,1°6 soluções aquosa TFA /0,1°6 da solução de acetonitrilo TFA com um gradiente de 61/39 a 54/46 (10 min). A amostra foi anaiisada por HPLC analltico (Agilent1200), e o tempo de 15 retenção foi de 11,6 minutos, a pureza foi determinada em 96,0% (veja figura 21). A análise de GPC foi empregada (SHIMADZU LC-2OAD, colunas HQ in tandem de SB-802 HQ/SB- 803 HQ/SB-804), sob a condição da solução do nitrato de sódio 0,1 M, a eluição foi realizada em uma taxa de 1,0 mf/min, e a pureza foi determinada em 97,1°6. Exemplo 8. Preparação e análise de PB-120 (PEG2700O-PB-105) 20 2,0 mg de PB-105 foram dissolvidos em 1 ml de tampão fosfato 20 mM (pH 6,5), e 24 mg de PEG27000 (fornecido por Peg8io Co., Ltd. (Suzhou), 27000 representa 27 klja de um peso molecular de um braço no PEG e a estrutura molecular é mostrada na figura Z) foi pesado de acordo com uma relação molar do PEG aos peptideos que é de 2:1 e adicionada à solução acima- A solução foi agitada adequadamente a fim de dissolver o PEG e formar 25 uma mistura homogênea com o peptideo. A reação foi realizada por 1 hora a 20°C e interrompida posteriormente por uma solução de excesso de cisteína (0,1 ml da sotução de cisteína 0,5M), e mantida finalmente a -20°C para a purificação.
A amostra foi diluída 5 vezes no tampão acetato de sódio 50 mM (pH 4,5), e carregada na coluna cromatográfica de troca iónica SP (coluna XK16/20, macroCap, GE 30 lnc.) equilibrada em 5 vezes o volume da coluna com tampão acetato de sódio 50 mM (pH 4,5). Após o carregamento, a coluna foi equilibrada em 2 vezes o volume da cduna com tampão acetato de sódio 50 mM (pH 4,5), e o tampão foi então aumentado linearmente para o tampão B de 100°6 (tampão acetato de sódio 50 mM (pH 4,5) que contém NaCl 1 M) em 20 vezes o volume de coluna. O pico da eluição foi coletado no purificador AKTA. 35 Aproximadamente 1 mg do peptideo foi obtido como determinado. A eluição da solução coletada foi realizada usando a coIuna analltica de fase reversa C4 com um tamanho do poro de 30OÂ (Jupiter C4 30OÂ 4.6*250mm) e 0,1°6 f < ' '" - 42/58 ± . ^ =. ' d,. soluções aquosa TFA /0,1°6 da solução de acetonitrilo TFA com um gradiente de 61/39 a &, £ 54/46 (10 min). A amostra foi analisada por HPLC anaiítico (Agilent1200), e o tempo de . retenção foi de 12,1 minutos, a pureza foi determinada em 97,7% (veja figura 22). A análise de GPC foi empregada (SHIMADZU LC-20AD, colunas HQ in tandem de SB-802 HQ/SB- 5 803 HQ/SB-804), sob a, condição da solução do nitrato de sódio 0,1 M, a eluição foi realizada em uma taxa de 1,0 ml/min, e a pureza foi determinada em 98,4°6. Exemplo 9. Teste de estabilidade para cjs conjugados de polietilenogHcoI de PB-105
· PB-11O (PEG500O-PB-105), PB-106 (PEG2000O-PB-105), PB-107 (PEG3000O-PB- 105), PB-108 (PEG4000O-PB-105) e PB-109 (PEG20000*2-PB-105) foram colocados 10 respectivamente no tampão acetato de sódio (pH 4,5) e no tampão de fosfato (pH 7,0) a 4'C e -20'C, e avaliados para estabilidade.
As amostras foram registradas para análise de HPLC no dia 7, 15, 30, 60. Os resultados para o dia 60 mostraram que as amostras eram estáveis em pH 4,5 e -2Q°C (Figura 23A), e em pH 7,0 e 4°C ou -20°C (Figura 23B,23C). Exemplo 10. Efeito in vitro de PB-1O1 e PB-105 na atividade de CAMP intracelular 15 Células PC12 foram digeridas, semeadas em placas de 24 poços numa densidade de 10' célula/ml, e incubadas por 48 hr ( 60-70% confluência). O meio de cultura foi abandonado e foi lavado duas vezes usando o tampão fosfato (PBS). 1 m! de PBS contendo 1°6 de 8SAfoi adicicmado.
P8-101 e PB-105 da variante de Exendina-4 (10", 10'°, 10"', 10" 8, 10"' e 10' M) com cisteína na posição 39 do C-terminal foram incubados com 3-isobutil-1 20 metilxantina (IBMX, concentração final de 100 µM) por 30 min.
O meio de incubação foi abandonado. 500 µ1 de HCl (0,1 M) foi adicicínado parar a degradação de cAMP pela enziTa.
As células foram recolhidas e lisadas por sonicação.
O conteúdo de proteína em células foi determinado por BCA.
A curva padrão foi desenhada reunindo uma serie de grupos padrões com concentrações diferentes usando a instrução do kit de ensaio 25 imunoenzimático cAMP (U.S.
RD System corporation). Absorvências foram determinadas a 450 nm em leitor ELISA (U.S.
Thermo Fisher Scientific Corporation) após a reação.
A concentração de CAMP foi lida em curva padrão usando tal absorbância.
Então, a concentração de CAMP nas amostras foi caículada.
A relação dose-resposta para o efeito de PB-1O1 e PB-l 05 em CAMP intracelutar crescente foi calculado usando o software Graphpad 30 Prism.
Os resuitados experimentais são mostrados na figura 24. PB-lOl aumentou o conteúdo do CAMP nas células PC12 em uma maneira dose-dependente, o máximo de CAMP aumentado (Emax) foi 133,2±7,2 pmol/1OO µg (proteina), e ÉC,q foi 1.9x1O ' M.
PB-105 apresentou um efeito in vitro similar em CAMP nas células PC12 comparadas 35 com PB-1O1. O máximo de CAMP aumentado (Emax) para PC-105 foi 129.4±6.8 pmol/lOO µg (proteina) (PB-105 vs PB-lOl, P > 0,05); EC,o was 2,5X1O ' M.
A análise posterior mostrou que log EC,, para PB-lOl e PB-105 foi respectivamente -8,71±0,15 e
- - 2, g í 4 43/58 3 Èfà· : '?= Sí, -8,61±0,15 (PB-105 vs PB-lOl, P > 0,05). lsso indicou que a atividade biológica de PB- 'Èi;' s y 101 não foi alterada pela introdução da cisteína (tiol) na posição 39 do C-terminal.
Exemplo 11. Efeito in vitro de PB-105 e do conjugado PEGuilado deste na atividade de CAMP intracefular 5 As células PC12 foram digeridas, semeadas em placas de 24 poços em uma densidade de 10' cel/ml, e incubadas por 48 horas (a confluência de 60-70°6). O meio de cultura foi abandonado e lavado duas vezes usando o tampão fosfato (PBS). 1 ml de PBS contendo 1% de BSA foi adicionado. O conjugado de PB-105, PB-105 PEGuilado (PEG5000) (PB-llO), o conjugado de PB-105 PEGuilado (PEG20000) (PB-106), o 10 conjugado de PB-105 PEGuilado (PEG30000) (PB-107), o conjugado de PB-105 PEGuilado (PEG40000) (PB-108) e o conjugado de PB-105 PEGuilado (PEG200OOx2, duplo-braço) (PB-109) (10"", 10"'°, 10"', 10"', 10"', 10"' e 10' M) foram incubados com 3 isobutiPl- metilxantina (IBMX, concentração final de 1OOµM) por 30 Min. O meio de incubação foi abandonado. 500 µ1 de HCl (0,1 M) foram adicionados para interromper a degradação do 15 CAMP pela enzima. As células foram coIetadas e lisadas pela sonicação. O conteúdo de proteína nas células foi determinado por BCA. A curva padrão foi traçada ajustando series de grupos padrões com concentrações diferentes usando a instrução do kit imunoenzimático CAMP (U.S. RD System corporation). As absorvências foram detérminadas a 450 nm no leitor ELISA (U.S. Thermo Fisher Scientific Corporation) apÓs a reação. A concentração 20 de CAMP foi lida em curva padrão usando tal absorbância. Então, a concentração de CAMP nas amostras foi calculada. A relação dose- resposta para o efeito de PB-106, de PB-107, de PB-108, de PB-109 e de PB-11O no aumento de CAMP intracelular foi cafculado usando o software Graphpad Prism. Os resultados experimentais indicaram que PB-105 aumentou o conteúdo de CAMP 25 nas células PC12 em uma maneira dose-dependente, q máximo de cAMP aumentado (Emj foi de 103,9±1,5 pmoVlOO µg (proteína), e EC,, foi de 1,3x1O"' M. A mod"áicação de peguilação fez com que a curva da relação dose-resposta movesse para a direita paralelamente de uma maneira da massa-independência molecular (5-40 kDa), e reduzir a atividade bidógica de PB-105 (figura 25). Os EC,, de PB-llO, de PB-106, de PB-107, de 30 PB-108 e de PB-109 eram respectivamente 1,1x1O"';1,1x1O"'; 1,2x1O"; 9,7x1O" e 1,3x1O' M. A modificação de Peguilação de 5 kOa (PB-llO) e 20 kOa (PB-106)"não teve quase nenhum efeito na atividade de PB-105 (a atividade era respectivamente 115°6 daquela de PB-105), e a modificação de Peguilação de 30 kDa (PB-107) e 40 kDa (incluindo braço linear e duplo, PB-108 e PB-109) reduziu respectivamente a atividade de PB-1.05 por 35 aproximadamente 90% e 99°6. As correlações entre o peso molecular de PEG no conjugado PEGuilado e as atividades destas drogas (Log EC50) são mostradas na figura 26A (que inclui EC,,, de PB-105 nafigura 24).
í "i7 ±.
Z - 44/58 .e Z £ >$ 'r· Example 12. Efeito in vitro de PB-105 e conjugados PEGuifados destes na C "iè atividade de CAMP intracelular As células PC12 foram digeridas, semeadas em placas de 24 poços em uma densidade de 10' cel/ml, e incubadas por 48 horas (a confluência de 60-70°6). O meio de 5 cultura foi abandonado e lavadd duas vezes usando o tampão fosfato (PBS)- 1 ml de PBS contendo 1°6 de BSA foi adicionado. O conjugado de PB-105, PB-105 PEGuilado (PEG23000) (PB-119), o conjugado de PB-105 PEGuilado (PEG27000) (PB-120), (10"", 10"'°, 10"', 10 ', 10"', 10"' e 10 ' M) foram incubados com 3 isobutiP1-metilxantina (IBMX, . concentração final de 100 µM) por 30 Min. O meio de incubação foi abandonado. 500 µ1 de 10 HCl (0,1 M) foram adicionados para interromper a degradação de cAMP pela enzima. As células foram coletadas e lisadas pela sonicação. O conteúdo de protelna nas células foi determinado por BCA. A curva padrão foi traçada ajustando séries de grupos padrões com concentrações dlferentes usando a instrução do kit imuno ligada a enzima CAMP acampamento (U.S. RD System corporation). As absorvências foram determinadas a 450 15 nm no leitor ELISA (U.S. Thermo Fisher Scientific Corporation) após a reação. A concentração de CAMP foi lida em curva padrão usando tal absorbância. Então, a concentração de cAMP nas amostras foi calculada. A relação dose- resposta para o efeito de PB-105, de PB119, e PB-120 no aumento de CAMP intracelular foi calculado usando o software Graphpad Prizm. 20 Os resultados experimentais indicaram que PB-105 aumentou o conteúdo de CAMP nas céiulas PC12 de uma maneira de dose-dependência, e ÉC,g foi 2,7x1O"' M. PB-106 (PEG20000) e PB-119 (PEG23000) não tiveram nenhum efeito na atividade de PB-105 para CAMP, e PB-120 (PEG27000) fez com que a curva dose-resposta movesse para a direita paraielamente e deduzisse a atividade biológica de PB-105 25 para CAMP em aproximadamente 50°6 (Figura 27). O EC,, de PB-106, PB-119 e PB- 120 foi respectivamente 1,5x10"9; 2,5x1O' e 5,4Xx1O"' M. Normalmente acredita-se que a atividade biológica da biomolécula conjugada irá reduzir exponencialmente com o aumento do peso molecular do grupo conjugado (tais como a partir de 4kDa) (Bailon et al. Rational design of potent, long-lasting form of 30 interferon: A 40 kOa branched polyethylene glycol-conjugated interferon a-2a for the treatmerit of hepat'nis C. Bioconjugate Chem 2001 ; 12 : 195 -202; Bowen et al. Relationship between molecular weight and duration of activity of poIyethylene glycol conjugated granulocyte colony-stimulating factor mutein. Experimenta! Hematology 1999; 27: 425 -32: Bailon et al. PEG-modified biopharmaceuticals. Expert Opin Deliv. 2009; 6: 1-16)- Entretanto, 35 O depositante descobriu surpreendentemente que, na Figura 25 e 27, a relação entre o peso molecular do grupo de polímero conjugado e a atividade do conjugado da variante de Exendina para estimular CAMP in vitro não está de acordo com esta expectativa. Pelo
€
. . 45/58 e 2 ,í f,, menos para o conjugado da variante de Exendina conjugado por PEG com um peso r~ « m, e molecular de até 23 kDa, a modificação de PEGuilação não teve nenhum efeito na ação do conjugado da variante de Exendina para estimular in vitro as células para produzir CAMP (e quando o peso molecular de PEG sendo de até 27 kDa, tem apenas 5 um efeito moderado). Em contraste, a modificação de PEGuilação não teve nehum efeito no efeito máximo de PB-105 para estimular a produção de CAMP (Emax). o Em,x de PB-11O, PB-106, PB-107, PB-108 e PB-109 é respectivamente 102,1±1,8; 111,9±2,1; 126,2±3,4; 100,4±1,7 e 115,5±3,5 pmol/1OO µg proteína- O peso moiecular de PEG nos conjugados PEGuilados não tiveram correlação com Em,, dessas drogas 10 (ver Figura 26B) (incluindo o Em,, de PB-105 na Figura 24). O depositante reafizou a seguinte análise baseada no resuitado surpreendente.
Uma vez que o meio contendo soro com várias proteinases presentes não foi usado como o sistema de reação neste exemplo e nenhuma proteinase foi adicionada na solução de reação, a degradação enzimática da variante de Exendina e os conjugado destes foram 15 significativamente mais baixos do que in vivo.
Ou seja, no caso do teste in vivo com um tempo de ação mais bngo, o grau de redução para a atividade biológica dos conjugado da variante de Exendina de acordo com a presente invenção é merior do que a Exendina não conjugada do tipo selvagem ou a variante de Exendina, mesmo a atividade biológica dos conjugados da variante de Exendina de acordo com a presente invenção seja mais elevada. 20 Em outro aspecto, a fração do polímero que é mais de 23 kOa pode ser usada para conjugar a variante de Exendina sem afetar significativamente a atividade biológica in vivo.
Embora a preSente invenção não seja limitada por esta teoria, a predição é provada nos seguintes exemplos.
Exemplo 13. Experimento de tempo-resposta do efeito hipoglicèmico para PB-1O1 e 25 PB-105 Camundongos masculinos Kunming ( peso corporal era 27-32 g) foram fornecidos.
Os ratos não jejuaram para o alimento ou água antes do experimento.
Foram distribuldos aleatoriamente em três grup?s com seis camundongos em cada grupo.
O volume igual de solução salina {10 ml/kg), PB-1O1 (10 µg/kg) e a variante PB-105 de Exendina (10 µg/kg) 30 com um cisteína na posição 39 do C-terminaf foram injetados subcutaneamente.
Em 0, 1, 2, 4, 8, 12 horas após a injeção, amostragem do sangue na ponta da cauda foi realizada.
A glicose do sangue foi determinada usando o medidor de glicose de sangue OneTouch e as tiras de teste acompanhados U.S.
Johnson & Johnson). A curva do tempo-resposta para o efeito hipogiicemico foi traçada usando o valor da glicose de sangue em pontos àiferentes 35 de tempo para a linha central de y e usando pontos de tempo para a linha central de x, para calcular a meia-vida biológica de efeitos hipoglicemicos para PB-1O1 e PB-105. O resultado é mostrado na figura 28. A meia-vida da variante de Exendina-4 substituldo pelo cistelna e
C ã , 46/58 à í »' ,P" ' >,. Exendina-4 é respectivamente 4,7"0,2 horas e 4,4±0,2 horas (PB-105 contra PB-lOl, P> s c 0,05). Indica que a variante de Exendina-4 substituida pelo cisteína na posição 39 do C- ' terminal e Exendina-4 têm a meia-vida comparável.
Exemplo 14. Experimento da dose-resposta do efeito hipoglicemico para PB-lOl e 5 PB-105
. Camundongos masculinos Kunming (peso corporal era 23-27 g) foram fornecidos.
Os camundongos jejuaram para o alimento por 3 horas mas não para a água antes do experimento.
Foram distribuldos aleatoriamente em três grupos com seis camundongos em cada grupo.
O volume de soiução salina (10 ml/kg), de PB-1O1 (0,01; 0,1; 0,3; 1;3;10;100 10 µg/kg) e variante PB-105 de Exendina (0,01; 0,1; 0,3; 1;3;10;100 µg/kg) com um cistelna na posição 39 do C-terminal foi subcutaneamente injetada- Em 1 hora após a injeção, a amostragem do sangue na ponta da cauda foi realizada.
A glicose do sangue foi determinada usando o medidor de giiccse de sangue OneTouch e as tiras de teste acompanhados U.S.
Johnson & johnson). A curva da dose- resposta para o efeito 15 hipoglicêmico foi traçada usando o valor da glicose de sangue para a linha central de y e usando a dose para a linha central de x (figura 29). Por sua vez, o parâmetro da relação dose- resposta para PB-1O1 e PB-105 (Em,xand ED50) foi calculada usando o software Graphpad Prizm.
O resultado indicou que a eficiência hipoglicemica máxima para a injeção do polus de PB-lOl e PB-105 foi respectivamente 32,2% e 36,1%, o valor de ED,,, foi 20 respectivamente 0,6 e 1,2 µg/kg.
A análise posterior indicou que Cl Log ED,, de PB-lOl e PB-105 foi respectivamente -0,25±0,17 e 0,08±0,20 (PB-105 vs PB-1O1, P> 0,05). Os resultados experimentais indicaram que a variante de Exendina-4 de PB-105 com uma cisteína na posição 39 do C-terminal não tem significativamente nenhuma diferença com a Exendina-4 em relação ao efeito hipoglicemico. 25 Exemplo 15. Experimento da dose- resposta do efeito hipoglicêmico para PB-1O1 e a variante deste (PB-102) Camundongos masculinos Kunming (peso de corpo era 22-26 g) foram fornecidos.
Os camundongos jejuaram para o alimento por 3 horas, mas não para a água antes do experimento.
Foram distribuídos aleatoriamente em 18 grupos com seis camundongos em 30 cada grupo.
Volume de solução salina (10 ml/kg), de PB-1O1 (0,01; 0,1; 1;10;100 µg/kg) e variante de Exendina de PB-102 (0,01; 0,1; 1;3;10;100 µg/kg) com um cisteína na posição 35 do C-terminal foi subcutaneamente injetada.
Em 1 hora após a injeção, a amostragem do sangue na ponta da cauda foi realizada.
A glicose do sangue foi determinada usando o medidor de glicose de sangue OneTouch e as tiras de teste acompanhados U.S.
Johnson & 35 Johnson). A curva da dose- resposta para o efeito hipoglicêmico foi traçada usando o valor da glicose de sangue para a linha y e usando a dose para a linha x (figura 29). Por sua vez, o parâmetro da relação dose- resposta para PB-1O1 e PB-102 (E,,,,,and ED,,J foi calculada
G á í 47/58 % è y" , ' ·, usando o software Graphpad Prizm.
O resultado indicou que a eficiência hipoglicêmica c © máxima para a injeção de polus de pb-1o1 e PB-102 foi respectivamente 39,8% e 32,8"6, o valor de ED50 foi respectivamente 0,5 e 2,5 µg/kg.
A análise posterior indicou que o Log EO,q de PB-1O1 e PB-102 foi respectivamente -0,2867±0,2272 e 0,4015±0,2946 (PB-102 vs PB- 5 101, P> 0,05). Os resultados experimentais indicaram que a variante de Exendina-4 de PB- 102 com uma cisteína na posição 35 do C-terminal não teve sign'rficativamente nenhuma diferença com a Exendina-4 em relação ao efeito hipoglicêmico.
Example 16. Experimento da relação tempo-resposta para o efeito hipoglicêmico de quantidades iguais de PB-105 e conjugados PEGuilados 10 Camundongos machos Kunming (peso corporal era 22-26 g) foram fornecidos.
Os camundongos jejuaram para o alimento por 3 horas, mas não para a água antes do experimento.
Foram distribuídos aleatoriamente em 18 grupos com seis camundongos em cada grupo.
Um volume igual de PB-105 (10 µg/kg), PB-105 PEGuilado (PEG5000) conjugado PB-11O (10 µg/kg), PB-105 PEGuiiado (PEG20000) conjugado PB-106 (10 15 µg/kg), PB-105 PEGuilado (PEG30000) conjugado PB-107 (10 µg/kg), PB-105 PEGuilado (PEG40000) conjugado PB-108 (10 µg/kg) e PB-105 PEGuilado (PEG200OOx2, duplo-braço) conjugado pb-109 (10 µg/kg) foram subcutaneamente injetados in bolus.
Em 0, 1, 2, 4, 8, 12, 18, 24, 36 horas após a injeção, a amostragem do sangue na ponta da cauda foi realizada.
A glicose de sangue foi determinada 20 usando o medidor de glicose de sangue OneTouch e as tiras de teste acompanharam U-S.
Johnson & Johnson). A curva de tempo-resposta para c) efeito hipoglicemico foi traçada usando o valor da glicose de sangue em pontos de tempo diferentes para a linha y e usando pontos do tempo para a linha x (figura 31), para calcular a meia-vida biológica e o efeito hipoglicêmico máximo de efeitos hipoglicêmicos para o conjugado 25 PB-105 e o PEG'uilado deste, assim como a área acima da curva do efeito hipoglicêmico (tabela 1). Pode-se ver na tabela 1, cada conjugado da variante de Exendina neste experimento tem similar ou mesmo significativamente mais alto (PB- 106) efeito hipoglicêmico acumulado (veja a área acima da curva), e estes conjugados da variante de Exendina têm uma meia-vida biológica significativamente mais longa, 30 comparado com o PB-105 não-conjugado.
A análise para o peso molecular do PEG vs.
A meia-vida biológica, o efeito hipoglicemico máximo e a área acima da curva do efeito hipoglicemico indica que PB-105 conjugados PEGuilados PB-106, PB-107, PB-108 e PB-109 todos prolongam significativamente o perlodo do efeito hipoglicemico de PB- 105 (meia-vida tj/j Entretanto, quando o peso molecular do PEG que está na escala 35 de 5-20 kOa, o prolongamento da meia-vida biológica é proporcional ao peso molecular, e quando é maior de 20 kDa, o período do efeito hipoglicêmico (a meia-vida biológica permanece a mesmo (figura 32A). Os conjugados PEGuilados têm o mesmo b L
7 2
: .· + 48/58 ^ 7 m' -
4 · ,, efeito hipoglicêmico máximo quando o peso molecular do PEG está na escala de 5-20 kOa, mas quando é maior que 20 kOa, o efeito hipoglicêmico máximo diminui com o G & aumento do peso molecular de PEG (figura 32B). Em relação a área acima da curva do efeito hipoglicêmico, o PB-106 (kOa PEG20) tem um efeito hipoglicêmico acumulado
5 significativamente mais alto do que PB-105, e os outros conjugados tem efeito similar ou um pouco menor (figura 32C). Como descrito acima, A modificação de PEGuilação sÍtio-específica (PB-11O e PB-106) não afeta significativamente o efeito hipoglicêmico máximo dos conjugados da variante de Exendina (respectivamente, 96°6 de PB-105), pelo menos quando o peso molecular do PEG é de até 20 kDa.
A modificação de 10 Peguilação reduz significativamente o efeito hipoglicêmico máximo quando o peso molecdar do PEG é de 30 kDa ou mesmo maior (PBjÇ)7, PB-108 e PB-109), embora estes conjugados ainda tenham o efeito hipoglicêmico acumulado comparável e significativamente maior por muito tempo de meia-vida biológica.
Este resultado indica que a fração conjugada com um peso molecular mais elevado pode ser útil para 15 conjugar as variantes de Exendina.
Como tal, uma meia-vida biológica significativamente mais Ionga e um nível mais delicado e mais estável de glicose do sangue são obtidos, para impedir que o nível de glicose do sangue abaaixe demasiadamente no curto período e flutue em uma larga escala.
Esta descoberta é consistente com o resuitado in vitro no experimento de CAMP como descrito acima 20 (veja figura 26). Tabela 1. Meia-vida biológica, efeito hipoglicêmico máximo e Area Acima da Curva para reduzir a glicose sanguínea (AAC) para PB-105 e conjugados PEGuilados destes (12 camundongos em cada grupo) conjugados de T1/2 (hrs) Efeito Máximo Area Acima da Curva Exendina hipoglicêmico para glicose (°/0 valor antes da sanguinea dosagem) (AAC, mmol*h/L) PB-105 4.9±0.1 38.0±4.3 32.8±5.4 fà
PB-11O 7.0±2.0 36.3±1.2 31.8±4.6 PB-106 13.4±0.5* 36.5±3.2 53.9±4.3* PB-107 12.5±2.0* 24.3±2.8* 30.0±7.2 PB-108 10.8±2.0* 22.6±2.9* 25.3±5.7 PB-109 9.2±2.2* 20.2±3.2* 21.6±4.8 *P<O.05(VSPB-105) 25 Exemplo 17. Experimento da relação tempo-resposta para o efeito hipoglicêmico de quantidades equivalentes de PB-105 e conjugados PEGuilados (PEG30000) destes (PB- 107)
b I ? 'L Ej W H 49/58 e J; e e »m Uma vez que PEG30000 (PB-107) in vitro reduziu a atividade biofógica de PB-105 * < $ em aproximadamente 90°6 (figura 25), e in vivo reduziu a atividade biológica de PB-105 em aproximadamente 50% (figura 31), a dose de PB-107 foi aumentada a fim de estudar a meia-vida biológica de PB-107 sob a condição de ser equivalente a PB-105. Camundongos 5 machos Kunming (o peso corporal era 22-25 g) foram fornecidos. Os camundongos não jejuaram para o alimento ou para a água antes do experimento. Foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos com seis camundongos em cada grupo. PB-105 (1 0 µg'/kg) e PB-105 PEGuilado (PEG30000) PB-107 conjugado (100 µg/kg, esta dose produz um efeito hipoglicêmico de aproximadamente 100% em 10 µg/kg de PB-105) foram injetados 10 subcutaneamente. Em 0, 1, 2, 4, 8, 12, 18, 24, 36, 48, 72 horas após a injeção, amostragem do sangue na ponta da cauda foi realizada- A glicose do sangue foi determinada usando o medidor de glicose de sangue OneTouch e as tiras de teste acompanharam U.S Johnson & Johnson). A curva de tempo-resposta para o efeito hipoglicêmico foi traçada usando o valor da glicose do sangue em pontos de tempos diferentes para a linha y e usando pontos 15 de tempo para a linha x, para calcular a meia-vida biológica de PB-105 (10 µg/kg) e PB-107 (100 µg/kg). Os resultados são mostrados na figura 33, a meia-vida biológica de PB-105 (1 0 µg/kg) e PB-107 (100 µg/kg) são respectivamente 4,5±0,4 horas e 44,6±4,5 horas P > 0.05, PB-107 vs PB-105). O estudo para a relação tempo-resposta da dose equivalente indica que a Peguilação (PEG30000) (PB-107) prolonga o perlodo do efeito hipoglimérico de PB- 20 105em1Ovezes. " . Exemplo 18. Experimento da dose- resposta do efeito hipoglicêmico para PB-l 05 e PEGuilados (PEG20000) conjugados deste (PB-106) Camundongos masculinos Kunming (o peso corporal era 20-24 g) foram fornecidos.
' Os camundongos jejuaram para o alimento por 3 horas, mas não para a água antes do 25 experimento. Foram distribuídos aleatoriamente em 13 grupos com seis camundongos em cada grupo. Volumede solução salina igual (10 ml/kg), de PB-105 (0,1; 0,3; 1; 3; 10; 30 µg/kg) e dose igual de PEGuilado (PEG20000) pb-106 conjugado (0,1; 0,3; 1; 3; 10; 30 µg/kg) foram injetados subcutaneamente. Em 1 hora após a injeção para o grupo PB-105 (o ponto do tempo para o pico da redução da gficose do sangue, ver a figura 28 e 31), em 4 "30 horas após a injeção para o grupo PB-106 (o ponto do tempo para o pico da redução da glicose do sangue, ver a figura 31), a amostragem do sangue na ponta da cauda foi realizada. A glicose do sangue foi determinada usando o medidor de glicose do sangue OneTouch e as tiras de teste acompanharam U.S. johnson & johnson). A curva da dose- resposta para o efeito hipoglicêmico foi traçada usando o valor da glicose do sangue para a 35 linha y e usando a dose para a linha x (figura 34). Por sua vez, o parâmetro da relação dose- resposta para PB-105 e PB-106 (Emin, E,,,,, e ED50) foi calculado usando o software de . Graphpad Prizm. Em,, para a injeção do poÍus de pb-105 e PB-106 foi respectivamente de
W' 1 F " . " Z - 50/58 ã ef
F ' ,. 8,3 ± 0,2 e 8,4 ±0,3 mmol/L; e E,,,,, foi respectivamente 6,0 ± 0,3 e 5,5± 0,6 mmol/L (a r , Vm eficiência hipoglicêmica máxima foi respectivamente 27,8°6 e 34,5°6). O EO,q de PB-105 e de PB-106 foi respectivamente 1,2 e 3,3 µg/kg. A análise posterior indicou que o Log ED5q de PB-105 e PB-106 foram respectivamente 0,07 ± 1,2 e 0,5 ± 0,2 (PB-106 vs. PB-105,P > 5 0-05). O resultado experimental indicou que os conjugados PEGuilados (PEG20000) de PB- 105 (PB-106) não tiveram significativamente nenhuma diferença com o PB-105 em relação ao efeito hipóglicêmico (incluindo Em,, e ED5n)- Exemplo'19. Experimento da relação tempo-resposta para o efeito hipoglicêmico de PB-105, de PB-111 e do conjugado PEGuilado (PB-106 e PB-112) em camundongos 10 normais Camundongos masculinos Kunming (o peso corporal era 24-30 g) foram fornecidos. Os camundongos não jejuaram para o alimento ou para a água antes do experimento. Foram distribuldos aleatoriamente em quatro grupos com seis camundongos em cada grupo. PB-105 (10 µg/kg), conjugado PEGuilado (PEG20000) de PB-105 (PB-106) (10 15 µg/kg), P8-111 (10 µg/kg) e conjugado PEGuilado (PEG20000) de PE3-111 (PB-112) (10 µg/kg) foram injetados subcutaneamente. PB-lll era derivado de PB-105 onde a cisteína na posição 39 do C-terminal liga-se a tirosina- Em 0; 0,5; 1; 2; 4; 8: 12; 24; 48 horas após a . , injeção, amostragem do sangue na ponta da cauda foi realizada. A glicose do sangue foi determinada usando o medidor de glicose de sangue OneTouch e as tiras de teste 20 acompanharam U.S. johnson & Johnson). A curva do tempo-resposta para o efeito hipoglicêmico foi traçada usando o valor da glicose do sangue em diferentes pontos de tempo para a linha y e usando pontos de tempo para a linha x, para calcular a meia-vida biológica e o efeito hipoglicêmico máximo do conjugado de PB-105, P8-111 e do PEGuilado destes. Os resultados são mostrados na·figura 35, PB-105, PB-106, P8-111 e PB-112 25 reduziram aleatoriamente a glicose do sangue nos camundongos de uma maneira de ' tempo-dependência. A meia-vida biológica de PB-105 e PB-111 é respectivamente de 4,6 horas e 6,0 horas, e o efeito hipoglicêmico máximo é respectivamente 44,7°6 e 36,4%. A meia-vida biológica de PB-106 e PB-112 é respectivamente de 19,6 horas e 21,7 horas, e o do efeito hipoglicêmico máximo é respectivamente 37,3°6 e 34,9%. Os resultados indicaram 30 que a tirosina adicionado na posição 39 do C-terminal não teve nenhum efeito na atividade do efeito hipoglicêmico e da meia-vida biológica do conjugado de PB-105 e do PEGuiiado destes (PB-106). Exemplo 20. Experimento da relação tempo-resposta para o efeito hipoglicêmico de PB-1O1 e das variantes PB-105, PB-111 e PB-113 assim como conjugados PEGuilados PB- 35 106, PB-112 e PB-114 em camundongos com diabetes STZ Os camundongos foram jejuados por 14 horas antes que a diabetes fosse induzida. A amostra de sangue foi registrada através do sangramento da ponta da cauda a fim de
( e
W a « 7 - "« 51/58 e r .' ,' ·'e determinar o vafor do branco da glicose do sangue. STZ então, recentemente preparado E g (estreptozotocina) (1 20 mg/lO ml/kg, preparado recentemente, dissolvidos na solução de nitrato 0,1 M, pH 4,5) foi injetada subcuteamente. A glicose do sangue foi determinada após 3 dias. A glicose do sangue aleatória dos camundongos cuja que estava acima de 16,7 5 mmol/L foram considerados como camundongos em que a diabetes foi induzida com sucesso. Os camundongos não jejuaram para o alimento ou para a água antes do experimento. Foram distribuídos em 7 grupos com 4-6 camundortgos em cada grupo- A glicose do sangue em 0 horas foi determinada através do sangramento da veia da cauda. E o volume igual de P8-101 (10 µg/1Oml/kg), PB-105 (10 µg/kg), PB-106 (10 µg/kg), P8-111 10 (10 µg/kg), PB-112 (10 µg/kg), PB-113 (10 µg/kg) e PB-114 (10 µg/kg) foram injetados subcutaneamente- P8-111 era derivado de PB-105 em que a cistelna na posição 39 do C- terminal liga-se a tirosina, PB-113 era derivado deP8-105 em que a glicina na posição 2 do N-terminal foi substitulda peia D-alanina, e PB-114 era conjugado do PEGuilado (PEG40000) de PB-113. Em 0; 0,5; 1; 2; 4; 8; 12; 24; 48 horas após a injeção, amostragem 15 do sangue foi realizada e a glicose do sangue foi determinada. A curva do tempo-resposta' para o efeito hipoglicêmico para PB-1O1, PB105, PB106, PB111, PB112, PB-113 e PB 114 foi traçada usando o valor da glicose do sangue usando diferentes pontos de tempo para a linha y e usando pontos dr tempo para a iinha x. A curva foi traçada usando GraphPad Prism 5 Demo software (Prism v5, Graphpad Software, lnc., San Diego, CA), 20 e a meia-vida biológica (t1/2) de PB-lOl, PB-105, PB-106, P8-111, PB-112, PB-113 e PB- 114 foi calculada e comparada usando métodos de estatlsticas matemáticas. Como mostrado na Figura 36, o a injeção de polus de PB-lOl, PB-105, PB-106, PB-111, PB-112, PB-113 e PB-114 reduziu a glicose do sangue aleatÓria em camundongos com diabete STZ induzida de uma maneira de dependência de tempo. As eficiências 25 máximas foram respectivamente 47,5 %, 57,6 %, 69,8 °6, 54,4 °6, 59,7 °6, 49,2 % e 17,9 % (simplesmente 38 % destes para PB-iOl). A meia-vida biológica de PB-lOl, PB-105, PB- 106, P8-111, PB-112 e PB-113 foi respectivamente 5,5: 5,5; 21;8; 5;0; 20,3 e 5,9 horas, e a meia-vida biológica deP8-114 não pode ser calculado devido ao efeito hipoglicêmico. Os resultados experimentais indicaram que a tirosina adicionado na posição 39 do C-terminal 30 ou da substituição da glicina pela D-alanina na posição 2 no N-terminal não reduziu a atividade anti-hiperglicemica de PB-105, Peguilação (PEG20000) nãcj reduziu a atividade de PB-105 e de derivados destes, mas a Peguilação (PEG40000) reduziu significativamente a atividade de PB-105 e de derivados destes. Exemplo 21. Experimento da relação tempo-resposta para o efeito hipoglicêmico de 35 quantidades equivatentes de PB-105 e PB-106, PB-119 e PB-120 Camundongos masculinos Kunming (o peso corporal era 24-30 g) foram fornecidos. Os camundongos não jejuaram para o alimento ou para a água antes do experimento.
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F H' Foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos com seis camundongos em cada é
± F grupo.
Conjugado de PB-105 (10 µg/kg), PB-105 PEGuilado (PEG20000) (PB-106) (1 0 µg/kg), conjugado de PB-105 PEGuilado (PEG23000) (PB-119) (10 µg/kg) e conjugado de PB-l 05 PEGuilado(PEG27000) (PB-120) (10 µg/kg) foram injetados subcutaneamente.
Em 5 0; 0,5: 1; 2; 4; 8; 12; 24; 48 horas após a injeção, amostragem do sangue na ponta da cauda foi realizados- A glicose do sangue foi determinada usando o medidor de giicose do sangue OneTouch e as tiras de teste acompanhados U.S.
Johnson & Johnson). A curva de tempo- resposta para o efeito hipoglicêmico foitraçada usando o valor da glicose do sangue em diferentes pontos de tempo para a linha y e usando pontos de tempo para a linha x, para 10 calcular a meia-vida biológica e o efeito hipoglicêmico máximo do conjugado de PB-105 e do PEGuilado deste.
Os resultados são mostrados na figura 37, PB-105, PB-106, PB-119 e PB- 120 reduziram a glicose do sangue aieatória nos camundongos em uma maneira de tempo- dependência A meia vida biolÓgica deles foi respectivamente 6,0: 21,7; 24,1 e 26,1 horas, e e a meia-vida biológica aumentou com o aumento do peso molecular de PEG.
O tempo do 15 efeito hipoglicêmico máximo foi respectivamente de aproximadamente 1 hora (PB-105) e 4 horas (PB-106, PB-119 e PB-120). Os valores máximos do efeito hipoglicêmico foram respectivamente 35,0°6, 50,9°6, 48,2°6 e 42,2% (figura 37A). Como calculado como a área de efeito-tempo hipoglicêmico, PB-106, PB-119 e PB-120 todos aumentaram significativamente o efeito hipoglicêmico de PB-105 (aumento em 3-4 vezes). E o efeito 20 acumulado aumentou com o aumento do peso molecular do PEG (figura 37B). Os resultados experimentais indicaram que a Peguilação não reduziu a atividade hipoglicêmica de PB-105, e prolongaram significativamente o período do efeito hipoglicêmico e aumentaram o efeito hipoglicêmico acumulado quando o peso molecular estava entre 20-27 kDa.
Como considerado aqui, quando o peso molecular do PEG é de 20-27 kDa, os 25 conjugados das variantes de Exendina de acordo com a presente invenção, PB-106, PB-119 e PB-120, fornecerem um valor do efeito hipoglicêmico máximo mais elevado, comparado com o PB-105 não con jugado.
Além d isso, estes conjugados têm um período significativamente mais longo do efeito hipoglicêmico e o efeito hipoglicêmico acumulado aumenta com o aumento do peso molecular dó PEG, de maneira a fornecer um efeito 30 hipoglicêmico eombinado melhor.
Exemplo 22. Teste de vÔmito do pombo para PB-lOl, PB-105, PB-106 e PB-120 Os pombos saudáveis, macho ou fêmea, foram distribuídos em 7 grupos com 4-8 pombos em cada grupo.
PB-lOl (3 mg/kg, N = 4 ou 6 mg/kg, N = 8), PB-105 (3 mg/kg, N = 4 ou 6 mg/kg, N = 8), PB-106 (3 mg/kg, N = 4 ou 6 mg/kg, N = 8) e PB-120 (6 mg/kg, N = 8) 35 foram separadamente subcuteamente injetados.
Os tempos de vômito e de latência para o vômito (o período da dose ao primeiro vômito) foram observados e registrados em 24 horas após dosagem usando q sistema de monitoramento eletrônico.
Os tempos de vômito foram
.7 a 4 . - . - . à 53/58 ? .· ;j: , .k q, definidos como uma vez se coçar o pescoço, abertura da boca, encolhimento dos ombros, ,í' í' contrações abdominais, e finalmente acalmar ou o fim do vômito.
Os experimentos Precedentes indicaram que a resposta do vômito não foi induzida pela situação normal tal como nenhuma dose nos pombos, e a dose de PB-1O1 (3 e 6 mg/kg) e de PB-105 (3 e 6 5 mg/kg) induziu um vômito significativo em uma maneira de dose-dependência.
Nos grupos PB-106 (3 mg/kg e 6 mg/kg) e PB-120 (6 mg/kg), a latência do vÔmito foram prolongados significativamente (probngado em aproximadamente 5-18 vezes, veja a figura 38A), e os tempos de vômito foram reduzidos significativamente (reduzido por aproximadamente 50- 70%, veja a figura 38B), comparado com os grupos de dose correspondente de PB-1O1, PB- lO 105. Para a dose de 6 mg/kg, a diferença foi estatisticamente significativa (p<O,05). O resultado indica que a Peguilação reduziu significantemente a resposta de vômito para a Exendina e as variantes desta.
Exemplo 23. Reação sistematica alérgica e efeitos no peso corporal induzido por PB-lOl, PB-105eP8-106 15 44 cobaias masculinas saudáveis foram fornecidas, e Cl peso de corpo de cada cobaia era aproximadamente 300 g.
Elas foram distribuídas em 5 grupos, isto é salino (N = 10), PB-1O1 (N = 10), PB-105 (N = 10), PB-106 (N = 10) e o grupo de albumina (N = 4). Salino (1 ml/kg) PB-lOl (100 µg/kg), PB105 (100 µg/Kg), PB-106 (100 µg/kg) e ovalbumina de galinha (80 mg/kg) foram respectivamente injetados subcueamente dia sim 20 dia não por três vezes consecutivas.
No dia 14depois da última injeção, a quantidade de estimulação do salino (1 ml/kg) PB-1O1 (300 µg/Kg), PB-105 (300 µg/kg), PB-106 (300 µg/kg) e albumina (240 mg/kg) respectivamente foram injetados através da veia dc dedo. lmediatamente depois da injeção, a resposta dos animais foi observada por 0-3 hrs depois do estímulo.
Os sintomas para reação alérgica em animais foram registrados como 25 mostrado na Tabela 2, e avaliado como mostrado na Tabela 3 (semi-quantitativo). Tabela 2. Os sintomas para a reação alérgica nos animais 0 Normat 7 respirações curtas 14 andar regular
1 sem descanço I 8 urinas 15 pulo
2 pouco pêlo 9 defecações 16 repouso
3 tremendo 10 lágrimas 17 cramps
4 nariz coçando l 11 dificuldade respiratória i 18 rotação
5 espirros 1 2 of egante 19 respiração forte
6 tosse 13 purpura ) 20 morto
Tabefa 3. Avaliação de graus da reação sistemática alérgica em animais e padrões semi-quantitativos
~7 y á : " "P 54/58 3 èS f -! ,Ç 0 0 reação alérgica negativa Á $' '~' 1-4 sintomas + í reação alérgica fraco negativa 5-10 sintomas ++ ã reação alérgica positiva 11-19 sintomas +++ 3 forte reação alérgica positiva 4 20 ++++ Muito forte reação alérgica positiva A curva foi traçada usando pontos de tempo para a linha x e os graus de resposta alérgica (semiquantitativa) para a linha y, segundo as indicações da figura 39- Nenhuma reação alérgica foi encontrada nas cobaias do grupo de controle salino, isto é, da reação alérgica negativa. As cobaias no grupo da albumina morreram imédiatamente depois da 5 estimulação (<2min), isto é, reação alérgica positiva muito forte. As cobaias nos grupos PB- lOl e PB-105 tiveram a resposta alérgica, isto é, reação alérgica positiva. PB-lOl e PB-105 ' eram polipeptídeos contendo 39 resíduos de aminoácidos, e puderam induzir a produção do anticorpo in vivo após a dose crônica (Buse et al. Ehects of exenatide (exendin-4) on glycemic control over 30 weeks in sulfonylurea-treated patients with type 2 diabetes. 10 Diabetes Care. 2004; 27 : 2628-2635.). E, PB-105 PEGuilado (PEG20000) PB-106 conjugado conduziram à reação alérgica negativa fraca nas cobaias. Este resultado indicou que a PEGuilação (PB-106) pode reduzir significativamente a imumnogenicidade de PB-1O1 ou PB-105 e reação alérgica. A curva traçada usando pontos de tempo para a linha x e o peso corporal das 15 cobaias para a linha y (figura 40) mostrou que o peso corporal das cobaias no grupo salino durante a sensibilização aumentou continuamente (o peso corporal aumentou em aproximadamente 38% durante 18 dias do experimento). O peso corporat não diminuiu 4 dias após duas doses sucessiva de albumina, çomparada com o grupo salino. Entretanto, o peso corporal das cobaias diminuiu respectivamente em aproximadamente 8% e 11% (p < 20 0,05), comparado com a dosaçem de PB-1O1 e PB-105. O peso corporal das cobaias nos grupos PB-1O1, PB-105 e PB-106 recuperaram 12 dias após cessar a dosagem, que foi .
comparável com q do grupo salino. Exempb 24 Efeho de PB 105, de PB106, de PB119 e de PB 120 no peso corporal do rato e na quantidade de ingestão de alimentos 25 24 ratos saudáveis masculinos SD foram fornecidos, e o peso corporat destes era de aproximadamente 200 G. Os ratos foram distribuídos em 5 grupos: grupo salino (1 ml/kg, N = 4), PB-105 (100 µg/kg, N = 5), PB-106 (100 µg/kg, N = 5), PB-119 (100 µg/kg, N = 5) e PB-l 20 (100 µg/kg, N = 5). SoIução salina e drogas ioram injetados respectivamente r subcuneamente em dias alternados para cada um por três vezes sucessivas. O peso
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6 ç .< corporal e a mudança da ingestão de alimentos nos camundongos foram observados g r diariamente. » A curva traçada usando pontos de tempo para a linha x e o peso corporal dos camundongos para a linha y (figura 41A) mostrou que q peso corporal dos camundongos no 5 grupo salino aumentou continuamente durante a dosagem (o peso corporal aumentou em 33,4°6 durante 9 dias do experimento). O peso corporal (por peso corporai-tempo AUC como um indicador) diminuiu em aproximadamente 5,3% (p<O,05) 9 dias após tres sucessivas dosagens de PB-105 (100 µg/kg), comparado com q grupo salino.
Dosagem de uma quantidade equivalente de PB-106, de PB-119 e de PB-120 conduziu a uma maior 10 redução de peso corporal do que PB-105. O peso corporal (por peso corporal-tempo AUC como um indicador) diminuiu respectivamente em aproximadamente 7%, 8°6 e 8% (p <0,05) no caso da dosagem de PB-106, PB-119 e PB-120, comparado com a dosagem de PB-105. A curva traçada usando pontos de tempo para a linha x e uma quantidade da ingestão de alimentos por camundongos para a Iinha y (figura 41B) mostrou que a 15 quantidade da ingestão de aiimentos por camundorigos no grupo salinc permarieceu substancialmente durante a dosagem.
A quantidade da ingestão de alimentos (em quantidade-tempo AUC da ingestão de alimentos como um indicador) diminuiu em aproximadamente 16% após três doses sucessivas de PB-105 (100 µg/kg), comparada com o grupo salino.
Dosagem de uma quantidade equivalente de PB-106, PB-119 e PB-120 20 conduziu a uma maior redução da ingestão de alimentos do que PB-105. É bem conhecido que a Exenatida pode reduzir o peso corporal em pacientes obesos e induzir a resposta de nausea e vômito, onde os mecanismos de sua ação é associado com a inibição do centro de alimentação do sistema nervoso central e ativação do centro de vômito (Larsen.
Mechanisms behind GLP-l induced weight loss, Br J Diabetes ' 25 Vasc Dis 2008; 8 (Suppl 2): S34—S41; Schick et al.
Glucagonlike peptide 1 (7-36)- amide acts at lateral and medial hypothalamic sites to suppress feeding in rats.
Am j Physiol Regul lntegr Comp Physiol 2003;284:R1427-35). Entretanto, 0$ conjugados de Exendina ou de variantes desta são difíceis de passar através da barreira sangue-cérebro devido ao peso mdecular ampliado, e assim podem reduzir a resposta de vômito induzida 30 por P8-101 (veja o exemplo 22). Consequentemente, antes do começo deste estudo, o depositante esperou que essa Exendina ou variantes destas reduziriam o efeito da Exendina na redução da ingestão de alimentos e do peso corporal que Íoi intermediado pelo sistema neNoso central.
Entretanto, o depositante descobriu surpreendentemente que os conjugados do PEG de Exendina ou sua variante tiveram o efeito significativamente 35 aumentado na redução da ingestão de alimentos e do peso corporal, embora a Exendina do tipo selvagem e a variante de Exendina não conjugada ambas reduziram a ingestão alimentos e o peso corporal.
0 \ m '" '? 56/58 g '·" ? . ·£ .. Exemplo 25. Experimentos Farmacocinéticos de PB-1O1 e PB-105 2 V Ratos SD masculinos (peso corporal: 250-300 g, comprados do Shanghai Lab f Animal Center, Chinese Science Academy) foram anestesiados aplicando hidrato de cioral 30 % (300 mg/kg, i.p.). A cateterização da artéria femoral e da veia foi realizada incisando 5 na borda direita superior da grande virilha e dissecando a artéria femoral e veia (tubo de polietileno PE50, U.S- Becton Dickinson Corporation). O cateter da artéria direita foi usado para a amostragem de sangue, e o cateter da veia direita foi usado para dosagem. O tubo PE-50 foi conduzido do pescoço para trás com subcutanea dorsal. O cateter foi preenchido com a solução de heparina (200 U/ml), e a incisão foi suturada. Após a operação, os ratos 10 foram colocados em gaiolas separadas, e recuperados por mais de 12 horas. Os ratos com cateteres estavam livres para movimentos e dietas nas gaiolas. Os ratos foram distribuldos no grupo PB-1O1 e no grupo PB-105 (3-6 ratos em cada grupo). 5 µg/kg do agente foi aplicado pela injeção de poIus na veia femoral direita. As amostras de sangue foram tomadas respectivamente em 0.08, 0.25, 0,5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6 horas após a dosagem.
15 As amostras de sangue foram colocadas no tubo Eppendorf e centrifugadas para a preparação do plasma (5000 RPM, 5 min), e armazenadas a -20 °C até o uso. A concentração de drogas nas amostras foi detetminada pelo kit de Exenatida a EÍA (Phoenix Pharmaceuticals, lnc USA) após a preparação completa de cada grupa de amostras do plasma. Curvas de droga-tempo de PB-1O1 e de PB-105 foram traçadas usando a 20 concentração do pIasma' para a linha y e o tempo para a linha x. Os resultados mostraram que PB-105 e P8-101 tiveram a distribuição e o afastamento similares nos ratos.
A análise estatlstica do parâmetro do método não-compartamental foi realizada empregando o software Kinetica 5.0 (Thermo Fisher Scientific lnc., EUA), para calcular parâmetros farmacocinéticos de PB-lOl e PB-105 (Cm,,,, AÜCq ,, AÜCq--, t1/2, MRT, CL and 25 V,,, etc.). Os resultados foram mostrados na tabela 4. A meia-vida plasmática de PB-lOl e de PB-105foirespectivamente4,8± 0,7e4,9 ± 1,4 horas(P8-105vs PB-1O1, P > 0,05). Ea área sob a curva de curvas de droga-tempo foi respectivamente 45,4 ± 1,6 e 47,9 ± 19,0 ng*hr/ml (PB-105 vs P8-101, P > 0,05). Os resultados experimentais mostraram que PB-105 e PB-lOl tiveram propriedades farmacocinéticas simiiares.
30 Tabela 4. Parâmetros farmacocinéticos de PB-lOl e PB-105 (3-6 ratos em cada grupo).
N Cma, (ng/ml) AUCo-, (ng*h/ml) AUCo - (ng*h/ml) PB-1O1 3 33.0±2.0 45.4±1.6 85.2±4.4 PB-105 6 36.8±10.6 47.9±19.0 103.8±51.1
*
£ -? , ¶ .± 57/58 E %" G· -, $ 2 'g T1/2 (h) MRT (h) CL (ml/(h*kg)) Vss (ml/kg)
g Vti PB-1O1 4.8±0.7 6.9±0.7 " 59.0±3.1 403.2±21.3
PB-105 4.9±1.4 7.2±2.2 117.7+58.5 563.8±186.1
Exemplo 26. Experimento da farmacocinética do conjugado de PB-105 e do . PEGuilado deste Ratos masculinos SD (peso corporal: 250-300 g, comprado do Shanghai Lab Animal Center, Chinese Science Academy) foram anestesiados aplicando o hidrato de 5 cloral 30% (300 mg/kg, i.p.). O cateterismo da artéria femoral e da veia foi realizado incisando na borda direita superior da grande virilha e dissecando a artéria femoral e veia (tubo do polietileno PE50, U.S.
Becton Dickinson Corporation). Cateter da artéria direita foi usado para a amostragem do sangue, e o cateter da veia direita foi usado para dosagem.
O tubo PE-50 foi conduzido do pescoço para trás com subcutanea dorsal.
O cateter foi 10 preenchido com a solução de heparina (200 U/ml), e a incisão foi suturada.
Após a operação, os ratos foram colocados.em gaiolas separadas, e recuperados por mais de 12 horas.
Os ratos com cateteres estavam livres para movimentos e dietas nas gaiolas.
Os ratos foram distribuídos em 6 grupos (3 ratos em cada grupo): PB-105, PB-11O,PB-106, PB- 107, PB-108 e PB-109. 5 µg/kg do agente foram aplicados pela injeção de polus na veia 15 femoral direita, e 0,2 ml de sangue foram tomados em pontos diferentes de tempo.
Para as primeiras 48 horas após a dosagem, a amostragem do sangue foi realizada usando o tubci PE50, e após 48 horas, a amostragem do sangue foi realizada pelo sangramento da veia da cauda.
Especificamente, grupo PB-105 0.08, 0.25, 0-5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6 horas após dosagem), grupo PB-11O (0.08, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 horas após 20 dosagem), grupo PB-106 (0.08, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 horas após dosagem), grupo PB-107 (0.08, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, ' 108, 120, 132, 144 horas após dosagem), grupos PB108 e PB109 (0.08, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156, 168 horas após dosagem). As amostras de sangue foram . colocadas no tubo de Eppendorf e 25 centrifugadas para a preparação do plasma (5000 RPM, 5 min), e armazenadas a -20 °C até o uso.
A concentração de drogas nas amostras foi determinada pelo kit de Exenatida EIA (Phoenix Pharmaceuticals, lnc.
USA) apÓs a preparação completa de cada grupo de amostras do plasma.
As curvas de droga-tempo de conjugado PEGuilado foram traçadas usando a concentração do plasma na linha y e o tempo para 30 a linha x.
Os resultados mostraram que os conjugados de PB-105 e do PEGuilado exibiram a distribuição rápida e o afastamento Ientc (veja figura 43). A anáfise estatlstica do parâmetro do método não-compartmental foi reafizada empregando o software Kinetica 5.0 (Thermo Fisher Scientific lnc., USA), para calcular q \ à' , ' °.f _ . 58/58 " e"' e "qÈ zZ ,. ' , Y, parâmetros farmacofineticos de conjugado de PB-105 e de PEGuilados destes (Cmax, 4 ' çí AUCo ,, AUC,,--, ttp, MRT, CL and V,,, etc.). Os resulfados foram mostrados na tabela
5. A meia-vida plasmática de PB-105 foi 2,9±0,1 horas, e meia-vida plasmática do conjugado de PEGuilado foi aumentado com o aumento do peso molecular do PEG. A 5 área sob a curva da curva de droga-tempo de PB-105 foi 18,2±1,9 ng*hr/ml, e a área sob a curva da curva de droga-tempo do conjugado PEGuilado foi aumentada com o aumento do peso molecular do PEG. As figuras 44A e 44B mostraram respectivamente a relação entre o peso molecular do PEG e o conjugado PEGuilado e a meia-vida plasmática, área sob a curva da curva de droga-tempo. 10 Tabela 5. Parâmetros farmacocinéticos de PB-105 e de conjugados PEGuilados destes (3 ratos em cada grupo) Cm,x (ng/ml) AUCw (ng*hr/ml) AUCo-- (ng*hr/ml) PB-105 23.0±2.8 18.2±1.9 24.5±2.2 ,P8-110 76.1±14.5 101.0±25.8 · 165.5±45.3 PB-106 149.2±5.7 942.5±84.6 1146.0±65.2 'PB-107 128.2±15.5 1485.2±123.0 1879.3±82.1 PB-108 148.1±24.5 1780.7±279.9 2202.5±318.8 PB 109 240-1+20 9 5478 8+654 3 7033.4±861 .6 T1,2 (hr) MRT (hr) CL (ml/hr*kg) Yss (ml/kg) PB-105 2.9±0.1 4.1±0.2 207.8±20.9 846,3+79.0 PB-11O 6.1±0.8 9.6+1.0 37.5+13.5 340,1±92.9 jp8-106 42.6±8.1 47.3±11.6 4.4±0.3 209.0±57.3 jP8-107 70.5±2.6 75.3±9.5 2.7±0.1 201.6±27.3 !PB-108 74.8±4.5 90-2±10.2 2.3±0.3 193.6±50.0 PB-109 103.6±2.4 102.0±6.8 0.7±0.1 74.8±10.4 As variantes de Exendina de acordo com a presente invenção melhoraram as propriedades farmacocinéticàs, reduzem significativamente a glicose sanguínea, e apresentam atividades biológicas comparáveis ou melhores. Os conjugado das variantes de 15 Exendina que são sÍtio-especificamente acoplados aos po1Ímeros através do tiolato nas cistelnas prolongam signlficativamente a meia-vida de variantes de Exendina e permanecem com a atividade biológica elevada. A presente invenção foi ilustrada por exemplos específicos. Entretanto, um técnico no assunto pode compreender que a presente invenção não está limitada aos exemplos 20 específicos, e um técnico no assunto pode fazer alguma variação Olj modificação no escopo da presente invenção sem sair do esplrito e do escopo da presente invenção. Esta variação e modificação estão no escopo da presente invenção.

Claims (13)

  1. REIVINDICAÇÕES ' 1. Conjugado da variante de Exendina apresentando a atividade do agonista do receptor do GLP-l, caracterizado pelo fato que uma ou mais frações do polímero são conjugadas à variante de Exendina e particularmente ao resíduo de cisteína da 5 variante de Exendina, e que uma ou mais frações de Exendina (apresentam)têm um peso molecular de 5 KDa a 40 kOa, preferencialmente de 20 kDa a 40 kDa, e mais preferencialmente de 20 kDa a 35 kDa.
  2. 2. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que uma ou mais frações do pollmero (apresentam)têm um peso molecular de 20 kOa a 30 klja, por exemplo, de 21 kOa a 29 klja, ou de 23 kOa a 27 kDa
  3. 3. Conjugado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato que a variante de Exendina apresenta uma sequência de aminoácido na qual um ou mais resíduos são substituídos pela cistelna, em comparação com a sequência do tipo selvagem da Exendina, preferencialmente a sequência do tipo selvagem da Exendina é selecionada do grupo que consiste de: sequência da Exendina-4 His-Gly-Glu-Gly-Thr- Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-G|u-G|u-Glu-A|a-Va|-Arg-LeU-Phe-||e-G|u-Trp- Leu-Lys-Asn-G|y-Gly-Pro-Ser-Ser-G|y-A|a-Pro-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 1), sequência da Exendina-3 His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp'-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu- G|u-A|a-Va|-Arg-Leu-Phe-[le-G|u-Trp-Leu-Lys-Asn-G|y-G|y-Pro-Ser-Ser-G|y-A|a-Pro- Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO: 2).
  4. 4. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato que a variante de Exendina apresenta uma substituição de cisteína no terminal C da variante da Exendina, preferencialmente apresenta uma substituição de cisteína ·nas posições correspondendo a Ser na posição 39 da SEQ ID NO:l ou SEQ ID NO: 2.
  5. 5. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato que a variante de Exendina apresenta a sequência selecionada do grupo que consiste de: His-G|y-Glu-G|y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gfn-Met-G|u-g|u-glU-A|a- Vaf-Arg-Leu-Phe-lle-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn- G|y-Gly-Pro-Ser-Ser-G|y-A|a-Pro-PrD-prc- Cys (SEQ ID NO: 3); His-G|y-G|u-G|y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-G|n-Met-Glu-g|u-g|u-A|a- Va|-Arg-Leu-Phe-||e-G|u-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-G|y-Prc-Ser-Ser-G|y-Cys-pro-pro-pro- Ser(SEQ ID NO: 4); His-G|y-GlU-G|y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-g|u-glu-g|u-A|a- Va|-Arg-Leu-Phe-lle-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-G|y-Cys-Pro-Ser-Ser-g|y-A|a-pro-pro-pro- Ser (SEQ ID NO: 5);
  6. "7 . 2 ãç 2/2 ê è" £ ' -e His-g|y-g!u-g|y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-G|n-Met-Glu-Glu-G|u-A|a- . .1 $' Va|-Arg-Leu-Phe-l|e-G|u-Cys-LeU-Lys-Asn-Gly-G|y-Pro-Ser-Ser-Gty-A|a-Pro-Pro-Pro- Ser(SEQ ID NO: 6): His-Gly-G|u-G|y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-G|n-Met-G|u-G|u-G|u-A|a- 5 Va|-Arg-Leu-Phe-|ie-G|u-Trp-Leu-Lys-Asn-G|y-Gly-Pro-Ser-Ser-G|y-A|a-Pro-Pro-Pro- Cys-Tyr (SEQ ID NO : 7); ou His-dA1a-G|u-G|y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-G|n-Met-G|u-Giu-G|u-A|a- Va|-Arg-Leu-Phe-|le-G|u-Trp-Leu-Lys-Asn-G!y-G|y-Pro-Ser-Ser-G|y-A|a-Pro-Pro-Pro- Cys (SEQ ID NO: 8). 10 6. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato que uma ou mais frações de poIímeros são cada uma independentemente polietilenoglicol.
  7. 7. Método para preparar o conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato que compreende contatar uma variante de 15 Exendina com um po1Ímero.
  8. 8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato que compreende uma quantidade eficaz do conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e opcionalmente um veiculo farmacêutico aceitável.
  9. 9. Uso do conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, '20 caracterizado pelo fato que é para a produção de um medicamento para reduzir a glicose sanguínea.
  10. 10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato que o medicamento é utilizadc no tratamento da diabete, incluindo a diabete tipo 1 e tipo 2, em particular a diabete tipo 2. 25
  11. 11. Kit, caracterizado pelo fato que compreende o conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e instruções para o uso.
  12. 12. Uso de Exendina ou uma variante desta conjugada a uma ou mais frações do polímero, caracterizado pelo fato que é para a produção de um medicamento para a redução do peso corporal, onde uma ou mais frações do polímero são 30 preferencialmente frações de polietilenogHcoL
  13. 13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracteriZado pelo fato que o conjugado da Exendina ou a variante desta é conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
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