EA029942B1

EA029942B1 - Стабильная фармацевтическая композиция на основе конъюгатов биологически активных белков с полиэтиленгликолем, содержащих азогруппу

Info

Publication number: EA029942B1
Application number: EA201400592A
Authority: EA
Inventors: Сергей Викторович Шереметьев; Сергей Анатольевич Коровкин; Антон Викентьевич Катлинский; Владимир Антонович Катлинский; Андрей Викторович Семченко
Original assignee: Общество С Ограниченной Ответственностью "Форт" (Ооо "Форт")
Priority date: 2014-06-16
Filing date: 2014-06-16
Publication date: 2018-06-29
Also published as: EA201400592A1

Abstract

Изобретение относится к области медицины и фармацевтической промышленности и обеспечивает фармацевтическую композицию, представленную в жидкой или лиофилизированной готовой лекарственной форме, содержащую пегилированный белок, отвечающий формуле (I), в котором полиэтиленгликолевые фрагменты ковалентно присоединены к молекуле белка посредством азогрупп:где Prot - биологически активный белок; А - аминокислотный фрагмент гистидина; В - аминокислотный фрагмент тирозина; n - целое число в интервале от 10 до 1200; m - целое число в интервале от 0 до 10; k - целое число в интервале от 0 до 10, причем m≠k, если m или k равны 0, в форме конъюгата или смеси конъюгатов с различными значениями n, m и k, а также фармакологически приемлемые вспомогательные ингредиенты, выбранные из сорастворителей, солей, кислот, оснований, антиоксидантов, консервантов, аминокислот, белков, углеводов, полимеров, детергентов и комплексонов. Технический результат заключается в расширении арсенала лекарственных средств.

Description

Изобретение относится к области медицины и фармацевтической промышленности и обеспечивает фармацевтическую композицию, представленную в жидкой или лиофилизированной готовой лекарственной форме, содержащую пегилированный белок, отвечающий формуле (I), в котором полиэтиленгликолевые фрагменты ковалентно присоединены к молекуле белка посредством азогрупп:

029942 Β1

где Рго! - биологически активный белок; А - аминокислотный фрагмент гистидина; В аминокислотный фрагмент тирозина; η - целое число в интервале от 10 до 1200; т - целое число в интервале от 0 до 10; к - целое число в интервале от 0 до 10, причем т^к, если т или к равны 0, в форме конъюгата или смеси конъюгатов с различными значениями η, т и к, а также фармакологически приемлемые вспомогательные ингредиенты, выбранные из сорастворителей, солей, кислот, оснований, антиоксидантов, консервантов, аминокислот, белков, углеводов, полимеров, детергентов и комплексонов. Технический результат заключается в расширении арсенала лекарственных средств.

029942

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины и фармацевтической промышленности и касается стабильной жидкой или лиофилизированной фармацевтической композиции, содержащей пегилированный биологически активный белок в форме конъюгата, в котором полиэтиленгликолевый фрагмент ковалентно присоединен к молекуле белка посредством азогруппы. Предлагаемую композицию применяют для лечения и профилактики заболеваний, при которых показано применение соответствующего белка, а также в качестве аналитического стандарта.

Сведения о предшествующем уровне техники

В последнее время в медицине все большее применение находят конъюгаты полиэтиленгликоля (ПЭГ) с биологически активными белками, в которых ПЭГ ковалентно присоединен через соответствующий линкер к белковой молекуле. Такие конъюгаты обладают рядом преимуществ по сравнению с нативными белками, поскольку ПЭГ защищает белок от ферментативной деградации в организме, снижает его иммуногенность, улучшает переносимость, а также увеличивает общий размер молекулы. Как следствие этого, затрудняется выведение конъюгата через почки и увеличивается время его циркуляции в организме, что обусловливает более редкое введение препарата и более ровное поддержание терапевтических концентраций в крови [Уегоиеке Р.М., Раки! С. "РЕСу1а1юи, киссеккГи1 арргоасП ίο бгад беПуегу". Эгид Эйсоу. Тобау. 2005. Νο. 10 (21). Р. 1451-1458; Куаи 8.М., Майоуаш С., \Уапд X., Набб1е1ои Ό.Μ., Вгаубеп Ό.Τ "Лбуапсек ίη РЕСу1а1юи оГ ипроПай Ью1есй то1еси1ек: беПуегу акрес!к". Ехрег! Ορίη. Эгид Эейу. 2008. №. 5 (4). Р. 371-383].

Биологические и физико-химические свойства таких конъюгатов зависят не только от размера и пространственной структуры присоединенного полимера и природы белка, но и от химической природы линкера, являющегося связующим звеном между полимерным и белковым фрагментами конъюгата.

Готовые лекарственные формы (ГЛФ) пегилированных белков должны иметь состав, не только исключающий деградацию и потерю биологической активности протеиновой части конъюгата, но и препятствующий разрыву ковалентных связей между полимером и белком при длительном хранении. Высвобождение свободного белка в лекарственной форме в результате разрушения конъюгата в процессе хранения приводит к резкому возрастанию биологической активности препарата, что означает несоответствие заявляемым регламентируемым параметрам, вероятному увеличению реактогенности и усиление побочных эффектов. Кроме того, в процессе разрушения конъюгата высвобождается ПЭГ в виде различных производных, а также в ряде случаев возможно накопление различных продуктов деградации линкерной части молекулы конъюгата, в том числе токсичных.

Деградация готовых лекарственных форм ковалентных конъюгатов биологически активных белков включает не только химические изменения (окисление, гидролиз и т.д.), но и физические (агрегацию, денатурацию, адсорбцию на поверхностях первичной упаковки, изменение конформации и т.д.). При этом если скорость химических изменений возрастает с повышением температуры, то нежелательные физические изменения могут происходить как при повышенных, так и при пониженных температурах, например при замораживании. Проблема стабильности фармацевтических композиций пегилированных белков дополнительно усугубляется сравнительно малым (микрограммовым, наномольным) содержанием действующего вещества в лекарственной форме. Вследствие этого, любой нежелательный процесс, например адсорбция на поверхности или окисление кислородом воздуха (в том числе растворенным), в отличие от более концентрированных лекарственных форм, отражается на свойствах препарата особенно ощутимо.

На современном фармацевтическом рынке представлен достаточно широкий спектр лекарственных препаратов на основе пегилированных белков для лечения самых разнообразных заболеваний.

Например, активное вещество препарата "ПегИнтрон" (производитель - §сЬегшд-Р1оидЬ) представляет собой пегилированный интерферон а-2Ь (ПЭГ-ИНФ а-2Ь, МНН: пегинтерферон альфа-2Ъ), в котором линейный ПЭГ массой 12 кДа ковалентно присоединен к аминогруппе ИНФ а-2Ь посредством карбаматной связи (\УО 1995/013090, опубл. 18.05.1995). Препарат выпускается в виде лиофилизата, содержащего, помимо действующего вещества ПЭГ -ИНФ а-2Ь, гидро- и дигидрофосфаты натрия, сахарозу и полисорбат 80 (№О 1999/048535, опубл. 30.09.1999).

Активное вещество препарата "Пегасис" (производитель - Р. НоГГтаии-Ба КосЬе Ыб.) представляет собой пегилированный интерферон а-2а (ПЭГ-ИНФ а-2а, МНН: пегинтерферон альфа-2а), в котором разветвленный ПЭГ массой 40 кДа ковалентно присоединен к аминогруппе ИНФ а-2а посредством амидной связи. ПЭГ-фрагмент представляет собой дипегилированный лизин, в котором две линейные молекулы ПЭГ массой по 20 кДа каждая ковалентно присоединены посредством карбаматной связи к лизиновым аминогруппам (КИ 97108698, опубл. 10.05.1999). Препарат выпускается в виде раствора, содержащего, помимо действующего вещества ПЭГ -ИНФ а-2а, хлорид натрия, бензиновый спирт, уксусную кислоту, ацетат натрия и полисорбат 80 (И8 5762923, опубл. 09.06.1998). Данные препараты применяют для лечения вирусных гепатитов.

- 1 029942

Активное вещество препарата "Мирцера" (производитель - Р. НоГГтапп-Ьа Росйе Ь1й.) представляет собой пегилированный эритропоэтин бета (ПЭГ-ЭПО β, МНН: метоксиполиэтиленгликоль-эпоэтин бета), в котором линейная ПЭГ-бутановая кислота массой 30 кДа ковалентно присоединена к аминогруппе эритропоэтина посредством амидной связи (АО 2002/049673, опубл. 27.06.2002). Препарат выпускается в виде раствора, содержащего, помимо действующего вещества ПЭГ-ЭПО β, сульфат натрия, дигидрофосфат натрия, Ь-метионин, маннит и полоксамер 188 (Р1игошс Р68) (АО 2001/087329, опубл. 22.11.2001). Данный препарат, стимулирующий гемопоэз, применяют для лечения анемии при хронической почечной недостаточности.

Активное вещество препарата "Неуластим" (производители - Р. НоГГтапи-Ьа Росйе ЬЙ, Атдеп 1пс.) представляет собой пегилированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (ПЭГ-Г-КСФ, МНН: Пэгфилграстим), в котором линейный ПЭГ массой 20 кДа ковалентно присоединен к терминальной аминогруппе Г-КСФ посредством вторичной аминной связи (АО 1996/011953, опубл. 25.04.1996). Препарат выпускается в виде раствора, содержащего, помимо действующего вещества ПЭГ -Г-КСФ, сорбит, ацетата натрия и полисорбат 20 (РйукЮап Раскаде 1пкег1 №йак!а™ (РедГйдгакйт), И8 20090247450, опубл. 01.10.2009). Данный препарат применяют в качестве стимулятора лейкопоэза при нейтропении.

Активное вещество препарата "Сомаверт" (производитель - РП/ег 1пс.) представляет собой пегилированный антагонист рецептора гормона роста (МНН: Пегвисомант), в котором от 4 до 6 линейных ПЭГ-фрагментов массой 5 кДа ковалентно присоединены к лизиновым аминогруппам белка посредством амидной связи (И8 5849535, опубл. 15.12.1998). Препарат выпускается в виде лиофилизата, содержащего, помимо действующего вещества, глицин, маннит, гидро- и дигидрофосфаты натрия (ΝΏΑ 21-106 ЗотауеП Ргорокей Райей Ьеайе!, 25/03/2003).

Данный препарат применяют для лечения больных акромегалией, у которых оперативное вмешательство и/или лучевая терапия были неэффективны.

Большинство современных коммерческих препаратов на основе пегилированных белков представляют собой конъюгаты, в которых полимерный фрагмент присоединен к аминогруппам биологически активных белков через соответствующий линкер. Однако в настоящее время интерес также представляют конъюгаты, в которых аминогруппы протеинов не затронуты. Препараты на основе таких активных веществ могут иметь иное соотношение и число позиционных изомеров, что может положительно сказаться на биологической активности и реактогенности, а в конечном итоге - на общей фармакологической ценности лекарственного средства. К таким соединениям, например, относятся биологически активные конъюгаты, где полимер присоединен к ароматическим фрагментам белковых молекул, например, посредством азогруппы. В частности, к таким конъюгатам относятся пегилированные белки, в которых линкером между полимерным и протеиновым фрагментами в молекуле является 4-диазенилбензоат. По своей химической сути данные конъюгаты представляют собой полиэтиленгликолевые эфиры 4-диазенилбензойной кислоты, в которых азогруппа присоединена к тирозиновым или гистидиновым ароматическим фрагментам соответствующего протеина. В данных конъюгатах биологически активным белком может быть интерферон α, β или γ (КБ 2433135, опубл. 10.11.2011), эритропоэтин (КБ 2433134, опубл. 10.11.2011), гормон роста человека (ЕА 201101664, опубл. 30.11.2012), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (ЕА 201101663, опубл. 28.06.2013).. Лекарственные формы на основе вышеперечисленных конъюгатов и их состав в литературе не описаны.

Известным недостатком азосоединений является их подверженность восстановительной и окислительной деградации, индуцируемой множеством факторов. Скорость деструктивных изменений зависит от рН, температуры, интенсивности света, наличия тех или иных эксципиентов. На примере азокрасителей различных технических классов было показано, что фотохимическая практически полная деградация азосоединения может быть достигнута непосредственным воздействием УФ-излучения независимо от концентрации субстрата в растворе (С. Оотек йа 8йуа, 1. Ьшк Рапа. "Рйойсйет1са1 апй рйо!оса1а1уйс йедгайайоп оГ ап а/о йуе ш адиеоик ко1ийоп Ьу ИУ йгайаПоп". 1. Рйойсйет. апй РйойЫо1. А: СйетЫгу. Уо1. 155 (2003). Р. 133-143).

Воздействие ультразвука, приводящее к образованию гидроксил-радикалов, также способно разрушать молекулы некоторых азосоединений, однако превращения не протекают количественно (ТаиЬег М.М., СиеЬй/ О.М. апй Кейогек А. "Бедгайайоп оГ А/о Буек Ьу Ьассаке апй ИНгакоипй Тгеа1теп1". Арр1. Епу1гоп. МюгоЬюк Уо1. 71, Νο. 5 (2005). Р. 2600-2607).

Азосоединения также претерпевают восстановительное разрушение в среде желудочно-кишечного тракта. Гидрофильные азосоединения легко восстанавливаются до аминов, тогда как восстановление гидрофобных соединений ограничивается стадией гидразонов (УокЫйаги Клтига, Те1кир Уатаока, Ткийти Иейа, 8ооп-1п Клт, НагиЫйе 8ака1апИ. "Бедгайайоп Месйашкт оГ А/о-Соп1аййпд Ро1уиге1йапек Ьу 1йе Асйоп оГ 1п1екйпа1 Р1ога". Айуапсей Вюта1ейа1к ш Вютейюа1 Епдтееппд апй Бгид Бейуегу 8ук1етк. 1996. Р. 349-350).

Не ограничиваясь конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что наличие в структуре конъюгатов азогруппы, сопряженной с ароматическими фрагментами создает возможность дополни- 2 029942

тельного п^п*-электронного перехода, приводящего к появлению полосы поглощения в видимой области электронного спектра. Этому способствует наличие электронодонорного (например, фенольного гидроксила тирозина) и электроноакцепторного (сложноэфирный карбонил) заместителей в различных ароматических фрагментах конъюгата. В результате значительная доля молекул рассматриваемых конъюгатов способна переходить в нестабильное возбужденное энергетическое состояние при поглощении фотонов в видимой области спектра с последующей фотодеструкцией.

Кроме того, в вышеуказанных пегилированных белках линкером выступает диазенилбензоат, содержащий легко гидролизуемую сложноэфирную связь. Поэтому данные конъюгаты чувствительны не только к окислению/восстановлению из-за наличия азогруппы, но также могут быть нестабильны в условиях, способствующих гидролизу (в частности, ферментативному). В то же время белковая часть конъюгата может подвергаться протеолизу, деамидированию, дисульфидному обмену, сульфоксидированию, окислению, рацемизации, агрегации и т.п., что влияет на общую конформацию и, следовательно, на биологические свойства конъюгата, такие как активность, иммуногенность и реактогенность. Заметное протекание перечисленных реакций может привести к снижению фармакологического эффекта и увеличению нежелательных побочных эффектов и токсичности.

Стабильность основного действующего вещества в фармацевтической композиции сильно зависит от вспомогательных компонентов, входящих состав лекарственного средства, например буферных солей, сахаров и детергентов, а также от самой формы композиции. Производные физиологически активного полипептида, такого как инсулин, содержащие в молекуле фрагменты ПЭГ и парафенилендиазония, раскрыты в публикации ИЗ 4179337 (опубл. 18.12.1979), однако их удовлетворительная стабильность не подтверждена описанием.

Существенным недостатком лиофилизатов является сложность процесса их производства. Применяемые для этого вспомогательные компоненты должны защищать конъюгат как процессе приготовления, т.е. при растворении, замораживании и высушивании, так и в процессе хранения ГЛФ. Кроме того, на стабильность активного вещества в лиофилизированных ГЛФ влияют условия лиофилизации - температура, давление, продолжительность операций замораживания и сублимации. Эти факторы также влияют на физическое состояние полученного продукта - аморфное стеклообразное, аморфное мягкое, кристаллическое или их комбинацию, что определяет фармакологические свойства. Другим недостатком лиофилизатов является необходимость восстановления лекарственной формы перед осуществлением инъекции, что требует от медицинского персонала дополнительных манипуляций и сопряжено с риском неправильного обращения с фармацевтическим продуктом. Кроме того, наиболее универсальным составом ГЛФ является тот, который стабилизирует конъюгат, находящийся как в растворе, так и в лиофилизате. Это связано с тем, что если препарат предполагается выпускать только в виде раствора, то его стандартные образцы или аналитические стандарты желательно производить в более стабильной лиофилизированной форме, причем состав последней после восстановления растворителем, по возможности, должен быть идентичен составу анализируемого препарата.

Таким образом, исходя из весьма ценных фармакологических свойств конъюгатов, содержащих азогруппу, создание на их основе единой стабильной фармацевтической композиции, пригодной как для жидких, так и для лиофилизированных форм является актуальной задачей.

Сущность изобретения

Поставленная задача согласно изобретению решается созданием фармацевтической композиции, представленной в жидкой или лиофилизированной готовой лекарственной форме (ГЛФ), содержащей пегилированный белок, в котором полиэтиленгликолевые фрагменты ковалентно присоединены к молекуле белка посредством азогрупп, отвечающий формуле (I)

где Рго! - биологически активный белок;

А - аминокислотный фрагмент гистидина;

В - аминокислотный фрагмент тирозина; η - целое число в интервале от 10 до 1200; т - целое число в интервале от 0 до 10;

к - целое число в интервале от 0 до 10, причем т Ψ к, если т или к равны 0, в форме конъюгата или смеси конъюгатов с различными значениями η, т и к,

а также фармакологически приемлемые вспомогательные ингредиенты, выбранные из сорастворителей, солей, кислот, оснований, антиоксидантов, консервантов, аминокислот, белков, углеводов, полимеров, детергентов и комплексонов.

Предпочтительно, если биологически активный белок выбран из рекомбинантных человеческих белков, таких как, например, интерферон и эритропоэтин.

- 3 029942

Более предпочтительно, если биологически активный белок является эритропоэтином и композиция представлена в виде жидкой ГЛФ.

Также более предпочтительно, если биологически активный белок является интерфероном и композиция представлена в виде лиофилизированной ГЛФ.

Альтернативно, более предпочтительно, если содержит от 0,01 до 50 мг конъюгата формулы (I), в качестве углевода содержит от 5 до 100 мг маннита, в качестве аминокислоты содержит от 0,1 до 20 мг глицина, в качестве антиоксиданта содержит от 0,1 до 10 мг Ь-метионина, в качестве детергента содержит от 0,01 до 1 мг полисорбата 80, в качестве комплексона содержит от 0,01 до 1 мг этилендиаминтетрауксусной кислоты, в качестве соли содержит от 1 до 25 мг дигидрофосфата натрия в пересчете на безводную соль, в качестве основания введен натрия гидроксид или в качестве кислоты введена кислота уксусная или кислота соляная до значения рН от 3,5 до 7,0 и в качестве растворителя содержит воду для инъекций до 1 мл.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала фармацевтических композиций, содержащих в качестве активных соединений белки, химически модифицированные с целью увеличения времени их циркуляции в кровотоке.

Предлагаемая фармакологическая композиция может быть представлена в виде раствора или в виде лиофилизата, который может быть переведен в жидкую форму путем добавления соответствующего фармакологически приемлемого растворителя и, необязательно, сорастворителя. Композиция может содержать вспомогательные вещества, такие как фармакологически приемлемые соли, введенные в нее как таковые или образовавшиеся при ее приготовлении, кислоты или основания, консерванты, аминокислоты, белки, углеводы, детергенты, полимеры, комплексоны.

Пегилированным белком Рго! может быть белок или полипептид, такой как интерферон α, интерферон β, интерферон γ, интерферон δ, эритропоэтин α, эритропоэтин β, гормон роста человека, антагонист рецептора гормона роста, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, фактор некроза опухоли, интерлейкин-1 (α или β), интерлекин-2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,18,33, уриказа, Ь-аспарагиназа.

Фармакологически приемлемым растворителем может быть вода для инъекций, бактериостатическая вода для инъекций, изотонические растворы глюкозы или хлористого натрия, растворы Рингера, Рингера-Локка и Рингера-Тироде в различных физиологически приемлемых вариантах, растворы "Дисоль", "Трисоль", "Ацесоль", "Хлосоль", "Квартасоль", "Лактасол", кровезамещающая жидкость Петрова.

Фармакологически приемлемым сорастворителем может быть этанол, пропиленгликоль, глицерин, гликофурол, жирные масла, такие как персиковое, миндальное, соевое и КоШрЬог ЕЬ™ (производитель ΒΑδΡ Согр., ΕΛδ ΡΝ 61791-12-6), представляющий собой полиоксиэтилированное касторовое масло.

Фармакологически приемлемыми солями могут быть фосфаты, ацетаты, цитраты, сукцинаты, адипинаты, лактаты, фумараты, малаты, тартраты, бензоаты, 4-аминобензоаты, карбонаты, гидрокарбонаты, хлориды, бромиды, и сульфаты натрия, аммония, кальция, магния, алюминия, 2-амино-2-гидроксиметилпропан-1,3-диола (трометамола) или калия различной степени замещения, если таковые могут существовать, физиологически переносимы и имеют приемлемую растворимость, а также их смеси, гидраты и оптические изомеры, если их образование возможно.

Фармакологически приемлемыми кислотами могут быть фосфорная, уксусная, лимонная, янтарная, адипиновая, молочная, фумаровая, яблочная, винная, бензойная, 4-аминобензойная, соляная и серная, а также их смеси, гидраты и оптические изомеры, если их образование возможно.

Фармакологически приемлемыми основаниями являются гидроксиды натрия, аммония, калия, магния, кальция, алюминия, 2-амино-2-гидроксиметил-пропан-1,3-диола (трометамола) или их смеси.

Фармакологически приемлемыми антиоксидантами являются аскорбиновая кислота, цистеин, ацетилцистеин, глутатион, унитиол, дитиотреитол, метионин, токоферолы, токотриенолы, ретинол, их соли, эфиры и оптические изомеры, если их существование возможно, а также соли пиросернистой, сернистой и 4-аминосалициловой кислот. Кроме того, для предотвращения окисления лекарственная форма может находиться в атмосфере инертных газов, таких как аргон, азот или их смесь.

Фармакологически приемлемыми консервантами являются фенол, крезол, хлоркрезол, бензиловый спирт, эфиры 4-гидроксибензойной кислоты, орто-этилртутьтиосалицилат натрия (мертиолят), хлорбутанолгидрат.

Фармакологически приемлемыми аминокислотами являются глицин, аланин, Р-аланин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, тирозин, триптофан, глутамин, глутаминовая кислота, аспарагин, аспарагиновая кислота, треонин, серин, гомосерин, цистеин, цистин, фенилаланин, гистидин, лизин, пролин, оксипролин, аргинин, метионин, карнитин, орнитин, саркозин, таурин или их соли или их смесь.

Фармакологически приемлемыми белками являются альбумин, желатин, желатоза и различные физиологически приемлемые белковые гидролизаты, в том числе пригодные для парентерального питания, а также их смесь.

Фармакологически приемлемыми углеводами являются глюкоза, фруктоза, маннит, сорбит, сахароза, трегалоза, тетрагалоза, меглумин, декстраны, циклодекстрины, гидроксиэтилированный крахмал, сиаловые кислоты или их смесь.

- 4 029942

Фармакологически приемлемыми детергентами являются полисорбаты, полоксамеры, проксанол, фосфолипиды, лецитин или их смесь.

Фармакологически приемлемыми полимерами являются полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, поливинилпирролидон, поливиниловый спирт или их смесь.

Фармакологически приемлемыми комплексонами являются этилендиаминтетрауксусная кислота, диэтилентриаминпентауксусная кислота, триэтилентетраамингексауксусная кислота или их соли или их смесь.

Более предпочтительно настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, которая включает:

от 0,01 до 50 мг конъюгата формулы (I); от 5 до 100 мг маннита; от 0,1 до 20 мг глицина; от 0,1 до 10 мг Ь-метионина; от 0,01 до 1 мг полисорбата 80;

от 0,01 до 1 мг этилендиаминтетрауксусной кислоты; от 1 до 25 мг дигидрофосфата натрия в пересчете на безводную соль; натрия гидроксид или кислоту уксусную или соляную - до рН от 3,5 до 7,0; воду для инъекций - до 1 мл.

Данную фармацевтическую композицию готовят в виде раствора путем растворения всех компонентов в воде для инъекций и последующей стерилизующей фильтрацией. При необходимости стерильный раствор может быть разлит в асептических условиях по шприцам, флаконам, картриджам или ампулам, а также заморожен и высушен.

Фармацевтическую композицию, полученную в соответствии с изобретением, можно вводить людям и животным или использовать для анализа, например в качестве аналитического стандарта. Композицию применяют в виде стандартной дозированной формы, предназначенной для парентерального, интраназального, инстиляционного, инсуфляционного и апликационного введения. Данная композиция может быть представлена в виде раствора, порошка и лиофилизата для инъекционного введения, а также в виде порошка, лиофилизата, раствора и спрея для местного и наружного применения. Лиофилизат, порошок и раствор для инъекций по данному изобретению можно вводить с помощью обычных приспособлений для инъекций, таких как шприцы, позволяющие вводить от 0,1 до 50 мл, а также инфузионнокапельно до 1000 мл композиции в виде стандартной дозы. Лиофилизат и раствор для местного и наружного применения можно вводить в виде капель, орошения или смазывания, например, обрабатывать слизистые поверхности горла, глаза, носа, а также уха.

Фармацевтическая композиция по данному изобретению может быть представлена в виде лиофилизата для приготовления раствора для внутримышечного и наружного применения, лиофилизата для приготовления раствора для внутриполостного и наружного применения, лиофилизата для приготовления раствора для инъекций; лиофилизата для приготовления раствора для внутривенного введения, лиофилизата для приготовления раствора для внутрикожного введения, лиофилизата для приготовления раствора для внутримышечного введения, лиофилизата для приготовления раствора для внутримышечного и подкожного введения, лиофилизата для приготовления раствора для инфузий, лиофилизата для приготовления раствора для инъекций в педиатрии, лиофилизата для приготовления раствора для инъекций и внутрипузырного введения, лиофилизата для приготовления раствора для инъекций и ингаляций, лиофилизата для приготовления раствора для инъекций и местного применения, лиофилизата для приготовления раствора для инъекций и накожного скарификационного нанесения, лиофилизата для приготовления раствора для инъекций и наружного применения, лиофилизата для приготовления раствора для местного и наружного применения, лиофилизата для приготовления глазных капель, лиофилизата для приготовления назального раствора, лиофилизата для приготовления назального раствора в педиатрии, лиофилизата для приготовления раствора для ингаляций, лиофилизата для приготовления раствора для наружного применения.

Фармацевтическая композиция по данному изобретению также может быть представлена в виде аэрозоля для ингаляций дозированного, аэрозоля для местного применения, аэрозоля назального, аэрозоля назального дозированного, аэрозоля для наружного применения.

Альтернативно, фармацевтическая композиция по данному изобретению может быть представлена в виде капель для местного применения, капель глазных, капель назальных, капель глазных и назальных, капель глазных и ушных, капель для приготовления полосканий рта, капель назальных в педиатрии, капель назальных и ушных, капель ушных.

Альтернативно, фармацевтическая композиция по данному изобретению также может быть представлена в виде порошка для ингаляций дозированного, порошка для приготовления раствора, порошка для приготовления раствора для внутриглазного введения и глазных капель, порошка для приготовления раствора для инъекций, порошка для приготовления раствора для внутривенного введения, порошка для приготовления раствора для внутривенного и внутримышечного введения, порошка для приготовления раствора для внутримышечного введения, порошка для приготовления раствора для внутримышечного и

- 5 029942

подкожного введения, порошка для приготовления раствора для внутриполостного введения, порошка для приготовления раствора для инфузий, порошка для приготовления раствора для подкожного введения, порошка для приготовления раствора для инъекций и местного применения, порошка для приготовления раствора для местного и наружного применения, порошка для приготовления вагинального раствора, порошка для приготовления глазных капель, порошка для приготовления раствора для эндотрахеального введения, порошка для приготовления раствора для наружного применения, порошка для приготовления капель в педиатрии.

Далее фармацевтическая композиция по данному изобретению может быть представлена в виде концентрата для приготовления раствора для инъекций, концентрата для приготовления раствора для внутривенного введения, концентрата для приготовления раствора для наружного применения, раствора для внутрибрюшного введения, раствора для внутривенного введения и ингаляций, раствора для внутрикожного введения и наружного применения, раствора для ингаляций, раствора для инъекций, раствора для внутривенного введения, раствора для внутривенного и внутримышечного введения, раствора для внутриглазного введения, раствора для внутрикожного введения, раствора для подкожного введения, раствора для внутрикожного и подкожного введения, раствора для внутримышечного ведения, раствора для внутримышечного и подкожного введения, раствора для внутрисосудистого введения, раствора для инфузий, в частности - в растворе декстрозы, в растворе натрия хлорида 0,9%, раствора для инфузий замороженного, раствора для инъекций в педиатрии, раствора для инъекций и наружного применения, раствора для накожного скарификационного нанесения, раствора для перфузий, раствора для субконъюктивального введения и закапывания в глаз, раствора для эндолимфатического введения, раствора для местного применения, раствора для наружного применения, раствора назального, раствора ректального, раствора для наружного применения пенообразующего, раствора для наружного применения и приготовления лекарственных форм, раствора для перитонеального диализа, жидкости для ингаляций.

Далее фармацевтическая композиция по данному изобретению также может быть представлена в виде спрея для местного применения, спрея для местного применения дозированного, спрея назального, спрея назального в педиатрии, спрея назального дозированного, спрея назального дозированного в педиатрии, спрея назального форте, спрея для наружного применения, спрея-порошка.

Предлагаемые композиции в виде растворов являются стабильными в соответствии с требованиями действующих нормативных документов в течение 3 лет и 6 месяцев при условии хранения при температуре от 2 до 8°С в защищенном от света месте, что подтверждено результатами исследований, приведенными в табл. 1-4.

Жидкие композиции в соответствии с изобретением при однократном и многократном введении в человеческих дозах и пятикратных человеческих дозах не проявляют острой и хронической токсичности, что характеризуется отсутствием признаков воспалительных, дистрофических и некротических процессов во внутренних органах животных по результатам гистологических исследований и плановой некропсии, а также не обнаруживается существенных различий в показателях общего и биохимического анализа крови между опытными и контрольными группами животных.

Композиции в виде растворов в соответствии с изобретением не оказывают местнораздражающего действия на глаза и не вызывают аллергических реакций гиперчувствительности немедленного и замедленного типов.

Результаты проведенных доклинических исследований показывают, что разработанная жидкая фармакологическая композиции является нетоксичной, апирогенной, не оказывает негативного влияния на системы и органы лабораторных животных.

- 6 029942

Стабильность жидких форм пегилированного эритропоэтина β при 37°С

Таблица 1

£

ПЕГ-ЭПО, мкг/мл

Маннит, мг/мл

1 1

Глицин, мг/мл

Метионин, мг/мл

Полисорбат 80, мг/мл

ЭДТА, мг/мл

ί

Содержание (%) через

1 неделю

2 недели

3 недели

4 недели

5 недель

| Агрегаты |

| Олигоформы |

ПЕГ-ЭПО |

эпо |

Агрегаты |

| Олигоформы |

ПЕГ-ЭПО |

эпо |

Агрегаты |

Олигоформы |

ПЕГ-ЭПО |

эпо |

| Агрегаты |

| Олигоформы |

ПЕГ-ЭПО |

ЭПО |

| Агрегаты |

| Олигоформы |

ПЕГ-ЭПО |

ЭПО |

1

312

40

3,12

5

1,50

0,1

0,0750

7,0

04*

сч, м⁷

СП 00

ю СП

о <Л

сч, сч*

84,8

о ж

00 сч

сч тТ

^79,6

τζ СП

СП с·*

<Л СЧ

т—Ч <Л Г-

«л

40

00 сч

78,7

т сч

2

312

40

5,46

5

1,50

0,1

0,0750

6,0

о, г-4

00

оо 8

о

’Ф ж

о\ СП

86,4

'Д 1-4

04 сп

'Т сч

82,5

сч

сч СП

СЧ сч

40 сп оо

о.

СП

40 сч

82,9

з

3

312

40

5,46

5,0

1,50

0,10

0,0750

5,0

ч. оо*

сч СП

00 40 00

'Ч

СП

04

90,2

гу тГ

СП СП

СП сч'

89,2

сч νί

<п СП

СП сч

| 87,2

о о

40 СП

сч'

гТ 00

сч, Г"'

4

156

20

9,36

12,5

0,75

0,05

0,0375

6,0

СП

чэ

з

о

Ώ. <л*

сч СП

^87,4

О\ СП

о «л

сч

88,4

«л тГ*

о\ СП

00

Г"* 00

СП г~-*

СП ’ф

04 сч'

сч 40 00

40 40

5

156

20

9,36

2,5

10,75

0,05

0,0375

6,0

<34 СП

сч

92,7

сч сч*

о,

о сч

| 9‘06 1

-¾ сп

00 СП

4Г сч'

| 89,2

40

СП

Гу

Гу 00 00

сч 40

тт"

о сч

СП $5

40 40

6

156

20

9,36

2,5

0,75

0,15

0,0375

6,0

ОО 40

о сч

89,9 |

СП

00 сч*

00 СЧ*

92,0

сч

тГ

П; с00

04 СП

<> СП

тт

Гу 00 оо

сч, 40

тТ П"

су сч'

87,0

04, «Л

7

156

20

9,36

2,5

0,75

0,45

0,0375

6,0

04 Ч-'

-

1—4 О\

04

Г' сч*

сч.

1 ⁹¹·⁵ ί

40 ’ф

Г" V

3· 00

«л, 'ί*

00 СП

сч

00 оо 00

СП «л*

04 -«г*

04

«л 58

су 40*

Стабильность жидких форм пегилированного эритропоэтина β при 20°С

Таблица 2

3

ПЕГ-ЭПО, мкг/мл

Маннит, мг/мл

| ί 2

Глицин, мг/мл

Ь-Метионин, мг/мл

Полисорбат 80, мг/мл

ЭДТА, мг/мл

Я а.

Содержание (%) через

1 месяц

2 месяца

3 месяца

6 месяцев

9 месяцев

Агрегаты |

Олигоформы

ПЕГ-ЭПО

ЭПО I 1

{

Олигоформы |

ПЕГ-ЭПО

Я Λ

Агрегаты |

Олигоформы |

ПЕГ-ЭПО |

эпо |

Агрегаты |

Олигоформы |

ПЕГ-ЭПО

ЭПО

Агрегаты |

Олигоформы |

ПЕГ-ЭПО

ЭПО

1

312

40

5,46

5,0

1,50

0,10

0,075

6,0

о сч*

<л сч

95,0

«л о*

00

СП сч

89,2

о

оо сч

СП тГ

^91,91

о.

СП СП

СП

92,9 |

г~ о

00 <ч

04 сч'

04 ОО 00

«л

2

312

40

5,46

5,0

1,50

0,10

0,075

5,0

<ч СП

^91,3

•Ч;

о СП

сч'

^92,4

•д сч

«л сч'

СП сч'

^94,3

04 О

«у тг

г~ сч

88,6

о

«л

40 сч

86,9

«л

3

156

20

9,36

12,5

0,75

0,05

0,0375

6,0

*п о

00 СП

Гу «л 04

о

сп ч·'

о. сч

90,9

00 сч*

су

сч сч

^92,61

«п о*

СП νί

СП

88,3 1

<ч СП

00 СП

о СП

85,7

«л г-*

4

156

20

9,36

2,5

0,75

0,15

0,0375

6,0

о

г~ сч*

1^95,1

сч

04 СЧ

сч

| 92,6

СЧ

су тГ

40, СП

I 90,4 I

2

>л «л

о СП

I 90,2 1

сп

сч, чг

00 сч

I 87,0

о 40

Стабильность жидкой формы пегилированного эритропоэтина β при 4°С

Таблица 3

Состав	Месяц	Содержание (%)	Активность, Ед/мл
	Агрегаты	Олнгоформы	ПЕГ-ЭПО	ЭПО
ПЕГ-ЭПО -312 мкг/мл Маннит - 40 мг/мл Ν3Η₂ΡΟ4·2Η₂Ο - 7,8 мг/мл Глицин - 5 мг/мл Ь-Метионин -1,5 мг/мл Полисорбат 80 - 0,1 мг/мл ЭДТА - 0,075 мг/мл рН6,0	3	0.8	2,2	96,2	0,8	ЗЛО²
6	1,7	2,4	94,8	1,1	3-10²
9	5,5	3,2	91,6	0,8	3-10²
12	2,3	2,9	91,7	3,1	4-10²

- 7 029942

Таблица 4

Аналитические данные, подтверждающие стабильность жидкой фармацевтической композиции ПЭГ-ЭПО при изученном сроке годности

- 8 029942

о §

03.201 0

δ

Соотв.

6,15

1

а

гствует

Соотв.

&

97

962

3,1+0,7

1010³

1

гствует

09.201 0

Соотв.

6,13

Соотв.

98

963

3,0+03

10-10³

03.201 1

Соотв.

6,10

Соотв.

98

95,8

2,7+13

10-10³

09.201 1

Соотв.

6,13

Соотв.

97

96,1

2,8+1,1

10-10³

о е

£

8

03.201 2

1

Соотв.

6,12

I

§

I

8

Соотв.

97

95,9

23+1,6

9-10³

о

I

09.201 2

Соотв.

6,08

о

Соотв.

о

96

95,7

2,3+2,0

9-10³

о

⁵

03201 3

Соотв.

6,08

Соотв.

96

95,6

2,1+23

910³

09.201 3

Соотв.

6,05

Соотв.

95

95,4

2,2+-2,4

910³

03.201 0

Соотв.

5,99

Соотв.

92

98,4

0,6+1,0

11-10³

09.201 0

Соотв.

6,01

Соотв.

92

98,2

0,6+1,2

11-10³

03.201 1

δ

Соотв.

5,98

δ

Соотв.

δ

93

98,0

0,8+12

11-10³

δ

_ё

гч тЧ Л

1

о §

09.201 1

В*

Соотв.

5,97

«п

Соотв.

ί

91

98,1

03+1,4

10-10³

1

е ^ч о

£ §

8

03.201 2

1

Соотв.

5,96

|

00 00 СП

§

I

Соотв.

|

90

97,8

0,7+1,5

10-10³

|

I

09.201 2

^и

Соотв.

5,95

и

^υ

Соотв.

90

97,9

0,5+1,6

910³

и

^ϋ

03.201 3

Соотв.

5,95

Соотв.

91

97,6

0,6+1,8

10-10³

09.201 3

Соотв.

5,93

Соотв.

89

973

03+2,2

9-10³

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Далее изобретение будет проиллюстрировано следующими примерами, подтверждающими возможность его осуществления с достижением указанного в описании технического результата.

Пример 1. Приготовление жидких фармакологических композиций ПЕГ-ЭПО.

В мерных колбах вместимостью 100 мл предварительно готовят растворы каждого вспомогательного компонента, для чего:

1) в небольшом количестве воды растворяют навеску 20,00 г маннита и конечный объем доводят водой до метки;

2) в небольшом количестве воды растворяют навеску 2,50 г глицина и конечный объем доводят водой до метки;

3) в 50 мл воды растворяют навеску 0,75 г Ь-метионина и конечный объем доводят водой до метки;

4) в небольшом количестве воды растворяют навеску 0,05 г полисорбата 80 и конечный объем доводят водой до метки;

5) в 80 мл воды растворяют навеску 0,0375 г ЭДТА и конечный объем доводят водой до метки;

6) в 50 мл воды растворяют навеску 3,90 г ΝαΗ₂ΡΟ₄·2Η₂Ο и конечный объем доводят водой до метки.

Далее все растворы фильтруют через стерилизующий фильтр с размером пор 0,22 мкм в стерильные емкости и хранят при 2-8°С.

Различные варианты жидкой фармакологической композиции ПЕГ-ЭПО готовят смешением соответствующих объемов растворов вспомогательных компонентов, прибавлением соответствующего количества раствора ПЭГ-ЭПО с концентрацией 0,624 мг/мл и 10%-ного ΝαΟΗ до необходимого значения рН. Далее растворы доводят водой до соответствующего объема, фильтруют через стерилизующий фильтр с размером пор 0,22 мкм в стерильные герметично закрывающиеся флаконы.

Пример 2. Определение стабильности жидких фармакологических композиций ПЕГ-ЭПО.

Флаконы распределяют на 3 группы и термостатируют при 4, 20 и 37°С. В процессе хранения осуществляют анализ образцов, отобранных из каждой группы, определяя специфическую активность, содержание агрегатов, олигоформ, пегилированного и свободного ЭПО. Отбор образцов, хранящихся при 4°С, осуществляют 1 раз в квартал, хранящихся при 20°С, - 1 раз в месяц, а образцов, хранящихся при 37°С, - 1 раз в неделю. Состав каждого образца анализируют эксклюзионной ВЭЖХ на колонке Зирегбех™ 200 10/300 СР (10x300 мм, 13 мкм) при комнатной температуре и расходе подвижной фазы (0,15 М ΝαίΊ в 50 мМ фосфатном буфере с рН 7) равном 0,5 мл/мин. Детектирование осуществляют спектрофотометрически при 280 нм. Одновременно определяют специфическую активность. Полученные результаты приведены в табл. 5. Исходные параметры приняты за 100%.

- 9 029942

Таблица 5

Стабильность жидкой фармакологической композиции ПЕГ-ЭПО

Время, месяцы	Определяемый параметр	Значение исследуемого параметра в % от исходного значения
4°С	20°С	37°С
6	Содержание ПЭГ-ЭПО	100	99	97
Содержание агрегатов	0	1	3
Специфическая активность	100	98	94
12	Содержание ПЭГ-ЭПО	97	97	-
Содержание агрегатов	3	3	-
Специфическая активность	100	96	-
18	Содержание ПЭГ-ЭПО	97	97	-
Содержание агрегатов	3	3	·
Специфическая активность	100	90	-

Данные подтверждают, что предлагаемая фармацевтическая композиция для приготовления жидкого лекарственного средства "Пэг-эритропоэтин, раствор для внутривенного и подкожного введения" стабильна в течение 18 месяцев.

Пример 3. Определение специфической активности жидких фармакологических композиций ПЕГЭПО измерением стимуляции образования ретикулоцитов у нормоцитемических мышей.

За 2 суток до начала исследования формируют группы на каждое разведение, рассаживая мышей на линии Р1 (СВЛхС57ВЕ, 7-9 недель) по 6 животных в клетку. Для проведения контроля на фосфатноальбуминовом буферном растворе готовят разведения образцов и международного стандартного образца эритропоэтина (мСОЭ) (ΕΏΡΜ, кат. № 1515000) с содержанием 90, 30 и 10 МЕ/мл в объеме 10 мл. В каждой группе мышам подкожно вводят по 0,5 мл раствора одного из разведений. Мышам контрольной группы вводят по 0,5 мл фосфатно-альбуминового буферного раствора,

Через 4 суток после введения у животных отбирают образцы крови (не менее 0,2 мл) и определяют число ретикулоцитов, для чего 1 мкл цельной крови добавляют к 1 мл раствора тиазола оранжевого в концентрации, удобной для определения ретикулоцитов. После окрашивания в течение 10 мин производят подсчет ретикулоцитов микрофлуориметрически в проточном цитометре, используя анализ красной флуоресцирующей гистограммы.

В работе используют международный стандарт эритропоэтина (ЕСОЭ) (Еигореап 1)п'ес1ога1е Юг Пте С)иа1йу о£ МеШсшез. Νο. Е 151500).

Для введения готовят разведения исследуемых препаратов и стандартного образца эритропоэтина в дозах 10,25 и 62,5 МЕ. Исследуемые образцы вводят однократно по 0,5 мл внутрибрюшинно в дозах 10,25 и 62,5 Ед. Дозы до введения хранят при комнатной температуре не более 4 ч.

Для исследований используют международный стандартный образец эритропоэтина (ЭПО), раствор субстанции эритропоэтина (с условным обозначением - серия № 1) и раствор пегилированного эритропоэтина (с условным обозначением - серия № 3). Расчетная активность образцов составляла примерно 2000 номинальных МЕ/мл. В табл. 6 приведены данные о номинальных и расчетных действительных дозах изученных образцов эритропоэтина, а также соответствующие поправочные коэффициенты.

Таблица 6

Номинальные (в Ед) и действительные (в МЕ) дозы и поправочные коэффициенты для исследуемых образцов эритропоэтина

Образец	Номинальные дозы, ЕД	Расчетные действительные дозы, МЕ	Поправочные коэффициенты
Раствор эритропоэтина (серия № 1)	10,0	9,1	0,910
25,0	24,9	1,000
62,5	68,5	1,009
		Среднее: 1,00 + 0,05
Раствор пегелированного эритропоэтина (серия №3)	10,0	9,8	0,98
25,0	24,7	0,99
62,5	62,5	1,00
		Среднее: 0,99 + 0,06

- 10 029942

Усредненный поправочный коэффициент близок к 1,00, таким образом, образцы эритропоэтина серии №1 и №3 в представленной расчетной активности 2000 МЕ/мл по своей эритропоэтической активности соответствуют международному стандартному образцу.

Полученные данные и результаты ранее проведенных экспериментов по изучению физикохимических свойств пегилированного эритропоэтина указывают на то, что размер прикрепленного к эритропоэтину полиэтиленгликоля незначительно экранируют активные центры ЭПО в синтезированных конъюгатах и поэтому специфическая активность в препарате сохраняется на достаточно высоких уровнях. Это дополнительно подтверждается сравнением предлагаемого лекарственного препарата "ПЭГэритропоэтин" с коммерческим препаратом пегилированного ЭПО "Мирцера" и международным стандартным образцом эритропоэтина. Результаты экспериментов представлены в табл. 7.

Таблица 7

Результаты сравнения специфической активности различных лекарственных средств, изготовленных на основе пегилированного эритропоэтина

Препарат	Специфическая активность образца, в МЕ/мг белка	% специфической активности образца, в МЕ/мг белка
Международный стандарт ЭПО*	141Ί0³	100
ПЭГ-эритропоэтин	₃₄.₁₀л	24
Мирцера	_{2θ 1θ3}	14

* Егу1йгоро1ейп ВЕР Е1515000, 35280 Ιϋ рег У1а1.

Как видно из табл. 7, остаточная специфическая активность жидкой лекарственной формы препарата "ПЭГ-эритропоэтин" в соответствии с изобретением в пересчете на активность нативного эритропоэтина составляет около 30-35%, что превосходит показатель удельной специфической активности коммерчески производимого препарата пегилированного эритропоэтина "Мирцера". Экспериментальнопроизводственные серии препарата "ПЭГ-эритропоэтин" в течение 3 лет и 6 мес. сохраняют первоначальную специфическую активность при хранении при температуре от 2 до 8°С в защищенном от света месте.

Пример 4. Доклиническое изучение токсических эффектов жидкой фармакологической композиции ПЕГ-ЭПО.

А. Определение острой токсичности жидкой фармацевтической композиции ПЕГ-ЭПО.

Исследование острой токсичности проводят на кроликах (25 животных) и мышах (50 животных), разделенных на 5 экспериментальных групп животных каждого вида животных (5 самцов и 5 самок в каждой группе). Животным 1- и 6-й групп вводят растворитель (воду для инъекций). Животным 2-, 4-, 7и 9-й групп вводят жидкую фармакологическую композицию ПЕГ-ЭПО в дозах 1,5 и 7,5 мкг/кг соответственно: во 2- и 4-й группах - внутривенно, животным 7- и 9-й групп - подкожно. Животные 3-, 5-, 8- и 10-й групп получают препарат сравнения "Мирцера" в дозах 1,5 и 7,5 мкг/кг соответственно: в 3- и 5-й группах - внутривенно, животные 8- и 10-й групп - подкожно. Таким образом, в исследованиях вводят терапевтическую и пятикратную терапевтическую дозы для человека.

На 15 день исследования животных подвергают эвтаназии с последующим осмотром макроповреждений органов, проводят отбор проб для гематологического, биохимического и гистологического исследования. В результате проведенных исследований было доказано, что применение жидкой фармакологической композиции ПЕГ-ЭПО и препарата сравнения "Мирцера" при изучении "острой токсичности" не вызывает гибели животных, не приводит к снижению массы тела, образованию воспалительных изменений и развитию некробиотических процессов в месте введения. Это свидетельствует об отсутствии симптомов интоксикации.

Б. Определение хронической токсичности жидкой фармакологической композиции ПЕГ-ЭПО.

Исследование хронической токсичности проводят на мышах (40 животных), морских свинках (80 животных) и кроликах (20 животных) из 16 экспериментальных групп. Животным в группах с нечетными номерами вводят жидкую фармакологическую композицию ПЕГ-ЭПО, животным в группах с четными номерами - препарат сравнения "Мирцера". Животные с 1- по 8-ю группы получают исследуемые препараты в дозе 2,5 мкг/кг, животные с 9- по 16-ю группу - в дозе 5 мкг/кг. Животным в 1-, 2-, 3-, 4-, 9-, 10-, 11-, 12-й группах препараты вводят внутривенно, в 5-, 6-, 7-, 8-, 13-, 14-, 15-, 16-й группах - подкожно в течение 6 недель (42 суток) два раза в неделю. Таким образом, в исследованиях вводят терапевтическую и двукратную терапевтическую дозы для человека.

На 29 день исследования и на 14 день после окончания введения жидкой фармакологической композиции ПЕГ-ЭПО и препарата сравнения (56-й день исследования) животных подвергают эвтаназии с осмотром макроповреждений органов, проводят отбор проб для гематологического, биохимического и гистологического исследования. Применение исследуемых препаратов не вызывает гибели животных, снижения двигательной и пищевой активности, изменения физиологических функций, снижения массы тела и внутренних органов, что свидетельствует об отсутствии токсического действия препарата на системы и органы лабораторных животных.

- 11 029942

При плановой некропсии проведенные патоморфологические и гистологические исследования показывают, что однократное и многократное введение препаратов "ПЭГ-ЭПО" и "Мирцера" в исследуемых дозах не вызывает развития патологических, в том числе воспалительных, дистрофических и некротических процессов во внутренних органах животных.

Результаты анализа гематологических и биохимических показателей крови лабораторных животных в "остром" и "хроническом" опыте показывают отсутствие выраженных патологических изменений показателей общего и биохимического анализа крови, а также отсутствие существенных различий между опытными и контрольными группами животных.

Препарат "ПЭГ-ЭПО" является апирогенным, так как вводится внутривенно кроликам в дозе 5 мкг/2,5 кг, так как сумма повышений температур не превышает 1,2°С.

Пример 5. Определение местного и местнораздражающего действия жидкой фармакологической композиции ПЕГ-ЭПО при подкожном и внутривенном введении.

А. Местное действие.

Местное действие при подкожном введении оценивают на 30 морских свинках в трех группах (по 15 животных в группе) путем введения препарата ПЭГ-ЭПО и физиологического раствора по 0,5 мл подкожно в дозе 1,5 и 15 мкг/250 г массы тела морской свинки. Неспецифическую воспалительную реакцию на введение препаратов оценивают с 24 ч до 7 суток включительно.

Полученные данные свидетельствуют, что препарат "ПЭГ-Эритропоэтин" не обладает воспалительным эффектом при внутрикожном введении морским свинкам и не отличается от уровня воспалительной реакции у контрольных животных, которым вводили физиологический раствор. Таким образом, изучение местного действия препарата "ПЭГ-Эритропоэтин" при подкожном введении морским свинкам показало отсутствие каких-либо патологических изменений в месте введения и регионарных лимфоузлах.

Изучение местного действия при внутривенном введении препарата кроликам проводят на 8 кроликах в двух группах (по 4 особи в группе) путем введения препарата ПЭГ-ЭПО по 1 мл в краевую ушную вену в дозе 1,5 и 15 мкг. Оценку местного действия осуществляют на основании данных осмотра, проводимого в течение 7 суток после примирования препаратов, а также результатов гистологического исследования.

На основании проведенных исследований установлено, что при внутривенном введении кроликам отсутствуют патологических изменения в месте введения и регионарных лимфоузлах.

Б. Местнораздражающее действие.

Пробу на местнораздражающее действие проводят по модифицированному методу Драйза на трех кроликах. Препарат "ПЭГ-Эритропоэтин" в дозе 5 мкг/2,5 кг массы тела кролика наносят на правое нижнее веко кролика и придерживают веки закрытыми в течение 1 с. Реакцию регистрируют через 24, 48, 72 ч и на 7-е сутки. При регистрации результатов конъюнктивальной пробы у трех кроликов через 24 ч отмечалось кратковременное расширение некоторых сосудов конъюнктивы.

С учетом результатов экспериментов препарат "ПЭГ-ЭПО" при воздействии на слизистые не обладает раздражающем эффектом.

Пример 6. Исследование аллергизирующих свойств жидкой фармакологической композиции ПЕГ-ЭПО.

А. Изучение гиперчувствительности немедленного типа.

Исследование гиперчувствительности немедленного типа проводят на модели морских свинок с массой тела 250 г (240-260 г). Для этого опытной группе из 6 животных трехкратно через 1 сутки вводят жидкую фармакологическую композицию ПЕГ-ЭПО в дозе 2,5 мкг/кг на одну инъекцию (соответствует одной дозе для человека): первая инъекция подкожно, две последующие - внутримышечно. На 21-е сутки, после первой инъекции, внутрисердечно вводят разрешающую дозу, равную суммарной сенсибилизирующей дозе 7,5 мкг/кг. Контрольной группе (6 морским свинкам) по той же схеме, что и опытной группе, вводят физиологический раствор по 0,5 мл на одну инъекцию. После введения разрешающей дозы жидкой фармакологической композиции ПЕГ-ЭПО у морских свинок не было зарегистрировано ни одного типа реакции гиперчувствительности немедленного типа.

Б. Изучение гиперчувствительности замедленного типа.

Исследование аллергизирующего действия гиперчувствительности замедленного типа проводят на мышах линии Ва1Ь/с (30 животных массой 20-21 г, 2 опытные и 1 контрольная группы) в плантарном тесте в условиях интенсивной сенсибилизации мышей. Индекс реакции гиперчувствительности замедленного типа при введении жидкой фармакологической композиции ПЕГ-ЭПО достигает 2,19, что указывает на слабое раздражающее действие препарата.

На основании проведенных экспериментов сделан вывод, что жидкая фармацевтической композиции ПЕГ-ЭПО не обладает аллергизирующим действием в реакции гиперчувствительности немедленного и замедленного действия, что подтверждает ее иммунологическую безопасность.

Пример 7. Изучение иммуногенных свойств жидкой фармакологической композиции ПЕГ-ЭПО.

В качестве биологических моделей используют морских свинок обоего пола массой 240-260 г и кроликов породы Шиншилла обоего пола массой 2,5 кг. Лабораторных животных распределяют на 10 групп: 4 опытные и 6 контрольных.

- 12 029942

На 56- и 92-й день исследования у животных всех опытных и контрольных групп проводят отбор крови. Из крови готовят сыворотку обычным методом: пробы крови инкубируют в течение 45 мин при 37°С, после чего отделяют тромб и повторно инкубируют при 4°С. Полученную сыворотку центрифугируют при 3500 об/мин и сохраняют при -65°С до проведения тестов.

Титр антител в сыворотках, полученных в результате иммунизации животных немодифицированным эритропоэтином-бета и жидкой фармакологической композиции ПЕГ-ЭПО, определяют прямым твердофазным иммуноферментным анализом (ТИФА). Для этого в лунки микропланшета вносят по 0,1 мл раствора немодифицированного эритропоэтина-бета в концентрации 200 нг. Антисыворотки, полученные от разных групп животных, вносят по 0,1 мл в лунки планшета в серии из последовательных разведений в два раза. Для детекции образовавшегося иммунного комплекса используют антивидовые иммуноглобулины, конъюгированные с пероксидазой (производитель - §1§та). Измерения проводят с помощью планшетного фотометра Вю-Каб Мобе1 680.

В проведенных исследованиях показано, что некоторые исследуемые образцы в различных дозировках обладают иммуногенной активностью и стимулируют выработку специфических антител у морских свинок и кроликов на 56-и 92-й дни.

Средний титр антисыворотки после введения немодифицированного ЭПО составляет у морских свинок на 56-й день - 1/418, на 92-й день - 1/580; у кроликов на 56-й день -1/670, на 92-й день - 1/1050.

Средний титр антисыворотки после введения жидкой фармакологической композиции ПЕГ-ЭПО составляет у морских свинок на 56-й день - 1/46, на 92-й день - 1/92; у кроликов на 56-й день - 1/56, на 92-й день - 1/106. Таким образом, иммуногенность жидкой фармакологической композиции ПЕГ-ЭПО в 8-10 раз ниже, чем у немодифицированного ЭПО.

Результаты проведенных исследований доказывают, что разработанная жидкая фармацевтическая композиция лекарственного средства "ПЭГ-ЭПО" в составе активного действующего вещества (молекулы конъюгата ПЕГ-ЭПО) и вспомогательных веществ (стабилизаторов), является низкоиммуногенным лекарственным средством.

Пример 8. Изучение фармакокинетических характеристик жидкой фармакологической композиции ПЕГ-ЭПО.

А. Исследование на мышах.

Приготовленную жидкую фармакологическую композицию ПЭГ-ЭПО оценивают по параметру пролонгации циркуляции в крови лабораторных животных. В качестве сравнения используют препарат "Мирцера" (производитель - Р. Нойтаии-Ьа РосНе Иб., серия Н0481Н02), раствор для внутривенного и подкожного введения в шприц-тюбике по 150 мкг/0,3 мл, годен до 02.2014 г.

В качестве биологических моделей используют 96 мышей линии СВА массой 18-20 г, полученных из питомника РАМН (п. Андреевка). Животных распределяют на три группы по 24 животных для каждого препарата, одна группа из 4 животных является контрольной.

После распределения лабораторных животных на четыре группы по 24 животных для каждого препарата и одну контрольную группу из 4 животных вводят исследуемые образцы по следующей схеме: в первый день мышам однократно подкожно в межлопаточную область вводят по 5 мкг (в пересчете на содержание белка-эритропоэтина) в 0,1 мл раствора исследуемого препарата "ПЕГ-ЭПО", непегилированную молекулу этропоэтина и препарат сравнения "Мирцера". Далее забирают кровь через 2, 6, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216 и 240 ч после введения препаратов. В контрольной группе вводят 0,1 мл физиологического раствора.

Отбор крови для изучения фармакокинетики осуществляют единовременным отбором крови от двух мышей на каждую точку исследования. Из образцов крови готовят сыворотку обычным методом: пробы крови инкубируют в течение 45 мин при 37°С, после чего отделяют тромб и повторно инкубируют при 4°С, полученную сыворотку центрифугируют при 3500 об/мин и сохраняют при -65°С до проведения тестов.

Концентрацию эритропоэтина в сыворотках крови определяют с помощью метода иммуноферментного анализа с набором реагентов "Эритропоэтин-ИФА-БЕСТ" А-8776 (производитель - ЗАО "ВекторБест", серия № 20) в соответствии с прилагаемой инструкцией. Измерения проводят с помощью планшетного фотометра Вю-Каб Мобе1 680.

- 13 029942

Таблица 8

Значения концентраций исследуемых препаратов в сыворотке крови мышей после подкожного введения

По результатам исследований, представленным в табл. 8, с помощью программы ОпдшРго 9.0.0 (разработчик - ОпдтЬаЪ Согр.) рассчитывают следующие фармакокинетические параметры:

Т_тах - время установления максимальной концентрации;

С_тах - величина максимальной концентрации;

ЛиС_о-1 - площадь под фармакокинетической кривой "концентрация-время";

У_б - объем распределения;

Т_1/2 - период полувыведения;

С_тах/ЛиС_о-1 - относительная скорость всасывания;

СЬ - клиренс,

значения которых представлены в табл. 9.

Таблица 9

Значения фармакокинетических параметров

Параметр	Среднее значение концентрации ЭПО в крови, нг/мл
«Мирцера»	Жидкая фармакологическая композиция ПЕГ-ЭПО	Эритропоэтин
Ттм, Ч	96	120	24
Стах. НГ/МЛ	363	412	287
СЬ, мл/ч	0,01	0,01	0,4
ν<\|, мл	1,35	1,22	17,42
Й/2,4	101	100	29

Значения концентрации ЭПО в крови животных для изучаемых препаратов статистически достоверно различаются, при этом концентрационные и временные профили в целом сходны. Композиция в соответствии с изобретением позволяет создавать в крови несколько более высокую концентрацию активного вещества.

Б. Исследование на кроликах.

В экспериментах используют кроликов породы шиншилла массой 2,5-3,0 кг. Животных распределяют на четыре группы: первой опытной группе из 2 животных композицию вводят подкожно в количестве 3 мкг/мл, второй - подкожно 10 мкг/кг, третьей - внутривенно 3 мкг/мл, четвертая группа является контрольной.

Кровь после введения препарата забирают в следующие временные промежутки: 0, 0,5, 24, 48, 72, 96, 120 и 144 ч. Забор крови проводят из ушной вены в объеме 2-3 мл на каждую точку исследования.

Из образцов крови готовят сыворотку обычным методом: пробы крови инкубируют в течение 45 мин при 37°С, после чего отделяют тромб и повторно инкубируют при 4°С, полученную сыворотку центрифугируют при 3500 об/мин и сохраняют при -65°С до проведения тестов.

Концентрацию эритропоэтина в сыворотках крови определяют с помощью метода иммуноферментного анализа с набором реагентов "Эритропоэтин-ИФА-БЕСТ" А-8776 (производитель - ЗАО "Вектор-Бест", серия № 20) в соответствии с прилагаемой инструкцией. Измерения проводят с помощью планшетного фотометра Вю-Каб Мобе1 680.

- 14 029942

Таблица 10

Значения концентраций жидкой фармакологической композиции ПЕГ-ЭПО в сыворотке крови кроликов

после подкожного и внутривенного введения

Время отбора крови,ч	Среднее значение концентрации ЭПО в крови, нг/мл.
внутривенно	подкожно
3 мкг/кг	3 мкг/кг	10 мкг/кг
0	0	0	0
0,5	1	-	-
24	68,5	35,5	46,5
48	17	19,5	47,5
72	9	11,5	17
96	4	6	11
120	3	4	6,5

По результатам исследований, представленным в табл. 10, с помощью программы ОпдщРго 9.0.0 (разработчик -Оп§1пЬаЪ Согр.) рассчитывают следующие фармакокинетические параметры:

С_тах - величина максимальной концентрации;

У_а - объем распределения;

Т₁/₂ - период полувыведения;

СИ - клиренс,

значения которых представлены в табл. 11.

Таблица 11

Значения фармакокинетических параметров

Параметр	Среднее значение расчетных фармакокинетических параметров
внутривенно	подкожно
3 мкг/кг	3 мкг/кг	10 мкг/кг
Тщах, Ч	27,03	19,70	33,34
Сии*, НГ/МЛ	105,57	36,02	52,17
АиСо-1, (нг-ч)/мл	2160,67	1954,63	3192,08
Уа, мл	28,42	83,29	191,68
1щ, Ч	14,19	37,61	42,41
Стах/АиСо-ι, Ч^-1	4,89· 10“^ζ	! _>84.₁₀-а	1,63-КГ⁴
СЬ, мл/ч	1,39	1,53	3,13

Из приведенных результатов расчета очевидно, что подкожное введение дает пролонгированную циркуляцию препарата в крови.

Пример 9. Приготовление лиофилизированной фармакологической композиции ПЭГ-ИНФ.

Предварительно готовят 5-кратный концентрат вспомогательных компонентов путем растворения в мерной колбе вместимостью 100 мл 20,0000 г маннита, 2,50 г глицина, 0,75 г И-метионина, 0,05 г полисорбата 80,0,0375 г ЭДТА и 3,90 г ХаН₂РО₄-2Н₂О в 90 мл воды и доведением конечного объема до метки. Далее полученный концентрат фильтруют через стерилизующий фильтр с размером пор 0,22 мкм в стерильные емкости и хранят при 2-8°С не более 5 дней.

Для приготовления фармакологической композиции к 10 мл концентрата приливают 50 мл раствора ПЭГ-ИНФ с концентрацией 0,3 мг/мл и 35 мл воды, добавлением 10% ХаОН значение рН 6,0 доводят и конечный объем доводят водой до 100 мл. Полученный раствора пропускают через стерилизующий фильтр с размером пор 0,22 мкм и разливают в асептических условиях по 1 мл в стерильные флаконы. Далее флаконы загружают в лиофильную сушилку, замораживают и сушат в асептических условиях при пониженном давлении в течение 72 ч.

Пример 10. Изучение стабильности лиофилизированной фармакологической композиции ПЭГ-ИНФ.

Флаконы закладывают на хранение при 4°С, отбирая образцы 1 раз в 3 месяца. В каждом отобранном образце определяют специфическую активность, содержание агрегатов, олигоформ, пегилированного и свободного ИНФ и другие показатели по спецификации ФСП. Для этого содержимое каждого флакона восстанавливают в 0,5 мл воды и полученный раствор анализируют эксклюзионной ВЭЖХ на колонке 8ирег4ех™ 200 10/300 ОИ (10x300 мм, 13 мкм) при комнатной температуре и расходе подвижной фазы (0,15 М ХаС1 в 50 мМ фосфатном буфере с рН 7) равном 0,5 мл/мин. Детектирование осуществляют спектрофотометрически при 280 нм. Результаты анализов представлены в табл. 12.

- 15 029942

Как видно из табл. 12, лиофилизированная фармакологическая композиция ПЭГ-ИНФ, укупоренные во флаконы темного стекла типа 1 (Еиг. РЕ, ИЗР), соответствуют требованиям проекта ФСП по параметру стабильность в течение 2 лет и 3 месяцев при условии хранения при температуре от 2 до 8 °С в защищенном от света месте.

Таблица 12

Аналитические данные, подтверждающая стабильность лиофилизированной фармацевтической композиции ПЭГ-ИФН при изученном сроке годности

Описание	Порошок белого цвета, не содержащий посторонних включений. Гигроскопичен.
Подлинность	А	Должен обладать специфической активностью.
Б	Время удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого образца соответствует времени удерживания основного пика на хроматограмме стандартного образца.
Время растворения	Должен раствориться в течение 3 минут.
Прозрачностьвосстановленного раствора	Растворенный препарат должен выдерживать сравнение с эталоном I.
Цветность восстановленного раствора	Растворенный препарат должен выдерживать сравнение с эталоном Υ.
рН	От 5,5 до 6,5
Механические включения	Должен соответствовать требованиям при определении видимых частиц.
Потеря в массе при высушивании	Не более 10 %.
Точность розлива	Коэффициент вариации по сухому веществу не более 10 %
Стерильность	Должен быть стерильным.
Бактериальные эндотоксины	Не более 25 ЭС в 0,5 мл.
Аномальная токсичность	Должен быть нетоксичен.
Количественное определение	От 85 до 115 % от заявленного количества.
Чистота	Не менее 85 %.
Посторонние соединения (родственные соединения)	Не более 10 % поли пэгинтерферонов альфа-2Ь и не более 5 % интерферона альфа-2Ь.
Специфическая активность	От 1 · 10⁷ до 3· 10’ МЕ/мг белка.

№ серии,дозировка \|	Дата контроля	Описание	Подлинность	Время растворения, мин	Прозрачность восстановленного раствора	Цветность восстановленного	раствора У	£	Механические включения	Потеря в массе при высушивании	Точность розлива	1 {	Бактериальные эндотоксины	Аномальная Токсичность	Количественное определение	я 1	Цосторонние соединения (родственные соединения)	Специфическая активность
А	Б
	07.09			Соотв.	13				6,30		5,5	3				98	92,4	6,6+1	2,7-10⁷
	10.09			Соотв.	1,5				6,30		5,0	2				98	92,6	6,1+13	2,7-10⁷
	01.10			Соотв.	13				635		63	3		§ •п о г а «л οί		98	91,7	6,1+1,2	2,5-10⁷
&	04.10	&	к	Соотв.	13	Б	&		6,33	гствует	53	2		£	97	913	6,2+2,3	2,5-Ю⁷
8	07.10			Соотв.	13		§		633	5,6	2	8 §		97	91,4	6,2+2,4	2,3-10’
010709,	10.10	\|	1	Соотв.	13	1			6,30		5,4	2		\|	97	91,7	63+3,0	2,2-Ю⁷
01.11	δ	δ	Соотв.	13	δ	δ		6,30		6,0	2		о «	δ	97	90,8	5,9+3,3	23-Ю⁷
	04.11			Соотв.	1,5				6,25		5,3	3		§		97	90,1	5,6+3,3	23-Ю⁷
	07.11			Соотв.	13				6,28		5,5	3				97	90,0	53+4,7	23-Ю⁷
	10.11			Соотв.	13				6,30		6,0	3				96	89,9	5,3+4,8	2,1-10’
	07.09			Соотв.	2				6,10		5,8	2				101	96	2,2+1,8	23-Ю⁷
	10.09			Соотв.	2				6,12		5,7	2				98	96,4	23+1,8	2,4-10’
	01.10			Соотв.	2				6,05		5,8	3		1 о		98	96,2	2,3+13	2,4-10’
и	04.10	£	£	Соотв.	2	1	£		6,00		5,9	2		δ	98	95,9	2,0+2,1	2,4-10’
3	07.10			Соотв.	2		угветств		6,00		5,8	2	δ §	я а <ч		98	95,8	1,9+2,3	23-Ю⁷
ί	10.10	§	ё	Соотв.	2	1		5,95	1	53	2	1	\|	98	95,4	1,8+2,8	2,3-10’
3 о	01.11	δ	δ	Соотв.	2	δ	δ		5,90	δ	5,4	2		Менее 1	δ	98	95,1	1,8+3,1	2,3-10’
	04.11			Соотв.	2				5,90		5,7	3			98	94,5	1,544,0	2,3-10’
	07.11			Соотв.	2				5,92		5,6	3				97	943	1,6+3,9	2,3-10’
	10.11			Соотв.	2				5,95		5,6	3				97	94,3	1,244,5	2,2-10’

- 16 029942

030709,50 мкг	07.09	Соответствует	Соответствует	Соогв.	1,5	Соответствует	Соответствует	6,25	Соответствует	24	2	[ Стерилен \|	Менее 12,5 ЕЭ на 0,5 мл	Соответствует	95	98,5	1,0+04	2410⁷
10.09	Соогв.	14	6,20	2,4	2	95	98,4	1,1+0,5	24-Ю⁷
01.10	Соотв.	14	6,23	2,5	2	95	97,6	1,0+1,4	2,5-10⁷
04.10	Соотв.	1,5	6,15	2,6	2	94	97,8	1,1+1,1	2,5-10⁷
07.10	Соотв.	14	6,10	2,8	3	94	974	1,0+14	2,5-10⁷
10.10	Соотв.	14	6,15	2,0	2	94	974	1,1+1,4	2,4-10⁷
01.11	Соотв.	14	6,10	24	2	91	97,3	1,0+1,7	2,4-10⁷
04.11	Соотв.	14	6,05	2,7	2	91	96,2	0,9+2,9	2,4-10⁷
07.11	Соотв.	14	6,10	2,1	2	91	96,4	0,8+2,8	2,4-10⁷
10.11	Соотв.	14	6,05	2,0	2	90	96,0	0,5+34	2,4-10⁷
	07.09			Соотв.	14			6,40		4,5	3				103	98,1	14+0,4	2,7-10⁷
	10.09			Соотв.	14			6,38		4,0	2				101	97,8	1,4+0,8	2,5-10⁷
	01.10			Соотв.	14			6,30		4,0	4		§		100	97,6	1,4+1,0	2,5-10⁷
	04.10	δ	δ	Соотв.	14	δ		6,31	δ	4,2	3		о	δ	100	97,4	14+1,4	2,6-10⁷
£ §	07.10			Соотв.	14			645		4,1	2	в О	Ж 2	>.	100	97,8	1,1+1,1	2,6-10⁷
ί	10.10		рз	Соотв.	1,5	\|	со δ	6,30	Β	4,2	3	δ	оГ		98	964	1,1+2,7	24-Ю⁷
1	01.11	δ	δ	Соотв.	14	о О	ο υ	6,28	δ	4,0	2		8	о О	98	96,1	1,0+2,9	2,5-10⁷
	04.11			Соотв.	14			6,25		4,0	2		Ж 2		99	95,5	0,8+3,7	2,5-10⁷
	07.11			Соотв.	14			6,25		4,4	3				98	95,1	0,6+4,3	2,4-10⁷
	10.11			Соотв.	14			6,28		44	3				98	94,9	0,6+44	2,4-10⁷
	07.09			Соотв.	14			6,22		5,1	3				97	97,5	2,4+0,1	2,8-10⁷
	10.09			Соотв.	14			6,25		5,2	2				97	97,4	2,3+0,3	2,8-10⁷
	01.10			Соотв.	14			6,20		5,0	3		10,5 мл		95	97,2	2,1+0,7	2,9-10⁷
и г*	04.10	δ	δ	Соотв.	1,5	δ	δ	6,20	δ	4,9	3		δ	96	96,6	2,0+1,4	2,7-10⁷
£			Л*			&		δ				я
§	07.10	£	δ	Соотв.	14	δ	6,15	4,8	3		2	Б	94	97,0	2,1+0,9	2,7-10⁷
1	10.10		£	Соотв.	14		1	6,19	Β	5,0	2		«о οί		94	96,9	2,0+1,1	24-Ю⁷
о	01.11	δ	δ	Соотв.	14	δ	δ	6,20	(§	5,2	3			и	92	96,3	1,9+1,8	2,5-10⁷
	04.11			Соотв.	1,5			6,05		4,9	3		1		91	95,8	1,8+2,4	2,5-Ю⁷
	07.11			Соотв.	14			6,08		4,8	2				90	95,4	1,7+2,9	2,4-10⁷
	10.11			Соотв.	14			6,00		5,0	3				90	95,5	1,6+2,9	2,4-10⁷
	07.09			Соотв.	2			6,10		4,2	2				94	96,1	3,5+0,4	2,8-10⁷
	10.09			Соотв.	2			6,10		4,1	2				94	96,0	3,4+0,6	2,7-10⁷
	01.10			Соотв.	2			6,08		4,1	2		§		95	95,8	3,3+0,9	2,7-10⁷
Ь	04.10	δ	δ	Соотв.	2	δ	δ	6,12	δ	4,0	2		о'	δ	93	95,7	3,1+14	2,7-10⁷
£		>»	>.				&			X	ж	>>
£	07.10	Ь	$	Соотв.	2	5	Ι	6,05	<3	4,5	2		2		93	95,4	3,1+14	2,7-10⁷
1	10.10		£	Соотв.	2	1	ь β	6,02	Β	3,8	2	I	3	£	92	95,1	3,2+1,7	2,7-10⁷
ξ о	01.11	δ	δ	Соотв.	2	δ	δ	6,00	δ	4,2	2		ϊ	δ	92	94,6	3,0+2,3	2,6-10⁷
	04.11			Соотв.	2			6,00		3,9	2				92	944	24+3,3	2,6-10⁷
	07.11			Соотв.	2			5,95		4,0	3				91	94,3	2,1+3,6	2,6-10⁷
	10.11			Соотв.	2			5,80		4,5	2				89	94,1	1,9+4,0	2,6-10⁷
	07.09			Соотв.	14			6,41		7,0	2				98	95,5	4,2+0,3	2,5-10⁷
	10.09			Соотв.	14			6,39		64	3				97	95,8	4,0+0,2	2,5-10⁷
	01.10			Соотв.	14			6,45		64	4		§		98	95,4	3,9+0,7	2,5-10⁷
ι мкг	04.10	1	δ	Соотв.	14	1	1	6,38	тствует	6,0	3	X	2 св Ж	δ	97	954	3,9+0,8	2,5-10⁷
§	07.10		£	Соотв.	14	0		647	6,2	2	о	2	5	96	95,0	3,8+14	2,4-10⁷
ί	10.10		§	Соотв.	14	1	1	645	Соотве	6,0	3	δ	сч		95	94,8	3,6+1,6	2,4-10⁷
£ о	01.11	δ	δ	Соотв.	14	δ	δ	648	64	2		8	δ	94	94,7	3,2+2,1	2,4-10⁷
	04.11			Соотв.	14			640		6,0	3		1		94	94,4	3,0+2,6	2,3-10⁷
	07.11			Соотв.	14			6,25		6,1	3				94	94,2	2,9+2,9	2,3-10⁷
	10.11			Соотв.	14			6,28		6,0	2				92	93,8	2,5+3,7	2,3-10⁷

- 17 029942

- 18 029942

141009,150 мкг	07.09	Й	Соответствует	Соотв.	1	Соответствует	Соответствует	5,95	Соответствует	33	3	\| Стерилен \|	Менее 12,5 ЕЭ на 0,5 мл	Соответствует	96	98,1	1,7+0,2	2,5-10⁷
10.09	Соотв.	1	5,90	3,2	3	95	97,5	1,6+0,9	2,5-10⁷
01.10	Соотв.	1	5,98	3,3	3	95	97,3	1,5+-1,2	23-10⁷
04.10	Соотв.	1	6,00	3,0	3	94	97,4	1,4+-1,2	2,5-10⁷
07.10	Соотв.	1	5,95	зз	3	95	97,1	1,2+-1,7	23· Ю⁷
10.10	Соотв.	1	5,98	33	3	93	96,5	1,1+-2,4	2,5-10⁷
01.11	Соотв.	1	5,95	3,0	3	93	95,9	1,0+3,1	2,4-10⁷
04.11	Соотв.	1	5,90	3,1	3	93	95,4	1,0+3,6	2,4-10⁷
07.11	Соотв.	1	5,98	3,2	3	92	953	0,9+3,6	2,4-10⁷
10.11	Соотв.	1	5,95	3,2	3	92	95,0	0,9+4,1	2,4-10⁷
151009,150 мкг	07.09	Соответствует	Соответствует	Соотв.	1Л	Соответствует	Соответствует	6,30	Соответствует	23	3	\| Стерилен \|	Менее 12,5 ЕЭ на 0,5 мл	Соответствует	98	98,8	0,9+0,3	2,6-10⁷
10.09	Соотв.	1,5	6,26	2,4	3	98	98,5	0,9+0,6	2,6-10⁷
01.10	Соотв.	13	6,35	23	3	97	98,4	0,8+0,8	2,7-10⁷
04.10	Соотв.	1,5	6,28	2.6	3	97	98,1	0,8+1,1	2,6-10⁷
07.10	Соотв.	1,5	6,12	2,0	4	97	97,9	0,8+1,3	2,6-10⁷
10.10	Соотв.	13	6,10	2,1	3	96	97,6	0,7+1,7	2,6-10⁷
01.11	Соотв.	1,5	6,13	2,2	3	96	97,4	0,6+2,0	2,5-10⁷
04.11	Соотв.	1,5	6,20	23	3	96	97,3	0,5+2,2	2,5-10⁷
07.11	Соотв.	1,5	6,05	2,6	2	96	97,1	0,4+2,5	23· Ю⁷
10.11	Соотв.	1,5	6,25	2,8	2	95	96,5	0,3+3,2	23· Ю⁷
161009,150 мкг	07.09	Соответствует	Соответствует	Соотв.	13	Соответствует	Соответствует	6,10	Соответствует	3,0	4	\| Стерилен \|	Менее 12,5 ЕЭ на 0,5 мл	Соответствует	95	98,9	0,9+0,2	2,6-10⁷
10.09	Соотв.	1,5	6,10	3,1	2	95	98,7	0,9+0,4	2,6-10⁷
01.10	Соотв.	13	6,05	3,2	4	95	98,6	0,8+0,6	2,6· 10⁷
04.10	Соотв.	13	6,08	3,5	2	94	98,4	0,7+0,9	2,5· Ю⁷
07.10	Соотв.	13	6,02	2,9	4	93	98,0	0,7+13	23· Ю⁷
10.10	Соотв.	13	5,99	3,0	4	93	97,6	0,6+1,8	2,5· Ю⁷
01.11	Соотв.	13	5,99	3,0	3	92	97,1	0,5+2,4	2,4-10⁷
04.11	Соотв.	13	5,95	2,9	3	92	96,8	0,5+2,7	2,4-10⁷
07.11	Соотв.	13	5,90	2,5	3	92	95,9	0,4+3,7	2,4-10⁷
10.11	Соотв.	13	5,91	3,0	2	89	95,5	0,4+4,1	2,3-10⁷

Пример 11. Определение специфической активности лиофилизированной фармакологической композиции ПЭГ-ИНФ.

Противовирусную специфическую активность (СА) немодифицированного интерферона а-2Ь и фармацевтической композиции, содержащей конъюгат моноПЭГ-ΙΝΡ а-2Ь определяли ίη νίίΐΌ в культуре линий клеток ΜΏΒΚ (производитель - "Биолот"), чувствительных к интерферону альфа-типа, полученных на 10-28 пассаже, зараженных вирусом везикулярного стоматита.

Результаты сравнительного исследования с использованием коммерческих препаратов пегилированного интерферона "Пегасис" и "ПегИнтрон" и международного стандартного образца немодифицированного интерферона представлены в табл. 13.

Таблица 13

Результаты сравнения специфической активности различных лекарственных средств, изготовленных на основе пегилированного интерферона

Препарат	СА образца, МЕ/мг белка	% СА от нативного интерферона
ΙΝΡ а-2Ъ	200*10^б	100
Препарат ПЭГ-ИФН альфа-2Ь*	64*10^б	32
ПегИнтрон	52*10^б	26
Пегасис	2*10^б	1

* Приготовлен в соответствии с изобретением.

Размер и строение прикрепленного к интерферону полиэиленгликоля незначительно снижает противовирусную активность за счет экранирования активных центров ИНФ.

В следующей серии экспериментов было установлено, что значения СА в растворе и в лиофилизате существенно не отличаются и после хранения в течение 42 месяцев специфическая активность лиофилизата не изменяется (табл. 14). Специфическая активность готовой лекарственной формы препарата "ПЭГ-интерферона альфа-2Ь", приготовленного в соответствии с изобретением, сопоставима со специ- 19 029942

фической активностью препарата "ПегИнтрон" (23-28%) и значительно превосходит таковую у препарата "Пегасис" (0,5-3%).

Таблица 14

Результаты изучения специфической активности препарата "ПЭГ-интерферона альфа а-2Ъ"

Препарат	Специфическая активность,МЕ/мг
ΙΝΡα-26	200-10®
ПЭГ-ΙΝΡ а-2Ь до внесения стабилизатора	64-10®
ПЭГ-ΙΝΡ а-2Ъ после внесения стабилизатора до лиофилизации	64-10®
ПЭГ-ΙΝΡ а-2Ь после лиофилизации	69-10®
ПЭГ-ΙΝΡ а-2Ь (серия ΡΑΙ493 е§1.) после лиофилизации и 42 месяцев хранения	62-10®

Пример 12. Доклиническое изучение токсических эффектов лиофилизированной фармакологической композиции ПЕГ-ИФН.

А. Определение острой токсичности лиофилизированной фармакологической композиции ПЭГИНФ.

Исследование острой токсичности проводят на мышах (50 животных) и морских свинках (50 животных) в пяти экспериментальных группах каждого вида животных по 5 самцов и 5 самок в каждой группе. Животным 1-й группы вводят растворитель (воду для инъекций). Животным 2- и 4-й групп вводят тестируемую фармакологическую композицию ПЭГ-ИНФ, животные 3- и 5-й групп получают препарат сравнения "ПегИнтрон" (производитель - 8сЬепп§-Р1ои§Ь). В исследовании используют терапевтическую и десятикратную терапевтическую дозы для человека.

На 15-й день исследования животных подвергают эвтаназии с осмотром макроповреждений органов, проводят отбор проб для гематологического, биохимического и гистологического исследования. Применение фармакологической композиции ПЭГ-ИФН и препарата сравнения "ПегИнтрон" при изучении острой токсичности не вызывает гибели животных, не приводит к снижению массы тела, образованию воспалительных изменений, развитию некробиотических процессов в месте введения, что свидетельствует об отсутствии симптомов интоксикации.

Б. Определение хронической токсичности лиофилизированной фармакологической композиции ПЭГ-ИНФ.

Исследование хронической токсичности проводят на мышах (100 животных) и морских свинках (100 животных) в пяти экспериментальных группах каждого вида по 10 самцов и 10 самок в каждой группе. Животным 1-й группы вводят растворитель (воду для инъекций). Животным 2- и 4-й групп вводят тестируемую фармакологическую композицию ПЕГ-ИФН, животные 3- и 5-й групп получают препарат сравнения "ПегИнтрон". Препараты вводят в течение 28 суток. В исследовании используют терапевтическую и десятикратную терапевтическую дозы для человека.

На 29- и 43-й день исследования животных подвергают эвтаназии с осмотром макроповреждений органов, проводят отбор проб для гематологического, биохимического и гистологического исследования. В ходе исследования не наблюдается гибели животных снижения двигательной и пищевой активности, изменений физиологических функций, не происходит снижение массы тела и внутренних органов, что свидетельствует об отсутствии токсического действия препарата на системы и органы лабораторных животных.

При плановой некропсии проведенные патоморфологические и гистологические исследования показывают, что однократное и многократное введение препаратов "ПЭГ-Интерферон" и "ПегИнтрон" в дозах 1,5 и 15 мкг/кг не вызывает развития патологических, в том числе воспалительных, дистрофических и некротических процессов во внутренних органах животных. Результаты анализа гематологических и биохимических показателей крови лабораторных животных в "остром" и "хроническом" опыте показывают отсутствие выраженных патологических изменений показателей общего и биохимического анализа крови, а также отсутствие существенных различий между опытными и контрольными группами животных.

Фармакологическая композиция ПЭГ-ИНФ является апирогенной, так как при внутривенном введении кроликам в дозе 15 мкг/2,5 кг сумма повышений температур не превышает 2,2°С.

Пример 13. Определение местного и местнораздражающего действия лиофилизированной фармакологической композиции ПЭГ-ИНФ при подкожном введении.

Местное действие оценивают на 8 морских свинках (по 4 животных в группе) путем введения фармакологической композиции ПЭГ-ИФН и физиологического раствора по 0,5мл подкожно в дозе 15 мкг/250 г массы тела. Неспецифическую воспалительную реакцию на введение препаратов оценивают с 24 ч по 5-е сутки включительно.

- 20 029942

При внутрикожном введении морским свинкам уровень воспалительной реакции у животных в опытной и контрольной группах значимо не отличается. Это свидетельствует, что фармакологическая композиция ПЭГ -ИНФ не проявляет воспалительного действия.

При оценке местного действия фармакологической композиции ПЭГ -ИНФ на морских свинках какие-либо патологические изменения в месте введения и регионарных лимфоузлах отсутствуют.

Пробу на местнораздражающее действие для глаз проводят по модифицированному методу Драйза на 6 кроликах. Фармацевтическую композицию ПЭГ-ИФН в дозе 15 мкг/2,5 кг массы тела кролика наносят на правое нижнее веко и придерживают веки закрытыми в течение 1 с. Реакцию регистрируют через 24, 48, 72 ч и на 7-е сутки. При регистрации результатов конъюнктивальной пробы у 2 кроликов через 24 ч отмечено кратковременное расширение некоторых сосудов конъюнктивы. Из результатов следует, что препарат "ПЭГ -Интерферон" при воздействии на слизистые не обладает раздражающем эффектом.

Пример 14. Исследование аллергизирующих свойств лиофилизированной фармакологической композиции ПЭГ-ИФН.

А. Изучение гиперчувствительности немедленного типа лиофилизированной фармакологической композиции ПЭГ-ИНФ.

Исследование гиперчувствительности немедленного типа проводят на модели морских свинок с массой тела 250 г (240-260 г). Животным опытной группы (6 морских свинок) трехкратно через 1 сутки вводят фармакологическую композицию ПЭГ-ИНФ в дозе 1,5 мкг/кг (1 человеческая доза) на одну инъекцию: первая инъекция - подкожно, две последующие - внутримышечно. На 21 сутки после первой инъекции внутрисердечно вводят разрешающую дозу, равную суммарной сенсибилизирующей дозе 4,5 мкг/кг. Животным контрольной группы (6 морских свинок) по той же схеме, что и в опытной группе, вводят физиологический раствор по 0,5 мл. После введения разрешающей дозы животным, сенсибилизированным фармакологической композицией ПЭГ-ИНФ, у морских свинок не было зарегистрировано ни одного типа реакции гиперчувствительности немедленного типа.

Б. Изучение гиперчувствительности замедленного типа лиофилизированной фармакологической композиции ПЭГ-ИФН.

Исследование аллергизирующего действия гиперчувствительности замедленного типа проводят на мышах линии Ва1Ь/С массой 20-21 г (20 мышей) в плантарном тесте в условиях интенсивной сенсибилизации мышей. Индекс реакции гиперчувствительности замедленного типа при введении фармакологической композиции ПЭГ-ИНФ достигает 2,17, что указывает на слабое раздражающее действие препарата.

На основании проведенных экспериментов сделан вывод, что лиофилизированная фармакологическая композиция ПЭГ-ИНФ не обладает аллергизирующим действием в реакции гиперчувствительности немедленного и замедленного действия, что подтверждает ее иммунологическую безопасность.

Пример 15. Изучение иммуногенных свойств лиофилизированной фармакологической композиции ПЭГ-ИФН.

В качестве биологических моделей используют 20 мышей линии Ва1Ь/С массой 18-20 г, полученных из питомника РАМН (п. Столбовая). Животных распределяют на 4 группы по 5 животных (две опытные и две контрольные группы).

Мышам первой опытной группы один раз в неделю в течение 5 недель подкожно в межлопаточную область вводят по 1,0 мкг препарата конъюгата ПЭГ-интерферона альфа-2Ь, приготовленного в соответствии с изобретением, в объеме 0,1 мл. Мышам второй опытной группы один раз в неделю в течение 5 недель подкожно в межлопаточную область вводят по 5,0 мкг того же препарата в объеме 0,1 мл.

Мышам первой контрольной группы один раз в неделю в течение 5 недель подкожно в межлопаточную область вводили по 1 млн МЕ немодифицированного интерферона альфа-2Ь в объеме 0,1 мл. Мышам второй контрольной группы животных вводят 0,1 мл физиологического раствора.

В конце пятой недели у всех мышей в группе проводят единовременный отбор крови. Из крови готовят сыворотку обычным методом: пробы крови инкубируют в течение 45 мин при 37°С, после чего отделяют тромб и повторно инкубируют при 4°С, полученную сыворотку центрифугируют при 3500 об/мин и сохраняют при -65°С до проведения тестов.

Титр антител в сыворотках, полученных в результате иммунизации мышей немодифицированным ИФН и конъюгатами ПЭГ-ИФН, определяют при помощи прямого твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА). Для этого в лунки микропланшета вносят по 0,1 мл раствора немодифицированного интерферона альфа-2Ь в концентрации 200 нг. Антисыворотки, полученные от разных групп животных, вносят по 0,1 мл в лунки планшета в серии из последовательных разведений в два раза. Для детекции образовавшегося иммунного комплекса используют антимышиные иммуноглобулины, конъюгированные с пероксидазой. Измерения проводят с помощью планшетного фотометра Βίο-Кай Мобе1 680.

Титр антисыворотки после введения немодифицированного ИФН составляет 1/1024. Титр антисывороток после введения конъюгата ПЭГ-ИФН в концентрации 1,0 мкг/мышь составляет 1/64, а после введения конъюгата ПЭГ-ИФН в концентрации 5,0 мкг/мышь составляет 1/128. Результаты исследования представлены в табл. 15.

- 21 029942

Таблица 15

Результаты анализа антисывороток после введения лиофилизата ПЭГ-ИФН

Наименование образца	Содержание в ОД мл	Титр антисыворотки
Контроль	0	0
Немодифицированный ИФН альфа-2Ь	1 млн. МЕ	1/1024
Лиофилизат ПЭГ-ИФН	1,0 мкг	1/64
Лиофилизат ПЭГ-ИФН	5,0 мкг	1/64

Таким образом, из полученных результатов следует, что иммуногенность изучаемой лиофилизированной фармакологической композиции ПЭГ-ИФН в 16 раз ниже, чем у немодифицированного ИФН.

Пример 16. Изучение фармакокинетических характеристик лиофилизированной фармакологической композиции ПЭГ-ИФН.

Приготовленную лиофилизированную фармакологическую композицию ПЭГ-ИФН оценили по параметру пролонгации циркуляции в крови лабораторных животных. В качестве препарата сравнения используют "ПегИнтрон" (производитель - ЗеЬепп§-Р1ои§Ь), лиофилизат для приготовления раствора для подкожного введения в шприц-ручках по 80 мкг, серия 9-ΙΚΟ-60127, годен до 10.2012.

В качестве биологических моделей используют 150 мышей линии СВА массой 18-20 г, полученных из питомника РАМН (п. Столбовая). Животные распределяют на 12 групп по 5 животных для каждого препарата, две группы по 15 животных являются контрольными.

В первый день мышам однократно подкожно в межлопаточную область вводят по 1 мкг в 0,1 мл раствора препарата "ПЕГ-ИФН", приготовленного в соответствии с изобретением, и препарата сравнения "ПегИнтрон" в пересчете на содержание белка (интерферона). Далее забирают кровь через 2, 4, 6, 12, 18, 24, 48, 72, 96, 120 и 144 ч после введения препаратов. Одной контрольной группе вводят 0,1 мл физиологического раствора, другая контрольная группа состоит из интактных животных.

Отбор крови для изучения фармакокинетики проводят единовременной декапитацией 3-5 мышей на каждую точку исследования. Из крови готовят сыворотку обычным методом: пробы крови инкубируют в течение 45 мин при 37°С, после чего отделяют тромб и повторно инкубируют при 4°С, полученную сыворотку центрифугируют при 3500 об/мин и сохраняют при -65°С до проведения тестов.

Концентрацию пегилированного интерферона в сыворотке крови определяют одномоментно во всех пробах с помощью метода иммуноферментного анализа с набором реагентов "Альфа-ИнтерферонИФА-БЕСТ" А-8755 (производитель - ЗАО "Вектор-Бест", серия № 20) в соответствии с прилагаемой инструкцией. Измерения проводят с помощью планшетного фотометра Вю-Кай Мойе1 680. По результатам рассчитывают фармакокинетические параметры (табл. 16).

Таблица 16

Значения фармакокинетических параметров

Параметр	Препарат
Композиция ПЭГ-ИФН	ПегИнтрон
Тщах, Ч	17,3	9,4
Стах, НГ/МЛ	166	30
Уа, мл	6,0	33,3
ίιζζ, ч	22,2	11,8
Стах/АиСо-ь Ч'¹	0,031	0,059
СЬ, мл/ч	0,19	1,96

Из анализа усредненных фармакокинетических данных исследуемых препаратов видно, что их профили не совпадают. Из приведенных значений видно, что лиофилизированная фармакологическая композиция ПЭГ-ИФН по времени циркуляции и создаваемой концентрации в крови при равной дозировке значительно превосходит коммерчески производимый препарат "ПегИнтрон".

- 22 029942

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Фармацевтическая композиция, представленная в жидкой или лиофилизированной готовой лекарственной форме (ГЛФ), содержащая пегилированный белок, отличающаяся тем, что пегилированный белок, в котором полиэтиленгликолевые фрагменты ковалентно присоединены к молекуле белка посредством азогрупп, соответствует формуле (I)

где Рго! - биологически активный белок, выбранный из интерферона и эритропоэтина;

А - аминокислотный фрагмент гистидина;

В - аминокислотный фрагмент тирозина; п - целое число в интервале от 10 до 1200; т - принимает значения от 0 до 10;

к - принимает значения от 0 до 10, причем т^к, если т или к равны 0, в форме конъюгата или смеси конъюгатов с различными значениями п, т и к,

а также фармакологически приемлемые вспомогательные ингредиенты.
2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что фармакологически приемлемые вспомогательные ингредиенты выбраны из сорастворителей, солей, кислот, оснований, антиоксидантов, консервантов, аминокислот, белков, углеводов, полимеров, детергентов и комплексонов.
3. Фармацевтическая композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что биологически активный белок является эритропоэтином и композиция представлена в виде жидкой ГЛФ.
4. Фармацевтическая композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что биологически активный белок является интерфероном и композиция представлена в виде лиофилизированной ГЛФ.
5. Фармацевтическая композиция по п.2, отличающаяся тем, что содержит от 0,01 до 50 мг конъюгата формулы (I), в качестве углевода содержит от 5 до 100 мг маннита, в качестве аминокислоты содержит от 0,1 до 20 мг глицина, в качестве антиоксиданта содержит от 0,1 до 10 мг Ь-метионина, в качестве детергента содержит от 0,01 до 1 мг полисорбата 80, в качестве комплексона содержит от 0,01 до 1 мг этилендиаминтетрауксусной кислоты, в качестве соли содержит от 1 до 25 мг дигидрофосфата натрия в перерасчете на безводную соль, в качестве основания содержит натрия гидроксид, в качестве кислоты содержит уксусную или соляную кислоту в количестве, обеспечивающем рН от 3,5 до 7,0, в качестве растворителя содержит воду для инъекций до 1 мл.