JP6581606B2 - 選択的グルカゴン受容体アゴニストとしてのエキセンジン−４誘導体 - Google Patents

Description

本発明は、グルカゴン受容体を活性化するエキセンジン−４ペプチドアナログ、およびそれらの医薬としての使用、例えば重度の低血糖の治療における使用に関する。

エキセンジン−４は、アメリカドクトカゲ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ）の唾液腺で産生される、アミノ酸３９個のペプチドである（非特許文献１）。エキセンジン−４は、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体の活性化剤であるが、グルカゴン受容体を有意に活性化しない。

エキセンジン−４のアミノ酸配列を配列番号１として示す。
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ_２

グルカゴンは、循環しているグルコースが少ない場合に血流中に放出される、アミノ酸２９個のペプチドである。グルカゴンのアミノ酸配列を配列番号２として示す。
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ−ＯＨ

低血糖の間、すなわち血糖値が通常未満に降下している時、グルカゴンは肝臓に、グリコーゲンを分解しグルコースを放出するよう信号を送り、通常レベルに達するように血糖値を増加させる。低血糖は、血糖値の上昇によりインスリンでの治療を受けている糖尿病患者における、一般的な副作用である。このように、グルコース調節におけるグルカゴンの最も主要な役割は、インスリンの作用に対抗し、血糖値を維持することである。

グルカゴンは約７に等電点を有し、したがってｐＨ範囲４〜８でのみ溶解しにくい（０．２ｍｇ／ｍｌ未満）。ｐＨ値３未満または９超では十分に溶解する（１０ｍｇ／ｍｌ超）（非特許文献２）。結果として、現在利用可能な市販のグルカゴン溶液（ＧｌｕｃａＧｅｎ（登録商標）ＨｙｐｏＫｉｔ、グルカゴン救急救命キット）は酸性であり、グルカゴンが低ｐＨ溶液中では化学的および生物物理学的に不安定であるため使用前に新しく調製する必要がある（非特許文献３）。

市販のキット溶液と比較して、増強された安定性を有するグルカゴン製剤の調製については、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８および特許文献９の特許出願に記載されており、これらの内容を参照によって本明細書に組み入れる。

安定化されたグルカゴンアナログの製造については、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３および特許文献１４の特許出願に記載されており、これらの内容を参照によって本明細書に組み入れる。

合成ペプチドの１位に４−チアゾリルアラニンを使用することについては、ＧＬＰ−１受容体アゴニストについての特許文献１５に記載されている。反対に、本発明における４−チアゾリルアラニンは、驚くべきことに、１位に天然ヒスチジンを有するペプチド（天然グルカゴン）と比較して、ＧＬＰ−１受容体における活性が低減した、高度に活性なグルカゴン受容体アゴニストをもたらす。

ＷＯ９９４７１６０ ＷＯ１２０５９７６２ ＵＳ２０１１／００９７３８６ ＵＳ２０１１／０２３７５１０ ＵＳ２０１１／０４９７１３ ＷＯ１２０１２４６０ ＷＯ１２１２２５３５ ＵＳ２０１２／００７１８１７ ＷＯ１３１０１７４９ ＷＯ１４０１６３００ ＷＯ１１０４９７１３ ＷＯ０７０５６３６２ ＷＯ０８０８６０８６ ＷＯ０９１５５２５７ ＷＯ０７１４０２８４

Ｅｎｇ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：７４０２〜０５頁、１９９２ Ｂｒｏｍｅｒ，Ｗ．Ｗ．、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ６６／１、１９８３頁 Ｊｏｓｈｉ，Ａ．Ｂ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈ．Ｓｃｉ．、２０３、１１５〜１２５頁、２０００

グルカゴン受容体を強力かつ選択的に活性化し、天然グルカゴンと比較して、中性ｐＨ付近でのより高い溶解性、および溶液中での増強された化学的安定性を示す、エキセンジン−４アナログが本明細書で提供される。化合物は全て、１位に人工アミノ酸４−チアゾリルアラニンを有する。これが、驚くべきことに、１位のみが異なる（Ｈｉｓの代わりに１位にＴｚａ）同一の化合物を互いに比較した場合、ＧＬＰ１受容体と対比して、グルカゴン受容体に対するより高い選択性をもたらす。したがって本発明は、高度に選択的なグルカゴン受容体アゴニストを提供する。

本発明は、式（Ｉ）：
Ｔｚａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘ１０−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｘ１４−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｘ２９−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｒ^１
（Ｉ）
を有するペプチド化合物であって、
Ｘ１０は、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、フェニルグリシン、１−ナフチルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、シクロヘキシルグリシンおよびｔｅｒｔ−ロイシンから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１４は、ＬｅｕおよびＮｌｅから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２９は、ＧｌｙおよびＴｈｒから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｒ^１は、ＯＨまたはＮＨ_２を表す、
ペプチド化合物、
またはそれらの塩もしくは溶媒和物
を提供する。

本発明の化合物は、グルカゴン受容体に結合するとき細胞内ｃＡＭＰ形成を刺激することができるという観察により決定される、グルカゴン受容体アゴニストである。化合物は、グルカゴン受容体において、天然グルカゴンと比較して少なくとも相対活性０．１％、好ましくは０．５％、より好ましくは１．０％およびさらにより好ましくは１０．０％を示す。

本発明の化合物は、ＧＬＰ１受容体に結合するとき細胞内ｃＡＭＰ形成を刺激することができるという観察により決定される通り、ＧＬＰ１受容体も活性化する。本発明の所与の化合物の活性（ＧＬＰ１受容体におけるＧＬＰ１の活性と比較したその活性で表される）は、グルカゴン受容体における同化合物の活性（グルカゴン受容体におけるグルカゴンの活性と比較した活性で表される）と比較して１０％未満、より好ましくは５％未満、さらにより好ましくは２％未満である。

驚くべきことに、１位に４−チアゾリルアラニンを有する式Ｉのペプチド化合物が、この位置にヒスチジンを有する誘導体と比較して、グルカゴン受容体活性化の増大およびＧＬＰ−１受容体における活性に対する選択性の増大を示すことが判明した。ヒスチジンはグルカゴンの１位に天然に存在するアミノ酸であり、グルカゴン受容体の活性化機構にとって重要であることが示されている（Ｕｎｓｏｎ，Ｃ．Ｇ．ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、３００、７４７〜７５０頁、１９９３）。

さらに、本発明の化合物は、好ましくは酸性および／または生理的ｐＨ値、例えば、２５℃、ｐＨ４．５および／またはｐＨ７．４で、増強された溶解性、好ましくは少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１．０ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは少なくとも１０．０ｍｇ／ｍｌを有する。

さらに、本発明の化合物は、好ましくは、ｐＨ７．３の溶液中５０℃で１４日間保管された場合、高い安定性を有する（実施例に記載のクロマトグラフ分析により決定）。好ましくは、新たに形成される分解生成物が４０％未満、より好ましくは３０％未満、さらにより好ましくは２０％未満である。

一実施形態において、Ｃ末端基Ｒ^１はＮＨ_２である。

さらなる実施形態において、Ｃ末端基Ｒ^１はＯＨである。

さらなる実施形態は、
Ｘ１０はＬｅｕを表し、
Ｘ１４は、ＬｅｕおよびＮｌｅから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２９は、ＧｌｙおよびＴｈｒから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｒ^１はＯＨを表す、
化合物、またはそれらの塩もしくは溶媒和物の群に関する。

さらなる実施形態は、
Ｘ１０はＴｙｒを表し、
Ｘ１４は、ＬｅｕおよびＮｌｅから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２１はＧｌｕを表し、
Ｘ２９は、ＧｌｙおよびＴｈｒから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｒ^１はＯＨを表す、
化合物、またはそれらの塩もしくは溶媒和物の群に関する。

さらなる実施形態は、
Ｘ１０はＶａｌを表し、
Ｘ１４はＬｅｕを表し、
Ｘ２１はＧｌｕを表し、
Ｘ２９は、ＧｌｙおよびＴｈｒから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｒ^１はＯＨを表す、
化合物、またはそれらの塩もしくは溶媒和物の群に関する。

さらなる実施形態は、
Ｘ１０はＩｌｅを表し、
Ｘ１４は、ＬｅｕおよびＮｌｅから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２１はＧｌｕを表し、
Ｘ２９はＴｈｒを表し、
Ｒ^１はＯＨを表す、
化合物、またはそれらの塩もしくは溶媒和物の群に関する。

さらなる実施形態は、
Ｘ１０は１−ナフチルアラニンを表し、
Ｘ１４は、ＬｅｕおよびＮｌｅから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２９はＴｈｒを表し、
Ｒ^１はＯＨを表す、
化合物、またはそれらの塩もしくは溶媒和物の群に関する。

さらなる実施形態は、
Ｘ１０は２−フルオロフェニルアラニンを表し、
Ｘ１４は、ＬｅｕおよびＮｌｅから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２１はＡｓｐを表し、
Ｘ２９はＴｈｒを表し、
Ｒ^１はＯＨを表す、
化合物、またはそれらの塩もしくは溶媒和物の群に関する。

さらなる実施形態は、
Ｘ１０はシクロヘキシルグリシンを表し、
Ｘ１４は、ＬｅｕおよびＮｌｅから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２９はＴｈｒを表し、
Ｒ^１はＯＨを表す、
化合物、またはそれらの塩もしくは溶媒和物の群に関する。

さらなる実施形態は、
Ｘ１０は、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、フェニルグリシン、１−ナフチルアラニン、２−フルオロフェニルアラニンおよびシクロヘキシルグリシンから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１４はＬｅｕを表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２９は、ＧｌｙおよびＴｈｒから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｒ^１はＯＨを表す、
化合物、またはそれらの塩もしくは溶媒和物の群に関する。

さらなる実施形態は、
Ｘ１０は、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、１−ナフチルアラニン、シクロヘキシルグリシンおよびｔｅｒｔ−ロイシンから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１４はＮｌｅを表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２９はＴｈｒを表し、
Ｒ^１はＯＨを表す、
化合物、またはそれらの塩もしくは溶媒和物の群に関する。

さらなる実施形態は、
Ｘ１０は、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、１−ナフチルアラニン、２−フルオロフェニルアラニンおよびシクロヘキシルグリシンから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１４は、ＬｅｕおよびＮｌｅから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２１はＡｓｐを表し、
Ｘ２９はＴｈｒを表し、
Ｒ^１はＯＨを表す、
化合物、またはそれらの塩もしくは溶媒和物の群に関する。

さらなる実施形態は、
Ｘ１０は、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、フェニルグリシン、１−ナフチルアラニン、シクロヘキシルグリシンおよびｔｅｒｔ−ロイシンから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１４は、ＬｅｕおよびＮｌｅから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２１はＧｌｕを表し、
Ｘ２９は、ＧｌｙおよびＴｈｒから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｒ^１はＯＨを表す、
化合物、またはそれらの塩もしくは溶媒和物の群に関する。

さらなる実施形態は、
Ｘ１０は、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、フェニルグリシン、１−ナフチルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、シクロヘキシルグリシンおよびｔｅｒｔ−ロイシンから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１４は、ＬｅｕおよびＮｌｅから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ２９はＴｈｒを表し、
Ｒ^１はＯＨを表す、
化合物、またはそれらの塩もしくは溶媒和物の群に関する。

さらなる実施形態は、
Ｘ１０は、Ｔｙｒ、ＬｅｕおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表し、
Ｘ１４はＬｅｕを表し、
Ｘ２１はＧｌｕを表し、
Ｘ２９はＧｌｙを表し、
Ｒ^１はＯＨを表す、
化合物、またはそれらの塩もしくは溶媒和物の群に関する。

式（Ｉ）のペプチド化合物の特定の例は、配列番号３〜２５の化合物、およびそれらの塩または溶媒和物である。

式（Ｉ）のペプチド化合物の特定の例は、配列番号３、５、６、９、１５、２０、２３、２４および２５の化合物、ならびにそれらの塩または溶媒和物である。

特定の実施形態において、すなわち式（Ｉ）の化合物が遺伝的にコードされるアミノ酸残基を含む場合、本発明は、前記化合物をコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい）、このような核酸を含む発現ベクター、およびこのような核酸または発現ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。

さらなる態様において、本発明は、本発明の化合物を担体との混合物中に含む組成物を提供する。好ましい実施形態において、組成物は薬学的に許容される組成物であり、担体は薬学的に許容される担体である。本発明の化合物は、塩、例えば薬学的に許容される塩、または溶媒和物、例えば水和物の形態であってよい。さらなる態様において、本発明は、医療の方法において、具体的にはヒトに対する医療において使用するための組成物を提供する。

特定の実施形態において、核酸または発現ベクターを、例えば遺伝子治療における治療薬剤として使用することができる。

式（Ｉ）の化合物は、さらなる治療上有効な薬剤がなくとも、治療への適用に適している。しかし、その他の実施形態において、化合物は、「組み合わせ治療」に記載される通り、少なくとも１つのさらなる治療上活性な薬剤とともに使用される。

本発明の化合物およびその製剤は、主に、低血糖を治療するため、血糖値を増加させるため、インスリンを伴う補助療法として使用するだけでなく、β遮断薬およびカルシウムチャネル遮断薬中毒に対する解毒剤として、体重を減少させ、維持するため、ならびに放射線用途のために消化管系の一時的な弛緩を誘起するためにも使用可能である。

末端麻酔したラットにおける、ＧＣＧまたは配列番号５の皮下投与後の血糖の偏位（ｅｘｃｕｒｓｉｏｎ）を示す図である。値は平均値±ＳＥＭ、ｎ＝ラット６〜８匹である。 末端麻酔したラットにおける、ＧＣＧまたは配列番号６の皮下投与後の血糖の偏位を示す図である。値は平均値±ＳＥＭ、ｎ＝ラット６〜８匹である。 イヌにおける、血糖に対し皮下の配列番号５およびヒトグルカゴンが及ぼす効果を示す図である。 イヌにおける、血糖に対し皮下および筋肉内の配列番号５が及ぼす効果を示す図である。 イヌにおける、血糖に対し皮下の配列番号５対配列番号６が及ぼす効果を示す図である。

定義
本発明のアミノ酸配列は、天然に存在するアミノ酸については従来の１文字および３文字記号、Ｎｌｅ（ノルロイシン）などのその他のアミノ酸については一般的に許容される３文字記号を含む。

さらに、以下の記号を表１に示すアミノ酸について使用した：

「天然のエキセンジン−４」という用語は、配列ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ_２（配列番号１）を有する天然のエキセンジン−４を指す。

本発明は、上記で定義されるペプチド化合物を提供する。

本発明のペプチド化合物は、ペプチド、すなわちカルボキシアミド結合により連結されたアミノカルボン酸の直鎖状主鎖を含む。好ましくは、アミノカルボン酸は別に示されない限り、α−アミノカルボン酸、より好ましくはＬ−α−アミノカルボン酸である。ペプチド化合物はアミノカルボン酸３９個の主鎖配列を含む。

疑義を回避するため、本明細書で提供される定義においては、ペプチドの部分の配列が、少なくとも、変化が可能であると明記される位置のうち１つにおいて、天然のエキセンジン−４と異なることが概して意図される。ペプチド部分内のアミノ酸は、従来のＮ末端からＣ末端への方向で、１〜３９まで連続して付番されると考えてよい。したがって、ペプチドの部分内の「位置」への言及は、天然のエキセンジン−４および他の分子内の位置への言及、例えば、エキセンジン−４においては、Ｈｉｓが１位、Ｇｌｙが２位、…、Ｍｅｔが１４位、…Ｓｅｒが３９位、のように構築されるべきである。

さらなる態様において、本発明は、本明細書で記載される本発明の化合物、またはそれらの塩もしくは溶媒和物を、担体との混合物中に含む組成物を提供する。

本発明は、薬剤として使用するための、具体的には本明細書で記載される状態の治療のための、本発明の化合物の使用も提供する。

本発明は、組成物が薬学的に許容される組成物であり、担体が薬学的に許容される担体である、組成物も提供する。

ペプチド合成
当業者は、本発明に記載されるペプチドを製造する様々な異なる方法を知っている。これらの方法には、合成手法および組換え遺伝子発現が含まれるが、これに限定されない。したがって、これらのペプチドを製造する一方法は、溶液中または固体支持体における合成、ならびにその後の単離および精製である。ペプチドを製造する別の方法は、ペプチドをコードするＤＮＡ配列が導入された宿主細胞における遺伝子発現である。代わりに、遺伝子発現を、細胞系を利用することなく実現することもできる。上記の方法は、任意の方法で組み合わせてもよい。

本発明のペプチドを製造する好ましい方法は、適切な樹脂における固相合成法である。固相ペプチド合成は、十分に確立された技法である（例えば：ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．、１９８４；Ｅ．ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＲ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ−ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９を参照のこと）。固相合成法は、切断可能なリンカーを担持する不活性な固体支持体に、Ｎ末端を保護したアミノ酸をそのカルボキシ末端で結合させることにより開始される。この固体支持体は、最初のアミノ酸のカップリングを可能にする任意のポリマー、例えばトリチル樹脂、クロロトリチル樹脂、Ｗａｎｇ樹脂またはＲｉｎｋ樹脂でもよく、そこでのカルボキシ基（または、Ｒｉｎｋ樹脂についてはカルボキシアミド）の樹脂への連結部は酸感受性である（Ｆｍｏｃ戦略を使用する場合）。ポリマー支持体は、ペプチド合成の間、α−アミノ基を脱保護するために使用される条件下で安定でなければならない。

最初のアミノ酸を固体支持体にカップリングした後、このアミノ酸のα−アミノ保護基を除去する。次いで、残存する保護されたアミノ酸を、適切なアミドカップリング試薬、例えばＢＯＰ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵまたはＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）／ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）を使用して、ペプチド配列で表される順序で次々にカップリングする。このとき、ＢＯＰ、ＨＢＴＵおよびＨＡＴＵは三級アミン塩基とともに使用される。代わりに、遊離したＮ−末端をアミノ酸以外の基、例えばカルボン酸などで官能化することもできる。

最終的に、ペプチドは樹脂から切断され脱保護される。これは、Ｋｉｎｇ’ｓカクテルを使用することで実現可能である（Ｄ．Ｓ．Ｋｉｎｇ、Ｃ．Ｇ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３６、１９９０、２５５〜２６６頁）。次いで、必要に応じて原料をクロマトグラフィー、例えば分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製してもよい。

効力
本明細書では、「効力」または「インビトロでの効力」という用語は、細胞ベースのアッセイにおいて、化合物がＧＬＰ−１受容体またはグルカゴン受容体を活性化する能力の尺度である。数値的に、これは、用量反応実験において、反応（例えば、細胞内ｃＡＭＰの形成）の最大の増加の半分を誘起する化合物の有効濃度である「ＥＣ５０値」として表される。

治療用途
本発明の化合物は、グルカゴン受容体のアゴニストである。このようなアゴニストはまず、低血糖を標的とする臨床上の必要性に取り組むという治療上の利益をもたらしうる。

抗高血糖医薬品、例えばインスリン治療により誘起される低血糖は、血糖コントロールを維持するためのＴ１ＤＭおよびＴ２ＤＭ治療における重大なリスクである。厳格なグルコースコントロールを実現しようとすると、外来患者および救命医療環境における低血糖リスクが増大しうる。健康な状態では、空腹時血漿グルコース濃度は通常、７０ｍｇ／ｄＬ超である。血中糖値がこの閾値未満に降下すると、まだ自分で治療可能な症状を伴う、軽度の低血糖が最初に発症する。これらの症状には、脱力感、眠気、めまい、かすみ目または悲愴感および不幸感が含まれる。低血糖の症状は患者の年齢によっても決まり、高齢者では主に神経性のものであり、子供では挙動の変化が頻繁に観察される。夜間の低血糖イベントにより、朝の頭痛、質の悪い眠り、鮮明な夢、悪夢、就寝中の大量の発汗および落ち着きのない挙動がもたらされる可能性がある。夜間の低血糖中の夢遊病も報告されている。血中糖値がさらに降下すると、重度の低血糖イベントが結果として生じる可能性がある。重度の低血糖は血清グルコース値４０〜５０ｍｇ／ｄＬ未満を伴い、このイベントは、他の人の支援が必要な、発作または昏睡などの神経低血糖症の症状をもたらす可能性がある。低血糖は脳に影響し、錯乱（異常な挙動または両方、例えば定型業務を遂行することができないなど）、視覚障害、発作および時として意識消失をもたらす可能性がある。低血糖が頻繁に発生すると自覚が低下し、したがって重度の低血糖リスクが有意に増加しうる。深刻かつ長期の重度の低血糖は死をもたらす可能性があり、低血糖誘起による死亡の原因となる有力な機構には、脳死および心不整脈が含まれる。平均すると、Ｔ１ＤＭの患者は、１週間あたり２回の症候性低血糖エピソード、および１年間あたり１回の重度の低血糖エピソードを経験する。インスリンによる治療を受けているＴ２ＤＭ患者における低血糖発症率は、Ｔ１ＤＭで見られた発症率の約３分の１である。この数字は、より長期のインスリン治療を受けている患者、併存症の発症、および患者の年齢において増加しうる。

低血糖の治療は、低血糖イベントの期間および強度によって決まる。軽度および中度の低血糖は、糖を含む飲料または食品を飲むか食べるかすることにより、自分で容易に治療することができる。一方、重度の低血糖は別の人の助けが必要である。糖質の静脈内施用は医療専門家に限定されているが、救命医薬品としてのグルカゴン投与は、皮下または筋肉内注射のいずれかにより、任意の熟練者が実施することができる。グルカゴンは、膵臓のα細胞で産生され、循環しているグルコースが少ない場合に血流中に放出されるペプチドホルモンである。インスリンの効果と反対の効果を有する膵島ホルモンとして、グルカゴンは、低血糖状態を回避するように糖新生およびグリコーゲン分解を刺激（同時に解糖系およびグリコーゲン合成を阻害）することにより、血糖値を上昇させている。

市販のグルカゴン救急キット２種が、重度の低血糖用の救命医薬品として承認されている。Ｇｌｕｃａｇｏｎ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ Ｋｉｔ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）およびＧｌｕｃａＧｅｎ（登録商標）Ｈｙｐｏｋｉｔ（登録商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ、Ｂａｇｓｖａｒｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）である。これらのキットは、グルカゴン粉末のバイアル、および溶媒で充填されたシリンジを含む。グルカゴンキットは使用前に再溶解の必要がある。溶媒をシリンジからバイアルに移し、固体が全て溶解するまでバイアルを振る。次いで溶液をシリンジに戻し、シリンジ中の気泡を除去した後に、キットは脚部または腹部への投与準備が整う。推奨される用量は、成人、および体重２５ｋｇ超の子供、および年齢６〜８才以上の子供では、滅菌水１ｍＬ中グルカゴン１ｍｇである。２５ｋｇ未満または年齢６〜８才未満の子供では、用量の半分（０．５ｍＬ）が推奨される。

市販のグルカゴン製品両方についてのＦＤＡ承認済みの説明書は、凍結乾燥粉末を水溶液中に再溶解した後、即時使用することのみを許可している。凍結乾燥粉末を慎重に溶解させ、注射を遂行するという様々な工程を含む複雑な手順のため、緊急事態の場合、患者の介護人または身内が、これらの製品を患者に投与する必要がある。これらの必要条件に基づき、グルカゴンは、低血糖を即時に改善するという利益が立証されているにもかかわらず、依然として十分に活用されていない治療手法のままである。

本発明に記載される、溶液中の安定性が改良されたグルカゴン受容体アゴニスト製品は、患者の自己注射に適したすぐに使えるペンデバイスを有効にすることができよう。救命医薬品としての有益性にとどまらず、このような製品は、グルコース最適化のためのインスリン対抗品として、治療構成要素となる機会を提供できよう。

際立った用途は、インスリンおよび本発明に記載されるグルカゴン受容体アゴニストを複式ポンプで送達する、自動クローズドループ人工膵臓制御システムにおける使用であってよい。このような埋込式のシステムが皮下で血糖を測定し、グルコースレベルを通常のレベルに戻すため、インスリンが患者に与えられる。対照的に、安定化されたグルカゴン受容体アゴニストが、グルコースレベルが低くなりすぎるのを防止するため、人工膵臓システムにより投与される。

したがって、本発明の化合物は、軽度から中度の低血糖の治療のため、または重度の低血糖イベントにおいて使用可能である。さらに、以下の種類の低血糖：抗糖尿病治療、例えばインスリン治療により誘起されるもの、反応性または食後低血糖、空腹時低血糖、アルコール誘起による低血糖、胃バイパス術後低血糖、非糖尿病性低血糖および妊娠関連性低血糖などは、本発明の化合物により治療できよう。

上記で概説される通り、グルカゴンは、インスリンの効果と反対の急性効果を有するホルモンであり、低血糖状態を回避するために、糖新生およびグリコーゲン分解を刺激することにより、血糖値を上昇させる。しかし、げっ歯類およびヒトにおける最近のデータにより、グルカゴンがエネルギー収支、体脂肪量および栄養摂取に対しても有益な効果を有しえたことが明らかとなっている。したがって、本発明の化合物は、低血糖の治療にとどまらず、様々な状態または障害に使用可能である。本発明の化合物は、他の治療活性な薬物と組み合わせて使用可能である。関連する治療用途は、急性、慢性双方の低血糖、２型糖尿病の治療または予防、前糖尿病から、２型糖尿病、例えば耐糖能障害および／または空腹時血糖異常の状態、妊娠糖尿病、１型糖尿病、肥満、肥満に至る過体重を伴う疾患、メタボリックシンドローム／糖尿肥満、心血管疾患への進行の遅延、摂食障害例えば過食症の治療における食欲および満腹の調節、ならびに減量成功後に減少した体重の維持を含む。

症候性徐脈および低血圧が存在するβ遮断薬中毒の場合には、高用量グルカゴンが第一選択の解毒剤と考えられる。したがって、本発明の化合物の注射は、β遮断薬およびカルシウムチャネル遮断薬の過剰投与における防御として使用可能である。

グルカゴンの肝外での効果は、胃、十二指腸、小腸および大腸を含む胃腸管の平滑筋細胞の弛緩である。本発明の化合物およびその医薬製剤は、胃腸管用の画像診断技術、例えばＸ線撮影、ＣＴスキャン、超音波検査、ＭＲＩ画像法および核医学画像法と組み合わせて、平滑筋細胞弛緩薬として使用可能である。

したがって、本発明の化合物およびその製剤は、低血糖を治療するため、血糖値を増加させるため、インスリンを伴う補助療法として、体重を減少させ、維持するため、β遮断薬およびカルシウムチャネル遮断薬の中毒に対する解毒剤として、ならびに放射線用途のために消化管系の一時的な弛緩を誘起するために使用可能である。

医薬組成物
「医薬組成物」という用語は、混合されると共存でき、投与しうる成分を含む混合物を示す。医薬組成物は、１つまたはそれ以上の医薬品を含んでもよい。さらに、医薬組成物は、活性な成分であると考えられるか不活性な成分であると考えられるかに関わらず、担体、溶媒、補助剤、軟化剤、増量剤、安定剤および他の成分を含んでもよい。医薬組成物製造の熟練者用の案内が、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、（２０版）Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ Ａ．Ｒ．編、２０００、Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓに見られる。

本発明のエキセンジン−４ペプチド誘導体またはそれらの塩は、医薬組成物の一部としての、許容される医薬担体、希釈剤または賦形剤と併せて投与される。「薬学的に許容される担体」は、ともに投与される物質の治療特性を保持しつつ、生理的に許容される担体である。標準的な許容される医薬担体およびそれらの製剤は当業者に公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、（２０版）Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ Ａ．Ｒ．編、２０００、Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓに記載されている。例示的な薬学的に許容される一担体は生理食塩水である。

許容される医薬担体または希釈剤は、経口、経直腸、経鼻または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内および経皮を含む）投与に適した製剤に使用されるものを含む。本発明の化合物は、典型的には非経口的に投与される。

「塩」または「薬学的に許容される塩」という用語は、哺乳類に使用するのに安全かつ有効な、本発明の化合物の塩を意味する。薬学的に許容される塩には、酸付加塩および塩基性塩を含めてよいが、これに限定されない。酸付加塩の例には塩化物、硫酸、硫酸水素、リン酸（水素）、酢酸、クエン酸、トシル酸またはメシル酸の各塩が含まれる。塩基性塩の例には、無機陽イオン塩、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウムまたはカルシウムの各塩などのアルカリまたはアルカリ土類金属塩、およびアミン塩などの有機陽イオン塩が含まれる。薬学的に許容される塩のさらなる例が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、（２０版）Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ Ａ．Ｒ．編、２０００、Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、またはＶｅｒｌａｇ Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、Ｚｕｒｉｃｈ、ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄおよびＷｉｌｅｙ−ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙにより共同で出版されたＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ， Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ、Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ、Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ編、２００２に記載されている。

「溶媒和物」という用語は、本発明の化合物またはその塩の、溶媒分子、例えば有機溶媒分子および／または水との錯体を意味する。

化合物の「治療上有効な量」という用語は、毒性はないが、望ましい効果をもたらすのに十分な化合物の量を指す。望ましい生物学的効果を実現するのに必要な式（Ｉ）の化合物の量は、複数の因子、例えば、選択された特定の化合物、意図される用途、投与様式および患者の臨床状態によって決まる。任意の各場合における適切な「有効な」量は、通常の実験法を使用して、当業者が決定することができる。

本発明の医薬組成物は、非経口（例えば皮下、筋肉内、皮内または静脈内）、経口、経直腸、局所および経口（例えば舌下）投与に適したものであるが、最も適切な投与様式は、個々の場合で、治療される予定の状態の性質および重症度、ならびに各場合で使用される式（Ｉ）の化合物の性質によって決まる。

適切な医薬組成物は、独立した単位、例えばカプセル剤、錠剤、およびバイアルまたはアンプル中の散剤の形態であってよく、それぞれが、散剤もしくは顆粒剤として；水性もしくは非水性液体中の液剤もしくは懸濁剤として；または水中油型もしくは油中水型乳剤として、明記した量の化合物を含む。組成物は、単回用量の注射可能な形態、例えばペンの形態で提供可能である。組成物は、既に言及された通り、活性な成分および担体（１つまたはそれ以上のさらなる成分からなっていてよい）を接触させる工程を含む、任意の適切な薬学的方法により製造可能である。

組み合わせ治療
低血糖イベント用の医薬品としての使用に加えて、本発明の化合物であるグルカゴン受容体アゴニストは、Ｒｏｔｅ Ｌｉｓｔｅ ２０１４で言及される全ての薬物などの、他の薬理学的に活性な化合物、例えばＲｏｔｅ Ｌｉｓｔｅ ２０１４の１２章で言及される全ての抗糖尿病薬、Ｒｏｔｅ Ｌｉｓｔｅ ２０１４の１章で言及される全ての減量薬もしくは食欲抑制薬、Ｒｏｔｅ Ｌｉｓｔｅ ２０１４の５８章で言及される全ての脂質低下薬、Ｒｏｔｅ Ｌｉｓｔｅ ２０１４で言及される全ての降圧薬および腎臓保護薬、またはＲｏｔｅ Ｌｉｓｔｅ ２０１４の３６章で言及される全ての利尿薬と広く組み合わせることができる。

活性成分の組み合わせは、特に作用の相乗的改善のために使用可能である。これらは、患者に活性成分を別々に投与することによっても、複数の活性成分が１つの医薬製剤中に存在する組み合わせ製品の形態でも施用可能である。活性成分を、活性成分を別々に投与することにより投与する場合、これを同時にまたは連続して行うことができる。

以下で言及される活性成分の大部分が、ＵＳＰ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ ＵＳＡＮ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇ Ｎａｍｅｓ、ＵＳ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ２０１１に開示されている。

このような組み合わせに適した他の活性物質には、具体的には、例えば、上記の兆候のうち１つに関して、１つもしくはそれ以上の活性物質に治療効果を付加するもの、および／または１つもしくはそれ以上の活性物質の投与量を低減させるものが含まれる。

組み合わせに適した治療薬剤には、例えば、抗糖尿病薬：
インスリンおよびインスリン誘導体、例えば：グラルギン／Ｌａｎｔｕｓ（登録商標）（ｗｗｗ．ｌａｎｔｕｓ．ｃｏｍを参照のこと）、グルリジン／Ａｐｉｄｒａ（登録商標）、デテミル／Ｌｅｖｅｍｉｒ（登録商標）、リスプロ／Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）／Ｌｉｐｒｏｌｏｇ（登録商標）、デグルテク／デグルテクプラス、アスパルト、基礎インスリンおよびアナログ（例えばＬＹ２９６３０１６）、ペグ化インスリンリスプロ（ＬＹ２６０５５４１）、Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）、リンジェッタ（Ｌｉｎｊｅｔａ）、ＳｕｌｉＸｅｎ（登録商標）、ＮＮ１０４５、インスリンおよびシムリン、即効性かつ短時間作用性のインスリン（例えばリンジェッタ、ＰＨ２０、ＮＮ１２１８、ヒンスベット（ＨｉｎｓＢｅｔ））、（ＡＰＣ−００２）ヒドロゲル、経口、吸入、経皮および舌下インスリン（例えばＥｘｕｂｅｒａ（登録商標）、Ｎａｓｕｌｉｎ（登録商標）、アフレッザ、トレゴピル（Ｔｒｅｇｏｐｉｌ）、ＴＰＭ ０２、カプスリン（Ｃａｐｓｕｌｉｎ）、Ｏｒａｌ−ｌｙｎ（登録商標）、Ｃｏｂａｌａｍｉｎ（登録商標）経口インスリン、ＯＲＭＤ−０８０１、ＮＮ１９５３、ビアタブ（ＶＩＡｔａｂ））
などが含まれる。さらに、ＨＭ１２４６０Ａ（ＬＡＰＳインスリン）などの、二官能性リンカーによりアルブミンまたは別のタンパク質に結合されるそれらのインスリン誘導体も含まれる。

ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１アナログおよびＧＬＰ−１受容体アゴニスト、例えば：リキシセナチド／ＡＶＥ００１０／ＺＰ１０／リキスミア、エキセナチド／エキセンジン−４／バイエッタ／ビデュリオン／ＩＴＣＡ６５０、リラグルチド／ビクトーザ、セマグルチド、タスポグルチド、アルビグルチド、デュラグルチド、ｒエキセンジン−４、ＣＪＣ−１１３４−ＰＣ、ＰＢ−１０２３、ＴＴＰ−０５４、ＨＭ−１１２６０Ｃ、ＣＭ−３、ＧＬＰ−１エリゲン（Ｅｌｉｇｅｎ）、ＯＲＭＤ−０９０１、ＮＮ−９９２４、ノデキセン（Ｎｏｄｅｘｅｎ）、ビアドール（Ｖｉａｄｏｒ）−ＧＬＰ−１、ＣＶＸ−０９６、ＺＹＯＧ−１、ＺＹＤ−１、ＭＡＲ−７０１、ＺＰ−２９２９、ＺＰ−３０２２、ＣＡＭ−２０３６、ＤＡ−１５８６４、ＡＲＩ−２６５１、ＡＲＩ−２２５５、エキセナチド−ＸＴＥＮおよびグルカゴン−Ｘｔｅｎ、ＭＡＲ７０９、ＨＭ１５２５Ａ、デュアルＧＬＰ１Ｒ／グルカゴンＲアゴニスト、デュアルＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲアゴニスト、トリプルＧＬＰ１Ｒ／グルカゴンＲ／ＧＩＰＲアゴニスト、イデグリラ（ＩＤｅｇＬｉｒａ）、リキシランなどの、ＧＬＰ１Ｒアゴニストとインスリン誘導体との組み合わせ。

ＤＰＰ−４阻害剤、例えば：アログリプチン／ネシーナ、リナグリプチン／ＢＩ−１３５６／オンデロ／トラゼンタ（Ｔｒａｊｅｎｔａ）／トラゼンタ（Ｔｒａｄｊｅｎｔａ）／トラゼンタ（Ｔｒａｙｅｎｔａ）／トラゼンタ（Ｔｒａｄｚｅｎｔａ）、サキサグリプチン／オングリザ、シタグリプチン／ジャヌビア／ゼレビア（Ｘｅｌｅｖｉａ）／テサベル（Ｔｅｓａｖｅｌ）／ジャヌメット／ベルメチア（Ｖｅｌｍｅｔｉａ）、ビルダグリプチン、アナグリプチン、ゲミグリプチン、テネグリプチン、メログリプチン、トレラグリプチン、ＤＡ−１２２９、ＭＫ−３１０２、ＫＭ−２２３。

ＳＧＬＴ２阻害剤、例えば：カナグリフロジン、ダパグリフロジン、レモグリフロジン、セルグリフロジン、エンパグリフロジン、イプラグリフロジン、トホグリフロジン、ルセオグリフロジン、ＬＸ−４２１１、ＰＦ−０４９７１７２９、ＲＯ−４９９８４５２、ＥＧＴ−０００１４４２、ＤＳＰ−３２３５。

ビグアニド（例えばメトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン）、チアゾリジンジオン（例えばピオグリタゾン、リボグリタゾン、ロシグリタゾン、トログリタゾン）、デュアルＰＰＡＲアゴニスト（例えばアレグリタザール、ムラグリタザール、テサグリタザール）、スルホニル尿素（例えばトルブタミド、グリベンクラミド、グリメピリド／アマリール、グリピジド）、メグリチニド（例えばナテグリニド、レパグリニド、ミチグリニド）、α−グルコシダーゼ阻害剤（例えばアカルボース、ミグリトール、ボグリボース）、アミリンおよびアミリンアナログ（例えばプラムリンチド、シムリン）。

ＧＰＲ１１９アゴニスト（例えばＧＳＫ−２６３Ａ、ＰＳＮ−８２１、ＭＢＸ−２９８２、ＡＰＤ−５９７）、ＧＰＲ４０アゴニスト（例えばＴＡＫ−８７５、ＴＵＧ−４２４、Ｐ−１７３６、ＪＴＴ−８５１、ＧＷ９５０８）。

他の適切な組み合わせ相手は：シクロセット（Ｃｙｃｌｏｓｅｔ）、１１−β−ＨＳＤ阻害剤（例えばＬＹ２５２３１９９、ＢＭＳ７７０７６７、ＲＧ−４９２９、ＢＭＳ８１６３３６、ＡＺＤ−８３２９、ＨＳＤ−０１６、ＢＩ−１３５５８５）、グルコキナーゼ活性化剤（例えばＴＴＰ−３９９、ＡＭＧ−１５１、ＴＡＫ−３２９）、ＤＧＡＴ阻害剤（例えばＬＣＱ−９０８）、タンパク質チロシンホスファターゼ１阻害剤（例えばトロダスケミン（Ｔｒｏｄｕｓｑｕｅｍｉｎｅ））、グルコース−６−ホスファターゼ阻害剤、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ阻害剤、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ阻害剤、ピルビン酸デヒドロキナーゼ阻害剤、α２−アンタゴニスト、ＣＣＲ−２アンタゴニストである。

１つまたはそれ以上の脂質低下薬、例えば：ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ阻害剤（例えばシンバスタチン、アトルバスタチン）、フィブラート（例えばベザフィブラート、フェノフィブラート）、ニコチン酸およびその誘導体（例えばナイアシン）、ＰＰＡＲ−（α、γまたはα／γ）アゴニストまたは修飾薬（例えばアレグリタザール）、ＰＰＡＲ−δアゴニスト、ＡＣＡＴ阻害剤（例えばアバシミブ）、コレステロール吸収阻害剤（例えばエゼチミブ）、胆汁酸結合物質（例えばコレスチラミン）、回腸胆汁酸輸送阻害剤、ＭＴＰ阻害剤またはＰＣＳＫ９修飾薬なども、組み合わせ相手として適切である。

ＨＤＬ増加化合物、例えば：ＣＥＴＰ阻害剤（例えばトルセトラピブ、アナセトラピブ、ダルセトラピブ、エバセトラピブ、ＪＴＴ−３０２、ＤＲＬ−１７８２２、ＴＡ−８９９５）またはＡＢＣ１調節薬。

他の適切な組み合わせ相手は、１つまたはそれ以上の肥満治療用の活性物質、例えば：シブトラミン、テソフェンシン、オルリスタット、カンナビノイド−１受容体アンタゴニスト、ＭＣＨ−１受容体アンタゴニスト、ＭＣ４受容体アゴニスト、ＮＰＹ５もしくはＮＰＹ２アンタゴニスト（例えばベルネペリット）、β−３−アゴニスト、レプチンまたはレプチン模倣物質、５ＨＴ２ｃ受容体アゴニスト（例えばロルカセリン）、またはブプロピオン／ナルトレキソン、ブプロピオン／ゾニサミド、ブプロピオン／フェンテルミンもしくはプラムリンチド／メトレレプチンの組み合わせなどである。

他の適切な組み合わせ相手は：
ペプチドＹＹ３−３６（ＰＹＹ３−３６）またはそのアナログ、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）またはそのアナログ、ＧＩＰ受容体アゴニストもしくはアンタゴニスト、グレリンアンタゴニストもしくはインバースアゴニスト、キセニンおよびそのアナログなどの、さらなる胃腸ペプチドである。

さらに、高血圧、慢性心不全またはアテローム性動脈硬化に影響を及ぼす薬物、例えば：アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト（例えばテルミサルタン、カンデサルタン、バルサルタン、ロサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、タソサルタン、アジルサルタン）、ＡＣＥ阻害剤、ＥＣＥ阻害剤、利尿薬、β遮断薬、カルシウムアンタゴニスト、中枢作用性昇圧薬、α−２−アドレナリン受容体アンタゴニスト、中性エンドペプチダーゼ阻害剤、血小板凝集阻害剤およびその他の薬物、またはそれらの組み合わせなどとの組み合わせが適切である。

別の態様において、本発明は、組み合わせ相手として上記される活性物質のうち少なくとも１つと組み合わせた、本発明による化合物またはそれらの生理的に許容される塩の使用であって、グルカゴン受容体に結合することにより影響を受けうる疾患または状態の、治療または予防に適した薬剤を製造するための使用に関する。これは、好ましくはメタボリックシンドロームに関する疾患、具体的には上記に列挙した疾患または状態のうちの１つ、最も具体的には糖尿病または肥満またはそれらの合併症である。

１つまたはそれ以上の活性物質と組み合わせた、本発明による化合物またはそれらの生理的に許容される塩の使用は、同時に、別々にまたは連続的に行うことができる。

別の活性物質と組み合わせた、本発明による化合物またはそれらの生理的に許容される塩の使用は、同時にまたは時間差で、ただし具体的には短時間内で行うことができる。これらが同時に投与される場合、２種の活性物質は一緒に患者に与えられる；これらが時間差で使用される場合、２種の活性物質は１２時間以内に、ただし具体的には６時間以内に患者に与えられる。

結果として、別の態様において、本発明は、本発明による化合物またはこのような化合物の生理的に許容される塩、および組み合わせ相手として上記活性物質のうち少なくとも１つを、場合により１つまたはそれ以上の不活性担体および／または希釈剤とともに含む薬剤に関する。

本発明による化合物または生理的に許容されるその塩もしくは溶媒和物、およびそれと組み合わされるさらなる活性物質はともに、１つの製剤、例えば錠剤もしくはカプセル剤、適切なシリンジもしくはデバイス中のすぐに使える製剤、注射前に再溶解することができる凍結乾燥物中に一緒に、または２種の同一もしくは異なる製剤中に、例えばいわゆるパーツキットとして別々に存在してもよい。

方法
用いる略号は以下の通りである：
２Ｆ−Ｐｈｅ ２−フルオロフェニルアラニン
ＡＡ アミノ酸
ｃＡＭＰ 環状アデノシン一リン酸
Ｂｏｃ ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ＢＯＰ （ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン
ｔＢｕ ターシャリーブチル
Ｃｈｇ シクロヘキシルグリシン
ＣＴＣ ２−クロロトリチルクロリド
ＤＩＣ Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＥＭ ダルベッコ改変イーグル培地
ＤＭＦ ジメチルホルムアミド
ＥＤＴ エタンジチオール
ＦＢＳ ウシ胎児血清
Ｆｍｏｃ フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＧＣＧ グルカゴン
ＧＬＰ−１ グルカゴン関連ペプチド１
ＨＡＴＵ ２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＢＳＳ ハンクス平衡塩液
ＨＢＴＵ ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＥＰＥＳ ２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸
ＨＯＢｔ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＯＳｕ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＨＴＲＦ 均一時間分解蛍光
ＩＢＭＸ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン
Ｎａｌ １−ナフチルアラニン
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水
ＰＥＧ ポリエチレングリコール
Ｐｈｇ フェニルグリシン
ＲＰ−ＨＰＬＣ 逆相高速液体クロマトグラフィー
ｓ．ｃ． 皮下
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
Ｔｌｅ ｔｅｒｔ−ロイシン
ＴＲＩＳ トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン
Ｔｒｔ トリチル
Ｔｚａ ４−チアゾリルアラニン
ＵＶ 紫外線

ペプチド化合物の一般的合成
材料：
固相ペプチド合成には、プレロード型Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｗａｎｇ樹脂を使用した。Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｗａｎｇ樹脂は、ローディング０．３ｍｍｏｌ／ｇでＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍより購入した。

Ｆｍｏｃで保護された天然アミノ酸を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓｅｎｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｉｒｉｓ ＢｉｏｔｅｃｈまたはＢａｃｈｅｍより購入した。合成を通して、以下の標準アミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＨ。

さらに、以下の特殊アミノ酸を上記と同じ供給業者より購入した：Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｚａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｇ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−ＮａＩ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−２Ｆ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｈｇ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｌｅ−ＯＨ。

標準的なＦｍｏｃ化学反応およびＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ活性化を使用して、Ｐｒｅｌｕｄｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）で固相ペプチド合成を行った。溶媒としてＤＭＦを使用した。脱保護：２０％ピペリジン／ＤＭＦで２ｘ２．５分間。洗浄：７ｘＤＭＦ。カップリング ＤＭＦ中２：５：１０ ２００ｍＭ ＡＡ／５００ｍＭ ＨＢＴＵ／２Ｍ ＤＩＰＥＡ。２ｘ２０分間。洗浄：５ｘＤＭＦ。

合成されたペプチドは全て、ＴＦＡ８２．５％、フェノール５％、水５％、チオアニソール５％、ＥＤＴ２．５％からなるＫｉｎｇ’ｓ切断カクテルで樹脂から切断した。次いで粗ペプチドをジエチルまたはジイソプロピルエーテル中で沈殿させ、遠心処理し、凍結乾燥した。分析ＨＰＬＣでペプチドを分析し、ＥＳＩ質量分析で確認した。分取ＲＰ−ＨＰＬＣ精製の従来手順により粗ペプチドを精製した。

分取ＨＰＬＣ精製の一般的手順：
Ａｋｔａ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ ＳｙｓｔｅｍまたはＪａｓｃｏ ｓｅｍｉｐｒｅｐ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍのいずれかで粗ペプチドを精製した。精製される予定の粗ペプチドの量に応じて、様々なサイズの分取ＲＰ−Ｃ１８−ＨＰＬＣカラムを、様々な流速で使用した。溶離剤としてアセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ（Ｂ）および水＋０．１％ＴＦＡ（Ａ）を用いた。生成物を含む画分を収集して凍結乾燥し、精製された生成物を、典型的にはＴＦＡ塩として得た。

エキセンジン−４誘導体の溶解性および安定性試験：
ペプチドバッチの溶解性および安定性試験の前に、その含量を決定した。そのため、２つのパラメータ、その純度（ＨＰＬＣ−ＵＶ）およびバッチの塩添加量（イオンクロマトグラフィー）を調べた。

溶解性試験については、目標濃度を、純粋な化合物が１０ｍｇ／ｍＬとした。したがって、先に決定された含量に基づき、様々な緩衝液系中で化合物濃度１０ｍｇ／ｍＬで、固体サンプルから溶液を調製した。４０００ｒｐｍで２０分間の遠心処理により得られた上清を穏やかに撹拌した２時間後、ＨＰＬＣ−ＵＶを行った。

次いで、純水中または可変量のアセトニトリル中の濃度２ｍｇ／ｍＬのペプチド保存液（当該化合物が完全に溶解した光学的対照）で得られたＵＶピーク領域と比較することで、溶解性を決定した。

溶解性試験については、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）ＣＳＨ（商標）Ｃ１８ １．７μｍ（１５０ｘ２．１ｍｍ）でのＷａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ系を用いて、５０℃、流速０．５ｍＬ／分のグラジエント溶出で分析クロマトグラフィーを行い、２１０〜２２５ｎｍでモニターした。グラジエントは、Ｂ２０％（０〜３分）〜Ｂ７５％（３〜２３分）に調節し、その後Ｂ９８％（２３．５〜３０．５）での洗浄工程および平衡期間（Ｂ２０％で３１〜３７分）を設けた。緩衝液Ａ＝水中０．５％トリフルオロ酢酸、およびＢ＝アセトニトリル中０．３５％トリフルオロ酢酸。場合により、ＬＣを、陽イオンモードを使用するＷａｔｅｒｓ ＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析計に連結した。

安定性試験については、目標濃度を、ｍ−クレゾール（３０ｍＭ）、塩化ナトリウム（８５ｍＭ）およびポリソルベート２０（８μＭ）を含むｐＨ７．３トリス緩衝液（５０ｍＭ）中純粋な化合物が１．０ｍｇ／ｍＬとした。溶液を５０℃で１４日間保存した。その後、溶液をＵＰＬＣで分析した。

安定性試験については、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ１３０ Ｃ１８ １．７μｍカラム（２．１ｘ１００ｍｍ）を用いる、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ−Ｃｌａｓｓ系により、４０℃、流速０．５ｍＬ／分のグラジエント溶出でＵＰＬＣを行い、２１５および２８０ｎｍでモニターした。グラジエントを１９．２分にわたりＢ１０％〜Ｂ９０％に、次いで０．８分間Ｂ９０％に調節した。緩衝液Ａ＝水中０．１％ギ酸、およびＢ＝アセトニトリル中０．１％ギ酸。

残存ペプチド量を測定するため、ｔ０およびｔ１４での目標化合物のピーク領域を比較し、方程式
％残存ペプチド＝［（ピーク領域ペプチドｔ１４）ｘ１００］／ピーク領域ペプチドｔ０。
にしたがって、「％残存ペプチド」を得た。

「％正規化純度」を、方程式
％正規化純度＝［（％相対純度ｔ１４）ｘ１００］／％相対純度ｔ０
にしたがって、ｔ０での％相対純度に対する１４日目の％相対純度により定義した。

ｔ０での％相対純度を、方程式
％相対純度ｔ０＝［（ピーク領域ｔ０）ｘ１００］／ピーク領域ｔ０全ての合計
にしたがって、ｔ０でのペプチドのピークをｔ０でのピーク領域全ての合計で割って算出した。

同様に、％相対純度ｔ１４を、方程式
％相対純度ｔ１４＝［（ピーク領域ｔ１４）ｘ１００］／ピーク領域ｔ１４全ての合計
にしたがって、ｔ１４でのペプチドのピークをｔ１４でのピーク領域全ての合計で割って算出した。

「％正規化純度」と「％残存ペプチド」との間の潜在的な差は、ストレス状態であるとき溶解した状態になかったペプチドの量を反映している。

この沈殿物は、遠心処理により分析前に除去された、不溶性の分解生成物、ポリマーおよび／または微小繊維を含む。

陰イオンクロマトグラフィー：
装置：Ｄｉｏｎｅｘ ＩＣＳ−２０００、プレ／カラム：Ｉｏｎ Ｐａｃ ＡＧ−１８ ２ｘ５０ｍｍ（Ｄｉｏｎｅｘ）／ＡＳ１８ ２ｘ２５０ｍｍ（Ｄｉｏｎｅｘ）、溶離剤：水酸化ナトリウム水溶液、流速：０．３８ｍＬ／分、グラジエント：０〜６分：２２ｍＭ ＫＯＨ、６〜１２分：２２〜２８ｍＭ ＫＯＨ、１２〜１５分：２８〜５０ｍＭ ＫＯＨ、１５〜２０分：２２ｍＭ ＫＯＨ、サプレッサー：ＡＳＲＳ ３００ ２ｍｍ、検出：導電率。

グルカゴン受容体効能についてのインビトロでの細胞アッセイ：
それぞれの受容体に対する化合物の受容体活性化作用を、ヒトＧＬＰ−１またはグルカゴン受容体を安定に発現するＨＥＫ−２９３細胞株のｃＡＭＰ応答を測定する機能アッセイにより決定した。

細胞のｃＡＭＰ含量を、ＨＴＲＦ均一時間分解蛍光に基づき、Ｃｉｓｂｉｏ Ｃｏｒｐ．（ｃａｔ．ｎｏ．６２ＡＭ４ＰＥＣ）のキットを使用して決定した。調製のため、細胞をＴ１７５培養フラスコに分け、培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）でほぼコンフルエントになるまで一晩増殖させた。次いで培地を除去し、細胞をカルシウムおよびマグネシウム不含のＰＢＳで洗浄し、その後、ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号Ａ６９６４）でプロテイナーゼ処理した。剥離された細胞を洗浄し、アッセイ緩衝液（１ｘＨＢＳＳ；２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡ、２ｍＭ ＩＢＭＸ）中で再懸濁し、細胞密度を決定した。次いでこれを４０００００細胞／ｍｌに希釈し、２５μｌ分量を９６ウェルプレートのウェルに分注した。測定のため、アッセイ緩衝液中の試験化合物２５μｌをウェルに添加し、その後室温で３０分間インキュベートした。溶解緩衝液（キット成分）で希釈したＨＴＲＦ試薬を添加した後、プレートを１時間インキュベートし、その後６６５／６２０ｎｍで蛍光比を測定した。インビトロでのアゴニストの効力を、最大の反応の５０％の活性化（ＥＣ５０）を引き起こす濃度を決定することで定量した。

麻酔したラットにおける血糖プロファイル：
この方法は、肝臓のグリコーゲン分解プロセスにおける試験化合物を研究することを目的としていた。ラットは、実験開始まで食料を自由に入手することができた。グルカゴン（ＧＣＧ）またはＧＣＧ模倣物質投与後、約６０〜９０分間続いた血糖の上昇が、ＧＣＧまたはＧＣＧ模倣物質誘起による肝臓のグリコーゲン分解の結果であったと明記することができる。肝臓のグリコーゲン分解およびその後の血中の高血糖のピークに対するＧＣＧ模倣物質の効果を、用量３０μｇ／ｋｇでＧＣＧを皮下ボーラス注射することで得られる効果と比較した。

以前に記載された通り、麻酔したオスのＷｉｓｔａｒラットにおける血糖値を分析した（Ｈｅｒｌｉｎｇら Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９８；２７４：Ｇ１０８７〜９３頁）。ペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によりラットを麻酔し、気管切開した。ペントバルビタールナトリウムを皮下輸注することで麻酔を最大５時間維持した（各動物の麻酔深度に調節；約２４ｍｇ／ｋｇ／時間）。直腸プローブ温度計で体温をモニターし、加熱した手術台を用いて温度を３７℃に維持した。グルコース分析用の血液サンプル（１０μｌ）を１５分毎に尾の先端から得た。外科手術後最大２時間、ラットの血糖値を安定させた。次いで、基準化合物としてのＧＣＧ、または試験化合物を皮下に投与した。ＧＣＧについては、用量３０μｇ／ｋｇを使用して肝臓のグリコーゲン分解を誘起した。試験化合物配列番号５については用量１０、２０および３０μｇ／ｋｇを投与し、試験化合物配列番号６については用量１０および３０μｇ／ｋｇを投与した。

正常血糖のビーグル犬における血糖プロファイル：
オスの正常血糖のビーグル犬を、実験全体の前の一晩および実験全体の間絶食させた。動物を群あたりｎ＝６で群にランダム化した。０分時点で、単回用量の試験化合物または基準化合物としての天然のヒトグルカゴンにより動物を処理した。実験前に注射溶液を新しく調製した。試験化合物を、用量１〜１００μｇ／ｋｇで３つの異なる経路（ｓ．ｃ．、ｉ．ｍ．およびｉ．ｖ．）により、単回の注射として投与した。薬物投与前（＝０分）および薬物投与後最大２４０分、頚静脈（ｖｅｎａ ｊｕｇｕｌａｒｉｓ）の穿刺により連続して血液サンプル採取を行った。血糖を全血から酵素的に（ヘキソキナーゼ法）決定し、イヌ特異的なＥＬＩＳＡアッセイにより、インスリンをＫ−ＥＤＴＡ血漿から分析した。

実施例
本発明を以下の実施例によりさらに例示する。

配列番号２５の合成
プレロード型Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｗａｎｇ樹脂で固相合成法を実施した。ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ活性化によるＦｍｏｃ合成戦略を適用した。固相合成プロトコールにおいて、１位にＦｍｏｃ−Ｔｚａ−ＯＨを、１０位にＦｍｏｃ−Ｔｌｅ−ＯＨを使用した。Ｋｉｎｇ’ｓカクテル（Ｄ．Ｓ．Ｋｉｎｇ、Ｃ．Ｇ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３６、１９９０、２５５〜２６６頁）でペプチドを樹脂から切断した。粗生成物を、アセトニトリル／水グラジエント（ともに０．１％ＴＦＡを含有する緩衝液）を使用して、Ｗａｔｅｒｓカラム（Ｓｕｎｆｉｒｅ、Ｐｒｅｐ Ｃ１８）による分取ＨＰＬＣで精製した。

最終的に、精製されたペプチドの分子質量をＬＣ−ＭＳにより確認した。

配列番号２４の合成
プレロード型Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｗａｎｇ樹脂で固相合成法を実施した。ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ活性化によるＦｍｏｃ合成戦略を適用した。固相合成プロトコールにおいて、１位にＦｍｏｃ−Ｔｚａ−ＯＨ、１０位にＦｍｏｃ−Ｃｈｇ−ＯＨを使用した。Ｋｉｎｇ’ｓカクテル（Ｄ．Ｓ．Ｋｉｎｇ、Ｃ．Ｇ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３６、１９９０、２５５〜２６６頁）でペプチドを樹脂から切断した。粗生成物を、アセトニトリル／水グラジエント（ともに０．１％ＴＦＡを含有する緩衝液）を使用して、Ｗａｔｅｒｓカラム（Ｓｕｎｆｉｒｅ、Ｐｒｅｐ Ｃ１８）による分取ＨＰＬＣで精製した。

最終的に、精製されたペプチドの分子質量をＬＣ−ＭＳにより確認した。

配列番号５の合成
プレロード型Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｗａｎｇ樹脂で固相合成法を実施した。ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ活性化によるＦｍｏｃ合成戦略を適用した。固相合成プロトコールにおいて、１位にＦｍｏｃ−Ｔｚａ−ＯＨを使用した。Ｋｉｎｇ’ｓカクテル（Ｄ．Ｓ．Ｋｉｎｇ、Ｃ．Ｇ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３６、１９９０、２５５〜２６６頁）でペプチドを樹脂から切断した。粗生成物を、アセトニトリル／水グラジエント（ともに０．１％ＴＦＡを含有する緩衝液）を使用して、Ｗａｔｅｒｓカラム（Ｓｕｎｆｉｒｅ、Ｐｒｅｐ Ｃ１８）による分取ＨＰＬＣで精製した。

最終的に、精製されたペプチドの分子質量をＬＣ−ＭＳにより確認した。

類似の方法で、ペプチド配列番号３〜３６を合成した、表２を参照のこと。

化学的安定性および溶解性
ペプチド化合物の溶解性および化学的安定性を、方法の項で記載する通りに評価した。結果を表３に示す。

ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体に関するインビトロでのデータ
ヒトグルカゴン受容体（ｈＧＬＵＣ Ｒ）およびヒトＧＬＰ−１受容体（ｈＧＬＰ−１ Ｒ）を発現する細胞を、濃度を増大させた列挙した化合物に曝露し、方法の項で記載する通りに、形成されたｃＡＭＰを測定することにより、ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体でのペプチド化合物の効力を決定した。

ヒトＧＬＰ−１受容体（ｈＧＬＰ−１ Ｒ）およびヒトグルカゴン受容体（ｈＧＬＵＣ Ｒ）での活性を有するエキセンジン−４誘導体についての結果を表４に示す。

比較試験
１位に人工アミノ酸４−チアゾリルアラニンを含むエキセンジン−４誘導体の選択を、１位にヒスチジンを有する対応する化合物との比較において試験した。１位のヒスチジンは、グルカゴンだけでなく、ＧＬＰ−１およびエキセンジン−４を含む多くの関連ペプチドにおいて、受容体の活性化に不可欠である。したがって、人工アミノ酸４−チアゾリルアラニンにより、１位に天然ヒスチジンを有する同一の化合物と比較して、より高度に受容体が活性化されるのは驚くべきことである。さらに、グルカゴンの効果を逆調節するＧＬＰ−１受容体の活性化が、驚くべきことに人工アミノ酸４−チアゾリルアラニンの導入により減少した。これにより、より高いＧＣＧ／ＧＬＰ−１活性比を有する、さらにより選択的なグルカゴン受容体アゴニストが生じる。基準の一対の化合物およびＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体での対応するＥＣ５０値（ｐＭで示す）を表５に示す。

ｓ．ｃ．注射後に麻酔されたラットにおける、グルコース放出に対する配列番号５および配列番号６の効果
２時間の前処理期間の間、血糖を、ラットにおける通常の摂食値（ｆｅｄ ｖａｌｕｅ）を表す約６ｍｍｏｌ／ｌのレベルで安定させた。用量３０μｇ／ｋｇのＧＣＧにより血糖の急速な上昇が引き起こされ、３０分後に血糖値約１０〜１１ｍｍｏｌ／ｌでピークとなった。用量１０、２０および３０μｇ／ｋｇの試験化合物配列番号５により、血糖の用量依存性増加が皮下で引き起こされ、それぞれ注射の３０、４５および９０分後にピークとなった。用量２０μｇ／ｋｇの配列番号５は、３０μｇ／ｋｇのＧＣＧと比較してほぼ同等の血糖偏位の形状を示した（図１）。

用量１０および３０μｇ／ｋｇの試験化合物配列番号６により、血糖の用量依存性増加が引き起こされ、それぞれ注射の３０および６０分後にピークとなった。用量１０μｇ／ｋｇの配列番号６は、３０μｇ／ｋｇのＧＣＧと比較して、より強力な血糖偏位を示した（図２）。

ｓ．ｃ．注射後の正常血糖のビーグル犬における、グルコース放出に対する配列番号５および配列番号６の効果
動物およびヒトにおいては、グルカゴンを注射すると、肝臓のグリコーゲンの急速な動員が引き起こされ、即時にグルコースに分解される。これにより、血糖の急性だが短期間の増加が生じる。正常血糖のビーグル犬において、１μｇ／ｋｇヒトグルカゴンの皮下（ｓ．ｃ．）注射により、１５分以内に２〜３ｍｍｏｌ／Ｌの急速な血糖の増加が引き起こされた。配列番号５および配列番号６のｓ．ｃ．注射は、血糖に対するヒトグルカゴンの効果を模倣していた。イヌにおいて、１μｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．配列番号５の注射後の総純グルコース応答（ベースラインからの血糖ＡＵＣ（０〜２４０分）の変化）は、１μｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．ヒトグルカゴンのものと類似していた。配列番号５に対する血糖応答は、１０μｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．で、ピーク増加が約３．５〜４ｍｍｏｌ／Ｌに達するまで用量に応じて増加した（図３）。このより高い用量のｓ．ｃ．配列番号５を超えて、より高いグルコースの偏位は生じなかった。イヌにおける、ｓ．ｃ．配列番号５に対するグルコース応答の開始はヒトグルカゴンのものに類似していたが、グルコース応答期間はわずかにより長かった。皮下、筋肉内および静脈内注射により急速かつ一過性の血糖増加が生じたため、配列番号５は全ての非経口経路において活性であった。イヌにおける、配列番号５の皮下と筋肉内注射との間で、活性および血糖の時間−作用プロファイルに差はなかった（図４）。

血糖応答の誘起に関して、配列番号５および配列番号６は正常血糖のイヌにおいても同様に活性であった（図５）。

Claims (25)

1. 式（Ｉ）：
   Ｔｚａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘ１０−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｘ１４−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｘ２１−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｘ２９−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｒ１
   （Ｉ）
   を有するペプチド化合物であって、
   Ｘ１０は、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、フェニルグリシン、１−ナフチルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、シクロヘキシルグリシンおよびｔｅｒｔ−ロイシンから選択されるアミノ酸残基を表し、
   Ｘ１４は、ＬｅｕおよびＮｌｅから選択されるアミノ酸残基を表し、
   Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
   Ｘ２９は、ＧｌｙおよびＴｈｒから選択されるアミノ酸残基を表し、
   Ｒ１は、ＯＨまたはＮＨ２を表す
   前記ペプチド化合物、
   またはその塩もしくは溶媒和物。
2. Ｃ末端基Ｒ１はＯＨである、請求項１に記載の化合物。
3. Ｘ１０は、Ｌｅｕを表し、
   Ｘ１４は、ＬｅｕおよびＮｌｅから選択されるアミノ酸残基を表し、
   Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
   Ｘ２９は、ＧｌｙおよびＴｈｒから選択されるアミノ酸残基を表し、
   Ｒ１は、ＯＨを表す
   請求項１または２のいずれか１項に記載の化合物、
   またはその塩もしくは溶媒和物。
4. Ｘ１０は、Ｔｙｒを表し、
   Ｘ１４は、ＬｅｕおよびＮｌｅから選択されるアミノ酸残基を表し、
   Ｘ２１は、Ｇｌｕを表し、
   Ｘ２９は、ＧｌｙおよびＴｈｒから選択されるアミノ酸残基を表し、
   Ｒ１は、ＯＨを表す
   請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物、
   またはその塩もしくは溶媒和物。
5. Ｘ１０は、１−ナフチルアラニンを表し、
   Ｘ１４は、ＬｅｕおよびＮｌｅから選択されるアミノ酸残基を表し、
   Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
   Ｘ２９は、Ｔｈｒを表し、
   Ｒ１は、ＯＨを表す
   請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物、
   またはその塩もしくは溶媒和物。
6. Ｘ１０は、シクロヘキシルグリシンを表し、
   Ｘ１４は、ＬｅｕおよびＮｌｅから選択されるアミノ酸残基を表し、
   Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
   Ｘ２９は、Ｔｈｒを表し、
   Ｒ１は、ＯＨを表す
   請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物、
   またはその塩もしくは溶媒和物。
7. Ｘ１０は、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、フェニルグリシン、１−ナフチルアラニン、２−フルオロフェニルアラニンおよびシクロヘキシルグリシンから選択されるアミノ酸残基を表し、
   Ｘ１４は、Ｌｅｕを表し、
   Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
   Ｘ２９は、ＧｌｙおよびＴｈｒから選択されるアミノ酸残基を表し、
   Ｒ１は、ＯＨを表す
   請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物、
   またはその塩もしくは溶媒和物。
8. Ｘ１０は、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、１−ナフチルアラニン、シクロヘキシルグリシンおよびｔｅｒｔ−ロイシンから選択されるアミノ酸残基を表し、
   Ｘ１４は、Ｎｌｅを表し、
   Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
   Ｘ２９は、Ｔｈｒを表し、
   Ｒ１は、ＯＨを表す
   請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物、
   またはその塩もしくは溶媒和物。
9. Ｘ１０は、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、１−ナフチルアラニン、２−フルオロフェニルアラニンおよびシクロヘキシルグリシンから選択されるアミノ酸残基を表し、
   Ｘ１４は、ＬｅｕおよびＮｌｅから選択されるアミノ酸残基を表し、
   Ｘ２１は、Ａｓｐを表し、
   Ｘ２９は、Ｔｈｒを表し、
   Ｒ１は、ＯＨを表す
   請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物、
   またはその塩もしくは溶媒和物。
10. Ｘ１０は、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、フェニルグリシン、１−ナフチルアラニン、シクロヘキシルグリシンおよびｔｅｒｔ−ロイシンから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ１４は、ＬｅｕおよびＮｌｅから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ２１は、Ｇｌｕを表し、
    Ｘ２９は、ＧｌｙおよびＴｈｒから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｒ１は、ＯＨを表す
    請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物、
    またはその塩もしくは溶媒和物。
11. Ｘ１０は、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、フェニルグリシン、１−ナフチルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、シクロヘキシルグリシンおよびｔｅｒｔ−ロイシンから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ１４は、ＬｅｕおよびＮｌｅから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ２１は、ＡｓｐおよびＧｌｕから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ２９は、Ｔｈｒを表し、
    Ｒ１は、ＯＨを表す
    請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物、
    またはその塩もしくは溶媒和物。
12. Ｘ１０は、Ｔｙｒ、ＬｅｕおよびＶａｌから選択されるアミノ酸残基を表し、
    Ｘ１４は、Ｌｅｕを表し、
    Ｘ２１は、Ｇｌｕを表し、
    Ｘ２９は、Ｇｌｙを表し、
    Ｒ１は、ＯＨを表す
    請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物、
    またはその塩もしくは溶媒和物。
13. 配列番号３〜２５の化合物、およびそれらの塩または溶媒和物から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物。
14. 配列番号３、５、６、９、１５、２０、２３、２４および２５の化合物、ならびにそれらの塩または溶媒和物から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
15. 医薬、具体的にはヒトに対する医薬に使用するための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の化合物。
16. 少なくとも１つの薬学的に許容される担体とともに、医薬組成物中に活性な薬剤として存在する、請求項１５に記載の使用のための化合物。
17. 少なくとも１つのさらなる治療上活性な薬剤と一緒である、請求項１５または１６に記載の使用のための化合物であって、さらなる治療上活性な該薬剤は、一連のインスリンおよびインスリン誘導体、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１アナログおよびＧＬＰ−１受容体アゴニスト、デュアルＧＬＰ１／グルカゴン受容体アゴニスト、デュアルＧＬＰ１／ＧＩＰ受容体アゴニスト、ＰＹＹ３−３６またはそのアナログ、膵臓ポリペプチドまたはそのアナログ、グルカゴン受容体アゴニスト、ＧＩＰ受容体アゴニストもしくはアンタゴニスト、グレリンアンタゴニストもしくはインバースアゴニスト、キセニンおよびそのアナログ、ＤＰＰ−４阻害剤、ＳＧＬＴ２阻害剤、ビグアニド、チアゾリジンジオン、デュアルＰＰＡＲアゴニスト、スルホニル尿素、メグリチニド、α−グルコシダーゼ阻害剤、アミリンおよびアミリンアナログ、ＧＰＲ１１９アゴニスト、シクロセット、１１−β−ＨＳＤ阻害
    剤、グルコキナーゼ活性化剤、ＤＧＡＴ阻害剤、タンパク質チロシンホスファターゼ１阻害剤、グルコース−６−ホスファターゼ阻害剤、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ阻害剤、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ阻害剤、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ阻害剤、α２−アンタゴニスト、ＣＣＲ−２アンタゴニスト、ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ阻害剤、フィブラート、ニコチン酸およびその誘導体、ＰＰＡＲ−（α、γまたはα／γ）アゴニストまたは修飾薬、ＰＰＡＲ−δアゴニスト、ＡＣＡＴ阻害剤、コレステロール吸収阻害剤、胆汁酸結合物質、ＩＢＡＴ阻害剤、ＭＴＰ阻害剤、ＰＣＳＫ９修飾薬、ＨＤＬ増加化合物、ＡＢＣ調節薬、肥満治療用の活性物質、例えばシブトラミン、テソフェンシン、オルリスタット、ＣＢ−１受容体アンタゴニスト、ＭＣＨ−１アンタゴニスト、ＭＣ４受容体アゴニスト、ＮＰＹ５もしくはＮＰＹ２アンタゴニスト、ＮＰＹ４アゴニスト、β−３−アゴニスト、レプチンまたはレプチン模倣物質、５ＨＴ２ｃ受容体アゴニスト、またはブプロピオン／ナルトレキソン（コントレイブ）、ブプロピオン／ゾニサミド（エンパチック（ＥＭＰＡＴＩＣ））、ブプロピオン／フェンテルミン、もしくはプラムリンチド／メトレレプチンの組み合わせなど、高血圧、慢性心不全またはアテローム性動脈硬化に影響を及ぼす薬物、例えばアンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、ＡＣＥ阻害剤、ＥＣＥ阻害剤、利尿薬、β遮断薬、カルシウムアンタゴニスト、中枢作用性昇圧薬、α−２−アドレナリン受容体アンタゴニスト、中性エンドペプチダーゼ阻害剤、血小板凝集阻害剤などから選択される、使用のための化合物。
18. 低血糖を治療し、血糖値を増加させるため、またはインスリンを伴う補助療法としての、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
19. 体重を減少させ、維持するため、β遮断薬およびカルシウムチャネル遮断薬の中毒に対する解毒剤として、ならびに放射線用途のために消化管系の一時的な弛緩を誘起するための、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
20. 低血糖、２型糖尿病を治療または予防するため、および前糖尿病から２型糖尿病への進行を遅延させるための、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
21. 医薬組成物であって、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの化合物、またはそれらのいずれかの、生理的に許容される塩または溶媒和物を含む、前記医薬組成物。
22. 患者の低血糖を治療するための医薬であって、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の、式Ｉの少なくとも１つの化合物の有効量を含む、前記医薬。
23. 患者の低血糖を治療するための医薬であって、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の、式Ｉの少なくとも１つの化合物の有効量、および低血糖の治療に有用な、少なくとも１つの他の化合物の有効量を含む、前記医薬。
24. 式Ｉの少なくとも１つの化合物の有効量、および少なくとも１つの他の化合物の有効量を、同時に、別々に、または連続的に投与する、請求項２２または２３に記載の医薬。
25. 非経口的に投与される、請求項２２〜２４に記載の医薬。

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