JP2015502336A

JP2015502336A - アルカリホスファターゼ及び／又はナトリウム利尿ペプチドを含む組成物、並びにそれを使用する方法

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Publication number: JP2015502336A
Application number: JP2014537254A
Authority: JP
Inventors: クライン，フィリップ; エレフトリオウ，フロレント
Original assignee: アレクシオンファーマホールディング; バンダービルトユニバーシティー
Priority date: 2011-10-19
Filing date: 2012-10-18
Publication date: 2015-01-22
Anticipated expiration: 2032-10-18
Also published as: JP6118807B2; KR20140084201A; EP2768526B1; WO2013059491A1; HK1201446A1; WO2013058833A1; SG11201401605QA; CA2852874A1; EP2768526A4; EP2768526A1; WO2013058833A8; EP3488861B1; EP3488861A1; ES2944087T3; ES2714406T3

Abstract

本発明は、神経皮膚症候群、例えば、神経線維腫症I型;FGFR3の過剰活性化と関連した障害、例えば、軟骨形成不全症;骨若しくは軟骨障害;又は血管平滑筋障害を処置し;又は骨を伸長させるための方法、組成物、及びキットを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、免疫グロブリンのFcドメインに融合したアルカリホスファターゼペプチド、又は免疫グロブリンのFcドメインに融合したナトリウム利尿ペプチドを有するポリペプチドを提供する。このようなポリペプチドは、神経皮膚症候群、FGFR3の過剰活性化と関連した障害、骨若しくは軟骨障害、又は血管平滑筋障害を処置し、あるいは骨を伸長するために、対象に、例えば皮下に投与することができる。また、本発明は、このようなポリペプチドをコードする核酸分子、及び神経皮膚症候群、FGFR3の過剰活性化と関連した障害、骨若しくは軟骨障害、又は血管平滑筋障害を処置し、あるいは骨を伸長するための該核酸分子の使用を特徴とする。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、2011年10月19日に出願された米国仮出願第61/549,047号、及び2012年5月21日に出願された米国特許出願番号第61/649,717号に対する優先権の利益を主張する。

配列表の参照
配列表は、2012年10月15日に作製された「50694_039WO4_ST25_Seq_Listing.txt」(サイズ716kB)と表するテキストファイルとして本特許書類に提供される。このファイルの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

概して、本発明は、アルカリホスファターゼ及び/又はナトリウム利尿ペプチドを用いた様々な疾患の処置に関する。

多くの疾患及び状態が骨又は軟骨の異常な骨格機能、構造、又は成長を伴う。いくつかの疾患について、これらの骨病変の病因は、例えば、低ホスファターゼ症(HPP)及び軟骨無形成症(ACH)において知られているが、処置の選択肢は限られている。他の疾患において、病因は不明である。例えば、神経線維腫症I型(NF1又はフォンレックリングハウゼン病)は、出生3,500人において約1人の発生率を有する常染色体優性遺伝性疾患である。NF1はニューロフィブロミンをコードし、これは、Rasキナーゼを抑制することが知られているGTPアーゼ活性化タンパク質(GAP)ファミリーのメンバーである。ニューロフィブロミンは、p21-RASの特異的なサプレッサーであり、NF1遺伝子の突然変異は、RASの抑制されない活性化を引き起こし、これは、異常な細胞の増殖及び分化をもたらす。従って、NF1の臨床的特徴は、様々な発癌性形質転換、例えば、神経皮膚の神経線維腫及び視神経経路腫瘍、並びに他の非癌性異変、例えば、認知障害及び骨格異常を含む。NF1骨病変のいくつかは、高い罹患率を有し(例えば、ジストロフィー脊柱側弯症、長骨の湾曲、及び偽関節)、また、処置の選択肢が満足できるものではなく、これは、これらの異変の病因が不明であるという事実によって複雑なものとされてきた。

多くの骨格疾患は、1つ以上のタンパク質の機能の喪失から生じる。例えば、低ホスファターゼ症(HPP)は、組織非特異的アルカリホスファターゼ(TNALP、別名肝臓/骨/腎臓型ALP)をコードする遺伝子ALPLにおける1つ以上の機能喪失型突然変異によって引き起こされる稀な遺伝性疾患である。骨芽細胞及び軟骨細胞におけるアルカリホスファターゼ欠乏は、くる病又は骨軟化症から、子宮内での骨の石灰化のほぼ完全な欠如へと様々な重症度の症状をもたらす、骨格の石灰化を損なう。しかしながら、非修飾アルカリホスファターゼ(例えば、天然のアルカリホスファターゼの注入)を用いた酵素補充療法は、それほど成功していない。

別の例において、軟骨無形成症(ACH)は、世界中で250,000人を超える個人に影響を及ぼし、ヒトにおける四肢短縮型低身長症の最も一般的な形態であり、線維芽細胞増殖因子受容体3(FGFR3)をコードする遺伝子における突然変異によって引き起こされ、これは、FGFR3機能の増加を引き起こす。臨床表現型の重症度は、MAPキナーゼ経路など、軟骨細胞におけるFGFR3シグナル伝達経路を過剰活性化する突然変異の能力に関連する。この経路は、セカンドメッセンジャーのcGMP、及びcGMPを生成し、次に、細胞内のMAPキナーゼ経路を阻害するナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR-B)を活性化することによって阻害し得る。細胞環境において、CNP53及びCNP22などのC型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の未熟形態及び成熟形態は、用量依存的に、同じようにしてNPR-Bに結合し、cGMP産生を誘導する。従って、骨格形成異常の処置のための、NPR-Bシグナル伝達経路を活性化することができるCNP又はCNP類似体の使用が検討されている。しかしながら、CNPの治療的使用の主な欠点は、その非常に短い半減期である。

したがって神経線維腫症などの骨病変を有する疾患を処置するための治療分子及び方法を開発することが当該技術分野において必要とされている。さらに、かなりの半減期及び/又は他の有利な薬物動態学的及び治療特性を有する、より多くの治療分子が必要とされており、これらの分子は、神経線維腫症、低ホスファターゼ症、及び軟骨形成不全などのこれらの作用下にある様式から恩恵を受ける様々な疾患を処置するために使用することができる。

驚くべきことに、神経線維腫症、神経系に腫瘍をもたらす神経皮膚症候群は、無機ピロリン酸(PP_i)の蓄積から生じる骨病変をもたらすことが発見された。アルカリホスファターゼ-Fc融合タンパク質(骨標的化部分を含む又は含まない)はPP_i蓄積を減少させることができるため、本発明は、可溶性アルカリホスファターゼ(sALP)ドメイン(すなわち、sALPポリペプチド)を含むポリペプチド、並びにその組成物及び使用を提供する。さらに、神経線維腫症における骨病変はまた、MAP-キナーゼ経路の過剰活性化から生じる場合があり、ナトリウム利尿ペプチド(NP)又はNP類似体を用いてこの経路を阻害することができた。従って、本発明は、NP(例えば、CNP)ドメインを含むポリペプチド(すなわち、NPポリペプチド)、並びにその組成物及び使用を提供する。

さらに、本発明は、sALPポリペプチドとNPポリペプチドの組み合わせを含み、これらのポリペプチドは、別々に又は一緒に投与することができる。この組み合わせは、ALPレベルの増大から恩恵を受ける疾患(例えば、PP_iレベルの増大と関連した障害、例えば神経線維腫症、又はALP欠乏症と関連した障害、例えば低ホスファターゼ症)、及び/又はFGFR3が関与するシグナル伝達経路の不活性化から恩恵を受ける疾患(例えば、MAP-キナーゼ経路の過剰活性化に関連した障害、例えば神経線維腫症若しくは軟骨無形成症、又はFGFR3の過剰活性化に関連した障害、例えば軟骨無形成症若しくは頭蓋骨癒合症若しくは癌)、及び/又はNPレベルの増大から恩恵を受ける疾患(例えば、CNP欠乏症に関連した障害、例えば骨格形成異常又は血管平滑筋障害)において特に有用である。本発明のポリペプチドはまた、別々に又は一緒にキットにおいて提供することができる。

第1の態様において、本発明は、対象（被験体）における神経皮膚症候群を治療する方法を特徴とし、該方法は、(a)構造A-sALP-Bを含むポリペプチド、及び(b)製薬上許容される賦形剤を含む、治療上有効な量の医薬組成物を該対象に投与することを含み、sALPは、アルカリホスファターゼの細胞外ドメインであり、Aは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Bは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である。いくつかの実施形態において、対象における症候群はそれによって治療される。

いくつかの実施形態において、sALPのアミノ酸配列は、配列番号1215のアミノ酸残基23〜508、配列番号1216のアミノ酸残基18〜498、配列番号1218のアミノ酸残基23〜508、若しくは配列番号1219のアミノ酸残基18〜498を含む若しくはそれらからなり、又はsALPのアミノ酸配列は、配列番号1215のアミノ酸残基23〜512、配列番号1216のアミノ酸残基18〜502、配列番号1218のアミノ酸残基23〜512、若しくは配列番号1219のアミノ酸残基18〜502を含む若しくはそれらからなる。いくつかの実施形態において、sALPのアミノ酸配列は、配列番号1205と少なくとも80%、85%、85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、sALPのアミノ酸配列は、配列番号1205のアミノ酸配列を含む又はそれからなる。

いくつかの実施形態において、sALPのアミノ酸配列は、配列番号1218のアミノ酸残基1〜497、1〜498、1〜499、1〜500、1〜501、1〜502、1〜503、1〜504、1〜505、1〜506、1〜507、1〜508、1〜509、1〜510、1〜511、1〜512、23〜497、23〜498、23〜499、23〜500、23〜501、23〜502、23〜503、23〜504、23〜505、23〜506、23〜507、23〜508、23〜509、23〜510、23〜511、又は23〜512を含む又はそれらからなり、Xは、任意のアミノ酸であるが、ヒトTNALPのその位置での病因性突然変異に対応するアミノ酸ではなく、例えば、表1に示されている病因性突然変異に対応するアミノ酸ではない。いくつかの実施形態において、sALPのアミノ酸配列は、配列番号1219のアミノ酸残基18〜497、18〜498、18〜499、18〜500、18〜501、18〜502、18〜503、18〜504、18〜505、18〜506、18〜507、18〜508、18〜509、18〜510、18〜511、又は18〜512を含む又はそれらからなり、Xは、任意のアミノ酸であるが、ヒトTNALPのその位置での病因性突然変異に対応するアミノ酸ではなく、例えば、表1に示されている病因性突然変異に対応するアミノ酸ではない。

いくつかの実施形態において、sALPのアミノ酸配列は、配列番号1218又は1219と少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Xは、任意のアミノ酸であるが、ヒトTNALPのその位置での病因性突然変異に対応するアミノ酸ではなく、例えば、表1に示されている病因性突然変異に対応するアミノ酸ではない。いくつかの実施形態において、sALPのアミノ酸配列は、配列番号1215のアミノ酸残基23〜508、配列番号1216のアミノ酸残基18〜498、配列番号1218のアミノ酸残基23〜508、若しくは配列番号1219のアミノ酸残基18〜498と少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む若しくはそれらからなり、又は配列番号1215のアミノ酸残基23〜512、配列番号1216のアミノ酸残基18〜502、配列番号1218のアミノ酸残基23〜512、若しくは配列番号1219のアミノ酸残基18〜502と少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号1218又は1219におけるXは、任意のアミノ酸であるが、ヒトTNALPのその位置での病因性突然変異に対応するアミノ酸ではなく、例えば、表1に示されている病因性突然変異に対応するアミノ酸ではない。

いくつかの実施形態において、A及び/又はBは存在しない。

いくつかの実施形態において、A及び/又はBは、結晶化可能断片領域(Fc)を含む。いくつかの実施形態において、Fcは、C_H2ドメイン、C_H3ドメイン、及びヒンジ領域を含む、又はFcは、IgG-1、IgG-2、IgG-3、及びIgG-4からなる群から選択される免疫グロブリン、例えばIgG-1の定常ドメインである。いくつかの実施形態において、Fcのアミノ酸配列は、配列番号401と少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Fcのアミノ酸配列は、配列番号401のアミノ酸配列を含む又はそれからなる。

いくつかの実施形態において、A及び/又はBはI_nを含み、Iはアスパラギン酸又はグルタミン酸を表し、n=10から16であり、例えば、nは10、11、12、13、14、15、又は16である。いくつかの実施形態において、I_nは、E₁₀、E₁₁、E₁₂、E₁₃、E₁₄、E₁₅、E₁₆、D₁₀、D₁₁、D₁₂、D₁₃、D₁₄、D₁₅、又はD₁₆、例えば、E₁₀又はD₁₀である。

いくつかの実施形態において、A及び/又はBは、骨標的化部分を含み、例えば、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、又は16個の連続した酸性残基、例えばアスパラギン酸又はグルタミン酸を含む。いくつかの実施形態において、骨標的化部分は、E₆、E₇、E₈、E₉、E₁₀、E₁₁、E₁₂、E₁₃、E₁₄、E₁₅、E₁₆、D₆、D₇、D₈、D₉、D₁₀、D₁₁、D₁₂、D₁₃、D₁₄、D₁₅、又はD₁₆、例えば、E₆、E₁₀、D₆、又はD₁₀を含む又はそれらからなる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、3個よりも長い連続したアスパラギン酸若しくはグルタミン酸残基のポリアスパラギン酸若しくはポリグルタミン酸領域を含まない、又はポリペプチドは、2個よりも長い連続したアスパラギン酸若しくはグルタミン酸残基のポリアスパラギン酸若しくはポリグルタミン酸領域を含まない。

いくつかの実施形態において、ポリペプチドは骨標的化部分を含まない。

いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、構造C-sALP-D-Fc-E又は構造C-Fc-D-sALP-Eを含み、Cは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Dは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Eは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である。

いくつかの実施形態において、C及び/又はEは存在しない。いくつかの実施形態において、Dは、2つのアミノ酸残基、例えば、ロイシン-リジン又はアスパラギン酸-イソロイシンである。いくつかの実施形態において、Dは、本明細書に記載されている任意のリンカーであり、例えば、配列番号301〜391のいずれか1つのアミノ酸配列である。

いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、構造C-sALP-D-Fc-G-I_n-H又は構造C-Fc-D-sALP-G-I_n-Hを含み、Cは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Dは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Gは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Hは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Iは、アスパラギン酸又はグルタミン酸を表し、n=10から16であり、例えば、nは10、11、12、13、14、15、又は16である。いくつかの実施形態において、I_nは、E₁₀、E₁₁、E₁₂、E₁₃、E₁₄、E₁₅、E₁₆、D₁₀、D₁₁、D₁₂、D₁₃、D₁₄、D₁₅、又はD₁₆、例えば、E₁₀又はD₁₀である。

いくつかの実施形態において、C及び/又はHは存在しない。いくつかの実施形態において、Gは2つのアミノ酸残基、例えば、ロイシン-リジン又はアスパラギン酸-イソロイシン、例えばアスパラギン酸-イソロイシンである。いくつかの実施形態において、Iは、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、n=10から16であり、例えば、nは、10、11、12、13、14、15、又は16であり、例えば、Iは、アスパラギン酸であり、n=10である。いくつかの実施形態において、Dは、2つのアミノ酸残基、例えば、ロイシン-リジン又はアスパラギン酸-イソロイシン、例えばロイシン-イソロイシンである。いくつかの実施形態において、D又はGは、本明細書に記載されている任意のリンカーであり、例えば、配列番号301〜391のいずれか1つのアミノ酸配列である。

いくつかの実施形態において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号1201、1204、1220、又は1221のいずれか1つ、例えば、配列番号1204と少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号1201、1204、1220、又は1221、例えば、配列番号1204のいずれか1つのアミノ酸配列を含む又はそれらからなる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号1204のアミノ酸配列からなる。

第2の態様において、本発明は、対象における神経皮膚症候群を治療する方法を特徴とし、該方法は、(a)構造V-NP-Wを含むポリペプチド、及び(b) 製薬上許容される賦形剤を含む、治療上有効な量の医薬組成物を前記対象に投与することを含み、NPは、ナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR-B)のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、Vは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Wは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である。いくつかの実施形態において、対象における症候群はそれによって治療される。

いくつかの実施形態において、NPは、構造[N末端伸長]-[短鎖セグメント]-[環ドメイン]-[C末端伸長]を含み、該環ドメインは、配列番号6、配列番号30のアミノ酸残基11〜27、又は配列番号95のアミノ酸配列を含み、該N末端伸長、短鎖セグメント、及びC末端伸長のそれぞれは、独立して、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である。いくつかの実施形態において、環ドメインは、配列番号126のアミノ酸残基6〜22を含む。いくつかの実施形態において、配列番号126の17位のアミノ酸は、Phe、Leu、Ile、Thr、Glu、Arg、Tyr、Cys、Pro、Asp、Gly、Ala、Ser、Val、Trp、Asn、Gln、His、又はLys、例えば、Phe、Leu、Ile、Thr、Val、Ala、Ser、Glu、Arg、Tyr、Cys、Pro、又はAsp、例えば、Phe、Leu、Ile、Thr、Val、Ala、又はSer、例えば、Phe又はLeu、例えば、Phe、例えば、Leuである。いくつかの実施形態において、環ドメインが、配列番号12のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、短鎖セグメント及び環ドメインは一緒になって、配列番号4、13〜30、119〜122、126、又は156〜161、例えば、配列番号4又は13〜30のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、短鎖セグメントのアミノ酸配列は、配列番号4のアミノ酸残基1〜5、2〜5、3〜5、4〜5、又は5を含む若しくはそれらからなり、例えば、配列番号4のアミノ酸残基1〜5、配列番号17のアミノ酸残基1〜10、配列番号19のアミノ酸残基1〜5、配列番号20のアミノ酸残基1〜3、配列番号21のアミノ酸残基1〜5、又は配列番号29のアミノ酸残基1〜6からなる。いくつかの実施形態において、短鎖セグメント及び環ドメインのアミノ酸配列は一緒になって、配列番号4のアミノ酸配列を含む又はそれからなる。いくつかの実施形態において、短鎖セグメント及び環ドメインのアミノ酸配列は一緒になって、配列番号119〜122、126、又は156〜161のいずれか1つのアミノ酸配列を含む又はそれからなる(配列番号126におけるXは、Phe、Leu、Ile、Thr、Glu、Arg、Tyr、Cys、Pro、Asp、Gly、Ala、Ser、Val、Trp、Asn、Gln、His、又はLys、例えば、Phe、Leu、Ile、Thr、Glu、Arg、Tyr、Cys、Pro、又はAsp、例えば、Phe、Leu、Ile、Thr、Val、Ala、又はSer、例えば、Phe又はLeu、例えば、Phe、例えば、Leuである)。

いくつかの実施形態において、N末端伸長のアミノ酸配列は、配列番号11のアミノ酸残基1〜31又は17〜31を含む。いくつかの実施形態において、N末端伸長のアミノ酸配列は、配列番号11のアミノ酸残基17〜31を含む。いくつかの実施形態において、N末端伸長のアミノ酸配列が、KGANKK(配列番号314)又はKGANQK(配列番号315)を含む。いくつかの実施形態において、N末端伸長、短鎖セグメント、及び環ドメインが一緒になって、配列番号11のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、C末端伸長は、配列番号117若しくは118のアミノ酸配列を含む、又は配列番号101〜116のいずれか1つから選択されるアミノ酸残基23〜37を含む。いくつかの実施形態において、NPのアミノ酸配列は、配列番号4若しくは11、又は配列番号31〜94のいずれか1つのアミノ酸配列、又は少なくとも環ドメインを含むこれらの断片、又は配列番号13〜29、100〜116、119〜125、127〜233、若しくは1001〜1155のいずれか1つのアミノ酸配列からなる。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、NPのアミノ酸配列は、配列番号126のアミノ酸6〜22を含んでもよく、配列番号126の17位のアミノ酸はPheであってもよい。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、NPのアミノ酸配列は、配列番号126のアミノ酸6〜22を含んでもよく、配列番号126の17位のアミノ酸はLeuであってもよい。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、NPのアミノ酸配列は、配列番号126のアミノ酸6〜22を含んでもよく、配列番号126の17位のアミノ酸はIleであってもよい。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、NPのアミノ酸配列は、配列番号126のアミノ酸6〜22を含んでもよく、配列番号126の17位のアミノ酸はThrであってもよい。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、NPのアミノ酸配列は、配列番号126のアミノ酸6〜22を含んでもよく、配列番号126の17位のアミノ酸はGluであってもよい。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、NPのアミノ酸配列は、配列番号126のアミノ酸6〜22を含んでもよく、配列番号126の17位のアミノ酸はArgであってもよい。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、NPのアミノ酸配列は、配列番号126のアミノ酸6〜22を含んでもよく、配列番号126の17位のアミノ酸はTyrであってもよい。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、NPのアミノ酸配列は、配列番号126のアミノ酸6〜22を含んでもよく、配列番号126の17位のアミノ酸はCysであってもよい。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、NPのアミノ酸配列は、配列番号126のアミノ酸6〜22を含んでもよく、配列番号126の17位のアミノ酸はProであってもよい。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、NPのアミノ酸配列は、配列番号126のアミノ酸6〜22を含んでもよく、配列番号126の17位のアミノ酸はAspであってもよい。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、NPのアミノ酸配列は、配列番号126のアミノ酸6〜22を含んでもよく、配列番号126の17位のアミノ酸はGlyであってもよい。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、NPのアミノ酸配列は、配列番号126のアミノ酸6〜22を含んでもよく、配列番号126の17位のアミノ酸はAlaであってもよい。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、NPのアミノ酸配列は、配列番号126のアミノ酸6〜22を含んでもよく、配列番号126の17位のアミノ酸はSerであってもよい。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、NPのアミノ酸配列は、配列番号126のアミノ酸6〜22を含んでもよく、配列番号126の17位のアミノ酸はValであってもよい。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、NPのアミノ酸配列は、配列番号126のアミノ酸6〜22を含んでもよく、配列番号126の17位のアミノ酸はTrpであってもよい。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、NPのアミノ酸配列は、配列番号126のアミノ酸6〜22を含んでもよく、配列番号126の17位のアミノ酸はAsnであってもよい。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、NPのアミノ酸配列は、配列番号126のアミノ酸6〜22を含んでもよく、配列番号126の17位のアミノ酸はGlnであってもよい。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、NPのアミノ酸配列は、配列番号126のアミノ酸6〜22を含んでもよく、配列番号126の17位のアミノ酸はHisであってもよい。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、NPのアミノ酸配列は、配列番号126のアミノ酸6〜22を含んでもよく、配列番号126の17位のアミノ酸はLysであってもよい。

いくつかの実施形態において、V及び/又はWは存在しない。

いくつかの実施形態において、V及び/又はWは、結晶化可能断片領域(Fc)を含む。いくつかの実施形態において、Fcは、C_H2ドメイン、C_H3ドメイン、及びヒンジ領域を含む、又はFcは、IgG-1、IgG-2、IgG-3、及びIgG-4からなる群から選択される免疫グロブリン、例えばIgG-1の定常ドメインである。いくつかの実施形態において、Fcのアミノ酸配列は、配列番号401と少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Fcのアミノ酸配列は、配列番号401のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなる。

いくつかの実施形態において、V及び/又はWは、グリシンリッチ領域を含む。

いくつかの実施形態において、V又はWのアミノ酸配列は、1つ以上のグリシン及び1つ以上のセリンからなる。いくつかの実施形態において、V又はWのアミノ酸配列は、[(Gly)_m(Ser)]_n(Gly)_p又は(Gly)_p[(Ser)(Gly)_m]_nを含み、m、n、及びpのそれぞれは、独立して、0から20の間である。いくつかの実施形態において、mは1から6の間にあり、nは1から10の間にあり、pは0から4の間にあり、例えば、mは4であり、nは1〜6である。いくつかの実施形態において、m、n、及びpの組み合わせは表2の一列から選択され、又はV若しくはWのアミノ酸配列は配列番号301〜391のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、V及び/又はWは、骨標的化部分を含まない。

いくつかの実施形態において、V及び/又はWは、骨標的化部分を含み、例えば、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、又は16個の連続した酸性残基、例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸を含む。いくつかの実施形態において、骨標的化部分は、E₆、E₇、E₈、E₉、E₁₀、E₁₁、E₁₂、E₁₃、E₁₄、E₁₅、E₁₆、D₆、D₇、D₈、D₉、D₁₀、D₁₁、D₁₂、D₁₃、D₁₄、D₁₅、又はD₁₆、例えば、E₆、E₁₀、D₆、又はD₁₀を含む又はそれらからなる。

いくつかの実施形態において、V及び/又はWは、カテプシン(例えば、カテプシンK)切断配列を含む。いくつかの実施形態において、カテプシン切断配列は、HGPQG(配列番号374)又はHKLRG(配列番号375)である。

いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、構造V-NP-Wを含み、NPは、ナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR-B)のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、V及びWのそれぞれは、独立して、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、NPは、配列番号17〜29、31〜40、42〜94、101〜116、119〜122、128〜161、若しくは163〜233のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、又はV若しくはWは、配列番号304〜313、322〜333、若しくは337〜391のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、構造V-NP又はNP-Wを含み、NPは、ナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR-B)のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、V及びWのそれぞれは、独立して、配列番号304〜313、322〜333、又は337〜391のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、構造X-Fc-Y-NP-Z又は構造X-NP-Y-Fc-Zを含み、NPは、ナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR-B)のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチド(例えば、本明細書において記載されている任意のNP)であり、X、Y、及びZは、独立して、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である。いくつかの実施形態において、Yは、グリシンリッチ領域を含む。いくつかの実施形態において、Yのアミノ酸配列は、1つ以上のグリシン及び1つ以上のセリンからなる。いくつかの実施形態において、Yのアミノ酸配列は、[(Gly)_m(Ser)]_n(Gly)_p又は(Gly)_p[(Ser)(Gly)_m]_nを含み、m、n、及びpのそれぞれは、独立して、0から20の間である。いくつかの実施形態において、mは1から6の間にあり、nは1から10の間にあり、pは0から4の間にあり、例えば、mは4であり、nは1〜6である。いくつかの実施形態において、m、n、及びpの組み合わせは表2の一列から選択され、又はYのアミノ酸配列は配列番号301〜389のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Yのアミノ酸配列は、[(Gly)_m(Ser)]_n(Gly)_p又は(Gly)_p[(Ser)(Gly)_m]_nからなり、m、n、及びpの組み合わせは表2の一列から選択され、又はYのアミノ酸配列は配列番号301〜389のいずれか1つのアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態において、Xは存在しない、Zは存在しない、又はXとZの両方は存在しない。いくつかの実施形態において、X、Y、又はZは、骨標的化部分を含み、例えば、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、又は16個の連続した酸性残基、例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸を含む。いくつかの実施形態において、骨標的化部分は、E₆、E₇、E₈、E₉、E₁₀、E₁₁、E₁₂、E₁₃、E₁₄、E₁₅、E₁₆、D₆、D₇、D₈、D₉、D₁₀、D₁₁、D₁₂、D₁₃、D₁₄、D₁₅、又はD₁₆、例えば、E₆、E₁₀、D₆、又はD₁₀を含む又はそれらからなる。

いくつかの実施形態において、X、Y、又はZは、カテプシン(例えば、カテプシンK)切断配列を含む。いくつかの実施形態において、カテプシン切断配列は、HGPQG(配列番号374)又はHKLRG(配列番号375)を含む又はそれからなる。

いくつかの実施形態において、ポリペプチドのアミノ酸は、配列番号501〜608のいずれか1つ、例えば、配列番号502、504、506、512、514、516、530、560、562、564、572、574、576、584、586、588、596、598、600、又は608、例えば、配列番号504、512、530、554、572、又は578、例えば、配列番号512のアミノ酸配列を含む又はそれからなる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドのアミノ酸は、骨標的化部分、例えば、E₆、E₇、E₈、E₉、E₁₀、E₁₁、E₁₂、E₁₃、E₁₄、E₁₅、E₁₆、D₆、D₇、D₈、D₉、D₁₀、D₁₁、D₁₂、D₁₃、D₁₄、D₁₅、又はD₁₆、例えば、E₆、E₁₀、D₆、又はD₁₀を含む。

いくつかの実施形態において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号504、512、530、554、572、又は578のいずれか1つ、例えば、配列番号504、512、530、又は572、例えば、配列番号512と少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号504、512、530、554、572、又は578のいずれか1つ、例えば、配列番号504、512、530、又は572、例えば、配列番号512のアミノ酸配列を含む又はそれからなる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号504、512、530、又は572、例えば、配列番号512のアミノ酸配列からなる。

一部の実施形態では、ポリペプチドは、構造Ｘ−Ｆｃ−Ｙ−ＮＰ−Ｚまたは構造Ｘ−ＮＰ−Ｙ−Ｆｃ−Ｚを含む単離されたポリペプチドを特徴とする。ここで、構造中、ＮＰは、ナトリウム利尿ペプチドレセプターＢ（ＮＰＲ−Ｂ）のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、かつ、（ｉ）ＮＰは、位置１７のアミノ酸がＭｅｔでない配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつＸ、Ｙ、およびＺのそれぞれは、独立して、不在でありもしくは少なくとも１個のアミノ酸のアミノ酸配列であるか、あるいは（ｉｉ）ＸおよびＺのそれぞれは、独立して、不在でありもしくは少なくとも１個のアミノ酸のアミノ酸配列であり、かつＹのアミノ酸配列は、［（Ｇｌｙ）_４（Ｓｅｒ）］_ｎ（Ｇｌｙ）_ｐもしくは（Ｇｌｙ）_ｐ［（Ｓｅｒ）（Ｇｌｙ）_４］_ｎ〔式中、ｎは１〜１０であり、かつｐは０〜４であり、もしくはｍ、ｎ、およびｐの組合せは、表２の１行から選択される〕を含み、またはＹのアミノ酸配列は、配列番号３０４〜３１３、３２２〜３３３、もしくは３３７〜３９１のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含むか、のいずれかである。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、構造Ｘ−Ｆｃ−Ｙ−ＮＰ−Ｚを含む。

いくつかの実施形態では、（ｉ）ＮＰは、位置１７のアミノ酸がＭｅｔでない配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつＸ、Ｙ、およびＺのそれぞれは、独立して、不在でありまたは少なくとも１個のアミノ酸のアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、またはＳｅｒである。いくつかの実施形態では、配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ、たとえば、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、またはＡｓｐ、たとえば、ＰｈｅまたはＬｅｕ、たとえば、Ｐｈｅ、たとえば、Ｌｅｕである。いくつかの実施形態では、ＮＰは、構造：［Ｎ末端伸長部］−［ショートセグメント］−［リングドメイン］−［Ｃ末端伸長部］を含む。ここで、構造中、前記リングドメインは、位置１７のアミノ酸がＭｅｔでない配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含み、かつ前記Ｎ末端伸長部、ショートセグメント、およびＣ末端伸長部のそれぞれは、独立して、不在でありまたは少なくとも１個のアミノ酸のアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、前記ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１１９〜１２５もしくは１５６〜２２０のいずれか１つで示されるアミノ酸配列（ここで、配列番号１２６を基準にした位置１７はＭｅｔでない）もしくは配列番号２２１〜２３３のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含みまたはそれからなる。

いくつかの実施形態では、（ｉｉ）ＸおよびＺのそれぞれは、独立して、不在でありまたは少なくとも１個のアミノ酸のアミノ酸配列であり、かつＹのアミノ酸配列は、［（Ｇｌｙ）_４（Ｓｅｒ）］_ｎ（Ｇｌｙ）_ｐもしくは（Ｇｌｙ）_ｐ［（Ｓｅｒ）（Ｇｌｙ）_４］_ｎ〔式中、ｎは１〜１０であり、かつｐは０〜４である〕を含み、またはＹのアミノ酸配列は、配列番号３０４〜３１３、３２２〜３３３、または３３７〜３９１のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＰは、構造：［Ｎ末端伸長部］−［ショートセグメント］−［リングドメイン］−［Ｃ末端伸長部］を含む。ここで、構造中、リングドメインは、配列番号６、配列番号３０のアミノ酸１１〜２７、または配列番号９５で示されるアミノ酸配列を含み、かつＮ末端伸長部、ショートセグメント、およびＣ末端伸長部のそれぞれは、独立して、不在でありまたは少なくとも１個のアミノ酸のアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、リングドメインは、配列番号１２６のアミノ酸６〜２２を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、またはＳｅｒである。いくつかの実施形態では、配列番号１２６の位置１７のアミノ酸は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ、たとえば、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、またはＡｓｐ、たとえば、ＰｈｅまたはＬｅｕ、たとえば、Ｐｈｅ、たとえば、Ｌｅｕである。いくつかの実施形態では、リングドメインは、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ショートセグメントおよびリングドメインは、一緒になって、配列番号４または１３〜３０のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ショートセグメントおよびリングドメインのアミノ酸配列は、一緒になって、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ショートセグメントおよびリングドメインのアミノ酸配列は、一緒になって、配列番号１１９〜１２２、１２６、または１５６〜１６１のいずれか１つで示されるアミノ酸配列からなる（たとえば、配列番号１２６中のＸは、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ、たとえば、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、またはＡｓｐ、たとえば、ＰｈｅまたはＬｅｕ、たとえば、Ｐｈｅ、たとえば、Ｌｅｕである）。いくつかの実施形態では、Ｎ末端伸長部、ショートセグメント、およびリングドメインは、一緒になって、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号４からなる。いくつかの実施形態では、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１１からなる。いくつかの実施形態では、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号３１〜９４のいずれか１つで示されるアミノ酸配列、または少なくともリングドメインを含むその断片からなる。いくつかの実施形態では、ＮＰのアミノ酸配列は、配列番号１３〜２９、１００〜１１６、１１９〜１２５、１２７〜２３３、もしくは１００１〜１１５５のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含みまたはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ショートセグメントのアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸１〜５からなる。いくつかの実施形態では、ショートセグメントのアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸１〜５、２〜５、３〜５、４〜５、もしくは５、配列番号１７のアミノ酸１〜１０、配列番号１９のアミノ酸１〜５、配列番号２０のアミノ酸１〜３、配列番号２１のアミノ酸１〜５、または配列番号２９のアミノ酸１〜６からなる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端伸長部のアミノ酸配列は、配列番号１１のアミノ酸１〜３１を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端伸長部のアミノ酸配列は、配列番号１１のアミノ酸１７〜３１を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端伸長部のアミノ酸配列は、ＫＧＡＮＫＫ（配列番号３１４）またはＫＧＡＮＱＫ（配列番号３１５）を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端伸長部は、配列番号１１８、配列番号１１７で示されるアミノ酸配列、または配列番号１０１〜１１６のいずれか１つから選択されるアミノ酸２３〜３７を含む。

いくつかの実施形態では、ＮＰは、ＮＰＲ−Ａに対してよりもＮＰＲ−Ｂに対して選択性が高く、この場合、ｉｎｖｉｖｏ薬動学的アッセイで決定されるＮＰのＥＣ_{５０（ＮＰＲ−Ａ）}／ＥＣ_{５０（ＮＰＲ−Ｂ）}比は、少なくとも３０である。

いくつかの実施形態では、Ｆｃは、Ｃ_Ｈ２ドメインとＣ_Ｈ３ドメインとヒンジ領域とを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４からなる群から選択される免疫グロブリンの定常ドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、配列番号４０１で示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ−１である。いくつかの実施形態では、Ｆｃのアミノ酸配列は、配列番号４０１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、または配列番号４０１で示されるアミノ酸配列を含みもしくはそれからなる。

いくつかの実施形態では、Ｙは、高グリシン領域を含み、またはＹのアミノ酸配列は、１個以上のグリシンと１個以上のセリンとからなる。たとえば、Ｙのアミノ酸配列は、［（Ｇｌｙ）_ｍ（Ｓｅｒ）］_ｎ（Ｇｌｙ）_ｐまたは（Ｇｌｙ）_ｐ［（Ｓｅｒ）（Ｇｌｙ）_ｍ］_ｎ〔式中、ｍ、ｎ、およびｐのそれぞれは、独立して、０〜２０である〕を含みうる。いくつかの実施形態では、ｍは０〜２０である（たとえば、ｍは、３〜６、３〜７、３〜８、３〜９、３〜１０、３〜１１、３〜１２、３〜１４、３〜１５、３〜１６、３〜１７、３〜１８、３〜１９、３〜２０、４〜６、４〜７、４〜８、４〜９、４〜１０、４〜１１、４〜１２、４〜１４、４〜１５、４〜１６、４〜１７、４〜１８、４〜１９、４〜２０、５〜６、５〜７、５〜８、５〜９、５〜１０、５〜１１、５〜１２、５〜１４、５〜１５、５〜１６、５〜１７、５〜１８、５〜１９、５〜２０、６〜７、６〜８、６〜９、６〜１０、６〜１１、６〜１２、６〜１４、６〜１５、６〜１６、６〜１７、６〜１８、６〜１９、６〜２０、７〜８、７〜９、７〜１０、７〜１１、７〜１２、７〜１４、７〜１５、７〜１６、７〜１７、７〜１８、７〜１９、７〜２０、８〜９、８〜１０、８〜１１、８〜１２、８〜１４、８〜１５、８〜１６、８〜１７、８〜１８、８〜１９、８〜２０、９〜１０、９〜１２、９〜１４、９〜１５、９〜１６、９〜１７、９〜１８、９〜１９、９〜２０、１０〜１１、１０〜１２、１０〜１４、１０〜１５、１０〜１６、１０〜１７、１０〜１８、１０〜１９、または１０〜２０である）。いくつかの実施形態では、ｍは４であり、かつｎは１〜６である。いくつかの実施形態では、ｍ、ｎ、およびｐの組合せは、表２の１行から選択され、またはＹのアミノ酸配列は、配列番号３０４〜３１３、３２２〜３３３、または３３７〜３９１のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｙのアミノ酸配列は、［（Ｇｌｙ）_ｍ（Ｓｅｒ）］_ｎ（Ｇｌｙ）_ｐまたは（Ｇｌｙ）_ｐ［（Ｓｅｒ）（Ｇｌｙ）_ｍ］_ｎ〔式中、ｍ、ｎ、およびｐの組合せは、表２の１行から選択される〕からなり、またはＹのアミノ酸配列は、配列番号３０４〜３１３、３２２〜３３３、または３３７〜３９１のいずれか１つで示されるアミノ酸配列からなる。

いくつかの実施形態では、Ｘは不在であり、Ｚは不在であり、またはＸおよびＺは両方とも不在である。

いくつかの実施形態では、Ｘ、Ｙ、またはＺは、たとえば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個の連続した酸性残基、たとえば、アスパラギン酸またはグルタミン酸を含む、骨ターゲッティング部分を含む。いくつかの実施形態では、骨ターゲッティング部分は、Ｅ_６、Ｅ_７、Ｅ_８、Ｅ_９、Ｅ_１０、Ｅ_１１、Ｅ_１２、Ｅ_１３、Ｅ_１４、Ｅ_１５、Ｅ_１６、Ｄ_６、Ｄ_７、Ｄ_８、Ｄ_９、Ｄ_１０、Ｄ_１１、Ｄ_１２、Ｄ_１３、Ｄ_１４、Ｄ_１５、もしくはＤ_１６、たとえば、Ｅ_６、Ｅ_１０、Ｄ_６、もしくはＤ_１０を含み、またはそれらからなる。

いくつかの実施形態では、Ｘ、Ｙ、またはＺは、カテプシン（たとえばカテプシンＫ）切断配列を含む。いくつかの実施形態では、カテプシン切断配列は、ＨＧＰＱＧ（配列番号３７４）もしくはＨＫＬＲＧ（配列番号３７５）を含みまたはそれらからなる。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５０１〜６０８のいずれか１つ、たとえば、配列番号５０２、配列番号５０４、配列番号５０６、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５６０、配列番号５６２、配列番号５６４、配列番号５７２、配列番号５７４、配列番号５７６、配列番号５８４、配列番号５８６、配列番号５８８、配列番号５９６、配列番号５９８、配列番号６００、もしくは配列番号６０８で示されるアミノ酸配列を含みまたはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、骨ターゲッティング部分、たとえば、Ｅ_６、Ｅ_７、Ｅ_８、Ｅ_９、Ｅ_１０、Ｅ_１１、Ｅ_１２、Ｅ_１３、Ｅ_１４、Ｅ_１５、Ｅ_１６、Ｄ_６、Ｄ_７、Ｄ_８、Ｄ_９、Ｄ_１０、Ｄ_１１、Ｄ_１２、Ｄ_１３、Ｄ_１４、Ｄ_１５、またはＤ_１６、たとえば、Ｅ_６、Ｅ_１０、Ｄ_６、またはＤ_１０を含む。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５０４で示されるアミノ酸配列を含みまたはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５１２で示されるアミノ酸配列を含みまたはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５３０で示されるアミノ酸配列を含みまたはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５５４で示されるアミノ酸配列を含みまたはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５７２で示されるアミノ酸配列を含みまたはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５７８で示されるアミノ酸配列を含みまたはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５６０で示されるアミノ酸配列を含みまたはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５６６で示されるアミノ酸配列を含みまたはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５３８で示されるアミノ酸配列を含みまたはそれからなる（たとえば、配列番号５３８中のＸは、任意のアミノ酸、たとえば、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ、たとえば、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、またはＡｓｐ、たとえば、ＰｈｅまたはＬｅｕ、たとえば、Ｐｈｅ、たとえば、Ｌｅｕでありうる）。

いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、構造V-NPを含む。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているNP又はポリペプチドのいずれかは、方法(例えば、本明細書に記載されている態様のいずれかに記載されているNP又はポリペプチド)と併せて使用されてもよい。いくつかの実施形態において、V又はWのアミノ酸配列は、[(Gly)_m(Ser)]_n(Gly)_p又は(Gly)_p[(Ser)(Gly)_m]_nを含み、m、n、及びpのそれぞれは、独立して、0から20の間にある。いくつかの実施形態において、mは4であり、nは1〜6である。いくつかの実施形態において、Vは存在しない、Wは存在しない、又はV及びWはともに存在しない。いくつかの実施形態において、V及び/又はWは、骨標的化部分、例えば、E₆、E₇、E₈、E₉、E₁₀、E₁₁、E₁₂、E₁₃、E₁₄、E₁₅、E₁₆、D₆、D₇、D₈、D₉、D₁₀、D₁₁、D₁₂、D₁₃、D₁₄、D₁₅、又はD₁₆、例えば、E₆、E₁₀、D₆、又はD₁₀を含む。いくつかの実施形態において、V及び/又はWは、カテプシン(例えば、カテプシンK)切断配列、例えば、HGPQG(配列番号374)又はHKLRG(配列番号375)を含む。

本明細書に記載されている態様のいずれかの、いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチド、例えば、sALPポリペプチド及び/又はNPポリペプチドは、二量体形態である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、グリコシル化又はペグ化されている。

本明細書に記載されている態様のいずれかの、いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約0.2mg/kgから約20mg/kgの本発明のポリペプチド、例えば、sALPポリペプチド及び/又はNPポリペプチド、例えば、sALPポリペプチドの投薬量で投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、週1回、2回、3回、又は4回、約0.2mg/kgから約20mg/kgの投薬量で対象に投与される。投薬量は、週1回、2回、3回、又は4回、例えば、約0.5mg/kgから約10mg/kg、例えば、約1mg/kgから約5mg/kgであってもよい。いくつかの実施形態において、投薬量は、週1回、2回、又は3回、約1mg/kg、約2mg/kg、又は約3mg/kgである。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、週1回、2回、3回、又は4回、約0.2mg/kgから約20mg/kgの投薬量で対象に投与される。投薬量は、週1回、2回、3回、又は4回、例えば、約0.5mg/kgから約10mg/kg、例えば、約1mg/kgから約5mg/kgであってもよい。いくつかの実施形態において、投薬量は、週1回、2回、又は3回、約1mg/kg、約2mg/kg、又は約3mg/kgである。

本明細書に記載されている態様のいずれかの、いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約0.5mg/kgから約500mg/kgの本発明のポリペプチド、例えば、sALPポリペプチド及び/又はNPポリペプチド、例えば、NPポリペプチドで投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、週1回、2回、3回、又は4回、約0.5mg/kgから約500mg/kgの投薬量で対象に投与される。投薬量は、週1回、2回、3回、又は4回、例えば、約5mg/kgから約200mg/kg、例えば、約10mg/kgから約100mg/kgであってもよい。いくつかの実施形態において、投薬量は、週2回、約10mg/kgから約100mg/kgである。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、週1回、2回、3回、又は4回、約0.5mg/kgから約500mg/kgの投薬量で対象に投与される。投薬量は、週1回、2回、3回、又は4回、例えば、約5mg/kgから約200mg/kg、例えば、約10mg/kgから約100mg/kg、例えば、約20mg/kgから約40mg/kgであってもよい。いくつかの実施形態において、投薬量は、週1回、2回、又は3回、約10mg/kg、約30mg/kg、又は約100mg/kgである。

本明細書に記載されている態様のいずれかの、いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約10μg/kgから約1,000μg/kgの本発明のポリペプチド、例えば、sALPポリペプチド及び/又はNPポリペプチド、例えば、NPポリペプチドの投薬量で投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、週1回、2回、3回、又は4回、約10μg/kgから約1,000μg/kgの投薬量で対象に投与される。投薬量は、週1回、2回、3回、又は4回、例えば、約20μg/kgから約800μg/kg、例えば、約30μg/kgから約600μg/kg、例えば、約50μg/kgから約500μg/kg、例えば、約100μg/kgから約400μg/kg、例えば、約200μg/kgから約300μg/kgであってもよい。いくつかの実施形態において、投薬量は、週1回、2回、又は3回、約30μg/kg、約100μg/kg、約300μg/kg、又は約500μg/kgである。

本明細書に記載されている態様のいずれかの、いくつかの実施形態において、医薬組成物は、皮下に投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、週1回、2回、又は3回投与される。

第3の態様において、本発明は、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドを含む組成物を特徴とし、a)第1のポリペプチドは構造A-sALP-Bを含み、i)sALPは、アルカリホスファターゼの細胞外ドメインであり、ii)Aは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、iii)Bは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、b)第2のポリペプチドは構造V-NP-Wを含み、i)NPはナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR-B)のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、ii)Vは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、iii)Wは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である。

いくつかの実施形態において、第1のポリペプチドは、本明細書に記載されている、例えば、第1の態様について記載されているいずれかのaALPポリペプチドである。いくつかの実施形態において、第1のポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号1201、1204、1220、又は1221のいずれか1つ、例えば、配列番号1204と少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第1のポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号1204のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなる。

いくつかの実施形態において、第2のポリペプチドは、本明細書に記載されている、例えば、第2の態様について記載されているいずれかのNPポリペプチドである。いくつかの実施形態において、第2のポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号504、512、530、554、572、又は578のいずれか1つ、例えば、配列番号512と少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第2のポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号512のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなる。

いくつかの実施形態において、第1のポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号1204又は1221のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなり、第2のポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号504、512、530、又は572のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなる。

いくつかの実施形態において、第1のポリペプチド及び/又は第2のポリペプチドは二量体形態である。いくつかの実施形態において、第1のポリペプチド及び/又は第2のポリペプチドは、グリコシル化又はペグ化されている。

いくつかの実施形態において、組成物は、製薬上許容される賦形剤、例えば生理食塩水を含む医薬組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は凍結乾燥されている。

いくつかの実施形態において、第1のポリペプチドは、約0.2mg/kgから約20mg/kgの投薬量で存在し、第2のポリペプチドは、約0.5mg/kgから約500mg/kgの投薬量で存在する。いくつかの実施形態において、第1のポリペプチドは、1日1回、1日2回、1日3回、1日4回、週1回、週2回、週3回、又は週4回の投与について、約0.2mg/kgから約20mg/kg、例えば、約0.5mg/kgから約10mg/kg、例えば1mg/kgから約5mg/kgの投薬量で存在し、例えば、1日1回、1日2回、1日4回、週1回、週2回、又は週3回の投与について、約1mg/kg、約2mg/kg、又は約3mg/kgの投薬量で存在し、第2のポリペプチドは、1日1回、1日2回、1日3回、1日4回、週1回、週2回、週3回、又は週4回の投与について、約0.5mg/kgから約500mg/kg、例えば、約5mg/kgから約200mg/kg、例えば、約10mg/kgから100mg/kg、例えば、約20mg/kgから40mg/kgの投薬量で存在し、例えば、1日1回、1日2回、1日3回、週1回、週2回、又は週3回の投与について、約10mg/kg、約30mg/kg、又は約100mg/kgの投薬量で存在する。

いくつかの実施形態において、第1のポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号1204のアミノ酸配列を含み、第2のポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号512のアミノ酸配列を含む。

第4の態様において、本発明は、対象における疾患又は状態を処置する方法を特徴とし、該方法は、治療上有効な量の第1のポリペプチドと第2のポリペプチドを対象に投与することを含み、a)第1のポリペプチドは構造A-sALP-Bを含み、i)sALPは、アルカリホスファターゼの細胞外ドメインであり、ii)Aは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、iii)Bは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、b)第2のポリペプチドは構造V-NP-Wを含み、i)NPはナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR-B)のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、ii)Vは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、iii)Wは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、疾患又は状態は、神経皮膚症候群、FGFR3の過剰活性化と関連した障害、骨又は軟骨障害、血管平滑筋障害、及び骨の伸長の状態からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、対象における疾患又は状態はそれによって治療される。

いくつかの実施形態において、第1のポリペプチドは、sALPを含む、本明細書に記載されているいずれかのポリペプチド、例えば、本明細書に記載されているいずれかのsALPポリペプチド、例えば、第1又は第3の態様について記載されるものである。いくつかの実施形態において、第1のポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号1201、1204、1220、又は1221のいずれか1つ、例えば、配列番号1204と少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第1のポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号1204のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなる。

いくつかの実施形態において、第2のポリペプチドは、NPを含む、本明細書に記載されているいずれかのポリペプチド、例えば、本明細書に記載されているいずれかのNPポリペプチド、例えば、第2又は第3の態様について記載されているものである。いくつかの実施形態において、第2のポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号504、512、530、554、572、又は578のいずれか1つ、例えば、配列番号512と少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第2のポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号512のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなる。

いくつかの実施形態において、第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドは、互いに10日以内、5日以内、又は24時間以内、例えば、互いに10日以内、9日以内、8日以内、7日以内、6日以内、5日以内、4日以内、3日以内、又は2日以内、又は互いに24時間以内、12時間以内、11時間以内、10時間以内、9時間以内、8時間以内、7時間以内、6時間以内、5時間以内、4時間以内、3時間以内、2時間以内、又は1時間以内に投与される。

いくつかの実施形態において、第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドは同時に投与される。いくつかの実施形態において、第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドは、組成物に一緒に製剤化され、又は組成物にそれぞれ別々に製剤化される。いくつかの実施形態において、組成物は、製薬上許容される賦形剤、例えば、生理食塩水を含む医薬組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は凍結乾燥される。いくつかの実施形態において、組成物は、いずれかの組成物、例えば、本明細書に記載されている医薬組成物、例えば、第1、第2、又は第3の態様について記載されているものである。

第5の態様において、本発明は、a)構造A-sALP-Bを含み、i)sALPは、アルカリホスファターゼの細胞外ドメインであり、ii)Aは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、iii)Bは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である、第1のポリペプチドと、b)神経皮膚症候群と診断された患者、又は神経皮膚症候群を発症するリスクを有する患者に第1のポリペプチドを投与するための指示書とを含むキットを特徴とする。いくつかの実施形態において、第1のポリペプチドは、sALPを含む、本明細書に記載されているいずれかのポリペプチド、例えば、本明細書に記載されているいずれかのsALPポリペプチド、例えば、上記態様のいずれかに記載されているものである。

いくつかの実施形態において、キットは、さらに、c)構造V-NP-Wを含み、i)NPはナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR-B)のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、ii)Vは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、iii)Wは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である、第2のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、第2のポリペプチドは、NPを含む、本明細書に記載されているいずれかのポリペプチド、例えば、本明細書に記載されているいずれかのNPポリペプチド、例えば、上記態様のいずれかに記載されているものである。

第6の態様において、本発明は、a)構造V-NP-Wを含み、i)NPはナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR-B)のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、ii)Vは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、iii)Wは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である、ポリペプチドと、b)神経皮膚症候群と診断された患者、又は神経皮膚症候群を発症するリスクを有する患者にポリペプチドを投与するための指示書とを含むキットを特徴とする。いくつかの実施形態において、該ポリペプチドは、NPを含む、本明細書に記載されているいずれかのポリペプチド、例えば、本明細書に記載されているいずれかのNPポリペプチド、例えば、上記態様のいずれかに記載のものである。

第7の態様において、本発明は、a)構造A-sALP-Bを含み、i)sALPは、アルカリホスファターゼの細胞外ドメインであり、ii)Aは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、iii)Bは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である、第1のポリペプチドと、b)構造V-NP-Wを含み、i)NPはナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR-B)のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、ii)Vは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、iii)Wは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である、第2のポリペプチドとを含むキットを特徴とする。いくつかの実施形態において、第1のポリペプチドは、sALPを含む、本明細書に記載されているいずれかのポリペプチド、例えば、本明細書に記載されているいずれかのsALPポリペプチド、例えば、上記態様のいずれかに記載されているものであり、第2のポリペプチドは、NPを含む、本明細書に記載されているいずれかのポリペプチド、例えば、本明細書に記載されているいずれかのNPポリペプチド、例えば、上記態様のいずれかに記載されているものである。いくつかの実施形態において、第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドは一緒に製剤化される。いくつかの実施形態において、第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドは、別々に製剤化され、個々の投薬量で製剤化される。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、sALPのアミノ酸配列は、配列番号1202、1205、1218、又は1219のいずれか1つと少なくとも80、85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、sALPのアミノ酸配列は、配列番号1215のアミノ酸残基23〜508、配列番号1216のアミノ酸残基18〜498、配列番号1218のアミノ酸残基23〜508、配列番号1219のアミノ酸残基18〜498、配列番号1215のアミノ酸残基23〜512、配列番号1216のアミノ酸残基18〜502、配列番号1218のアミノ酸残基23〜512、又は配列番号1219のアミノ酸残基18〜502と少なくとも80、85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む又はそれらからなり、配列番号1218又は1219におけるXは、任意のアミノ酸であるが、ヒトTNALPのその位置での病因性突然変異に対応するアミノ酸ではなく、例えば、表1に示されている病因性突然変異に対応するアミノ酸ではない。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、NPのアミノ酸配列は、配列番号126のアミノ酸残基6〜22を含む又はそれからなり、配列番号126の17位のアミノ酸は、Phe、Leu、Ile、Thr、Glu、Arg、Tyr、Cys、Pro、Asp、Gly、Ala、Ser、Val、Trp、Asn、Gln、His、又はLys、例えば、Phe、Leu、Ile、Thr、Val、Ala、Ser、Glu、Arg、Tyr、Cys、Pro、又はAsp、例えば、Phe、Leu、Ile、Thr、Val、Ala、又はSer、例えば、Phe、Leu、Arg、Tyr、例えば、Phe又はLeu、例えば、Phe、例えば、Leuである。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、NPのアミノ酸配列は、配列番号13〜29、100〜116、119〜125、127〜233、又は1001〜1155のいずれか1つのアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなる。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、NPは、NPR-Aと比較してNPR-Bに選択的であり、NPに対するEC_50(NPR-A)/EC_50(NPR-B)比は、インビボでの薬物動態アッセイにおいて決定され、少なくとも30、例えば、少なくとも35、40、35、50、55、又は60である。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、FcはC_H2ドメイン、C_H3ドメイン、及びヒンジ領域を含み、Fcは、IgG-1、IgG-2、IgG-3、及びIgG-4からなる群から選択される免疫グロブリン、例えばIgG-1の定常ドメインである。いくつかの実施形態において、Fcのアミノ酸配列は、配列番号401と少なくとも80%、85%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Fcのアミノ酸配列は、配列番号401のアミノ酸配列を含む又はそれからなる。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、D若しくはYのアミノ酸配列は、グリシンリッチな領域を含む、又はD若しくはYのアミノ酸配列は、1つ以上のグリシン及び1つ以上のセリンからなる。例えば、D又はYのアミノ酸配列は、[(Gly)_m(Ser)]_n(Gly)_p又は(Gly)_p[(Ser)(Gly)_m]_nを含む又はそれからなり、m、n、及びpのそれぞれは、独立して、0から20の間である。いくつかの実施形態において、mは1から6の間にあり、nは1から10の間にあり、pは0から4の間にあり、例えば、mは4であり、nは1〜6である。いくつかの実施形態において、m、n、及びpの組み合わせは表2の一列から選択され、又はD若しくはYのアミノ酸配列は配列番号301〜391のいずれか1つのアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなる。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、D、G、又はYのアミノ酸配列は、場合により、2つのアミノ酸残基(例えば、ロイシン-リジン又はアスパラギン酸-イソロイシン)である。sALPポリペプチドのいくつかの実施形態において、C及びEはともに存在しなくてもよく、Dは存在しなくてもよく又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であってもよい。例えば、ポリペプチドは、構造sALP-D-Fc又は構造Fc-D-sALPからなってもよく、Dは、本明細書に記載されているいずれかのリンカーであってもよく、又は、場合により、2つのアミノ酸残基、例えば、ロイシン-リジンからなっていてもよい。例えば、ポリペプチドは、構造sALP-D-Fcからなっていてもよい。場合により、sALPのアミノ酸配列は、配列番号1205のアミノ酸配列であり、Dのアミノ酸配列は、ロイシン-リジンであり、及び/又はFcのアミノ酸配列は、配列番号401のアミノ酸配列である。sALPポリペプチドの他の実施形態において、Cは存在しなくてもよく、D及びEはともに存在しなくてもよく、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であってもよい。例えば、ポリペプチドは、構造sALP-D-Fc-E又は構造Fc-D-sALP-Eを含んでもよい。sALPポリペプチドの他の実施形態において、Cはアミノ酸配列であってもよく、D、G、及びHは全て存在しなくてもよく、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であってもよい。例えば、ポリペプチドは、構造sALP-D-Fc-G-I_n-Hを含んでもよい。NPポリペプチドのいくつかの実施形態において、X及びZはともに存在しなくてもよく、Yは存在しなくてもよく、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であってもよい。例えば、ポリペプチドは、構造NP-Y-Fc又は構造Fc-Y-NPからなっていてもよく、Yは、本明細書に記載されているいずれかのリンカーであってもよく、又は、場合により、2つのアミノ酸残基、例えば、ロイシン-リジンからなっていてもよい。例えば、ポリペプチドは、構造NP-Y-Fcからなっていてもよい。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、A、B、C、D、E、G、H、V、W、X、Y、又はZの1つ以上は存在しない。いくつかの実施形態において、Aは存在しない、Bは存在しない、又はA及びBはともに存在しない。いくつかの実施形態において、Cは存在しない、Eは存在しない、又はC及びEはともに存在しない。いくつかの実施形態において、Cは存在しない、Hは存在しない、又はC及びHはともに存在しない。いくつかの実施形態において、Xは存在しない、Zは存在しない、又はX及びZはともに存在しない。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、本発明のポリペプチド、例えば、sALPポリペプチド及び/又はNPポリペプチドは、骨標的化部分、例えば、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、又は16個の連続した酸性残基、例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸、例えば、E₆、E₇、E₈、E₉、E₁₀、E₁₁、E₁₂、E₁₃、E₁₄、E₁₅、E₁₆、D₆、D₇、D₈、D₉、D₁₀、D₁₁、D₁₂、D₁₃、D₁₄、D₁₅、又はD₁₆、例えば、E₆、E₁₀、D₆、又はD₁₀を含んでもよい。上記態様のいずれかの、いくつかの実施形態において、A、B、C、D、E、V、W、X、Y、又はZの1つ以上は、骨標的化部分、例えば、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、又は16個の連続した酸性残基、例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸、例えば、E₆、E₇、E₈、E₉、E₁₀、E₁₁、E₁₂、E₁₃、E₁₄、E₁₅、E₁₆、D₆、D₇、D₈、D₉、D₁₀、D₁₁、D₁₂、D₁₃、D₁₄、D₁₅、又はD₁₆、例えば、E₆、E₁₀、D₆、又はD₁₀を含んでもよい。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、本発明のポリペプチドは、場合により、骨標的化部分(例えば、2個の連続したアスパラギン酸又はグルタミン酸残基よりも長いポリアスパラギン酸又はポリグルタミン酸領域)を含まない。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、本発明のポリペプチドは、カテプシン(例えば、カテプシンK)切断配列、例えば、HGPQG(配列番号374)又はHKLRG(配列番号375)を含んでもよい。上記態様のいずれかの、いくつかの実施形態において、A、B、C、D、E、G、H、V、W、X、Y、又はZは、カテプシン(例えば、カテプシンK)切断配列を含む。

上記態様のいずれかの、いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、対照(例えば、CNP22、CNP53、又は本明細書に記載されているいずれかのポリペプチド、例えば、国際出願第WO2010/135541号又は米国出願公開第2010-0331256号に記載されているペプチド)と比較して、分解(例えば、中性エンドペプチダーゼ(NEP)、インスリン分解酵素(IDE)、又はインビボにおいてナトリウム利尿ペプチドを切断するいずれかの他の酵素による)が減少した(例えば、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、又は約100%)ポリペプチドを含んでもよい。

上記態様のいずれかの、いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、対照(例えば、本明細書に記載されているいずれかのポリペプチド、例えば、国際出願第WO2010/135541号又は米国出願公開第2010-0331256号に記載されているペプチド)と比較して、効率が増加した(例えば、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約100%、又はそれ以上)及び/又は用量依存的な副作用(例えば、有害血行動態作用の減少、例えば、血圧低下の減少)の減少した(例えば、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、又は約100%)ものであってよい。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、本発明のポリペプチド(例えば、sALPポリペプチド又はNPポリペプチド)はグリコシル化又はペグ化される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、1つ以上の本発明のポリペプチドの二量体を含む。いくつかの実施形態において、製薬上許容される賦形剤は生理食塩水を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は凍結乾燥される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、皮下、静脈内、経口的、経鼻的、筋内、舌下、髄腔内、又は皮内、例えば、皮下に投与される。

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、1日に1回、2回、3回、又は4回、約0.5mg/kgから約500mg/kgの投薬量で対象に投与される。投薬量は、1日に1回、2回、3回、又は4回、例えば、約5mg/kgから約200mg/kg、例えば、約10mg/kgから約100mg/kgであってもよい。いくつかの実施形態において、投薬量は、1日2回、約10mg/kg又は約100mg/kgである。

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、週1回又は2回、約0.5mg/kgから約500mg/kgの投薬量で対象に投与される。投薬量は、週1回又は2回、例えば、約5mg/kgから約200mg/kg、例えば、約10mg/kgから約100mg/kg、例えば、約20mg/kgから約40mg/kgであってもよい。いくつかの実施形態において、投薬量は、週1回又は2回、約10mg/kg、約30mg/kg、又は約100mg/kgである。

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、週1回又は2回、約10μg/kgから約1,000μg/kgの投薬量で対象に投与される。投薬量は、週1回又は2回、例えば、約20μg/kgから約800μg/kg、例えば、約30μg/kgから約600μg/kg、例えば、約50μg/kgから約500μg/kg、例えば、約100μg/kgから約400μg/kg、約200μg/kgから約300μg/kgであってもよい。いくつかの実施形態において、投薬量は、週1回又は2回、約30μg/kg、約100μg/kg、約300μg/kg、又は約500μg/kgである。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、医薬組成物は、1日に1回、2回、3回、又は4回の投薬レジメンにおいて、約0.1mg/kgから約500mg/kgの1つ以上の本発明のポリペプチドの投薬量で対象に投与される。投薬量は、1日に1回、2回、3回、又は4回の投薬処方において、例えば、約1mg/kgから約200mg/kg、例えば、約2mg/kgから約100mg/kg又は約10mg/kgから約100mg/kgの1つ以上の本発明のポリペプチドであってもよい。いくつかの実施形態において、投薬量は、1日2回の投薬処方において、約10mg/kg又は約100mg/kgの1つ以上の本発明のポリペプチドである。例えば、本発明の方法は、場合により、約0.5mg/kg/日から約10mg/kg/日(例えば、約2mg/kg/日から約3mg/kg/日)の投薬量で、対象に、本発明のポリペプチド(例えば、sALPポリペプチド及び/又はNPポリペプチド)を含む医薬組成物を投与することを含んでもよい。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、医薬組成物は、週に1から14回、対象に投与され、又は少なくとも月に1回、少なくとも1日に1回投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、少なくとも1カ月間、週に1回、対象に投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、週に1回、2回、3回、又は4回、例えば、週に3回投与される。

本発明の医薬組成物のいずれかは、場合により、対象における疾患又は状態(例えば、本明細書に記載されているいずれかのもの)を治療するために製剤化されてもよい。

単離された核酸を特徴とする本発明の医薬組成物のいずれかは、場合により、単離された核酸を含む組換え発現ベクター(例えば、レンチウイルスベクター)を含んでもよい。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約0.1mgから約10mgの単離された核酸を含む。

本明細書に記載されているいずれかの実施形態において、ポリペプチドは単離されてもよく、又は単離されなくてもよい。

本明細書に記載されているいずれかの実施形態において、対象はヒトであってもよい。

本明細書に記載されている態様のいずれかにおいて、本発明の2つ以上のポリペプチド(例えば、本明細書に記載されているいずれかのsALPポリペプチド及び/又はいずれかのNPポリペプチド)又は本発明の2つ以上の組成物の組み合わせは、相乗効果を与える。特定の実施形態において、相乗効果は、2つ以上のポリペプチドの組み合わせについて観察される治療的効果、本発明のポリペプチドの1つ以上は、通常、非治療的である投薬量で存在する、又は、1つ以上の有害事象(例えば、血行力学的効果、例えば、血圧の低下、例えば、収縮期動脈血圧、拡張期動脈血圧、若しくは平均動脈血圧の低下、これは有害降圧作用をもたらす)の予期しない減少をもたらす治療的効果、又は治療的用量での本発明のシグナルペプチドについて観察される用量依存的な副作用のレベルと比較して、用量依存的な副作用の減少をもたらす治療的効果である。

本明細書に記載されている方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、疾患は、神経皮膚症候群(例えば、神経線維腫症(例えば、古典的なフォン・レックリングハウゼン病型(I型)、消化管間質腫瘍(すなわち、腸神経線維腫症(3B型)として)を伴う、又はこのような腫瘍を伴わない;聴神経腫型(II型);主要な特徴を有するI型及びII型の特徴を組み合わせた混合型、例えば、両側性聴神経腫、後方窩及び上位頸髄膜腫、及び脊髄/傍脊柱神経線維腫(III型、リッカルディ(Riccardi)型又は3A型);I型を特徴する虹彩リッヒ(Lisch)結節の欠損によるものと区別される異型(VI型);正中線を交差する身体の単一セグメント又は領域などの身体の特定領域に影響を及ぼす病変を有するI型の変形である分節性神経線維腫症(V型);神経線維腫症の他の異変を伴わないカフェオレスポットの症状だけを有する型(VI型);ニューロフィブロミン遺伝子NF1における変異によって引き起こされ、I型と区別される変形であると考えられる家族性脊髄性神経線維腫;神経線維腫症-褐色細胞腫-十二指腸カルチノイド症候群などのI型の他の変形;ヌーナン症候群の異変を伴う神経線維腫症、例えば、低身長症、下垂症、顔面中央の低形成、翼状頚、学習障害、及び筋力低下;神経鞘腫症、これらの障害のいずれかは1つ以上の骨病変を含む、又は排除することができる);結節硬化症;スタージ・ウェーバー疾患;毛細血管拡張性運動失調;フォン・ヒッペル・リンドウ病;色素失調症;表皮母斑症候群、例えば、ヤーダスゾーンの線形脂腺母斑;母斑性基底細胞癌症候群;伊藤母斑症;神経皮膚黒色症;クリッペル-トレナウナイ症候群;及びワールデンブルグ症候群、I、II、III、及びIV型を含む)である。いくつかの実施形態において、神経皮膚症候群は、1つ以上の骨病変を有する。いくつかの実施形態において、神経皮膚症候群は、神経線維腫症I型である。本明細書に記載されている方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、疾患は、過剰活性化したRAS及び/又はERKシグナル伝達を伴ういずれかの症候群(例えば、神経皮膚症候群)(例えば、ヌーナン症候群、コステロ症候群、複数の黒子を有するヌーナン症候群/レオパルド(LEOPARD)症候群、神経線維腫症1型、遺伝性歯肉線維腫症1型、NF1-ヌーナン症候群、毛細血管奇形-AV奇形症候群、Legius症候群、緩い成長期毛を伴うヌーナン症候群様障害、若年性骨髄単球性白血病を伴うヌーナン症候群様障害(JMML)、心臓-顔-皮膚症候群、又は自己免疫リンパ増殖性症候群であり、これらの疾患のいずれかは、1つ以上の骨病変を含む、又は排除する)である。本明細書に記載されている方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、FGFR3の過剰活性化と関連した障害は、骨又は軟骨障害、例えば、骨格形成異常、例えば、本明細書に記載されているもの、例えば、軟骨無形成症又は頭蓋骨癒合症である。本明細書に記載されている方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、障害は、骨又は軟骨障害、例えば、骨格形成異常、例えば、本明細書に記載されているいずれかのものである。いくつかの実施形態において、骨又は軟骨障害は、骨格形成異常、例えば、軟骨無形成症、ホモ接合軟骨無形成症、ヘテロ接合軟骨無形成症、軟骨無形成、先端骨形成不全、遠位中間肢異形成症、骨発生不全症、屈肢症異形成、軟骨点状発育不全、肢根型軟骨点状発育不全、鎖骨頭蓋骨形成不全症、先天性短小大腿骨、頭蓋骨癒合症(例えば、ムンク症候群、クルゾン症候群、アペール症候群、ジャクソン・ワイス症候群、ファイファー症候群、又はクルゾン真皮骨格症候群)、趾、短指症、屈指症、多指症、合指症、捻曲性骨異形成症、低身長症、分節異常骨異形成症、内軟骨腫症、線維軟骨形成症、線維性骨異形成、遺伝性多発性外骨腫、軟骨低形成症、低ホスファターゼ症、低リン血症性くる病、ヤッフェ-リヒテンシュタイン症候群、クニースト異形成症、クニースト症候群、ランガー型中脚異形成症、マルファン症候群、マッキューン-オルブライト症候群、小肢症、骨幹端異形成、ヤンセン型骨幹端異形成症、変容性骨異形成症、モルキオ症候群、ニーバージェルト型中脚異形成症、神経線維腫症(例えば、1型、例えば、骨病変を伴う又は骨病変を伴わない、2型、神経鞘腫症、又は本明細書に記載されているいずれかのもの)、変形性関節症、骨軟骨異形成症、骨形成不全症、周産期致死型の骨形成不全症、大理石骨病、骨斑紋症、末梢骨形成不全症、ラインハルト症候群、ロバーツ症候群、ルビノー症候群、ショートリブ多指症症候群、低身長、先天性脊椎-骨端骨異形成症、脊椎骨端骨幹端異形成症、又は致死性骨異形成症である。いくつかの実施形態において、骨又は軟骨障害は、場合により、低ホスファターゼ症(例えば、乳児HPP、小児HPP、周産期HPP、成体HPP、又は歯限局型低ホスファターゼ症)である。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、発育遅延、頭蓋骨変形症、及び歯科矯正異常からなる群から選択される軟骨無形成症の表現型を治療するのに、治療上有効な量で投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、子宮頸部脊髄圧迫、脊髄狭窄症、水頭症、慢性中耳炎に起因した聴力損失、心血管疾患、神経疾患、及び肥満からなる群から選択される軟骨無形成症の表現型を治療するのに治療上有効な量で投与される。本明細書に記載されている方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、FGFR3の過剰活性化と関連した障害は、癌、例えば、多発性骨髄腫、骨髄増殖性症候群、白血病、形質細胞性白血病、リンパ腫、神経膠芽腫、前立腺癌、膀胱癌、又は乳癌である。本明細書に記載されている方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、血管平滑筋障害は、高血圧症、再狭窄、動脈硬化症、急性非代償性心不全、うっ血性心不全、心臓浮腫、腎性浮腫、肝性浮腫、急性腎不全、又は慢性腎不全である。本明細書に記載されている方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、骨の伸長の状態は、骨折、腎不全又は機能不全、乏しい食生活、ビタミン欠乏、ホルモン欠乏、又は本明細書に記載されているいずれかの骨格形成異常から生じる不十分な又は損なわれた骨成長である。

本明細書に記載されている任意の方法において、対象における神経皮膚症候群、FGFR3の過剰活性化と関連した障害、骨又は軟骨障害、血管平滑筋障害、又は骨の伸長の状態は、それによって治療される。

本明細書に記載されている方法のいずれかの、いくつかの実施形態において、本発明の1つ以上のポリペプチド又は本発明の1つ以上の組成物は、場合により、HPPと関連した発作、乳歯の早期喪失、不完全な骨石灰化、無機ピロリン酸(PPi)の血中及び/又は尿中レベルの上昇、ホスホエタノールアミン(PEA)の血中及び/又は尿中レベルの上昇、ピリドキサール5'-リン酸塩(PLP)の血中及び/又は尿中レベルの上昇、不適切な体重増加、くる病、骨痛、ピロリン酸カルシウム二水和物結晶沈着、形成不全、発育不全、及び歯科セメント質の異形成からなる群から選択されるHPP表現型を治療するのに治療上有効な量で投与される。いくつかの実施形態において、不完全な骨石灰化は、不完全な大腿骨の石灰化、不完全な脛骨の石灰化、不完全な中足骨の石灰化、又は不完全な肋骨の石灰化である。

定義
本明細書で用いられる場合、「約」という用語は、記載値の±１０％を意味する。

ｉｎｖｉｖｏ薬動学的アッセイとの関連では、「曲線下面積」または「ＡＵＣ」とは、動物における投与後の血清中濃度ｖｓ時間曲線下の面積を意味する。

「骨障害または軟骨障害」とは、骨または軟骨の機能、構造、または成長に影響を及ぼす任意の障害、疾患、または他の異常を意味する。

「骨ターゲッティング部分」とは、骨ターゲッティング部分が、単独使用で、少なくとも１０^−６Ｍまたはそれよりも良好な（たとえば、１０^−７Ｍ、１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍ、またはそれよりも良好な）骨基質に対するｉｎｖｉｖｏ結合親和性を有するように、骨基質に対する十分な親和性を有する６〜２０アミノ酸残基長のアミノ酸配列を意味する。

「カテプシン切断配列」とは、３０℃以上（たとえば３７℃）で少なくとも１０^３Ｍ^−１ｓ^−１（たとえば、１０^４Ｍ^−１ｓ^−１、１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、１０^６Ｍ^−１ｓ^−１、１０^７Ｍ^−１ｓ^−１、または１０^８Ｍ^−１ｓ^−１）のｋ_ｃａｔ／ｋＭ速度定数でカテプシンにより切断可能な部位を有するアミノ酸配列を意味する。特定の実施形態では、カテプシン切断配列は、カテプシンＫに特異的である。例示的カテプシン切断配列は、Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’であり、この場合、酵素による切断は、Ｐ１−Ｐ１’ペプチド結合で起こるであろう。また、Ｐ２は、好ましくは、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅからなるが、Ｖａｌ、ノルロイシン、Ｍｅｔ、またはＡｌａからなることも可能であり、Ｐ１は、好ましくは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎであるが、ノルロイシン、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、またはＴｈｒも可能であり、かつＰ１’は、任意のアミノ酸でありうるが、好ましくはＧｌｙである。このほかのカテプシン切断配列は、Ｃｈｏｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（１８）：１２８２４−８３２，２００６（参照により本明細書に組み込まれる）に提供されている。

「ＣＮＰ２２」とは、とくに異なる意味が明示的に示されていないかぎり、ヒトＣＮＰ２２（配列番号４）を意味する。

「ＣＮＰ５３」とは、とくに異なる意味が明示的に示されていないかぎり、ヒトＣＮＰ５３（配列番号１１）を意味する。

「骨の伸長のための症状」とは、骨の１以上の部分の伸展(伸長化)の恩恵を受ける任意の障害、疾患、または他の異常を意味する。本明細書に記載の任意のポリペプチドの投与後に、骨の１以上の部分の長さは約1%、約2%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%または約100%以上、増大しうる。

「ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害」とは、ＦＧＦＲ３の過剰活性化、たとえば、機能獲得ＦＧＦＲ３突然変異に由来する過剰活性化により引き起こされるまたはそれに関連付けられる任意の障害、疾患、または他の異常、障害を意味する。

「有効性」とは、用量−応答アッセイにおける化合物のＥ_ｍａｘ値を意味する。

「Ｆｃ」とは、免疫グロブリン重鎖のＣ_Ｈ２ドメインおよびＣ_Ｈ３ドメインを含む、免疫グロブリン、たとえば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３またはＩｇＧ−４の結晶性フラグメント領域を意味する。Ｆｃはまた、Ｆａｂ領域とＦｃ領域とを連結するヒンジ領域の任意の部分をも含みうる。Ｆｃは、ヒトを含む任意の哺乳動物のものが可能であり、かつ（たとえばグリコシル化により）翻訳後修飾が可能である。例として、Ｆｃは、配列番号４０１で示されるアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ−１の結晶性フラグメント領域でありうるが、これに限定されるものではない。

「断片」とは、好ましくは、参照の核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上を含有する、ポリペプチドまたは核酸分子の一部を意味する。断片は、たとえば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００ヌクレオチド、もしくはそれ以上（核酸分子の全長まで）、または１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、４００、５００、６００、７００アミノ酸、もしくはそれ以上（ポリペプチドの全長まで）を含有しうる。例示的sALP断片はALPのコンセンサス配列(例えば配列番号1215、配列番号1216、配列番号1218、または配列番号1219)のアミノ酸残基18-498、18-499、18-500、18-501、18-502、18-503、18-504、18-505、18-506、18-507、18-508、18-509、18-510、18-511、または18-512を有し、追加のN末端及び／又はC末端部分を有しうる。例示的ＮＰ断片は、少なくともコンセンサスリングドメイン、たとえば、配列番号６、３０、または９５で示されるものを有し、かつ追加のＮ末端部分および／またはＣ末端部分を含んでいてもよい。

「同族体（ホモログ）」とは、参照のアミノ酸配列または核酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を呈するポリペプチドまたは核酸分子を意味する。そのような配列は、一般的には、参照配列に対して、アミノ酸レベルまたは核酸レベルで、少なくとも、たとえば、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性である。一般的には、ポリペプチドでは、比較配列の長さは、少なくとも５アミノ酸残基、たとえば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００アミノ酸残基、またはそれ以上（ポリペプチドの全長まで）でありうる。核酸では、比較配列の長さは、一般的には、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００ヌクレオチド、またはそれ以上（核酸分子の全長まで）でありうる。配列同一性を決定する目的では、ＤＮＡ配列をＲＮＡ配列と比較した場合、チミンヌクレオチドは、ウラシルヌクレオチドと等価なものとみなされる。

本明細書で用いられる場合、ポリペプチド配列または核酸配列が参照配列に対して「少なくともＸ％の配列同一性」を有するものとして参照されるとき、ポリペプチドまたは核酸のアミノ酸残基またはヌクレオチドの少なくともＸパーセントは、配列が最適にアライメントされたときに参照配列のものと同一であることを意味する。配列の最適アライメントは、当該技術の範囲内の種々の方法、たとえば、スミス・ウォーターマンアライメントアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−７，１９８１）およびＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０）により、決定可能である。これらのおよび他のアライメントアルゴリズムは、公的に利用可能なコンピューターソフトウェア、たとえば、ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒＰｌｕｓＴＭ（ＳｃｈｗａｒｚａｎｄＤａｙｈｏｆ，ＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，Ｅｄｐｐ３５３−３５８，１９７９）に組み込まれた「ＢｅｓｔＦｉｔ」（ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ，ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，４８２−４８９，１９８１）、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ、ＢＬＡＳＴ−Ｘ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、ＣＬＵＳＴＡＬ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）などにより利用可能である。それに加えて、当業者であれば、比較される配列の長さ全体にわたる最適アライメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含めて、アライメントを評価するのに適切なパラメーターを決定することが可能である。

「ハイブリダイズする」とは、種々のストリンジェンシー条件下で相補的ポリヌクレオチド間またはその一部分間で二本鎖分子を形成するように対合することを意味する。（たとえば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄＳ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９、Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照されたい）。たとえば、高ストリンジェンシー塩濃度は、通常、約７５０ｍＭＮａＣｌおよび７５ｍＭクエン酸三ナトリウムよりも低く、約５００ｍＭＮａＣｌおよび５０ｍＭクエン酸三ナトリウムよりも低く、または約２５０ｍＭＮａＣｌおよび２５ｍＭクエン酸三ナトリウムよりも低いであろう。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒たとえばホルムアミドの不在下で達成可能であり、一方、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％のホルムアミドまたは少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で達成可能である。高ストリンジェンシー温度条件は、通常、少なくとも約３０℃、３７℃、または４２℃の温度を含むであろう。さまざまな追加のパラメーター、たとえば、ハイブリダイゼーションの時間、界面活性剤たとえばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度、および担体ＤＮＡの組込みまたは排除は、当業者に周知である。必要に応じてこれらの種々の条件を組み合わせることにより、種々のストリンジェンシーレベルが達成される。一実施形態では、ハイブリダイゼーションは、７５０ｍＭＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および１％ＳＤＳ中、３０℃で行われるであろう。代替実施形態では、ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミド、および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中、３７℃で行われるであろう。さらなる代替実施形態では、ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、および２００μｇ／ｍｌｓｓＤＮＡ中、４２℃で行われるであろう。これらの条件の有用な変更は、当業者には自明であろう。

ほとんどの用途では、ハイブリダイゼーションに続く洗浄工程もまた、ストリンジェンシーがさまざまであろう。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度によりおよび温度により規定可能である。以上のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を低下させることによりまたは温度を上昇させることにより増大可能である。たとえば、洗浄工程の高ストリンジェンシー塩濃度は、たとえば、約３０ｍＭＮａＣｌおよび３ｍＭクエン酸三ナトリウムよりも低くてもよいし、または約１５ｍＭＮａＣｌおよび１．５ｍＭクエン酸三ナトリウムよりも低くてもよい。洗浄工程の高ストリンジェンシー温度条件は、通常、たとえば、少なくとも約２５℃、４２℃、または６８℃の温度を含むであろう。一実施形態では、洗浄工程は、３０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳ中、２５℃で行われるであろう。代替実施形態では、洗浄工程は、１５ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳ中、４２℃で行われるであろう。さらなる代替実施形態では、洗浄工程は、１５ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳ中、６８℃で行われるであろう。これらの条件のさらなる変更は、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知であり、たとえば、ＢｅｎｔｏｎａｎｄＤａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ１９６：１８０，１９７７）、ＧｒｕｎｓｔｅｉｎａｎｄＨｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ７２：３９６１，１９７５）、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ，２００１）、ＢｅｒｇｅｒａｎｄＫｉｍｍｅｌ（ＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）、およびＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋに記載されている。

「単離された」または「精製された」とは、他の天然に付随する成分から分離されたことを意味される。典型的には、化合物（たとえば、ポリペプチド、核酸、もしくは小分子）、因子、細胞、または他の成分は、タンパク質、抗体、天然に存在する有機分子、および天然に会合している他の成分が、重量基準で、少なくとも、たとえば、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、さらには９９％除去された場合、単離されたとみなされる。いくつかの場合には、成分は、重量基準で、少なくとも７５％、９０％、さらには９９％の純度である。単離された成分は、化学合成、天然源由来の因子の分離、または成分を天然に産生しない組換え宿主細胞内での成分の産生により、取得可能である。タンパク質および小分子は、当業者であれば、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，２０００）に記載の技術などの標準的技術を用いて精製可能である。成分は、たとえば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、光学濃度、ＨＰＬＣ分析、またはウェスタン分析（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ）を用いて測定したとき、好ましくは、少なくとも、たとえば、出発物質の２、５、または１０倍の純度である。例示的精製方法は、カラムクロマトグラフィー法、免疫沈降法、および磁気ビーズ免疫アフィニティー精製法である。

「ナトリウム利尿ペプチドレセプターＢのアゴニストであるナトリウム利尿ペプチド（「ＮＰ」と略記される）」とは、本明細書で説明したナトリウム利尿ペプチド、たとえば、ヒトＣＮＰ２２（配列番号４）、または標準的ＮＰＲ−Ｂ活性化アッセイ、たとえば、本明細書で説明した膜アッセイまたは全細胞アッセイで測定したとき、ＣＮＰ２２の効力の少なくとも０．０００００１、０．０００００５、０．００００１、０．００００５、０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．９、または１倍、かつその有効性の少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９５％、さらには１００％を有して、ＮＰＲ−Ｂ、たとえば、ヒトＮＰＲ−Ｂをアゴナイズ可能な、その変異体を意味する。変異型ＮＰは、ＣＮＰ２２に対して１つ以上の置換、付加、または欠失を含んで、ＮＰＲ−Ｂをアゴナイズする能力を有しうる。本明細書で説明したＮＰは、ＮＰがＮＰＲ−Ｂをアゴナイズする能力を有するかぎり、共有結合または非共有結合された任意の他の配列または部分を含んでいてもよい。

「神経皮膚症候群」とは、１以上の皮膚症状、例えば皮膚および／または眼の損傷を伴う神経学的障害を意味する。かかる症候群は場合により身体の複数の部位において良性若しくは悪性の腫瘍を伴うものであり得る。

「NPポリペプチド」とは、本明細書に定義する、NP配列を含む任意の配列を意味する。例示的なNPポリペプチドとしては、構造V-NP-Wを有するもの、[式中、V及びWはそれぞれ、不在であるか、または少なくとも１アミノ酸のアミノ酸配列である]（例えば本明細書に記載の任意のNP融合ポリペプチド）が挙げられる。

「核酸分子」とは、２個以上の共有結合された天然に存在するまたは修飾されたヌクレオチドの配列を有する分子、たとえば、ＲＮＡまたはＤＮＡを意味する。核酸分子は、たとえば、単一鎖または二本鎖であってもよく、かつ修飾型もしくは非修飾型のヌクレオチドまたはそれらの混合物もしくは組合せを含んでいてもよい。また、種々の塩、混合塩、および遊離酸形も含まれる。

「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、同義的に用いられ、翻訳後修飾（たとえば、グリコシル化またはリン酸化）の有無を問わず、本明細書で説明した天然に存在するまたは天然に存在しないポリペプチドまたはペプチドの全部または一部を構成する２個以上の天然または非天然アミノ酸残基の任意の鎖を意味する。

本明細書で用いられる場合、天然アミノ酸とは、Ｌ配置を有する天然α−アミノ酸、たとえば、天然ポリペプチド中に通常存在するアミノ酸のことである。非天然アミノ酸とは、ポリペプチド中に通常存在しないアミノ酸、たとえば、Ｌ配置を有する天然α−アミノ酸のエピマー、すなわち、非天然Ｄ配置を有するアミノ酸、またはそれらの（Ｄ，Ｌ）−異性体混合物、あるいはそのようなアミノ酸の同族体、たとえば、β−アミノ酸、α，α−二置換アミノ酸、またはアミノ酸側鎖が１もしくは２個のメチレン基だけ短縮されたもしくは１０個の炭素原子まで延長されたα−アミノ酸、たとえば、直鎖中に５個から１０個まで（両端値を含む）の炭素原子を有するα−アミノアルカン酸、無置換もしくは置換芳香族（α−アリールもしくはα−アリール低級アルキル）、たとえば、置換フェニルアラニンもしくはフェニルグリシンを意味する。

「製薬上許容される担体(薬学的に許容可能な担体)」または「製薬上許容される賦形剤(薬学的に許容可能な賦形剤)」とは、一緒に投与される化合物の治療性を維持しながら治療患者に生理学的に許容可能な担体または賦形剤を意味する。例示的な製薬上許容される担体物質の１つは、生理食塩水である。他の生理学的に許容可能な担体およびその製剤は、当業者に公知であり、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，（２０ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ），ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡに記載されている。

「医薬組成物」とは、製薬上許容される賦形剤と共に製剤化された本明細書で説明したポリペプチドまたは核酸分子を含有する、かつ被験体において疾患またはイベントを治療または予防すべく治療レジメンの一部として政府規制機関の承認を得て製造または販売される、組成物を意味する。医薬組成物は、たとえば、皮下投与に供すべく、静脈内投与に供すべく（たとえば、粒状塞栓を含まない無菌溶液としておよび静脈内使用に好適な溶媒系で）、経口投与に供すべく（たとえば、錠剤、カプセル剤、カプレット剤、ゲルキャップ剤、もしくはシロップ剤）、または本明細書で説明した任意の他の製剤、たとえば、ユニット製剤の形で、製剤化可能である。

「効力」とは、用量−応答アッセイにおける化合物のＥＣ_５０値の逆数を意味する。化合物と対照との間またはアッセイと対照アッセイとの間で効力を比較する場合、低減された効力は、対照または対照アッセイのＥＣ_５０値と比較して、増大されたＥＣ_５０値を示し、増大された効力は、低減されたＥＣ_５０値を示す。

「低減された分解性」とは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、６０、１２０、１８０、もしくは２４０分間またはそれ以上あるいはこれらの値の任意の２つの間の任意の範囲にわたり酵素に暴露した後、分解されたペプチドのパーセントが、分解された対照、たとえば、ＣＮＰ２２、ＣＮＰ５３、または本明細書で説明した任意のポリペプチド、たとえば、国際公開第２０１０／１３５５４１号パンフレットまたは米国特許出願公開第２０１０−０３３１２５６号明細書に記載のペプチドのパーセントと比較して、より低いことを意味する。分解されたペプチドのパーセントは、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％低くなりうる。この場合、分解されたペプチドのパーセントは、酵素（たとえば、中性エンドペプチダーゼ、インスリン分解酵素、およびｉｎｖｉｖｏでナトリウム利尿ペプチドを切断する任意の他の酵素）に暴露した後、残存するペプチドのパーセントを測定してから残存するペプチドのこのパーセントを１００％から引き算して、分解されたペプチドのパーセントを直接的または間接的に測定することにより、決定可能である。分解されたペプチドまたは残存するペプチドのパーセントは、任意の有用な方法、たとえば、液体クロマトグラフィー法（たとえば、高性能液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ））、質量分析法（ＭＳ）、または組合せ分析技術（たとえば、ＬＣ−ＭＳ）により、測定可能である。

「低減された用量依存的副作用」とは、対照（たとえば、本明細書で説明した任意のポリペプチド、たとえば、国際公開第２０１０／１３５５４１号パンフレットまたは米国特許出願公開第２０１０−０３３１２５６号明細書に記載のペプチド）と比較して、化合物の投与量の関数としての１つ以上の有害作用が低減されることを意味する。１つ以上の有害作用の低減は、有害作用を検出するのに有用な任意のアッセイにより決定したとき、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％でありうる。例示的有害作用は、血行力学的作用、たとえば、有害な低血圧作用を引き起こす血圧の低下、たとえば、収縮期動脈血圧、拡張期動脈血圧、または平均動脈血圧の低下を含み、そのような血行力学的作用を検出するアッセイは、血圧計または留置圧力トランスデューサーを含む。

用語「sALP」、「可溶性アルカリホスファターゼ」および「アルカリホスファターゼの細胞外ドメイン」は相互に交換可能に使用され、可溶性で、非膜結合性のアルカリホスファターゼもしくはドメイン、またはその生物学的に活性な断片もしくは生物学的に活性なバリアントを意味する。sALPとしては、例えばC末端GPIシグナル配列を欠いたアルカリホスファターゼ、例えばヒトTNALP (配列番号1208)のアミノ酸残基18-502を含むかまたはこれからなるポリペプチドが挙げられる。sALPとしてはさらに、例えば、可溶性で、非膜結合性の形態のヒトTNALPの哺乳動物オルソログ(例えば配列番号1206のアミノ酸残基16-502もしくは18-502、配列番号1207のアミノ酸残基18-502、配列番号1209のアミノ酸残基18-502、配列番号1210のアミノ酸残基18-502、または配列番号1211のアミノ酸残基1-480を含むかまたはこれからなるポリペプチド)、
可溶性で、非膜結合性の形態のヒトIALP、GALP、およびPLALP (例えば配列番号1212のアミノ酸残基20-503、配列番号1213のアミノ酸残基20-503、または配列番号1214のアミノ酸残基23-506を含むかまたはこれからなるポリペプチド)、ならびにアルカリホスファターゼ活性、例えばPPiを加水分解する能力、を保持するその追加のバリアントおよびアナログが挙げられる。

「sALPポリペプチド」とは、本明細書に定義するsALP配列を含む任意の配列を意味する。例示的なsALP ポリペプチドとしては、構造A-sALP-Bを有するもの[式中、AおよびBのそれぞれは、不在であるかまたは少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列である](例えば本明細書に記載の任意のsALP融合ポリペプチド)が挙げられる。

「ＮＰＲ−Ａに対してよりもＮＰＲ−Ｂに対して選択性が高い」とは、本明細書で説明したように、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏ用量−応答アッセイで、たとえば、ｃＧＭＰ産生の測定で、少なくとも１．２５、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、７．５、１０、１２．５、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１，０００、１，１００、１，２００、１，２５０、１，３００、１，４００、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、もしくはそれ以上またはこれらの値の任意の２つの間の任意の範囲であるＥＣ_{５０（ＮＰＲ−Ａ）}／ＥＣ_{５０（ＮＰＲ−Ｂ）}比を有することを意味する。他の選択肢としてまたは追加として、「ＮＰＲ−Ａに対してよりもＮＰＲ−Ｂに対して選択性が高い」という用語は、本明細書で説明したように、少なくとも１．１、１．２、１．２５、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．７５、１．８、１．９、２、２．２５、２．５、２．７５、３、３．５、４、４．５、５、７．５、１０、１２．５、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１，０００、１，１００、１，２００、１，２５０、１，３００、１，４００、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、もしくはそれ以上またはこれらの値の任意の２つの間の任意の範囲であるＡＵＣ_{（ＮＰＲ−Ｂ）}／ＡＵＣ_{（ＮＰＲ−Ａ）}比を有することを意味する。

「シグナルペプチド」または「シグナル配列」とは、ポリペプチドが分泌されるようにポリペプチドを細胞膜に方向付けるアミノ酸配列を意味する。他の選択肢として、シグナル配列は、ポリペプチドを細胞内区画またはオルガネラたとえばゴルジ装置に方向付け可能である。シグナル配列は、ポリペプチドを細胞の特定の領域にターゲッティングする既知の機能を有するペプチド配列との相同性または生物学的活性により同定可能である。当業者であれば、容易に利用可能なソフトウェア（たとえば、ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅｏｆｔｈｅＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒ，１７１０ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＡｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７０５、ＢＬＡＳＴ、またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を用いて、シグナル配列を同定することが可能である。シグナル配列は、たとえば、配列番号５０１のアミノ酸残基１〜２５または配列番号1201のアミノ酸残基1-17と実質的に同一のものでありうる。

「骨格形成異常」とは、低身長症または小人症により特徴付けられる骨または軟骨障害を意味する。

「被験体」とは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、たとえば、ウシ科動物、ウマ科動物、イヌ科動物、ヒツジ科動物、またはネコ科動物を含む哺乳動物を意味するが、これらに限定されるものではない。

「相乗」効果とは、２以上の薬剤の投与後に観察される治療効果が、各々の単一の薬剤の投与後に観察される治療効果の合計よりも大きいことをいう。相乗効果のある例では、２以上の薬剤の組合せについて治療効果が観察され、このとき１以上の薬剤が通常は治療的ではない用量で存在する。相乗効果の別の例では、２以上の薬剤の組合せが、１以上の不利なイベントの予期せぬ低下をもたらす(すなわち、不利なイベントのレベルまたは数が、単一の薬剤の投与後に観察される不利なイベントの合計よりも少ない)。別の例では、治療的な用量での２以上の薬剤の組合せが、単一の薬剤の治療的用量で観察される用量胃依存的副作用のレベルと比較して、用量依存的副１以上の薬剤が通常は治療的でない用量で存在するときに、２以上の薬剤の組合せについて治療効果が観察される。

「治療上有効量」とは、神経皮膚症候群、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、骨障害もしくは軟骨障害（たとえば軟骨無形成症）、または血管平滑筋障害の任意の症状を実質的に治療、予防、遅延、抑制、または阻止するのに十分な、あるいは骨を実質的に伸長させるのに十分な、本明細書で説明したポリペプチドまたは核酸分子の量を意味する。本明細書で説明した組成物の治療上有効量は、治療される疾患の重症度、ならびに被験体の病態、体量、および全身状態に依存しうる。また、当業者であれば、そのような因子を考慮して、それを決定することが可能である。本明細書で説明した組成物の治療上有効量は、一定期間にわたり被験体に単回用量で投与可能であり、または複数回用量で投与可能である。

「治療」（”ｔｒｅａｔｉｎｇ””ｔｒｅａｔ””ｔｒｅａｔｍｅｎｔ”）とは、たとえば、医薬組成物を投与することによる、神経皮膚症候群、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、骨障害もしくは軟骨障害（たとえば軟骨無形成症）、または血管平滑筋障害の治癒、寛解、安定化、可能性減少、または予防を目的とした患者の医療管理、あるいは骨の伸長を目的とした健常被験体の管理を意味する。この用語は、積極療法、すなわち、疾患、病態、障害、もしくはイベントの改善をとくに目指した治療、またはその治癒に関連付けられる治療を含み、さらには、原因療法、すなわち、関連する疾患、病態、障害、もしくはイベントの原因の除去を目指した治療をも含む。それに加えて、この用語は、待期療法、すなわち、疾患、病態、障害、またはイベントの治癒ではなく、症状の軽減を意図した治療、対症療法、すなわち、関連する疾患、病態、障害、またはイベントの全身症状に対処する治療、予防療法、すなわち、たとえば、まだ病気でないが、特定の疾患、病態、障害、またはイベントに罹患しやすい、さもなければその危険性のある患者において、関連する疾患、病態、障害、またはイベントの発生の最小化または部分的もしくは完全な抑制を目指した治療、および支持療法、すなわち、関連する疾患、病態、障害、またはイベントの改善を目指した他の特異療法を補足すべく利用される治療を含む。

「血管平滑筋障害」とは、血管平滑筋の機能、構造、または成長に影響を及ぼす任意の障害、疾患、または他の異常を意味する。

「ベクター」とは、ＤＮＡ断片の挿入またはクローニングが可能なＤＮＡ分子、通常、プラスミドまたはバクテリオファージに由来するものを意味する。組換えベクターは、１つ以上の特有の制限部位を含有するであろう。また、クローン化配列が複製できるように、規定の宿主生物または媒体生物において自律複製が可能でありうる。ベクターは、レシピエント細胞へのトランスフェクト時にＲＮＡが発現されるように、遺伝子領域またはコード領域に機能可能に連結されたプロモーターを含有する。

本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明からおよび特許請求の範囲から明らかであろう。

多重配列アライメントを示す図中、「＊」は同一性を表し、「：」は保存置換を表し、かつ「．」は半保存置換を表す。

図１Ａは、野生型マウス(左)およびNF1col2^-/-マウス(右)からの骨芽細胞におけるピロホスフェート(PPi)のレベルを示すグラフである。図１Ｂは、野生型マウス(「WT」とラベルする)およびNF1col2^-/-マウス(「KO」とラベルする)からの骨芽細胞における進行性の関節強直遺伝子(Ank) mRNA発現のレベルを示すグラフである。骨芽細胞は、ビヒクル、MEK1/MEK2キナーゼ阻害剤U0126 (1,4-ジアミノ-2,3-ジシアノ-1,4-ビス(2-アミノフェニルチオ)ブタジエン)または骨形成タンパク質2 (BMP2)で処置した。図２は、非限定的な、NF1col2^-/-マウスにおける欠陥性の骨基質無機化のための仮説に基づいたワーキングモデルを示す概略図である。図３Ａは、野生型マウス(「ＷＴ］とラベル)およびNF1col2^-/-マウス由来の骨芽細胞における組換えヒト骨形成タンパク質2 (rhBMP2)の効果を示す。細胞プレートは、アルカリホスファターゼ(ALP)単独またはアリザリンレッドSとの組合せ(ALP/Alizarin)での組織染色について示し、クリスタルバイオレットで細胞数を示す。図３Ｂは、野生型マウス(「ＷＴ］とラベル)およびNF1col2^-/-マウス由来の骨髄間質細胞におけるsALP融合タンパク質(sTNALP-FcD10, 配列番号1204)の作用を示す。次いで細胞を、増加する用量のsTNALP-FcD10で8日間処置した。細胞プレートは、石灰症（上）の存在を決定するためにアリザリンレッドSで組織染色して示し、アリザリンレッドSでの染色の相対強度を定量した（下）。図３Ｃは、野生型マウス(「ＷＴ］とラベル)およびNF1col2^-/-マウス由来の骨髄間質細胞(BMSC)におけるsALP融合ポリペプチド(sTNALP-FcD10, 配列番号1204)の作用を示す。BMSCを培地に播種し、ビタミンCおよびβ−グリセロホスフェートを用いて14日間にわたり分化を誘導した。次いで細胞を0.5μg/mLのsTNALP-FcD10で処置し、アリザリンレッドで染色して無機化のレベルを評価し、ピクロシリウスレッドで染色して細胞外マトリックスの存在を実証し、またはクリスタルバイオレットを用いて細胞を染色した。図３Ｄは、floxed NF1遺伝子マウス由来の骨髄間質細胞(BMSC)におけるsALP融合ポリペプチド(sTNALP-FcD10, 配列番号1204)の作用を示す。BMSCを培地に播種し、ビタミンCおよびβ−グリセロホスフェートを用いて14日間にわたり分化を誘導した。細胞を、ビヒクルまたは0.5μg/mLのsTNALP-FcD10を用いて、GFPをコードするアデノウイルス (「Ad-GFP」、対照として)またはCREレコンビナーゼをコードするアデノウイルス(「Ad-Cre」)で8日間処置した。次いで細胞をアリザリンレッドで染色して無機化を評価し（第１および第２列）、またはピクロシリウスレッドで染色して細胞外マトリックスの存在を実証した（第３および第４列）。次いで細胞をアリザリンレッドで染色して無機化のレベルを評価し（第１および第２列）、またはピクロシリウスレッドで染色して細胞外マトリックスの存在を実証した（第３及び第４列）。図３Ｅは、野生型マウス(「ＷＴ］とラベル)およびNF1col2^-/-マウスにおけるsALP融合ポリペプチド(sTNALP-FcD10, 配列番号1204)のin vivo作用を示す。NF1col2^-/-マウスは8.2 mg/kgのsTNALP-FcD10で第１日から第８日まで処置し、未処置またはWTマウスと比較した。マウスを第19日に犠牲にし、脊椎をマイクロCTイメージングを用いて分析して、骨容積対全容積(BV/TV)を測定した。マウスのsTNALP-FcD10での処置は、NF1col2^-/-マウスにおいて、ビヒクルと比較して、骨ミネラル密度欠損を増大させた(* p < 0.5)。図４ＡはNF1col2^-/-マウスにおけるNPR-B遺伝子の発現を示す。骨髄間質細胞を骨形成条件下で（アスコルベートアセテートを用いて）３週間培養し溶解させた。RT-PCRをNPR-Bおよびハウスキーピング遺伝子GAPDHプライマーを用いて行った。図４Ｂは、野生型マウス(「ＷＴ］とラベル)およびNF1col2^-/-マウス由来の軟骨細胞におけるNP融合ポリペプチド(NC2-KGANKK, 配列番号512)の作用を示す。ウエスタンブロット解析は、野生型マウス由来またはNF1col2^-/-マウス由来の軟骨細胞についてERKおよびリン酸化されたERK (p-ERK)のレベルを提供する。新生NF1col2^-/-マウスまたはWTマウスの肋骨から抽出された一次軟骨細胞を培養し、次いで増加する濃度のNC2-KGANKKで30分間処置した。次いで細胞を溶解させ、抗ERKまたは抗ホスホ-ERK特異的抗体を用いてウェスタンブロットを溶解物について行った。図４Ｃは、野生型マウス(「ＷＴ］とラベル)およびNF1col2^-/-マウスにおける身長（nasoanal長）に対するNP融合ポリペプチド(NC2B, 配列番号504)のin vivo作用を示す。NF1col2^-/-マウスを100もしくは300 mg/kgのNC2Bで第１日から第18日まで処置し、ビヒクル処置もしくはWTマウスと比較した。マウスの身長（鼻肛門長）を第19日に測定した。図４Ｄは、野生型マウス(「ＷＴ］とラベル)およびNF1col2^-/-マウスにおける脛骨長に対するNP融合ポリペプチド(NC2B, 配列番号504)のin vivo作用を示す。NF1col2^-/-マウスを100もしくは300 mg/kgのNC2Bで第１日から第18日まで処置し、ビヒクル処置もしくはWTマウスと比較した。マウスは第19日に脛骨長について測定した。図４Ｅは、野生型マウス(「WT］とラベル)およびNF1col2^-/-マウスにおける増殖プレート上でのNP融合ポリペプチド(NC2B, 配列番号504)のin vivo作用を示す。NF1col2^-/-マウスを300 mg/kgのNC2Bで第１日から第18日まで処置し、ビヒクル処置もしくはWTマウスと比較した。第19日には、脛骨長を用いて近接増殖プレートを組織学的に分析し、軟骨細胞ゾーンのサイズを測定した。図５Ａは本明細書に記載のヒト組織非特異的アルカリホスファターゼ(hsTNALP)の構造の概略図でありhsTNALPは、TNALP エクトドメイン、N末端シグナル配列およびGPIシグナル配列を有するポリペプチド(上段)；TNALPエクトドメイン、N末端シグナル配列、IgG1-Fc配列、および骨標的化D10部分を有するhsTNALP-FcD₁₀(中段); ならびにTNALP エクトドメイン、IgG1-Fc配列、および骨標的化D10部分を有すしシグナル配列を有しないhsTNALP-FcD₁₀(下段)を含む。図５ＢはhsTNALP-FcD₁₀ のアミノ酸配列(配列番号1201)を示しており、これにはN末端シグナル配列(最初の17アミノ酸残基、下線を付し斜体としている; 位置2、バリン、はその位置における野生型の残基、イソロイシンと異なる); およびN末端シグナル配列を欠く分泌されたhsTNALP-FcD₁₀ (配列番号1204)のアミノ酸配列が含まれる。ポリペプチドのhsTNALP部分のアミノ酸残基はhsTNALP(配列番号1205)のアミノ酸残基18-502に対応し、斜体で示される。配列番号1201におけるシグナル配列は斜体とし下線を付してある。ポリペプチドのFc部分(配列番号401)には下線を付した。hsTNALPおよびFc部分の間のジペプチドロイシン−リシン(LK)リンカーならびにhsTNALPおよび骨標的部分の間のジペプチドアスパラギン酸−イソロイシン(DI)リンカーを太字で示す。図５Ｃは、骨標的部分を欠いたsALP融合タンパク質であるhsTNALP-Fc (配列番号1220)およびN末端シグナル配列を欠く分泌されたhsTNALP-FcD₁₀ (配列番号1221)のアミノ酸配列を示す。hsTNALP(配列番号1205)のアミノ酸残基18-502に対応するポリペプチドのhsTNALP部分のアミノ酸残基を斜体で示す。配列番号1201におけるシグナル配列を斜体および下線で示す。ポリペプチドのFc部分(配列番号401)に下線を付す。hsTNALPおよびFc部分の間のジペプチドロイシン−リシン(LK)リンカーを太字で示す。図５Ｄは、図５Ｂに示すhsTNALP-Fcポリペプチドをコードする核酸配列(配列番号1217)を示す。図６は、ヒト可溶性組織非特異的アルカリホスファターゼ(hsTNALP)のアミノ酸配列を示し、これにはN末端シグナル配列(アミノ酸残基1-502) (配列番号1202)およびシグナル配列(アミノ酸残基18-502)を欠いた分泌されたhsTNALP(配列番号1205)の配列を有するhsTNALPの配列が挙げられる。シグナル配列に下線を付す。図７はヒトIgG-1 (配列番号401)からの例示的Fcのアミノ酸配列の配列表である。図８−１は哺乳動物組織非特異的アルカリホスファターゼ(TNALP)オルソログのCLUSTAL(商標)W (1.82)多重配列アライメントを示す。哺乳動物TNALPオルソログとしては、ウシTNALP (「P09487|PPBT_BOVIN」; 受託番号P09487; 配列番号1206); ネコTNALP (「Q29486|PPBT_FELCA」; 受託番号Q29486; 配列番号1207)、ヒトTNALP (「P05186|PPBT_HUMAN」; 受託番号P05186; 配列番号1208)、マウスTNALP (「P09242|PPBT_MOUSE」; 受託番号P09242; 配列番号1209)、ラットTNALP (「P08289|PPBT_RAT」; 受託番号P08289; 配列番号1210)、およびイヌTNALPの部分配列(「Q9N0V0|Q9N0V0_CANFA」; 受託番号Q9N0V0; 配列番号1211)が挙げられる。このアライメントからコンセンサス配列を導くが(「コンセンサス」; 配列番号1216)、ここでXは縮重した位置を示し任意のアミノ酸でありうる。図８−２は図８−１の続きである。図８−３は図８−２の続きである。図９−１は哺乳動物組織非特異的アルカリホスファターゼ(TNALP)オルソログおよびヒトアルカリホスファターゼ(ALP)アイソザイムのCLUSTAL(商標)(2.0.5)多重配列アライメントを示す。哺乳動物TNALPオルソログとしては、図８に示すものが挙げられ、これにはラットTNALP (「TNALPrn」、配列番号1210)、マウスTNALP (「TNALPmm」、配列番号1209)、ヒトTNALP (「TNALPhs」、配列番号1208)、イヌTNALPの部分配列(「TNALPcf」、配列番号1211)、ネコTNALP (「TNALPfc」、配列番号1207)、およびウシTNALP (「TNALPbt」、配列番号1206)が含まれる。ヒトALPアイソザイムには、ヒト胃腸ALP (「GALPh」; 受託番号P10696; 配列番号1213)、ヒト胎盤ALP (「PLALPh」; 受託番号05187; 配列番号1214)、およびヒト腸ALP (「IALPh」; 受託番号P09923; 配列番号1212)が含まれる。このアライメントからコンセンサス配列を導くが(「コンセンサス」; 配列番号1215)、ここでXは縮重した位置を示し任意のアミノ酸でありうる。図９−２は図９−１の続きである。図９−３は図９−２の続きである。図９−４は図９−３の続きである。図１０は、哺乳動物組織非特異的アルカリホスファターゼ(TNALP)オルソログおよび病原性突然変異を除くヒトアルカリホスファターゼ(ALP)アイソザイムについてのコンセンサス配列 (配列番号1218)であり、Xは任意のアミノ酸でありうるが、表１に提供する病原性突然変異の１以上に対応するアミノ酸ではない。図１１は病原性突然変異を除く哺乳動物組織非特異的アルカリホスファターゼ(TNALP) オルソログについてのコンセンサス配列 (配列番号1219)であり、Xは任意のアミノ酸でありうるが、表１に提供する病原性突然変異の１以上に対応するアミノ酸ではない。図１２は、ヒトＡＮＰ（配列番号１）、ヒトウロジラチン（配列番号２）、ヒトＢＮＰ（配列番号３）、ヒトＣＮＰ２２（配列番号４）、およびＤＮＰ（配列番号５）の多重配列アライメントである。各ナトリウム利尿ペプチドの１７アミノ酸リングドメインは、ボールド体で示され、四角で囲まれている。コンセンサス配列（配列番号６）は、下側に示されており、ここで、各Ｘは、任意のアミノ酸を表し、または場合により配列番号１〜５のうちの１つの対応する位置の任意のアミノ酸を表す。図１３は、ヒトＣＮＰ５３（配列番号１１）、ヒトＣＮＰ２２、およびヒトＣＮＰ（リングドメインのみ）（配列番号１２）のアライメントである。図１４は、種々のＣＮＰ２２同族体の多重配列アライメントである。各ＮＰの１７アミノ酸リングドメインは、ボールド体で示され、四角で囲まれている。コンセンサス配列（配列番号３０）は、下側に示されており、ここで、リングドメイン内の各Ｘは、任意のアミノ酸を表し、または場合により配列番号４および１３〜２９のうちの１つの対応する位置の任意のアミノ酸を表す。リングドメイン外の各Ｘは、任意のアミノ酸を表しもしくは不在であってもよく、または場合により配列番号４および１３〜２９のうちの１つの対応する位置の任意のアミノ酸を表す。図１５Ａ〜１５Ｇは、種々のＣＮＰ同族体の多重配列アライメントであり、いくつかの場合には、Ｎ末端のプレ配列およびプロ配列を含む。各ＮＰの１７アミノ酸リングドメインは、ボールド体で示され、四角で囲まれている。コンセンサス配列（配列番号９５）は、下側に示されており、ここで、各Ｘは、任意のアミノ酸を表し、または場合により配列番号３１〜９４のうちの１つの対応する位置の任意のアミノ酸を表す。図１５Ａの続きである。図１５Ｂの続きである。図１５Ｃの続きである。図１５Ｄの続きである。図１５Ｅの続きである。図１５Ｆの続きである。図１６は、オプションのＮ末端伸長部、オプションのショートセグメント、所要のリングドメイン、およびオプションのＣ末端伸長部を含む、本明細書で説明したナトリウム利尿ペプチドの構造の概略図である。図１７Ａ〜１７Ｅは、例示的なＦｃ−ＮＰ構築物またはＮＰ−Ｆｃ構築物の概略図である。図１７Ａは、Ｆｃ−ＮＰ二量体を示している。図１７Ｂは、ＮＰ−Ｆｃ二量体を示している。図１７Ｃは、Ｆｃ：Ｆｃ−ＮＰ単量体−二量体ハイブリッドを示している。図１７Ｄは、ＮＰ−Ｆｃ：Ｆｃ単量体−二量体ハイブリッドを示している。図１７Ｅは、ＮＰ−Ｆｃ：Ｆｃ−ＮＰハイブリッド二量体を示している。図１８Ａは、タンパク質領域のまとめを提供する表と一緒になった、未成熟ＮＣ２Ｓｔｒｅｐｔａｇ（「ＮＣ２ｓｔ」）融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号５０１）のリストである。翻訳時に切断されるＮ末端シグナル配列は、下線が付されている。種々のリンカー配列は、イタリック体で示されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。図１８Ｂは、シグナル配列無しのＮＣ２ｓｔ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号５０２）のリストである。図１８Ｃは、ＮＣ２ｓｔ融合タンパク質をコードする核酸配列（配列番号８０１）のリストである。図１９Ａは、シグナル配列有り（配列番号５０３）およびシグナル配列無し（配列番号５０４）の両方のＮＣ２Ｂアミノ酸配列、ならびにシグナル配列有り（配列番号６０７）およびシグナル配列無し（配列番号６０８）の両方のＤ_１０タグ付きＤ１０−ＮＣ２アミノ酸配列のリストである。図１９Ｂは、ＮＣ２Ｂをコードする核酸配列（配列番号８０２）のリストである。図２０Ａは、シグナル配列有り（それぞれ、配列番号５０５、５０７、および５０９）およびシグナル配列無し（それぞれ、配列番号５０６、５０８、および５１０）の両方の、ＮＣ２Ｂ−２２、ＮＣ２Ｂ−２８、およびＮＣ２Ｂ−３４のアミノ酸配列のリストである。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。図２０Ｂは、ＮＣ２Ｂ−２２をコードする核酸配列（配列番号８０３）のリストである。図２０Ｃは、ＮＣ２Ｂ−２８をコードする核酸配列（配列番号８０４）のリストである。図２０Ｄは、ＮＣ２Ｂ−３４をコードする核酸配列（配列番号８０５）のリストである。図２１は、シグナル配列有り（それぞれ、配列番号５１１および５１３）およびシグナル配列無し（それぞれ、配列番号５１２および５１４）の両方のＮＣ２−ＫＧＡＮＫＫおよびＮＣ２−ＫＧＡＮＱＫのアミノ酸配列のリストである。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。図２２は、シグナル配列有り（配列番号５１５）およびシグナル配列無し（配列番号５１６）の両方のＮＣ２−ＣＮＰ５３ｍｕｔ２のアミノ酸配列のリストである。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。図２３は、シグナル配列有り（それぞれ、配列番号５１７および５１９）およびシグナル配列無し（それぞれ、配列番号５１８および５２０）の両方の、Ｆｃ−ＣＮＰ５３−Ａ（Ｆｃ−ＣＮＰ５３ｗｔとしても参照される）およびＦｃ−ＣＮＰ５３−ＡＡＡ（Ｆｃ−ＣＮＰ５３ｍｕｔとしても参照される）のアミノ酸配列のリストである。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。図２４は、種々のＮＰおよび同族体（ＣＤＮＰを含む）の多重配列アライメントである。四角で囲まれた領域は、ＮＰＲＡ結合ペプチド中のＤＮＰテールの最も保存された領域である。多くのＣＤＮＰ変異体の配列は、図の下半分に示され、ＤＮＰＣ末端テールのコンセンサス配列（配列番号１１８）もまた、示されている。コンセンサス配列中の各Ｘは、任意のアミノ酸を表し、または場合により配列番号１００〜１１６のうちの１つの対応する位置の任意のアミノ酸を表す。図２５Ａは、ＣＮＰ−１６ＡＡリンカー−Ｆｃ−Ｈｉｓ１０（ＮＣ１）（配列番号５２１）、ＣＮＰ−６ＡＡリンカー−Ｆｃ−Ｈｉｓ１０（ＮＣ３）（配列番号５２２）、ＣＮＰ−６ＡＡリンカー−Ｆｃ（配列番号５２３）、ＣＤＮＰ−Ｆｃ（配列番号５２４）、ＣＤＮＰ−Ａ１７ｓａａ−Ｆｃ（配列番号５２５）、およびＣＤＮＰ−Ａ１７ｓｒａ−Ｆｃ（配列番号５２６）のアミノ酸配列のリストである。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。図２５Ｂは、ＮＣ１の核酸配列（配列番号８０６）のリストである。図２６は、コンセンサス配列（配列番号１２６）と一緒になった、ＣＮＰ２２の位置１７の突然変異をそれぞれ有する種々の点突然変異体（配列番号１１９〜１２５）のリストである。Ｘは、任意のアミノ酸を表し、または場合により配列番号１１９〜１２５のうちの１つの対応する位置の任意のアミノ酸を表す。図２７は、いくつかのＣＮＰ変異体（配列番号4および127-150）のアミノ酸配列のリストである。各変異体の１７アミノ酸リングドメインは、ボールド体で示されている。リンカー領域は、イタリック体で示されている。図２８Ａ〜２８Ｅは、追加のＣＮＰ変異体のアミノ酸配列のリストである(配列番号1001-1155)。図２８Ａの続きである。図２８Ｂの続きである。図２８Ｃの続きである。図２８Ｄの続きである。図２９は、ＣＮＰ２２（配列番号４）、ＣＮＰ−Ｌ１７（配列番号１２０）、ＣＮＰ−Ｆ１７（配列番号１１９）、ＣＮＰ−Ｔ１７（配列番号１２２）、Ｄ６−１４ＡＡリンカー−ＣＮＰ［Ｃ３］（配列番号１４７）、ＣＮＰ−１４ＡＡリンカー−Ｄ６［Ｃ４］（配列番号１４８）、ＣＮＰ−Ｎｔｅｒｍ２［Ｃ５］（配列番号１５０）、ＣＤＮＰ−Ｓ３Ａ４Ａ５Ｒ６［Ｃ１３］（配列番号１１５）、ＣＤＮＰ２９−Ｓ３Ａ４Ａ５Ｒ６［Ｃ１４］（配列番号１５１）、Ｃ１（Ｅ６）［ＢＣ１］（配列番号１２９）、Ｃ２（Ｅ６）［ＢＣ２］（配列番号１３０）、Ｃ３（Ｅ６）［ＢＣ３］（配列番号１３１）、Ｃ４（Ｅ６）［ＢＣ４］（配列番号１３２）、Ｃ５（Ｅ６）［ＢＣ５］（配列番号１３３）、Ｃ６（Ｅ６）［ＢＣ６］（配列番号１３４）、Ｃ７（Ｅ６）［ＢＣ７］（配列番号１３５）、Ｃ８（Ｅ６）［ＢＣ８］（配列番号１３６）、Ｃ９（Ｅ６）［ＢＣ９］（配列番号１３７）、Ｃ１０（Ｅ６）［ＢＣ１０］（配列番号１３８）、Ｃ１１（Ｅ６）［ＢＣ１１］（配列番号１３９）、ＰＧＣＮＰ３７（Ｅ６）（配列番号１２８）、ＫＡ１（配列番号１５２）、ＫＡ１（Ｅ６）（配列番号１５３）、ＫＢ１（配列番号１５４）、およびＫＢ１（Ｅ６）（配列番号１５５）のアミノ酸配列のリストである。各変異体の１７アミノ酸リングドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。カテプシン切断配列は、下線付きで示されている。図３０は、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７に点突然変異を有するＣＮＰ変異体のアミノ酸配列（配列番号１２６、１１９〜１２２、および１５６〜１７２）のリストである。配列番号１２６および１６２では、Ｘは、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、Ｙ、Ｃ、Ｐ、またはＤをはじめとする任意のアミノ酸でありうるが、これらに限定されるものではない。各変異体の１７アミノ酸リングドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。図３１Ａ〜３１Ｂは、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７に点突然変異を有する追加のＣＮＰ変異体のアミノ酸配列（配列番号１７３〜２２０）のリストである。Ｘは、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、Ｙ、Ｃ、Ｐ、またはＤをはじめとする任意のアミノ酸でありうるが、これらに限定されるものではない。各変異体の１７アミノ酸リングドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。カテプシン切断配列は、下線付きで示されている。図３１Ａの続きである。図３２は、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７に点突然変異を有するＣＮＰ変異体のアミノ酸配列（配列番号２２１〜２３３）のリストであるが、ここで、位置１７のメチオニンは、ロイシンで置換されている。各変異体の１７アミノ酸リングドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。カテプシン切断配列は、下線付きで示されている。図３３Ａ〜３３Ｅは、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７に点突然変異を有する構築物のアミノ酸配列（配列番号５２７〜５５２）のリストである。Ｘは、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、Ｙ、Ｃ、Ｐ、またはＤをはじめとする任意のアミノ酸でありうるが、これらに限定されるものではない。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。図３３Ａの続きである。図３３Ｂの続きである。図３３Ｃの続きである。図３３Ｄの続きである。図３４Ａ〜３４Ｊは、シグナル配列有りまたは無しのかつＮ末端にＤ_１０骨ターゲッティング部分有りまたは無しのいずれかのＮＣ２変異体のアミノ酸配列（配列番号５１１〜５１６および５５３〜６０６）のリストである。シグナル配列は、下線が付されている。Ｆｃドメインは、ボールド体で示されている。リンカー配列は、イタリック体で示されている。ＣＮＰドメインは、灰色強調表示で示されている。図３４Ａの続きである。図３４Ｂの続きである。図３４Ｃの続きである。図３４Ｄの続きである。図３４Ｅの続きである。図３４Ｆの続きである。図３４Ｇの続きである。図３４Ｈの続きである。図３４Ｉの続きである。

本発明は、可溶性アルカリホスファターゼ(sALP)ポリペプチド、例えば、免疫グロブリンのFcドメインに融合したもの、それをコードする核酸、並びに本明細書に記載されているいずれかの疾患又は状態(例えば、神経皮膚症候群(例えば、神経線維腫症、例えば、1型)、FGFR3の過剰活性化と関連した障害、骨又は軟骨障害(例えば、低ホスファターゼ症又は軟骨無形成症)、血管平滑筋障害)を治療するため、及び骨を伸長するためのそれらの使用を特徴とする。本発明はまた、ナトリウム利尿(NP)ポリペプチド、例えば、免疫グロブリンのFcドメインに融合したもの、それをコードする核酸、並びに本明細書に記載されているいずれかの疾患又は状態(例えば、神経皮膚症候群(例えば、神経線維腫症、例えば、1型)、FGFR3の過剰活性化と関連した障害、骨又は軟骨障害(例えば、低ホスファターゼ症又は軟骨無形成症)、血管平滑筋障害)を治療するため、及び骨を伸長するためのそれらの使用を特徴とする。本発明はまた、本明細書に記載されているように、このようなsALPポリペプチドとこのようなNPポリペプチドの組み合わせ、本明細書に記載されているいずれかの疾患又は状態(例えば、神経皮膚症候群、FGFR3の過剰活性化と関連した障害、骨又は軟骨障害(例えば、低ホスファターゼ症又は軟骨無形成症)、血管平滑筋障害)を治療するため、及び骨を伸長するためのそれらの組み合わせによる使用を特徴とする。本発明のさらなる詳細は、以下に提供される。

アルカリホスファターゼ
アルカリホスファターゼは、様々な状況においてリン酸塩を切断することができる特性(例えば、ピロリン酸塩の加水分解、PP_i)を共有する酵素群を包含する。4つの知られている哺乳動物のアルカリホスファターゼ(ALP)アイソザイムが存在する:組織非特異的アルカリホスファターゼ(TNALP、以下にさらに記載する)、胎盤アルカリホスファターゼ(PLALP)(例えば、受託番号P05187、NP_112603、及びNP_001623)、生殖細胞アルカリホスファターゼ(GALP)(例えば、受託番号P10696)、及び腸アルカリホスファターゼ(IALP)(例えば、受託番号P09923及びNP_001622)。これらのアイソザイムは、非常に類似した三次元構造を保有する。それらの触媒部位のそれぞれは、2つの亜鉛イオンと1つのマグネシウムイオンを含む、酵素活性に必要な金属イオンに結合する4つの金属結合ドメインを含有する。これらの酵素は、リン酸モノエステルの加水分解を触媒し、また高濃度のリン酸アクセプターの存在下でのリン酸転移反応を触媒する。PLALPは、ホスホエタノールアミン(PEA)、無機ピロリン酸塩(PP_i)、及びピリドキサール5'-リン酸(PLP)に対して生理学的に活性であることが示され、3つ全てはTNALP(Whyte, 1995)に対する、知られている天然基質である(Whyte, 1995)。これらのアイソザイム間のアラインメントを図9に示す。さらなるアルカリホスファターゼは、WO2008/138131及び米国特許公開第2006/0014687号に記載され、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。

組織非特異的ホスファターゼは、翻訳後修飾によって互いに異なる単一の遺伝子によりコードされるタンパク質のファミリーである。TNALPは、肝臓、腎臓、及び骨において主に存在するが、身体全体に発生する可能性がある。哺乳動物において知られているTNALPは、本明細書において提供される他の例に加えて、例えば、ヒトTNALP(受託番号NP_000469、AAI10910、AAH90861、AAH66116、AAH21289、及びAAI26166)、アカゲザルTNALP(受託番号XP_01109717)、ラットTNALP(受託番号NP_037191)、イヌTNALP(受託番号AAF64516)、ブタTNALP(受託番号AAN64273)、マウス(受託番号NP_031457)、ウシTNALP(受託番号NP_789828、NP_776412、AAM8209、及びAAC33858)、及びネコTNALP(受託番号NP_001036028)を含む。

可溶性アルカリホスファターゼ
本発明の可溶性アルカリホスファターゼ(sALP)には、例えば、本明細書に記載されているアルカリホスファターゼのいずれかの可溶性(例えば、細胞外又は非膜結合型)形態が挙げられる。本発明の可溶性アルカリホスファターゼは、例えば、ヒトTNALPの可溶性形態であり得る。ヒトTNALP(hTNALP)のドメインの略図を図5A(上段)に示す。TNALPは、そのC末端に結合した糖脂質を通じて固定された膜結合タンパク質である(Swiss-Prot、P05186)。この糖脂質アンカー(GPI)は、一時的な膜アンカーとして、及びGPIの付加のためのシグナルとして機能を果たす疎水性のC末端の除去後に、翻訳後に加えられる。このGPIアンカーは細胞膜内に埋め込まれ、タンパク質の残りの部分は細胞外にある。TNALPは、hTNALPを含み、終止コドンを有する疎水性C末端配列の最初のアミノ酸(アラニン)を置換するように遺伝子操作することができる。このように形成された、遺伝子操作されたhTNALPは、TNALPの天然のアンカー型形態の全てのアミノ酸残基を含有するが、GPI膜アンカーを欠損している。可溶性であるhTNALPは、本明細書において「hsTNALP」と称する。GPI膜アンカーの位置は、異なるアルカリホスファターゼにおいて変化し、例えば、該ポリペプチドのC末端上で最後の10個、12個、14個、16個、18個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、32個、34個、36個、38個、40個、45個、50個、又はそれを超えるアミノ酸残基を含んでもよいことを当業者なら理解するであろう。例えば、hTNALP(配列番号1208)のGPI膜アンカーは、アミノ酸残基503〜524である。このhsTNALPのアミノ酸配列(シグナル配列の2位に1つの変異を有する)は、Fcに融合され、図5Bに示される。このhsTNALP-Fc融合ポリペプチドをコードする核酸の配列を図5Dに示す(配列番号1217)。

C末端のGPIアンカーに加えて、TNALPはまた、N末端シグナルペプチド配列を有する。N末端シグナルペプチドは、合成された場合、初期にはタンパク質上に存在するが、ERに移行した後に切断される。このようにして、N末端シグナルペプチドは、TNALPの分泌型には存在しない。本発明のsALPsは、その分泌型形態(すなわち、N末端シグナルを欠損している)と非分泌型形態(すなわち、N末端シグナルを有する)の両方を含む。N末端シグナルペプチドの位置は、異なるアルカリホスファターゼにおいて異なっており、例えば、該ポリペプチドのN末端上で最初の5個、8個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、27個、30個、又はそれを超えるアミノ酸残基を含んでもよいことを当業者なら理解するであろう。例えば、配列番号1208のhTNALPのN末端シグナルペプチドは、図6に示すように、その最初の17個のアミノ酸残基である。従って、このhTNALPの分泌型可溶性形態は、図6に示すように、配列番号1208のアミノ酸残基18〜502(配置番号1205)である。この分泌型hsTNALPのアミノ酸配列は、Fcに融合され、図5Bに示される。本発明のsALPは、その分泌型形態と非分泌型形態の両方を含む。当業者は、例えば、Bendtsen et al. (J. Mol. Biol. 340(4):783〜795, 2004)に記載され、及びhttp://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/のWebサイトで利用可能である適当なコンピュータアルゴリズムによって、シグナル配列切断部位の位置を予測することができる。

本発明のsALPはまた、例えば、ヒトALPアイソザイム及び哺乳動物TNALPオルソログ(ヒト、マウス、ラット、ウシ、ネコ、及びイヌ)のALP細胞外ドメインに由来する共通配列(配列番号1215、図9に示される)、又は単なる哺乳動物TNALPオルソログ(ヒト、マウス、ラット、ウシ、ネコ、及びイヌ)のALP細胞外ドメインに由来する共通配列(配列番号1216、図8に示される)を満たすポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、sALPは、配列番号1216のアミノ酸残基18〜498、18〜499、18〜500、18〜501、18〜502、18〜503、18〜504、18〜505、18〜506、18〜507、18〜508、18〜509、18〜510、18〜511、又は18〜512を含む。いくつかの実施形態では、sALPは、配列番号1215のアミノ酸残基23〜498、23〜499、23〜500、23〜501、23〜502、23〜503、23〜504、23〜505、23〜506、23〜507、23〜508、23〜509、23〜510、23〜511、又は23〜512を含む。

本発明のsALPはまた、これらのTNALPオルソログ又はヒトALPアイソザイムの様々な組み合わせに由来する類似の共通配列を満たすものを含む。このような共通配列は、例えば、WO2008/138131に示され、参照により本明細書に組み込まれている。

さらに、元々のアミノ酸残基1〜501(分泌された場合は18〜501)(Oda et al., J. Biochem. 126: 694〜699, 1999)、アミノ酸残基1〜502(分泌された場合は18〜502)(WO2008/138131)、アミノ酸残基1〜504(分泌された場合は18〜504)(米国特許第6,905,689号、参照により本明細書に組み込まれている)、及びアミノ酸残基1〜505(分泌された場合は18〜505)(米国特許公開第2007/0081984号、参照により本明細書に組み込まれている)を保持している組換えhsTNALPは酵素的に活性であることが示されている。これは、特定のアミノ酸残基が、その酵素活性に影響を及ぼすことなく可溶性hsTNALPポリペプチドのC終端から切り取られ得ることを示している。これはまた、GPI膜アンカーの特定のアミノ酸残基が、存在する場合に、ポリペプチドの可溶性に有意な影響を及ぼさないことを示している。従って、本発明のsALPはまた、最大5個(例えば、1個、2個、3個、4個、又は5個)のアミノ酸残基がそのC終端で切り取られるもの、例えば、GPI膜アンカーの最大5個(例えば、1個、2個、3個、4個、又は5個)のアミノ酸残基が存在しているものを含む。例えば、本発明の非分泌型sALPは、配列番号1208のアミノ酸残基1〜497、1〜498、1〜499、1〜500、1〜501、1〜502、1〜503、1〜504、1〜505、1〜506、又は1〜507を含有するもの、及び2位のアミノ酸がバリンであるその変形を含み、本発明の分泌型sALPは、配列番号1208のアミノ酸残基18〜497、18〜498、18〜499、18〜500、18〜501、18〜502、18〜503、18〜504、18〜505、18〜506、又は18〜507を含有するものを含む。

酵素のアミノ酸配列における多数の突然変異が酵素の触媒機能を有意に破壊しないことを当業者なら理解するであろう。いくつかの場合において、特定の突然変異は、本明細書に記載されているいずれかの障害又は状態(例えば、神経皮膚症候群又は骨若しくは軟骨障害)の治療との関連で、酵素の触媒機能の恩恵を受けることさえある。従って、本発明のsALPは、上述したアルカリホスファターゼの野生型配列だけでなく、これらのアルカリホスファターゼと少なくとも50%(例えば、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又はそれを超える)の配列同一性を有するポリペプチドを含む。しかしながら、TNALPにおける特定の突然変異はHPPを引き起こすことが知られている。このような病因性突然変異は、好ましくは、本発明のsALPにおいて存在しない。従って、本発明のsALPは、病因性突然変異を欠損している複数の哺乳動物TNALPオルソログ及びヒトALPアイソザイムの共通配列(配列番号1218、図10)、又は病因性突然変異を欠損している複数の複数の哺乳動物TNALPオルソログの共通配列(配列番号1219、図11)を含むアミノ酸配列を有するものを含む。本発明の例示的なsALPは、配列番号1218のアミノ酸残基1〜497、1〜498、1〜499、1〜500、1〜501、1〜502、1〜503、1〜504、1〜505、1〜506、1〜507、1〜508、1〜509、1〜510、1〜511、1〜512、23〜497、23〜498、23〜499、23〜500、23〜501、23〜502、23〜503、23〜504、23〜505、23〜506、23〜507、23〜508、23〜509、23〜510、23〜511、又は23〜512を含有するものを含み、本発明の分泌型sALPは、配列番号1219のアミノ酸残基18〜497、18〜498、18〜499、18〜500、18〜501、18〜502、18〜503、18〜504、18〜505、18〜506、18〜507、18〜508、18〜509、18〜510、18〜511、又は18〜512を含有するものを含む。これらの共通配列(配列番号1218及び1219)において、Xは任意のアミノ酸であるが、ヒトTNALPのその位置での病因性突然変異に対応するアミノ酸ではない。このような病因性突然変異の例は以下に列挙され、表1に提供される。

いくつかの実施形態において、本発明のsALPポリペプチドは、表1に示される突然変異のいずれも含まない。特に、本発明のsALPポリペプチドは、配列番号1218の共通配列(図10)の番号付けを用いると、22位のアミノ酸はフェニルアラニン残基でない、33位(シグナルペプチドを含まない配列の11位)のアミノ酸はシステイン残基でない、38位(シグナルペプチドを含まない配列の16位)のアミノ酸はバリン残基でない、42位(シグナルペプチドを含まない配列の20位)のアミノ酸はプロリン残基でない、45位(シグナルペプチドを含まない配列の23位)のアミノ酸はバリン残基でない、56位(シグナルペプチドを含まない配列の34位)のアミノ酸残基はセリン及びバリン残基でない、67位(シグナルペプチドを含まない配列の45位)のアミノ酸残基はロイシン、イソロイシン及びバリン残基でない、68位(シグナルペプチドを含まない配列の46位)のアミノ酸残基はバリン残基でない、73位(シグナルペプチドを含まない配列の51位)のアミノ酸残基はメチオニン残基でない、76位(シグナルペプチドを含まない配列の54位)のアミノ酸残基はシステイン、セリン、プロリン及びヒスチジン残基でない、77位(シグナルペプチドを含まない配列の55位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、80位(シグナルペプチドを含まない配列の58位)のアミノ酸残基はセリン残基でない、81位(シグナルペプチドを含まない配列の59位)のアミノ酸残基はアスパラギン残基でない、105位(シグナルペプチドを含まない配列の83位)のアミノ酸残基はメチオニン残基でない、113位(シグナルペプチドを含まない配列の89位)のアミノ酸残基はロイシン残基でない、116位(シグナルペプチドを含まない配列の94位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、117位(シグナルペプチドを含まない配列の95位)のアミノ酸残基はセリン残基でない、119位(シグナルペプチドを含まない配列の97位)のアミノ酸残基はグリシン残基でない、121位(シグナルペプチドを含まない配列の99位)のアミノ酸残基はセリン及びトレオニン残基でない、125位(シグナルペプチドを含まない配列の103位)のアミノ酸残基はアルギニン残基でない、128位(シグナルペプチドを含まない配列の106位)のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基でない、133位(シグナルペプチドを含まない配列の111位)のアミノ酸残基はメチオニン残基でない、134位(シグナルペプチドを含まない配列の112位)のアミノ酸残基はアルギニン残基でない、137位(シグナルペプチドを含まない配列の115位)のアミノ酸残基はトレオニン及びバリン残基でない、139位(シグナルペプチドを含まない配列の117位)のアミノ酸残基はヒスチジン又はアスパラギン残基でない、141位(シグナルペプチドを含まない配列の119位)のアミノ酸残基はヒスチジン残基でない、153位(シグナルペプチドを含まない配列の131位)のアミノ酸残基はアラニン及びイソロイシン残基でない、167位(シグナルペプチドを含まない配列の145位)のアミノ酸残基はセリン及びバリン残基でない、172位(シグナルペプチドを含まない配列の150位)のアミノ酸残基はメチオニン残基でない、175位(シグナルペプチドを含まない配列の153位)のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基でない、176位(シグナルペプチドを含まない配列の154位)のアミノ酸残基はチロシン及びアルギニン残基でない、181位(シグナルペプチドを含まない配列の159位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、182位(シグナルペプチドを含まない配列の160位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、184位(シグナルペプチドを含まない配列の162位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、186位(シグナルペプチドを含まない配列の164位)のアミノ酸残基はロイシン残基でない、189位(シグナルペプチドを含まない配列の167位)のアミノ酸残基はトリプトファン残基でない、194位(シグナルペプチドを含まない配列の172位)のアミノ酸残基はグルタミン酸残基でない、196位(シグナルペプチドを含まない配列の174位)のアミノ酸残基はリジン及びグリシン残基でない、197位(シグナルペプチドを含まない配列の175位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、198位(シグナルペプチドを含まない配列の176位)のアミノ酸残基はアラニン残基でない、206位(シグナルペプチドを含まない配列の184位)のアミノ酸残基はチロシン残基でない、208位(シグナルペプチドを含まない配列の186位)のアミノ酸残基はグルタミン酸残基でない、207位(シグナルペプチドを含まない配列の190位)のアミノ酸残基はプロリン残基でない、216位(シグナルペプチドを含まない配列の194位)のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基でない、217位(シグナルペプチドを含まない配列の195位)のアミノ酸残基はフェニルアラニン残基でない、223位(シグナルペプチドを含まない配列の201位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、225位(シグナルペプチドを含まない配列の203位)のアミノ酸残基はバリン及びアラニン残基でない、226位(シグナルペプチドを含まない配列の204位)のアミノ酸残基はバリン残基でない、228位(シグナルペプチドを含まない配列の206位)のアミノ酸残基はトリプトファン及びグルタミン残基でない、229位(シグナルペプチドを含まない配列の207位)のアミノ酸残基はグルタミン残基でない、231位(シグナルペプチドを含まない配列の209位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、240位(シグナルペプチドを含まない配列の218位)のアミノ酸残基はグリシン残基でない、251位(シグナルペプチドを含まない配列の229位)のアミノ酸残基はセリン残基でない、254位(シグナルペプチドを含まない配列の232位)のアミノ酸残基はバリン残基でない、269位(シグナルペプチドを含まない配列の247位)のアミノ酸残基はアルギニン残基でない、277位(シグナルペプチドを含まない配列の255位)のアミノ酸残基はシステイン、ロイシン及びヒスチジン残基でない、280位(シグナルペプチドを含まない配列の258位)のアミノ酸残基はプロリン残基でない、295位(シグナルペプチドを含まない配列の273位)のアミノ酸残基はフェニルアラニン残基でない、297位(シグナルペプチドを含まない配列の275位)のアミノ酸残基はリジン残基でない、298位(シグナルペプチドを含まない配列の276位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、300位(シグナルペプチドを含まない配列の278位)のアミノ酸残基はチロシン及びアラニン残基でない、301位(シグナルペプチドを含まない配列の279位)のアミノ酸残基はバリン、トレオニン及びイソロイシン残基でない、303位(シグナルペプチドを含まない配列の281位)のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基でない、304位(シグナルペプチドを含まない配列の282位)のアミノ酸残基はリジン残基でない、305位(シグナルペプチドを含まない配列の283位)のアミノ酸残基はプロリン残基でない、312位(シグナルペプチドを含まない配列の290位)のアミノ酸残基はバリン残基でない、313位(シグナルペプチドを含まない配列の291位)のアミノ酸残基はセリン及びロイシン残基でない、317位(シグナルペプチドを含まない配列の295位)のアミノ酸残基はリジン残基でない、332位(シグナルペプチドを含まない配列の310位)のアミノ酸残基はアルギニン残基でない、333位(シグナルペプチドを含まない配列の311位)のアミノ酸残基はシステイン、グリシン及びロイシン残基でない、334位(シグナルペプチドを含まない配列の312位)のアミノ酸残基はロイシン残基でない、340位(シグナルペプチドを含まない配列の318位)のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基でない、345位(シグナルペプチドを含まない配列の323位)のアミノ酸残基はアルギニン及びグルタミン酸残基でない、354位(シグナルペプチドを含まない配列の332位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、360位(シグナルペプチドを含まない配列の338位)のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基でない、361位(シグナルペプチドを含まない配列の339位)のアミノ酸残基はトレオニン及びイソロイシン残基でない、377位(シグナルペプチドを含まない配列の355位)のアミノ酸残基はロイシン残基でない、380位(シグナルペプチドを含まない配列の358位)のアミノ酸残基はメチオニン残基でない、383位(シグナルペプチドを含まない配列の361位)のアミノ酸残基はバリン残基でない、384位(シグナルペプチドを含まない配列の362位)のアミノ酸残基はバリン残基でない、387位(シグナルペプチドを含まない配列の365位)のアミノ酸残基はアルギニン残基でない、388位(シグナルペプチドを含まない配列の366位)のアミノ酸残基はロイシン残基でない、395位(シグナルペプチドを含まない配列の373位)のアミノ酸残基はロイシン残基でない、397位(シグナルペプチドを含まない配列の375位)のアミノ酸残基はシステイン及びヒスチジン残基でない、398位(シグナルペプチドを含まない配列の376位)のアミノ酸残基はアラニン残基でない、401位(シグナルペプチドを含まない配列の379位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、405位(シグナルペプチドを含まない配列の383位)のアミノ酸残基はセリン及びバリン残基でない、406位(シグナルペプチドを含まない配列の384位)のアミノ酸残基はロイシン残基でない、412位(シグナルペプチドを含まない配列の390位)のアミノ酸残基はグリシン残基でない、416位(シグナルペプチドを含まない配列の394位)のアミノ酸残基はロイシン残基でない、417位(シグナルペプチドを含まない配列の395位)のアミノ酸残基はアラニン残基でない、420位(シグナルペプチドを含まない配列の398位)のアミノ酸残基はメチオニン残基でない、423位(シグナルペプチドを含まない配列の401位)のアミノ酸残基はセリン残基でない、426位(シグナルペプチドを含まない配列の404位)のアミノ酸残基はセリン残基でない、429位(シグナルペプチドを含まない配列の407位)のアミノ酸残基はアラニン残基でない、430位(シグナルペプチドを含まない配列の408位)のアミノ酸残基はメチオニン残基でない、432位(シグナルペプチドを含まない配列の410位)のアミノ酸残基はシステイン及びアスパラギン酸残基でない、434位(シグナルペプチドを含まない配列の412位)のアミノ酸残基はプロリン残基でない、435位(シグナルペプチドを含まない配列の413位)のアミノ酸残基はリジン残基でない、442位(シグナルペプチドを含まない配列の420位)のアミノ酸残基はヒスチジン残基でない、451位(シグナルペプチドを含まない配列の429位)のアミノ酸残基はプロリン残基でない、456位(シグナルペプチドを含まない配列の434位)のアミノ酸残基はヒスチジン及びシステイン残基でない、458位(シグナルペプチドを含まない配列の436位)のアミノ酸残基はリジン残基でない、460位(シグナルペプチドを含まない配列の438位)のアミノ酸残基はアルギニン残基でない、461位(シグナルペプチドを含まない配列の439位)のアミノ酸残基はセリン及びアスパラギン酸残基でない、462位(シグナルペプチドを含まない配列の440位)のアミノ酸残基はトリプトファン及びアルギニン残基でない、465位(シグナルペプチドを含まない配列の443位)のアミノ酸残基はメチオニン及びロイシン残基でない、472位(シグナルペプチドを含まない配列の450位)のアミノ酸残基はロイシン残基でない、473位(シグナルペプチドを含まない配列の451位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、474位(シグナルペプチドを含まない配列の452位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、479位(シグナルペプチドを含まない配列の457位)のアミノ酸残基はセリン残基でない、482位(シグナルペプチドを含まない配列の460位)のアミノ酸残基はリジン及びグリシン残基でない、484位(シグナルペプチドを含まない配列の462位)のアミノ酸残基はロイシン残基でない、495位(シグナルペプチドを含まない配列の473位)のアミノ酸残基はセリン残基でない、496位(シグナルペプチドを含まない配列の474位)のアミノ酸残基はフェニルアラニン残基でない、及び497位(シグナルペプチドを含まない配列の475位)のアミノ酸残基はアルギニン残基でない。

さらにまた具体的には、sTNALPが本発明の骨標的化sALPを使用する場合、ヒトTNALP配列の番号付けを用いると、17位のアミノ酸はフェニルアラニン残基でない、28位(シグナルペプチドを含まない配列の11位)のアミノ酸はシステイン残基でない、33位(シグナルペプチドを含まない配列の16位)のアミノ酸はバリン残基でない、37位(シグナルペプチドを含まない配列の20位)のアミノ酸残基はプロリン残基でない、40位(シグナルペプチドを含まない配列の23位)のアミノ酸はバリン残基でない、51位(シグナルペプチドを含まない配列の34位)のアミノ酸残基はセリン及びバリン残基でない、62位(シグナルペプチドを含まない配列の45位)のアミノ酸残基はロイシン、イソロイシン、及びバリン残基でない、63位(シグナルペプチドを含まない配列の46位)のアミノ酸残基はバリン残基でない、68位(シグナルペプチドを含まない配列の51位)のアミノ酸残基はメチオニン残基でない、71位(シグナルペプチドを含まない配列の54位)のアミノ酸残基はシステイン、セリン、プロリン、及びヒスチジン残基でない、72位(シグナルペプチドを含まない配列の55位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、75位(シグナルペプチドを含まない配列の58位)のアミノ酸残基はセリン残基でない、76位(シグナルペプチドを含まない配列の59位)のアミノ酸残基はアスパラギン残基でない、100位(シグナルペプチドを含まない配列の83位)のアミノ酸残基はメチオニン残基でない、108位(シグナルペプチドを含まない配列の89位)のアミノ酸残基はロイシン残基でない、111位(シグナルペプチドを含まない配列の94位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、112位(シグナルペプチドを含まない配列の95位)のアミノ酸残基はセリン残基でない、114位(シグナルペプチドを含まない配列の97位)のアミノ酸残基はグリシン残基でない、116位(シグナルペプチドを含まない配列の99位)のアミノ酸残基はセリン及びトレオニン残基でない、120位(シグナルペプチドを含まない配列の103位)のアミノ酸残基はアルギニン残基でない、123位(シグナルペプチドを含まない配列の106位)のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基でない、128位(シグナルペプチドを含まない配列の111位)のアミノ酸残基はメチオニン残基でない、129位(シグナルペプチドを含まない配列の112位)のアミノ酸残基はアルギニン残基でない、132位(シグナルペプチドを含まない配列の115位)のアミノ酸残基はトレオニン及びバリン残基でない、134位(シグナルペプチドを含まない配列の117位)のアミノ酸残基はヒスチジン及びアスパラギン残基でない、136位(シグナルペプチドを含まない配列の119位)のアミノ酸残基はヒスチジン残基でない、148位(シグナルペプチドを含まない配列の131位)のアミノ酸残基はアラニン及びイソロイシン残基でない、162位(シグナルペプチドを含まない配列の145位)のアミノ酸残基はセリン及びバリン残基でない、167位(シグナルペプチドを含まない配列の150位)のアミノ酸残基はメチオニン残基でない、170位(シグナルペプチドを含まない配列の153位)のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基でない、171位(シグナルペプチドを含まない配列の154位)のアミノ酸残基はチロシン及びアルギニン残基でない、176位(シグナルペプチドを含まない配列の159位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、177位(シグナルペプチドを含まない配列の160位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、179位(シグナルペプチドを含まない配列の162位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、181位(シグナルペプチドを含まない配列の164位)のアミノ酸残基はロイシン残基でない、184位(シグナルペプチドを含まない配列の167位)のアミノ酸残基はトリプトファン残基でない、189位(シグナルペプチドを含まない配列の172位)のアミノ酸残基はグルタミン酸残基でない、191位(シグナルペプチドを含まない配列の174位)のアミノ酸残基はリジン及びグリシン残基でない、192位(シグナルペプチドを含まない配列の175位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、193位(シグナルペプチドを含まない配列の176位)のアミノ酸残基はアラニン残基でない、201位(シグナルペプチドを含まない配列の184位)のアミノ酸残基はチロシン残基でない、203位(シグナルペプチドを含まない配列の186位)のアミノ酸残基はグルタミン酸残基でない、207位(シグナルペプチドを含まない配列の190位)のアミノ酸残基はプロリン残基でない、211位(シグナルペプチドを含まない配列の194位)のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基でない、212位(シグナルペプチドを含まない配列の195位)のアミノ酸残基はフェニルアラニン残基でない、218位(シグナルペプチドを含まない配列の201位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、220位(シグナルペプチドを含まない配列の203位)のアミノ酸残基はバリン及びアラニン残基でない、221位(シグナルペプチドを含まない配列の204位)のアミノ酸残基はバリン残基でない、223位(シグナルペプチドを含まない配列の206位)のアミノ酸残基はトリプトファン及びグルタミン残基でない、224位(シグナルペプチドを含まない配列の207位)のアミノ酸残基はグルタミン酸残基でない、226位(シグナルペプチドを含まない配列の209位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、235位(シグナルペプチドを含まない配列の218位)のアミノ酸残基はグリシン残基でない、246位(シグナルペプチドを含まない配列の229位)のアミノ酸残基はセリン残基でない、249位(シグナルペプチドを含まない配列の232位)のアミノ酸残基はバリン残基でない、264位(シグナルペプチドを含まない配列の247位)のアミノ酸残基はアルギニン残基でない、272位(シグナルペプチドを含まない配列の255位)のアミノ酸残基はシステイン、ロイシン、及びヒスチジン残基でない、275位(シグナルペプチドを含まない配列の258位)のアミノ酸残基はプロリン残基でない、289位(シグナルペプチドを含まない配列の272位)のアミノ酸残基はフェニルアラニン残基でない、291位(シグナルペプチドを含まない配列の274位)のアミノ酸残基はリジン残基でない、292位(シグナルペプチドを含まない配列の275位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、294位(シグナルペプチドを含まない配列の277位)のアミノ酸残基はチロシン及びアラニン残基でない、295位(シグナルペプチドを含まない配列の278位)のアミノ酸残基はバリン、トレオニン、及びイソロイシン残基でない、297位(シグナルペプチドを含まない配列の280位)のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基でない、298位(シグナルペプチドを含まない配列の281位)のアミノ酸残基はリジン酸残基でない、299位(シグナルペプチドを含まない配列の282位)のアミノ酸残基はプロリン残基でない、306位(シグナルペプチドを含まない配列の289位)のアミノ酸残基はバリン残基でない、307位(シグナルペプチドを含まない配列の290位)のアミノ酸残基はセリン及びロイシン残基でない、311位(シグナルペプチドを含まない配列の294位)のアミノ酸残基はリジン残基でない、326位(シグナルペプチドを含まない配列の309位)のアミノ酸残基はアルギニン残基でない、327位(シグナルペプチドを含まない配列の310位)のアミノ酸残基はシステイン、グリシン、及びロイシン残基でない、328位(シグナルペプチドを含まない配列の311位)のアミノ酸残基はロイシン残基でない、334位(シグナルペプチドを含まない配列の317位)のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基でない、339位(シグナルペプチドを含まない配列の332位)のアミノ酸残基はアルギニン及びグルタミン酸残基でない、348位(シグナルペプチドを含まない配列の331位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、354位(シグナルペプチドを含まない配列の337位)
のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基でない、335位(シグナルペプチドを含まない配列の338位)のアミノ酸残基はトレオニン及びイソロイシン残基でない、371位(シグナルペプチドを含まない配列の354位)のアミノ酸残基はロイシン残基でない、374位(シグナルペプチドを含まない配列の357位)のアミノ酸残基はメチオニン残基でない、377位(シグナルペプチドを含まない配列の360位)のアミノ酸残基はバリン残基でない、378位(シグナルペプチドを含まない配列の361位)のアミノ酸残基はバリン基でない、381位(シグナルペプチドを含まない配列の364位)のアミノ酸残基はアルギニン残基でない、382位(シグナルペプチドを含まない配列の365位)のアミノ酸残基はロイシン残基でない、389位(シグナルペプチドを含まない配列の372位)のアミノ酸残基はロイシン残基でない、391位(シグナルペプチドを含まない配列の374位)のアミノ酸残基はシステイン及びヒスチジン残基でない、392位(シグナルペプチドを含まない配列の375位)のアミノ酸残基はアラニン残基でない、395位(シグナルペプチドを含まない配列の378位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、399位(シグナルペプチドを含まない配列の382位)のアミノ酸残基はセリン及びバリン残基でない、400位(シグナルペプチドを含まない配列の383位)のアミノ酸残基はロイシン残基でない、406位(シグナルペプチドを含まない配列の389位)のアミノ酸残基はグリシン残基でない、410位(シグナルペプチドを含まない配列の393位)のアミノ酸残基はロイシン残基でない、411位(シグナルペプチドを含まない配列の394位)のアミノ酸残基はアラニン残基でない、414位(シグナルペプチドを含まない配列の397位)のアミノ酸残基はメチオニン残基でない、417位(シグナルペプチドを含まない配列の400位)のアミノ酸残基はセリン残基でない、420位(シグナルペプチドを含まない配列の403位)のアミノ酸残基はセリン残基でない、423位(シグナルペプチドを含まない配列の406位)のアミノ酸残基はアラニン残基でない、424位(シグナルペプチドを含まない配列の407位)のアミノ酸残基はメチオニン残基でない、426位(シグナルペプチドを含まない配列の409位)のアミノ酸残基はシステイン及びアスパラギン酸残基でない、428位(シグナルペプチドを含まない配列の411位)のアミノ酸残基はプロリン残基でない、429位(シグナルペプチドを含まない配列の412位)のアミノ酸残基はリジン残基でない、436位(シグナルペプチドを含まない配列の419位)のアミノ酸残基はヒスチジン残基でない、445位(シグナルペプチドを含まない配列の428位)のアミノ酸残基はプロリン残基でない、450位(シグナルペプチドを含まない配列の433位)のアミノ酸残基はヒスチジン及びシステイン残基でない、452位(シグナルペプチドを含まない配列の435位)のアミノ酸残基はリジン残基でない、454位(シグナルペプチドを含まない配列の437位)のアミノ酸残基はアルギニン残基でない、455位(シグナルペプチドを含まない配列の438位)のアミノ酸残基はセリン及びアスパラギン酸残基でない、456位(シグナルペプチドを含まない配列の439位)のアミノ酸残基はトリプトファン及びアルギニン残基でない、459位(シグナルペプチドを含まない配列の442位)のアミノ酸残基はメチオニン及びロイシン残基でない、466位(シグナルペプチドを含まない配列の449位)のアミノ酸残基はロイシン残基でない、467位(シグナルペプチドを含まない配列の450位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、468位(シグナルペプチドを含まない配列の451位)のアミノ酸残基はトレオニン残基でない、473位(シグナルペプチドを含まない配列の456位)のアミノ酸残基はセリン残基でない、476位(シグナルペプチドを含まない配列の459位)のアミノ酸残基はリジン及びグリシン残基でない、478位(シグナルペプチドを含まない配列の461位)のアミノ酸残基はロイシン残基でない、489位(シグナルペプチドを含まない配列の472位)のアミノ酸残基はセリン残基でない、490位(シグナルペプチドを含まない配列の473位)のアミノ酸残基はフェニルアラニン残基でない、及び491位(シグナルペプチドを含まない配列の474位)のアミノ酸残基はアルギニン残基でない。他の特定の実施形態において、1つ以上のXは、アラインメントの配列においてその位置で見出されるアミノ酸残基のいずれか、又はこれらのアミノ酸残基のいずれかの保存された若しくは半保存された置換を構成する残基として定義される。他の特定の実施形態において、Xは、アラインメントの配列におけるその位置で見出されるアミノ酸残基のいずれかとして定義される。例えば、51位(シグナルペプチドを含まない配列の34位)のアミノ酸残基はアラニン又はバリン残基であり、177位(シグナルペプチドを含まない配列の160位)のアミノ酸残基はアラニン又はセリン残基であり、212位(シグナルペプチドを含まない配列の195位)のアミノ酸残基はイソロイシン又はバリン残基であり、291位(シグナルペプチドを含まない配列の274位)のアミノ酸残基はグルタミン酸又はアスパラギン酸残基であり、及び374位(シグナルペプチドを含まない配列の357位)のアミノ酸残基はバリン又はイソロイシン残基である。

sALPは、場合により、いずれかの適当な1つ以上のアミノ酸残基でグリコシル化されてもよい。

さらに、sALPは、本明細書に記載されているsALPのいずれかと少なくとも50%(例えば、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又はそれを超える)配列同一性を有してもよい。

sALPは、本明細書に記載されているsALPのいずれかに対して、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、若しくはそれを超える数の付加、欠失、又は置換を有してもよい。

ＮＰ
ナトリウム利尿ペプチドレセプターＢ（「ＮＰＲ−Ｂ」）たとえばヒトＮＰＲ−Ｂのアゴニストである任意のナトリウム利尿ペプチドまたはその変異体を、本明細書で説明した方法および組成物のいずれかで使用することが可能である。

本明細書に記載するナトリウム利尿ペプチドは、ＮＰＲ−Ｂをアゴナイズ可能なペプチドである。ナトリウム利尿ペプチドとしては心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、脳ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、およびC型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)が挙げられる。こうしたペプチドは、生理学的機能をモジュレートするよう細胞内にシグナル伝達する３種のレセプターに結合する。ANPおよびBNPはナトリウム利尿ペプチド受容体A (NPR-A) (グアニリルサイクラーゼA (GC-A)としても知られている)に優先的に結合し、CNPはナトリウム利尿ペプチド受容体B (NPR-B)(グアニリルサイクラーゼB (GC-B)としても知られている)に優先的に結合する。３種のペプチドはいずれもナトリウム利尿ペプチド受容体C (NPR-C)に対しては類似の親和性を有し、NPR-Cはシグナル伝達およびペプチドクリアランス機能を有する。ナトリウム利尿ペプチドのクリアランスはまた、膜結合性中性エンドペプチダーゼ(NEP)の作用によりもたらされる。NPR-AまたはNPR-Bへのペプチド結合は、これらの受容体の細胞倍グアニリルサイクラーゼドメインを活性化し、それが二次メッセンジャーcGMPを生じる。cGMPは細胞内で複数のシグナル伝達経路を活性化または阻害する。

主にＮＰＲ−Ａをアゴナイズするナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰを含む）ならびに主にＮＰＲ−ＢをアゴナイズするＡＮＰおよびＢＮＰは、複数の生物学的過程で重要な役割を有する。種々のＮＰファミリーメンバーおよびコンセンサス配列の多重配列アライメントを、図１２〜１４および１５Ａ〜１５Ｇに示す。

ＮＰＲ−Ｂをアゴナイズするうえでの本明細書で説明したＣＮＰ２２およびＣＮＰ５３ならびにそれらの変異体の主要な下流効果は、軟骨内骨化である。したがって、本明細書で説明したＮＰは、たとえば、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる広範にわたる一連の障害および血管平滑筋障害を治療するのに有用である。

ＮＰは、図１６に示される模式的構造を含む。ここで、リングドメインは、必要であり、かつＮ末端伸長部、ショートセグメント、およびＣ末端伸長部のそれぞれは、オプションである。リングドメインは、１７アミノ酸残基長であり、ジスルフィド結合を形成するシステイン残基をリングドメインの各末端（位置１および１７）に有する。いくつかの実施形態では、リングドメインは、図１２〜１４または１５Ａ〜１５Ｇに示されるコンセンサス配列（それぞれ、配列番号６、配列番号３０のアミノ酸残基１１〜２７、または配列番号９５）の１つに該当するアミノ酸配列を有する。図１２〜１４および１５Ａ〜１５Ｇに示されるリングドメインのいずれかを、本明細書で説明したＮＰで使用することが可能である。

ショートセグメントは、リングドメインのＮ末端のすぐ隣にある０〜１０アミノ酸残基長（たとえば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸残基長）のセグメントである。例示的ショートセグメントは、図１２または図１４の四角で囲まれた領域のＮ末端のすぐ隣に示されており、たとえば、配列番号４の残基１〜５、または図１４および１５Ａ〜１５Ｇに示される種のいずれかの保存リングドメインのＮ末端のすぐ隣にある１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０アミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、ショートセグメントは、図１２〜１４または１５Ａ〜１５Ｇに示される種のいずれかの保存リングドメインのＮ末端のすぐ隣にある５アミノ酸部分からなる。いくつかの実施形態では、ショートセグメントは、ＮＰＲ−Ａに対してよりもＮＰＲ−Ｂに対して増大された選択性を付与する。

Ｎ末端伸長部は、ショートセグメント（ショートセグメントが存在する場合）またはリングドメイン（ショートセグメントが存在しない場合）のＮ末端のすぐ隣にある領域であり、かつ任意の長さ、たとえば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、またはそれ以上のアミノ酸残基でありうる。この領域は、ＣＮＰ２２には不在であるが、ＣＮＰ５３には存在する（配列番号１１の残基１〜３１）の中にある。例示的Ｎ末端伸長部は、図１５Ａ〜１５Ｇに示される種のいずれかの、たとえば５アミノ酸残基のショートセグメント（ショートセグメントが存在する場合）のＮ末端のすぐ隣にある、またはリングドメイン（ショートセグメントが存在しない場合）のＮ末端のすぐ隣にある、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、またはそれ以上の残基である。いくつかの実施形態では、Ｎ末端伸長部は、ＮＰＲ−Ａに対してよりもＮＰＲ−Ｂに対して増大された選択性を提供する。

Ｃ末端伸長部は、リングドメインのＣ末端のすぐ隣にある領域であり、かつ任意の長さ、たとえば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、またはそれ以上のアミノ酸残基でありうる。この領域は、ＣＮＰ２２およびＣＮＰ５３には不在であるが、ハイブリッドペプチドＣＤＮＰ（配列番号１００、図24）には存在する。CDNPの追加のバリアントとしては、低減されたNEP分解をもたらす１以上の突然変異を有するもの、例えば図24に提供されるCDNP-N1 (配列番号101), CDNP-G1 (配列番号102), CDNP-H1 (配列番号103),およびCDNP-K1 (配列番号104)が挙げられる。

例示的Ｃ末端伸長部は、図１２の四角で囲まれた領域のＣ末端のすぐ隣に示されており、たとえば、配列番号１のアミノ酸残基２４〜２８、配列番号２のアミノ酸残基２８〜３２、配列番号３のアミノ酸残基２７〜３２、または配列番号５のアミノ酸残基２４〜３８である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端テールは、ＤＮＰＣ末端テール（配列番号１１７）、または１つ以上の付加、欠失、もしくは置換突然変異を有するその変異体（たとえば配列番号１１８）を含みまたはそれらからなる。たとえば、ＮＰのＣ末端テールは、図２４に示されるＤＮＰＣ末端テール突然変異のいずれかを含みうる。特定的には、ＤＮＰＣ末端テール（配列番号１１７）の残基１、３、４、５、６、および／または７は、たとえば、図２４に示される突然変異のいずれかのように、突然変異されたものでありうる。いくつかの実施形態では、Ｃ末端伸長部は、ＮＰＲ−Ａに対してよりもＮＰＲ−Ｂに対して増大された選択性を付与する。

ＮＰは、場合により、任意の適切な１個以上のアミノ酸残基がグリコシル化されたものでありうる。

それに加えて、ＮＰは、本明細書で説明したＮＰのいずれかに対して、またはリングドメイン、ショートセグメント、Ｃ末端伸長部、もしくはＮ末端伸長部の１つ以上に対して、少なくとも５０％（たとえば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有しうる。

ＮＰは、本明細書で説明したＮＰのいずれか、またはリングドメイン、ショートセグメント、Ｃ末端伸長部、もしくはＮ末端伸長部の１つ以上に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の付加、欠失、または置換を有しうる。

ある例において、NPは有効性または効力を実質的に低減することなく、酸化にさほど感受性でない１以上の突然変異を有しうる。例えば、CNP22の残基17は、CNP22におけるさほど保存されていない部位の一つであり、天然のホモログがこの位置に（限定するものではないが）Phe、Leu、Ile、Thr、Val、またはSerを有する(例えば図１４を参照されたい)。例示的なCNP22バリアントとしては、CNP-F17 (配列番号119); CNP-L17 (配列番号120); CNP-I17 (配列番号121); CNP-T17 (配列番号122); CNP-V17 (配列番号123); CNP-A17 (配列番号124); CNP-S17 (配列番号125); CNP-E17 (配列番号156); CNP-R17 (配列番号157); およびCNP-Y17 (配列番号158)が挙げられ、ここでコンセンサス配列は配列番号126 に示され(ここでXは任意のアミノ酸であってもよく、これには限定するものではないがPhe、Leu、Ile、Thr、Glu、Arg、Tyr、Cys、Pro、Asp、Val、Ala、またはSerが含まれる) (図26)。追加の例示的CNP22バリアントとしては、図30に示すように位置17に点突然変異を有するもの(配列番号126、119-122、および156-172)が挙げられ、ここで配列番号126または162におけるXは任意のアミノ酸、例えばF、L、I、T、E、R、Y、C、P、またはDであり得る。

別の例では、NPは、in vivoでCNPを切断する１以上の酵素(例えば中性エンドペプチダーゼ(NEP)および／またはインスリン分解酵素(IDE))に対する耐性の増大を提供する１以上の突然変異を有しうる。例示的な分子は図27(配列番号127-150)、図28A-28E (配列番号1001-1155)、ならびに図29 (配列番号4、115、119、120、122、128-139、147、148、および150-155)に示される。

本明細書で説明したＮＰは、ＮＰがＮＰＲ−Ｂをアゴナイズする能力を有するかぎり、共有結合または非共有結合された任意の他の配列または部分を含んでいてもよい。

いくつかの実施形態では、本明細書で説明したＮＰは、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、または１２０アミノ酸残基長以下でありうる。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書で説明したＮＰは、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８、または１０．０キロダルトン（ｋＤａ）以下の分子量でありうる。

本明細書で説明した組成物および方法で使用するのに好適なＮＰは、たとえば、米国特許第５，３５２，７７０号明細書、同第５，４３４，１３３号明細書、同第６，０２０，１６８号明細書、同第６，０３４，２３１号明細書、同第６，４０７，２１１号明細書、同第６，７４３，４２５号明細書、同第６，８１８，６１９号明細書、同第７，２７６，４８１号明細書、同第７，３８４，９１７号明細書、および同第７，７５４，８５２号明細書、米国特許出願公開第２００７−０１９７４３４号明細書、同２００８−０１８１９０３号明細書、同２００８−０３１２１４２号明細書、同２００９−０１７０７５６号明細書、同２０１０−００５５１５０号明細書、および同２０１０−０２９７０２１号明細書、国際公開第９４／２０５３４号パンフレット、同第０２／０４７８７１号パンフレット、同第２００４／０４７８７１号パンフレット、同第２００５／０９８４９０号パンフレット、同第２００８／１５４２２６号パンフレット、および同第２００９／０６７６３９号パンフレット、欧州特許第０４９７３６８号明細書および同第０４６６１７４号明細書、Ｆｕｒｕｙａｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８３：９６４−９６９（１９９２）、Ｔａｋａｎｏｅｔａｌ．，Ｚｏｏｌ．Ｓｃｉ．，１１：４５１−４５４（１９９４）、Ｐｌａｔｅｒｅｔａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｎ．，３６（６）：８４７−８５７（１９９８）、およびＩｎｏｕｅｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１００（１７）：１００７９−１００８４（２００３）（それらはいずれも、ナトリウム利尿ペプチドおよびその変異体のすべての式、構造、および配列を含めて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものを含む。代替実施形態では、本節で参照されたＮＰは、本明細書で説明した組成物および方法から除外される。

いくつかの実施形態では、本明細書で説明したもしくは参照により本明細書に組み込まれるＮＰのいずれかを、Ｆｃドメインにもリンカーにも融合させずに、本明細書で説明した組成物および方法で使用することが可能であり、または他の選択肢として、Ｆｃドメインに融合させずに、本明細書で説明したリンカーのいずれかに融合させることが可能である。そのようなＮＰは、本明細書で説明した、神経皮膚症候群、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、たとえば、軟骨無形成症、骨もしくは軟骨の障害、血管平滑筋障害または骨の伸長の症状を治療すべく使用可能である。

他の実施形態では、本明細書で説明したまたは参照により本明細書に組み込まれるＮＰのいずれかは、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７に点突然変異を含みうる。野生型ＣＮＰ２２は、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７にメチオニンを有し、これは、ｉｎｖｉｖｏで酸化可能であり、かつ／またはプロテアーゼにより分解されうるペプチドを提供可能である。本明細書で説明したように、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７の点突然変異は、効力を保持しながら、低減された分解性を有するポリペプチドを提供可能である。ＣＮＰ２２を基準にした位置１７の例示的アミノ酸残基は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ、たとえば、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、またはＡｓｐ、たとえば、ＰｈｅまたはＬｅｕ、たとえば、Ｐｈｅ、例えばＬｅｕである。たとえば、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７のアミノ酸は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、およびＡｓｐ、たとえば、ＰｈｅまたはＬｅｕ、たとえばＰｈｅ、例えばＬｅｕでありうる。他の例では、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７のアミノ酸は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、またはＳｅｒでありうる。他の選択肢として、ＣＮＰ２２を基準にした位置１７の例示的アミノ酸残基は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓである。

さらに、本明細書で説明した組成物および方法には、本明細書で説明したＮＰおよび融合ポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子、ならびに本明細書で説明したＮＰまたは融合ポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子の少なくとも一部に、たとえば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらには１００％に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸分子が含まれる。

結晶性フラグメント領域（Ｆｃ）断片
本発明に係る融合ポリペプチドは、Ｆｃ（免疫グロブリンの結晶性フラグメント領域）などのＮ末端ドメインまたはＣ末端ドメインを含みうる。例えば本発明のsALPポリペプチドおよび／またはNPポリペプチドは、Fcを含む融合ポリペプチドであり得る。免疫グロブリン分子は、当技術分野で周知の構造を有する。それは、２本の軽鎖（それぞれ約２３ｋＤ）と、鎖間ジスルフィド結合により連結された２本の重鎖（それぞれ約５０〜７０ｋＤ）と、を含む。免疫グロブリンは、タンパク質分解により（たとえば、パパイン切断により）、Ｆａｂ（軽鎖と重鎖のＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインとを含有する）とＦｃ（隣接配列と一緒に重鎖のＣ_Ｈ２ドメインおよびＣ_Ｈ３ドメインを含有する）とに容易に切断される。切断は、典型的には、Ｆａｂ領域とＦｃ領域とを連結するフレキシブルヒンジ領域で起こる。たとえば、パパインは、２本の重鎖を連結するジスルフィド結合の直前のヒンジ領域を切断する。

本明細書で説明した有用なＦｃフラグメントは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ、およびそれらの種々のサブクラス（たとえば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＧ−４、ＩｇＡ−１、ＩｇＡ−２）を含めて、任意の哺乳動物（たとえばヒト）から採取される任意の免疫グロブリン分子のＦｃフラグメントを含む。本発明に係るＦｃフラグメントは、たとえば、重鎖のＣ_Ｈ２ドメインおよびＣ_Ｈ３ドメインならびにヒンジ領域の任意の部分を含みうる。さらに、Ｆｃ領域は、場合により、任意の適切な１個以上のアミノ酸残基、たとえば、当業者に公知の種々のアミノ酸残基がグリコシル化されていてもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃフラグメントは、ヒトＩｇＧ−１のものである。特定の実施形態では、融合ポリペプチドのＦｃフラグメントは、配列番号４０１で示されるアミノ酸配列を有し、または配列番号４０１（図７）に対して少なくとも５０％（たとえば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、たとえば、国際公開第２００５／００７８０９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、工学操作された（たとえば、天然に存在しない）Ｆｃ領域を本発明に係る組成物および方法で利用することが可能である。

本明細書で説明したＦｃフラグメントは、本明細書で説明したＦｃフラグメントのいずれかに対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、またはそれ以上の付加、欠失、または置換を有しうる。

リンカー
本明細書で説明した融合タンパク質は、ＦｃフラグメントとsALPとの間またはFcフラグメントとＮＰとの間にペプチドリンカー領域を含みうる。さらに、Fcフラグメントと任意選択的な骨標的部分との間にペプチドリンカー領域が追加されうる。リンカー領域は、sALPまたはＮＰが生物学的活性を維持する、たとえば、立体障害を受けない、任意の配列および長さでありうる。例示的リンカー長は、１〜２００アミノ酸残基、たとえば、１〜５、６〜１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜２５、２６〜３０、３１〜３５、３６〜４０、４１〜４５、４６〜５０、５１〜５５、５６〜６０、６１〜６５、６６〜７０、７１〜７５、７６〜８０、８１〜８５、８６〜９０、９１〜９５、９６〜１００、１０１〜１１０、１１１〜１２０、１２１〜１３０、１３１〜１４０、１４１〜１５０、１５１〜１６０、１６１〜１７０、１８１〜１９０、または１９１〜２００アミノ酸残基である。さらなる例示的リンカー長は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００アミノ酸残基である。さらなる例示的リンカー長は、１４〜１８、２０〜２４、２６〜３０、３２〜３６、３８〜４２、および４４〜４８アミノ酸残基である。

いくつかの実施形態では、リンカーは、フレキシブル部分、たとえば、有意な固定された二次構造や三次構造をとらない領域を含みまたはそれからなる。例示的フレキシブルリンカーは、高グリシンリンカー、たとえば、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、さらには１００％のグリシン残基を含有するリンカーである。リンカーはまた、たとえば、セリン残基を含有しうる。いくつかの場合には、リンカーのアミノ酸配列は、グリシン残基およびセリン残基のみからなる。

いくつかの場合には、リンカー配列のアミノ酸配列は、式［（Ｇｌｙ）_ｍ（Ｓｅｒ）］_ｎ（Ｇｌｙ）_ｐ〔式中、ｍ、ｎ、およびｐのそれぞれは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である〕で表される配列を含みまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｍ＝１、２、３、４、５、または６、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、かつｐ＝０、１、２、３、または４である。他の選択肢として、リンカー配列は、式（Ｇｌｙ）_ｐ［（Ｓｅｒ）（Ｇｌｙ）_ｍ］_ｎ〔式中、ｍ、ｎ、およびｐのそれぞれは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である〕で表される配列を含みまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｍ＝１、２、３、４、５、または６、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、かつｐ＝０、１、２、３、または４である。

以上の２つの式のいずれに対しても、ｍ、ｎ、およびｐの値の例示的組合せを表２に列挙する。

いくつかの実施形態では、リンカーのアミノ酸配列(例えばFcとsALPとの間、もしくはFcとNPとの間、またはFcと任意選択的な骨標的部分との間のもの)は、表３の配列を含みまたはそれらからなる。

いくつかの実施形態では、リンカーは、以上で説明した［（Ｇｌｙ）_ｍ（Ｓｅｒ）］_ｎ（Ｇｌｙ）_ｐまたは（Ｇｌｙ）_ｐ［（Ｓｅｒ）（Ｇｌｙ）_ｍ］_ｎリンカーと、それに続く配列番号３１４〜３２１の１つ、たとえば、配列番号３１４、３１５、または３２１の１つと、を含みまたはそれらからなりうる。

sALPを含むポリペプチドの他の実施形態において、リンカーは、sALPの全て若しくはその断片を含む又はそれからなっていてもよい。例えば、N末端シグナル配列、又はその相同体若しくは変形若しくは断片(例えば、配列番号1202又は1208の残基1〜17)であるヒトTNALPの17アミノ酸部分をリンカーとして使用してもよい。この17アミノ酸領域の相同体は、例えば、図8(配列番号1216の残基1〜17、Xは任意のアミノ酸であり得る)又は図11(配列番号1219の残基1〜17、Xは任意のアミノ酸であり得えるが、表1に示される病因性突然変異でない)などの配列アラインメントを調べることによって同定してもよい。別の例において、ヒトTNALPのC末端GPIアンカー部分、又はその相同体若しくは変形若しくは断片(例えば、配列番号1208の残基503〜524)をリンカーとして使用してもよい。このC末端領域の相同体は、例えば、図8(配列番号1216の残基503〜524、Xは任意のアミノ酸であり得る)又は図11(配列番号1219の残基503〜524、Xは任意のアミノ酸であり得えるが、表1に示される病因性突然変異でない)などの配列アラインメントを調べることによって同定してもよい。

NPを含むポリペプチドの他の実施形態において、リンカーは、NPの全て若しくはその断片を含む又はそれからなっていてもよい。例えば、CNP22に対してN末端であるヒトCNP53(例えば、配列番号320の残基4〜34)、又はその相同体若しくは変形をリンカーとして使用してもよい。この31アミノ酸領域の相同体は、例えば、図15A〜図15Gなどの配列アラインメントを調べ、ヒトCNP53のN末端の31アミノ酸残基に対応する領域を同定することによって、同定してもよい。他の適切なリンカーもまた、例えば、図15A〜図15Gにおいて、又はいずれかの他のNP若しくは図15A〜図15Gに示されていないNPの領域に示されるように、NPのいずれかの部分を選択し、場合により環ドメインを排除することによって同定してもよい。例えば、DNPのC末端伸長(配列番号117)、又はその断片若しくは変形をリンカーとして使用してもよい。

リンカーは、場合により、1つ以上の適当なアミノ酸残基でグリコシル化されてもよい。

さらに、リンカーは、本明細書に記載されているリンカーのいずれかと少なくとも50%(例えば、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又はそれを超える)の配列同一性を有してもよい。さらに、リンカーは、本明細書に記載されているリンカーのいずれかに対して、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、若しくはそれを超える付加、欠失、又は置換を有してもよい。

本明細書に記載されているリンカーは、共有結合若しくは非共有結合したいずれかの他の配列又は部分を含んでもよい。

いくつかの実施形態において、リンカーは存在しない、これは、Fc断片及びsALPが直接一緒に融合している、又はFc断片及びNPが介在残基なしに直接一緒に融合していることを意味する。

特定のFc-sALP又はsALP-Fcの融合タンパク質は、本開示に従えば、1)リンカーを有さない、又は2)sALPの部分に対応するリンカーを有する、のいずれかとして見ることができることに留意されたい。例えば、hsTNALP(1〜502)に直接融合したFcは、例えば、リンカーを有さない(NPはhsTNALP(1〜502)である)、又は17アミノ酸のリンカーを有する(NPはhsTNALP(18〜502)である)のいずれかとして見ることができる。

さらに、特定のFc-NP又はN-FcPの融合タンパク質は、本開示に従えば、1)リンカーを有さない、又は2)NPの部分に対応するリンカーを有する、のいずれかとして見ることができることに留意されたい。例えば、CNP53に直接融合したFcは、例えば、リンカーを有さない(NPはCNP53である)、又は31アミノ酸のリンカーを有する(NPはCNP22である)のいずれかとして見ることができる。

sALPポリペプチド
本明細書に記載されているsALP及びリンカーのいずれかは、sALPポリペプチド、例えば、A-sALP-BのsALPポリペプチド(A及びBのそれぞれは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である)において組み合わされてもよい。存在する場合、A及び/又はBは、本明細書に記載されているいずれかのリンカー(例えば、配列番号301〜309のいずれか1つのアミノ酸配列)であり得る。いくつかの実施形態において、Aは存在しない、Bは存在しない、又はAとBはともに存在しない。

本発明のsALPポリペプチドは、場合により、本明細書に記載されているように、sALP融合ポリペプチドを提供するためにFc領域を含むことができる。

sALPポリペプチドは、場合により、骨標的化部分(例えば、本明細書に記載されているいずれかのもの)を含めることができる。いくつかの実施形態において、リンカー、例えば、フレキシブルリンカーは、骨標的化部分とsALPとの間に含められてもよい。例えば、図5Bは、Fc領域と骨標的化部分との間の骨標的化部分とリンカー(ボールドで示される)の両方を有するポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、リンカーは、ジペプチド配列(例えば、ロイシン-リジン又はアスパラギン酸-イソロイシン)、又は配列番号301〜391のいずれか1つのアミノ酸配列である。

sALPポリペプチドは、本明細書に記載されているいずれかのALP、突然変異、N末端シグナル配列、C末端GPI配列、及び/若しくはリンカー、又はそれらの断片を含むことができる。例えば、図5B〜図5Cにおけるイタリックで示された領域、及び図6又は図8〜図11に提供される配列は、本明細書において開示されるsALP(配列番号1201、1202、1204〜1216、1218、及び1219)のいずれかのために使用することができる。

sALP融合ポリペプチド
本明細書に記載されているsALP、リンカー、及びFc領域のいずれかは、融合ポリペプチド、例えば、組換え融合ポリペプチドにおいて組み合わせられてもよく、この融合ポリペプチドは、構造C-sALP-D-E-Fc、C-Fc-D-sALP-E、C-sALP-D-Fc-G-I_n-H、又はC-Fc-D-sALP-G-I_n-Hを含み、C、D(リンカー領域)、E、G(リンカー領域)、及びHのそれぞれは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Iは、アスパラギン酸又はグルタミン酸を表し、n=10〜16である。D及びGは、存在しないか、又は場合により、本明細書に記載されているいずれかのリンカー(例えば、配列番号301〜391のいずれか1つのアミノ酸配列)を含むことができる。

本発明のポリペプチドは、場合により、1)ポリペプチドのN末端に、2)sALPとポリペプチドのFc領域との間に、及び3)ポリペプチドのC末端に、1つ以上のさらなるアミノ酸残基を含む。従って、本発明は、例えば、形態C-sALP-D-Fc-E又は構造C-Fc-D-sALP-Eのポリペプチドを含み、Cは、ポリペプチドのN末端での1つ以上(例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、17個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、又はそれを超える)のさらなるアミノ酸残基であり、Dは、sALPとポリペプチドのFc領域との間の1つ以上(例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、17個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、又はそれを超える)のさらなるアミノ酸残基(すなわち、リンカー)であり、Eは、ポリペプチドのC末端での1つ以上(例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、17個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、又はそれを超える)のさらなるアミノ酸残基である。特定の例において、Dは、ジペプチドのロイシン-リジンである。あるいは、C、D、及びEのいずれかの組み合わせが存在してもよく又は存在しなくてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、CとEはともに存在しない、Dは存在しないか又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である。例えば、ポリペプチドは、構造sALP-D-Fc又は構造Fc-D-sALPからなっていてもよい。構造sALP-D-Fc又はFc-D-sALPからなるポリペプチドのいくつかの実施形態において、Dは、2つのアミノ酸残基、例えば、ロイシン-リジンからなっていてもよい。例えば、ポリペプチドは、構造sALP-D-Fcからなっていてもよい。場合により、sALPのアミノ酸配列は、配列番号1205のアミノ酸配列であり、Dのアミノ酸配列は、ロイシン-リジンであり、及び/又はFcのアミノ酸配列は、配列番号401のアミノ酸配列である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号1204のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号1204又は1221のアミノ酸配列と少なくとも50%(例えば、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又はそれを超える)の配列同一性のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、骨標的化部分、例えば、一連の連続したAsp又はGlu残基、例えば、E₆、E₇、E₈、E₉、E₁₀、E₁₁、E₁₂、E₁₃、E₁₄、E₁₅、E₁₆、D₆、D₇、D₈、D₉、D₁₀、D₁₁、D₁₂、D₁₃、D₁₄、D₁₅、又はD₁₆を有する骨標的化部分を含む。骨標的化部分は、存在する場合、融合ポリペプチドにおけるいずれかの場所、例えば、N末端若しくはC末端又はその近傍、及び/又はリンカー領域に位置してもよい。例えば、C、D、及び/又はEのいずれか1つは、骨標的化部分を含んでもよい。いくつかの実施形態において、骨標的化部分はC末端にある。例えば、ポリペプチドは、構造C-sALP-D-Fc-G-I_n-H又は構造C-Fc-D-sALP-G-I_n-Hを含む又はそれからなっていてもよく、C、D(リンカー領域)、G(リンカー領域)、及びHのそれぞれは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Iはアスパラギン酸又はグルタミン酸を表し、nは10から16である。いくつかの実施形態において、CとHはともに存在せず、D及びGは、存在しなくてもよく、又は場合により、本明細書に記載されているいずれかのリンカー(例えば、配列番号301〜391のいずれか1つのアミノ酸配列)を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは、構造sALP-D-Fc-G-I_n又は構造Fc-D-sALP-G-I_nを含んでもよく、又はそれからなっていてもよい。

いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、骨標的化部分を含まない。

本明細書に記載されている融合ポリペプチドは、本明細書に記載されている融合ポリペプチドのいずれか、例えば、配列番号1201、1204、1220、又は1221と少なくとも50%(例えば、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又はそれを超える)の配列同一性を有してもよい。さらに、本明細書に記載されている融合ポリペプチドは、本明細書に記載されている融合ポリペプチドのいずれかに対して1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、50個、又はそれを超える付加、欠失、又は置換を有してもよい。さらに、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている融合ポリペプチドは、高ストリンジェンシー条件下、ポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子の少なくとも一部、例えば、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%とさえもハイブリダイズする核酸分子によってコードされてもよい。

いくつかの実施形態において、さらなるアミノ酸残基は、融合ポリペプチドを生成するために使用されるクローニング戦略に従ってポリペプチドに導入することができる。いくつかの実施形態において、さらなるアミノ酸残基は、可溶性形態でポリペプチドを維持するようにさらなるGPIアンカーシグナルを提供しない。さらに、いくつかの実施形態において、このようなさらなるアミノ酸残基は、本発明のポリペプチドに組み込まれる場合、宿主細胞のエンドプロテアーゼ用の切断部位を提供しない。設計された配列が宿主細胞のエンドプロテアーゼによって切断される可能性は、例えば、Ikezawa (Biol. Pharm. Bull. 25:409〜417, 2002)に記載されているように、予測することができる。

特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、二量体又は四量体に結合される。例えば、2つのsALP-Fcモノマーは、Fc断片のヒンジ領域に置かれた2つのジスルフィド結合を介して共有結合的に連結され得る。

NPポリペプチド
本明細書に記載されているNP及びリンカーのいずれかは、NPポリペプチド、例えば、V-NP-WのNPポリペプチドにおいて組み合わせられてもよく、V及びWのそれぞれは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である。

本発明のNPポリペプチドは、場合により、本明細書に記載されているように、NP融合ポリペプチドを提供するFc領域を含むことができる。

NPポリペプチドは、場合により、骨標的化部分を含むことができる。いくつかの実施形態において、リンカー、例えば、フレキシブルリンカーは、骨標的化部分とNPとの間に含まれてもよい。例えば、図27は、リンカー又は骨標的化部分とリンカー(配列番号128〜150)の両方を有するポリペプチドを提供する。図31A〜図31Bは、リンカー又は骨標的化部分とリンカーの両方を有するポリペプチドを提供し、配列番号173〜220のいずれか1つにおけるXは、任意のアミノ酸、例えば、F、L、I、T、E、R、Y、C、P、又はDであり得る。図32は、特定の変形についてのアミノ酸配列を提供し、配列番号186〜198におけるXは、配列番号221〜233における配列を提供するためのロイシンである。

NPポリペプチドは、本明細書に記載されている、いずれかのNP、N末端伸長、C末端伸長、及び/又はリンカーを含むことができる。例えば、図30、図31A及び図31B、並びに図32においてイタリック体で示されている領域は、本明細書において開示されるNP(配列番号511〜516及び553〜558参照)のいずれかのために使用することができる。

NP融合ポリペプチド
本明細書に記載されているNP、リンカー、及びFc領域のいずれかは、融合ポリペプチド、例えば、構造X-Fc-Y-NP-Z又は構造X-Y-NP-Fc-Zを含む組換え融合ポリペプチドにおいて組み合わせることができ、X、Y(リンカー領域)、及びZのそれぞれは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である。

図17A〜図17Eは、本明細書に記載されている融合ポリペプチドのいくつかの可能な概略的な構造を示す。Fc-NP又はNP-Fcのホモ二量体は、例えば、Fcによって形成されるジスルフィド結合によって形成されてもよい(それぞれ図17A及び図17B)。あるいは、NP-Fc又はFcの-NP融合ポリペプチドが遊離Fcドメインと合体している単量体-二量体ハイブリッドが可能である(それぞれ図17C及び図17D)。さらに、NP-Fc単量体は、図17Eに示されるように、Fc-NP単量体と合体してもよい。これらの構成は、網羅的なものを意図せず、単に例示的なものである。

N末端NPドメイン及びC末端Fcドメインを有する例示的な融合ポリペプチドは、図25Aに示されるものを含み、CNP-16AAリンカー-Fc-His₁₀(NC1)(配列番号521);CNP-6AAリンカー-Fc-His₁₀(NC3)(配列番号522);CNP-6AAリンカー-Fc(配列番号523);CDNP-Fc(配列番号524)、これはCDNPとFc部分との間にリンカーを有さない;CDNP-A17saa-Fc(配列番号525)、これはCNP22領域の17位のアラニンに対する突然変異、DNPテール領域における突然変異S3、A4、及びA5を有する;CDNP-A17sra-Fc(配列番号526)、これはCNP22領域の17位のアラニンに対する突然変異、DNPテール領域における突然変異S3及びA5を有する、を含む。図25Bは、NC1の核酸配列(配列番号806)のリストである。

融合ポリペプチドにおけるNPドメインは、本明細書に記載されているいずれかのNPであり得る。例えば、図30、図31A及び図31B、並びに図32に示される分子のいずれかは、骨標的化部分を有するか又は有さず、Fcドメインに融合されてもよく、場合により、本明細書に記載されているように、FcとNPとの間にリンカー領域をさらに含んでもよい。例えば、M17X突然変異を有するCNP変形は、Fcドメイン、例えば、図33A〜図33Eに示されるものに融合させることができ、Xは、任意のアミノ酸、例えば、F、L、I、T、E、R、Y、C、P、D、G、A、S、V、W、N、Q、H、又はK、例えば、F、L、I、T、E、R、Y、C、P、又はD、例えば、F又はLであり得る。いくつかの実施形態において、配列は、配列番号530であり、Xは、本明細書に記載されている任意のアミノ酸、例えば、F、L、I、T、E、R、Y、C、P、D、G、A、S、V、W、N、Q、H、又はK、例えば、F、L、I、T、E、R、Y、C、P、又はD、例えば、F又はLである。

構造X-Fc-Y-NP-Z又は構造X-NP-Y-Fc-Zにおいて、Xは、ポリペプチドのN末端で1つ以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、又はそれを超える)のさらなるアミノ酸残基を含んでもよく、Zは、独立して、ポリペプチドのC末端で1つ以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、又はそれを超える)のさらなるアミノ酸残基を含んでもよい。

いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、骨標的化部分、例えば、一連の連続したAsp又はGlu残基、例えば、E₆、E₇、E₈、E₉、E₁₀、E₁₁、E₁₂、E₁₃、E₁₄、E₁₅、E₁₆、D₆、D₇、D₈、D₉、D₁₀、D₁₁、D₁₂、D₁₃、D₁₄、D₁₅、又はD₁₆を有する骨標的化部分を含む。骨標的化部分は、存在する場合、融合ポリペプチドにおけるいずれかの場所、例えば、N末端若しくはC末端又はその近傍、及び/又はリンカー領域に位置してもよい。例えば、X、Y、及び/又はZのいずれか1つは、骨標的化部分を含んでもよい。

いくつかの例において、1つ以上のアミノ酸残基は、使用されるクローニング戦略の結果として、融合ポリペプチド、例えば、X、Y、又はZ内に導入される。いくつかの実施形態において、いずれかのこのようなさらなるアミノ酸残基は、本発明のポリペプチドに組み込まれる場合、宿主細胞のエンドプロテアーゼ用の切断部位を提供しない。設計された配列が宿主細胞のエンドプロテアーゼによって切断される可能性は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ikezawa (Biol. Pharm. Bull. 25:409〜417, 2002)に記載されているように、予測することができる。

特定の実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、Fc断片のヒンジ領域に置かれた2つのジスルフィド結合を介して、例えば、二量体に結合される。

いくつかの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、インビボにおいて、少なくとも、例えば、CNP22の、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、9、10、12.5、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、40,000、又は50,000倍の半減期を有する。

いずれかのNP融合ポリペプチドは、分泌を促進するためのN末端シグナル配列、例えば、配列番号501のアミノ酸残基1〜25、又は当該技術分野において知られているいずれかの他のシグナル配列とともに発現されてもよい。このような配列は、一般に、共翻訳的に切断され、タンパク質の成熟バージョンの分泌をもたらす。

本明細書中に記載される融合ポリペプチドは、本明細書に記載されている融合ポリペプチドのいずれか、例えば、配列番号501〜608と少なくとも50%(例えば、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又はそれを超える)の配列同一性を有してもよい。さらに、本明細書に記載されている融合ポリペプチドは、本明細書に記載されている融合ポリペプチドのいずれかに対して、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、50個、又はそれを超える付加、欠失、又は置換を有してもよい。さらに、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている融合ポリペプチドは、高ストリンジェンシー条件下、本明細書に記載されている、ポリペプチドのいずれか、例えば融合ポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも一部、例えば、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%とさえもハイブリダイズする核酸分子によってコードされてもよい。

融合タンパク質は、発現中に切断される1つ以上の修飾を有するものを含む。例えば、Fc-CNP融合タンパク質は、図18A及び図18Bに示すように設計された。このタンパク質は、「NC2 Streptag」又は「NC2st」と呼ばれ、発現中に切断される25アミノ酸のN末端シグナル配列を有する。成熟タンパク質は、N末端からC末端に向かって、以下のドメイン構造、短いリンカー配列に隣接されたStrep-tag II配列(精製を促進するため)、TEVプロテアーゼ切断配列、続いて短いリンカー、ヒトIgG-1のFcドメイン、16アミノ酸のグリシンリッチなリンカー、及びCNP22を有する。このタンパク質は、当該技術分野において知られている標準的な技術を用いて、コード配列(図18C、配列番号801)を化学的に合成し、小さいクローニングプラスミドにコード配列を挿入することによって生成することができる。

融合タンパク質は、いくつかの点で変えられてもよい。例えば、NC2stは、Fcドメインに対してN末端である配列を除去し(例えば、図19A及び図19Bに示されるように、NC2Bをもたらす)、骨標的化部分を加え(例えば、図19Aに示されるように、D10-NC2をもたらす)、及び/又はFcとCNP22との間のリンカー(図20A〜図20Dに記載されるように、例えば、NC2B-22(NC2-22とも称される)、NC2B-28(NC2-28とも称される)、及びNC2B-34(NC2-34とも称される))の長さを変更することによって変えることができる。他の例示的なNC2st変形は、図21(NC2-KGANKKとNC2-KGANQK)及び図22(NC2-CNP53mut2)に示される。

NC2Bは、いくつかの点において変えられてもよく、例えば、CNP22に対して、17位に、点突然変異を有すること、骨標的化部分を有すること、及び/又は修飾された若しくは変更されたリンカー領域を有することが挙げられる。例示的な融合タンパク質は、NC2B(図16A及び図16Bに示される)と比較して、修飾された又は変更されたリンカー領域を有するいずれかの配列(図34Aに示されるように、例えば、配列番号511〜516);骨標的化部分、例えば、D₁₀部分を有するいずれかの配列(図34Bに示されるように、例えば、配列番号553〜558);本明細書に開示されているNPのいずれかについての、いずれかのN末端伸長、C末端伸長、及び/又はリンカー(例えば、図30、図31A及び図31、並びに図32Bに示されるように、配列番号511〜516及び533〜558においてイタリック体で示された領域);CNP22に対して17位にフェニルアラニン(Phe、F)置換を有するいずれかの配列(例えば、図34Cに示されるように、配列番号559〜564)、例えば、N末端でD₁₀骨標的化部分のさらなる修飾を有するそれらの配列(例えば、図34Dに示されるように、配列番号565〜570);CNP22に対して17位にロイシン(Leu、L)置換を有するいずれかの配列(例えば、図34Eに示されるように、配列番号571〜576)、例えば、N末端でD₁₀骨標的化部分のさらなる修飾を有するそれらの配列(例えば、図34Fに示されるように、配列番号577〜582);CNP22に対して17位にアルギニン(Arg、R)置換を有するいずれかの配列(例えば、図34Gに示されるように、配列番号583〜588)、例えば、N末端でD₁₀骨標的化部分のさらなる修飾を有するそれらの配列(例えば、図34Hに示されるように、配列番号589〜594);及びCNP22に対して17位にチロシン(Tyr、Y)置換を有するいずれかの配列(例えば、図34Iに示されるように、配列番号595〜600)、例えば、N末端でD₁₀骨標的化部分のさらなる修飾を有するそれらの配列(例えば、図34Jに示されるように、配列番号601〜606)を含む。

さらなる構築物は、N末端Fcドメインが、短いGly₃リンカー領域を有するCNP53の変形に融合されている融合タンパク質を含む。これらの融合ポリペプチドを分析するための代替の方法は、リンカー領域が、Gly3、続いてCNP53のアミノ酸残基1〜31であること(又はその変形)であり、このようにしてみると、リンカー領域は、FcドメインをCNP22に接続し、長さは34アミノ酸残基である。Fc-CNP53-A(「Fc-CNP53wt」とも称する)(配列番号517(シグナル配列を有する)及び518(シグナル配列を有さない、図23)に関して、CNP22の17位に対応する、CNP53の48位をアラニンに突然変異させた。Fc-CNP53-AAA(「Fc-CNP53mut」とも称する)(配列番号519(シグナル配列を有する)及び520(シグナル配列を有さない、図23)は、Fc-CNP53-Aと同じ配列を有するが、ただし、CNP22の直前の2つの残基である、CNP53の残基30及び31残基は、タンパク分解的切断の可能性を低減させるためにアラニンに突然変異されている。いくつかの場合において、CNP53の最初の31アミノ酸残基を含むようにFc-CNP22融合体のリンカー領域を修飾することは、インビトロでの膜アッセイ及び全細胞アッセイにおいてNC2stよりも大きな効力及び有効性さえ有する構築物をもたらす可能性がある。

さらなるポリペプチドの特徴
本発明のポリペプチドはまた、グリコシル化(例えば、マンノシル化、及び本明細書において検討されている他のグリコシル化形態)、アセチル化、アミド化、ブロック化、ホルミル化、γ-カルボキシグルタミン酸ヒドロキシル化、メチル化、ユビキチン化、リン酸化、ピロリドンカルボン酸修飾、及び硫酸化などの1つ以上の翻訳後修飾を有する任意のポリペプチドを含む。人工的な修飾、例えば、ペグ化もまたなされてもよい。

核酸及びポリペプチドの生成
本発明の核酸及びポリペプチドは、当該技術分野において知られている任意の方法により生成することができる。典型的に、所望の融合タンパク質をコードする核酸は、分子クローニング法を用いて産生され、一般に、プラスミド又はウイルスなどのベクター内に配置される。ベクターは、融合タンパク質の発現に適当な宿主細胞に核酸を形質転換するために使用される。代表的な方法は、例えば、Maniatisら(Cold Springs Harbor Laboratory, 1989)に開示されている。多くの細胞型が適当な宿主細胞として使用することができるが、哺乳動物細胞が好ましく、これは、これらの細胞は適当な翻訳後修飾を付与することができるためである。例えば、ヒト胎児腎臓293(HEK293)細胞は、以下の実施例においてより詳細に記載されるように、本発明の融合タンパク質を発現するための宿主として使用された。

本発明のポリペプチドは、宿主細胞におけるポリペプチドの発現をもたらすのに適した任意の条件下で生成することができる。このような条件は、緩衝液、重炭酸塩及び/又はHEPES、塩化物イオン、リン酸イオン、カルシウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオンのようなイオン、単糖のような炭素源、アミノ酸、潜在的脂質、ヌクレオチド、ビタミン、インスリンのような増殖因子などの成分で調整した培地;2〜4mMのL-グルタミン及び5%ウシ胎児血清を添加した、α-MEM、DMEM、Ham's-F12のような通常市販されている培地;2〜4mMのL-グルタミンを添加した、Hyclone(商標)SFM4CHO、Sigma CHO DHFR^-、Cambrex POWER(商標)CHO CDのような通常市販されている動物タンパク質不含培地の適当な選択を含む。これらの培地は、望ましくは、選択圧を維持するためにチミジン、ヒポキサンチン及びL-グリシンなしで調製され、それにより安定なタンパク質生成発現を可能にする。

本発明のポリペプチド及び核酸の生成のさらなる詳細を実施例に示す。

治療的適用
本明細書に記載されているポリペプチド及び核酸分子は、例えば、神経皮膚症候群(例えば、神経線維腫症)又はFGFR3の過剰活性化と関連した障害(例えば、骨及び軟骨障害、例えば、軟骨無形成症、又は癌、例えば、多発性骨髄腫)又は骨若しくは軟骨の障害(例えば、FGFR3の過剰活性化と関連していないもの)血管平滑筋障害の分野において、多種多様の治療的適用を有することができる。さらに、本明細書に記載されているポリペプチド及び核酸分子は、骨の伸長によって利益を得るいずれかの状態又は障害のために使用することができる。

神経皮膚症候群
本明細書に記載されているポリペプチド及び核酸分子は、いずれかの障害、疾患、又は無機ピロリン酸(PPi)の血中及び/若しくは尿中レベルの上昇及び/又はMAPキナーゼの過剰活性化と関連した他の異常、例えば神経皮膚症候群を治療するために使用することができる。特定の実施形態において、ポリペプチド及び核酸分子は、骨病変を伴う又は骨病変を伴わない神経皮膚症候群を治療するために使用される。例示的な神経皮膚症候群としては、神経線維腫症(例えば、本明細書に記載されているいずれかの型、例えばI型又はII型);緩い成長期毛を伴うヌーナン症候群様障害;若年性骨髄単球性白血病を伴うヌーナン症候群様障害(JMML);結節硬化症;スタージ・ウェーバー疾患;毛細血管拡張性運動失調;フォン・ヒッペル・リンドウ病;色素失調症;表皮母斑症候群,例えば、ヤーダスゾーンの線形脂腺母斑;母斑性基底細胞癌症候群;伊藤母斑症;神経皮膚黒色症;クリッペル-トレナウナイ症候群;及びワールデンブルグ症候群、I、II、III、及びIV型を含む、が挙げられる。

神経線維腫症
神経線維腫症は、例えば、腫瘍(若しくは神経線維腫)又は異常色素沈着(例えば、カフェオレスポット)を生成させるように、神経組織の異常成長又は増殖によって特徴付けられる常染色体優性の神経皮膚症候群である。特に、神経線維腫症は、骨病変(例えば、低ホスファターゼ症から生じる異変)、例えば、低身長症、脊柱側弯症、骨軟化症、骨性線維異形成症(例えば、大腿骨、脛骨、又は腓骨などの、1つ以上の骨の末端又は骨内の1つ以上の病変)、偽関節(例えば、脛骨偽関節)、及び/又は骨格形成異常(例えば、脛骨異形成、軌道異形成、及び/又は蝶形骨翼異形成)を伴い得る。

神経線維腫症、又はその異変若しくは表現型のいずれかは、本明細書に記載されている組成物及び方法を用いて治療することができる。このような障害、異変、及び表現型の例としては、古典的なフォン・レックリングハウゼン病型(I型)、消化管間質腫瘍(すなわち、腸神経線維腫症(3B型)として)を伴う、又はこのような腫瘍を伴わない;聴神経腫型(II型);主要な特徴を有するI型及びII型の特徴を組み合わせた混合型、例えば、両側性聴神経腫、後方窩及び上位頸髄膜腫、及び脊髄/傍脊柱神経線維腫(III型、Riccardi型又は3A型);I型を特徴する虹彩Lisch結節の欠損によるものと区別される異型(VI型);正中線を交差する身体の単一セグメント又は領域などの身体の特定領域に影響を及ぼす病変を有するI型の変形である分節性神経線維腫症(V型);神経線維腫症の他の異変を伴わないカフェオレスポットの症状だけを有する型(VI型);ニューロフィブロミン遺伝子NF1における変異によって引き起こされ、I型と区別される変形であると考えられる家族性脊髄性神経線維腫;神経線維腫症-褐色細胞腫-十二指腸カルチノイド症候群などのI型の他の変形;ヌーナン症候群の異変を伴う神経線維腫症、例えば、低身長症、下垂症、顔面中央の低形成、翼状頚、学習障害、及び筋力低下;神経鞘腫症が挙げられ、これらの障害のいずれかは1つ以上の骨病変を含む、又は排除することができる。

RAS及び/又はERKの過剰活性化と関連した障害
RAS及び/又はERKの過剰活性化によって引き起こされ、又はそれと関連付けられるいずれかの障害、疾患、又は異常は、本明細書に記載されている組成物及び方法を用いて治療されてもよい。これらの障害、疾患、及び他の異常は、限定されないが、ヌーナン症候群、コステロ症候群、複数の黒子を有するヌーナン症候群/LEOPARD症候群、神経線維腫症1型、NF1-ヌーナン症候群、遺伝性歯肉線維腫症1型、毛細血管奇形-AV奇形症候群、Legius症候群、緩い成長期毛を伴うヌーナン症候群様障害、若年性骨髄単球性白血病を伴うヌーナン症候群様障害(JMML)、心臓-顔-皮膚症候群、又は自己免疫リンパ増殖性症候群が挙げられ、これらの疾患のいずれかは、1つ以上の骨病変顕在化を含む、又は排除することができる。

FGFR3の過剰活性化と関連した障害
FGFR3の過剰活性化によって引き起こされ、又はそれと関連付けられ、例えば、機能獲得型FGFR3突然変異に起因する、いずれかの障害、疾患、又は異常は、本明細書に記載されている組成物及び方法を用いて治療されてもよい。これらの障害、疾患、及びその他の異常は、限定されないが、骨又は軟骨の障害及び癌を含み、それぞれが以下においてより詳細に説明される。

FGFR3の過剰活性化と関連した骨又は軟骨障害
骨若しくは軟骨の機能、構造、又は成長に影響を及ぼすいずれかの障害、疾患、又は異常は、本明細書に記載されている組成物及び方法を用いて治療されてもよい。特に、障害は、FGFR3の過剰活性化と関連付けられる骨格形成異常、例えば、軟骨無形成症であってもよく、発達遅延や表皮肥厚を伴う重度の軟骨無形成症;ムンク症候群(ムンク冠状頭蓋骨癒合症);クルゾン真皮骨格症候群;軟骨低形成症;致死性骨異形成症I型;及び致死性骨異形成症II型が挙げられる。本発明の組成物及び方法はまた、FGFR3の過剰活性化と関連していない骨又は軟骨の障害を治療するために使用することができ、これらの障害は、以下においてより詳細に説明される。

癌
FGFR3の過剰活性化によって引き起こされ、又はそれと関連付けされるいずれかの癌は、本明細書に記載される組成物及び方法を用いて治療されてもよい。これらの癌としては、例えば、多発性骨髄腫、骨髄増殖性症候群、白血病(例えば、形質細胞性白血病)、リンパ腫、神経膠芽腫、前立腺癌、膀胱癌、及び乳癌が挙げられる。

骨又は軟骨障害
本明細書に記載されるポリペプチド及び核酸分子は、骨若しくは軟骨の機能、構造、又は成長に影響を及ぼすいずれかの障害、疾患、表現型、又は他の異常を治療するために使用することができる。これらの骨又は軟骨障害は、FGFR3の過剰活性化と関連付けられてもよいが、必ずしもそうである必要はない。

例示的な骨又は軟骨障害には、骨格形成異常、及び骨若しくは軟骨と関連付けられるいずれかの障害、疾患、表現型、又は他の異常が含まれ、軟骨形成不全(例えば、ホモ接合又はヘテロ接合軟骨無形成症)、軟骨無形成症、先端骨形成不全、遠位中間肢異形成症、骨発生不全症、骨痛、ピロリン酸カルシウム二水和物(CPPD)結晶沈着、屈肢症異形成、軟骨点状発育不全(例えば、肢根型軟骨点状発育不全)、鎖骨頭蓋骨形成不全症、先天性短小大腿骨、頭蓋骨癒合症(例えば、ムンク症候群、クルゾン症候群、アペール症候群、ジャクソン・ワイス症候群、ファイファー症候群、又はクルゾン真皮骨格症候群)、趾(例えば、短指症、屈指症、多指症、又は合指症)、捻曲性骨異形成症、歯科障害(例えば、歯の石灰化の減少及び乳歯の早期喪失、例えば、歯のセメント質の形成不全、発育不全又は異形成を介するもの)、低身長症、分節異常骨異形成症、内軟骨腫症、線維軟骨形成症、線維性骨異形成、遺伝性多発性外骨腫、軟骨低形成症、低ホスファターゼ症(HPP)(例えば、乳児HPP、小児HPP、周産期HPP、成体HPP、又は歯限局型低ホスファターゼ症)、HPPと関連した発作、低リン血症性くる病、不完全な骨石灰化、ヤッフェ-リヒテンシュタイン症候群、クニースト異形成症、クニースト症候群、ランガー型中脚異形成症、マルファン症候群、マッキューン-オルブライト症候群、小肢症、骨幹端異形成(例えば、ヤンセン型骨幹端異形成症)、変容性骨異形成症、モルキオ症候群、ニーバージェルト型中脚異形成症、神経線維腫症(例えば、1型、例えば、骨病変を伴う又は骨病変を伴わない;2型;神経鞘腫症)、変形性関節症、骨軟骨異形成症、骨形成不全症(例えば、周産期致死型の骨形成不全症)、骨軟化症、大理石骨病、骨斑紋症、骨軟化症、末梢骨形成不全症、ラインハルト症候群、ロバーツ症候群、ルビノー症候群、ショートリブ多指症症候群、低身長、先天性脊椎-骨端骨異形成症、脊椎骨端骨幹端異形成症、又は致死性骨異形成症が挙げられる。骨又は軟骨障害はまた、例えば、低ホスファターゼ症(例えば、無機ピロリン酸(PPi)、ホスホエタノールアミン(PEA)、及び/又はピリドキサール5'-リン酸(PLP)レベルの上昇)に関連した1つ以上の臨床マーカーの血中及び/又は尿中レベルの上昇、長骨(例えば、大腿骨、脛骨、上腕骨、橈骨、尺骨)の長さの減少を伴う発育遅延、全骨の平均密度の減少、又は大腿骨、脛骨、肋骨、中足骨、及び指骨などの骨における骨の石灰化の減少によって診断され得るものを含む。そのように限定されることなしに、骨又は軟骨障害の治療は、以下:長骨の長さの増加、骨及び/又は歯における石灰化の増加、脚の曲がりの修正、骨痛の低減、及び関節におけるCPPD結晶沈着の減少の1つ以上によって観察されてもよい。

骨格異形成症
骨格異形成症は、低身長または矮小発育により特徴付けられる骨障害または軟骨障害である。骨格異形成症は、典型的には、先天性であり、低身長のほかに、多くの異常、たとえば、短肢および短体幹、内反膝、動揺性歩行、頭蓋奇形、たとえば、大頭、クローバー葉頭蓋、頭蓋骨癒合（頭蓋骨の早期融合）、もしくはウォルム骨（頭蓋骨間の異常糸状結合）、手および足の異常、たとえば、多指（余分の指）、「ヒッチハイカー」母指、ならびに異常な指の爪および足の爪、または胸部異常、たとえば、洋ナシ形胸部もしくは細状胸郭を含みうる。また、骨格異形成症を有する者には、非骨格異常、たとえば、先天白内障、近視、口蓋裂、もしくは難聴などの眼、口、および耳の異常、水頭、孔脳、水無脳、もしくは脳梁欠損などの脳奇形、心房中隔欠損、動脈管開存、もしくは大血管転位などの心臓欠陥、発達遅延、または精神遅滞も存在しうる。ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる骨格異形成症は、軟骨無形成症を含む。

骨格異形成症は、軟骨無形成症（たとえば、ホモ接合またはヘテロ接合軟骨無形成症）、軟骨無発生症、先端異骨症、遠位中位肢異形成症、骨形成不全症、屈曲肢異形成症、点状軟骨異形成症（たとえば、近位肢型点状軟骨異形成症）、鎖骨頭蓋異骨症、先天性大腿骨短縮症、頭蓋骨癒合症(例えばムエンケ症候群、クルゾン症候群、アペール症候群、ジャクソン−ワイス症候群、ファイファー症候群、またはクルーゾン皮膚骨格症候群)、指症（たとえば、短指症、屈指症、多指症、または合指症）、捻曲性骨異形成症、矮小発育症、分節異常骨異形成症、内軟骨腫症、繊維軟骨形成症、繊維性骨異形成症、遺伝性多発性外骨腫症、軟骨低形成症、低ホスファターゼ血症(HPP)(例えば幼児HPP、小児HPP、周産期HPP、成人HPP、または象牙低ホスファターゼ血症)、低リン血症性くる病、ヤッフェ・リヒテンシュタイン症候群、クニースト骨異形成症、クニースト症候群、ランガー型中位肢異形成症、マルファン症候群、マッキューン・オルブライト症候群、小肢症、骨幹端異形成症（たとえば、ヤンセン型骨幹端異形成症）、変容性骨異形成症、モルキオ症候群、ニーベルゲルト型中位肢異形成症、神経繊維腫症（たとえば、１型、たとえば、骨病変併発型もしくは骨病変非併発型、２型、または神経鞘腫症）、骨関節炎、骨軟骨異形成症、骨形成不全症（たとえば、周産期致死型骨形成不全症）、骨化石症、骨斑紋症、末梢骨形成不全症、ラインハルト症候群、ロバーツ症候群、ロビノー症候群、短肋骨多指症候群、低身長症、先天性脊椎骨端異形成症、脊椎骨端骨幹端異形成症または致死性骨異形成症を含む。

特に、いくつかの形態の頭蓋骨癒合症は、ＭＡＰＫ経路の活性化を引き起こす繊維芽細胞増殖因子レセプター（たとえば、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、またはＦＧＦＲ３の１つ以上）の１つの突然変異の結果である。このことは、たとえば、ムエンケ症候群（ムエンケ冠状頭蓋骨癒合症）、クルーゾン症候群、アペール症候群、ジャクソン・ワイス症候群、ファイファー症候群、およびクルーゾン皮膚骨格症候群の場合にあてはまる。ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１／２）の活性化を予防可能な作用剤は、動物モデルで頭蓋骨癒合症を予防可能であるという遺伝的および生化学的証拠が科学文献に存在する。特定的には、ＥＲＫ１／２の活性化を予防するＭＥＫ１／２阻害剤（たとえば、Ｕ０１２６）の使用により、アペール症候群の動物モデルで頭蓋骨癒合症を予防可能である（Ｓｈｕｋｌａｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３９：１１４５，２００７）。したがって、ＭＡＰキナーゼ経路の活性化を予防可能な本発明に係る化合物は、これらの形態の頭蓋骨癒合症を治療すべく使用可能である。

軟骨無形成症
軟骨無形成症は、ヒトにおいて矮小発育症の最も一般的な原因となる常染色体優性骨格異形成症である。その発生頻度は、生児出生２０，０００例中約１例である。骨格病変は、成長遅延（平均成人身長１２３〜１３１ｃｍ（４フィート１／２インチ〜４フィート３・１／２インチ））、頭蓋変形、および歯科矯正学的欠陥を含む。骨外性病変は、頸髄圧迫（たとえば、中枢性無呼吸または発作が原因で、死の危険を伴う）、脊柱管狭窄（たとえば、下肢痛および腰痛）、水頭（たとえば、脳シャント手術を必要とするもの）、慢性耳炎起因性聴力損失、心血管疾患、神経疾患、より高頻度の偶発症候、および肥満を含む。

乳児は、出生時に診断されることが多い。ホモ接合型は、通常、致死的であるが、ヘテロ接合型と診断された者は、正常者よりも平均で１５年間短い余命を有する。

本明細書で説明した組成物および方法を用いて、ヘテロ接合もしくはホモ接合軟骨無形成症またはその病変もしくは表現型のいずれかを治療することが可能である。いずれの型の治療も、患者の生涯のできるだけ早い時期に、たとえば、出生直後に、さらには子宮内で、開始可能であり、このことは、典型的にはかなり重篤で治療しなければ致死的であることが多いホモ接合型の治療にとくに重要である。

低ホスファターゼ血症(HPP)
HPPはマトリックス無機化障害であり、歴史的には診断時の年齢に応じて分類され、これには(最も重症から最も軽傷まで順に)周産期、幼児期、小児期、成人および象牙低ホスファターゼの形態がある。最も重度の形態である周産期（致死性）HPPは子宮内での骨石灰化（骨無機化）のほとんど完全な不在により顕在化し、死産をもたらしうる。周産期HPPの一部の新生児は数日生存することがあるが、胸の形成不全およびくる病疾患に起因して増大した呼吸困難を罹患する。幼児期HPPは生後６月前に診断され、出産後の発達は食欲不振、不十分な体重増加、およびくる病の出現までは正常にみえる。幼児HPPは特徴的な放射線学的特徴を示し、損なわれた骨格無機化を示し、ときには進行性の骨格脱無機化を伴いこれは肋骨骨折や胸郭奇形をもたらす。小児HPPは高度に変動する臨床発現を示す。小児HPPの症状の１つは、乳歯の早期喪失であり、これは歯根を歯周靱帯に連結する歯のセメント質の無形性、形成不全、または異形性に起因するものである。小児HPPの別の症状はくる病であり、これは広がった骨幹端に起因する低身長症と骨格変形、例えばO脚および手首、膝および踝の拡大を生じる。成人HPPは通常、中年に顕れるが、多くの場合、これに先行して、くる病および／または歯の早期喪失の病歴とそれに続く思春期および若年成人期における良好な健康状態がある。成人HPPでは、再発性の中足骨疲労骨折はよく見られ、ピロリン酸カルシウム二水和物結晶沈着症は関節炎およびピロリン酸関節症の発作をもたらしうる。最後に、象牙低ホスファターゼ血症は、唯一の臨床異常が歯の疾患であるときかつ放射線学的検査および骨生検がくる病および骨軟化症の兆候を全く示さないときに診断される。

HPPのより重度の臨床形態は通常、常染色体劣性の形質として遺伝子し、かかる患者の親は血清AP活性のレベルが正常未満である。HPPのより軽度の形態、つなわち成人HPPと象牙低ホスファターゼ血症では、常染色体優性の遺伝が確認された。

健康な骨格では、TNALPは骨芽細胞および軟骨細胞の原形質膜およびその脱落した基質小胞（MV）の膜の表面上に存在する外酵素であり、そこでは当該酵素は特に富化されている。骨石灰化（無機化）におけるヒドロキシアパタイトの沈着は通常、こうしたMVの内腔で開始される。電子顕微鏡法は、重症のHPP患者およびAkp2^-/-マウス(TNALP無効化マウスモデル、下記参照)からのTNALP欠損MVが、ヒドロキシアパタイト結晶を含むが小胞外結晶増殖は見かけ上停滞していることを示す。この障害はTNALP活性の欠損に起因するPPi（石灰化の強力な阻害剤）の細胞外蓄積に帰せられる。

生理学的な濃度(0.01-0.1 mM)では、PPiは無機化を刺激する能力を有する。これは臓器培養された鶏大腿部および単離されたラットMVで実証された。しかしながら、1 mMより高い濃度では、PPiはヒドロキシアパタイト結晶をコーティングすることによりリン酸カルシウム無機物形成を阻害し、したがって無機物結晶成長及び増殖的な自己核生成を妨げる。したがって、PPiは二重の生理学的な役割を果たす。PPiは低濃度では無機化のプロモーター（促進因子）として機能するが、高濃度では無機化の阻害剤として機能する。TNALPは無機化阻害剤PPiを加水分解し無機物沈着と成長を促進することが示されている。Akp2^-/-マウスを用いた最近の研究は、生体内でのTNALPの主要な役割が、細胞外PPiプールのサイズを制限して正常な骨無機化を可能にすることであることを示した。

低ホスファターゼ血症の重症度は、TNALP突然変異の性質に依る。酵素の活性部位近傍、ホモダイマー界面、クラウンドメイン、アミノ末端腕およびカルシウム結合部位を含む、TNALPの種々の位置におけるミスセンス突然変異はいずれも、その触媒活性に影響を及ぼすことが見出された。さらに、ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、およびスプライス突然変異もまた、異常な突然変異タンパク質または細胞内トラフィック欠陥をもたらすことが示されており、これは細胞表面の正常未満の活性をもたらす。HPPを引き起こす突然変異の数の多さと、複合ヘテロ接合性がHPPでは頻繁に生じるという事実は、変動する発現性と、この疾患に多くの場合に観察される不完全な浸透度を説明する。

HPPのヒト形態に関する進歩は、HPP の動物モデルであるTNALPヌルマウス(Akp2^-/-)の存在の恩恵を多大に受けてきた。Akp2^-/-マウスは幼児性HPPを驚くほどよく表現型模写（フェノコピー）する。Akp2^-/-マウスは正常に無機化された骨格をもって生まれるが、Ｘ線写真上明確なくる病を約6日齢で発症し、重症の骨格低無機化（低石灰化）とPLP(ビタミンB6)代謝の撹乱に起因する無呼吸およびてんかん発作の発現を罹患して12-16日の間に亡くなる。

PPiとPLPの両方は確認されたTNALPの天然の基質であり、一部のTNALP活性部位突然変異は、該酵素がPPiおよびPLPを代謝する能力に異なる影響を及ぼすことが示された。PLP代謝における異常は、Akp2^-/-マウスに観察されるてんかん発作を説明し、PPi代謝における異常は、このHPPマウスモデルの骨格表現型を説明する。

本発明のいずれの方法においても、本明細書に記載する医薬組成物は場合によりHPP関連発作、乳歯の早期喪失、不完全な骨無機化、血中および／または尿中のPPiレベルの上昇、血中および／または尿中のPEAレベルの上昇、血中および／または尿中のPLPレベルの上昇、不十分な体重増加、くる病、骨痛、ピロリン酸カルシウム二水和物結晶沈着、ならびに歯のセメント質の形成不全、低形成、および異形成、からなる群より選択されるHPP表現型を治療するのに治療上有効な量で投与される。一部の実施形態では、不完全な骨無機化は、不完全な大腿骨無機化、不完全な脛骨無機化、不完全は中足骨無機化、または不完全な肋骨無機化である。

血管平滑筋障害
本明細書で説明したポリペプチドおよび核酸分子は、血管平滑筋の機能、構造、または成長に影響を及ぼす任意の障害、疾患、または他の異常を治療すべく使用可能である。例えばナトリウム利尿ペプチドは体における塩分および水分の恒常性をモジュレートし、これらを介して、血圧の調節因子として作用する。このファミリーに属するペプチドは、さまざまなアミノ酸配列を有し、体の様々な組織により異なる機構を介して分泌される。例えばANPは心臓（心房筋細胞）の上方の房（心房）における筋細胞により放出され、血管拡張物質として作用する；BNPは心臓負荷に応答して心臓の下方の室（心室）から分泌される；そしてCNPはナトリウム排出およびナトリウム利尿作用を発揮して血管緊張を調節し、血管平滑筋細胞の移動と増殖を阻害する。したがって本発明のポリペプチドおよび組成物は平滑筋細胞障害の治療に使用することができる。例示的血管平滑筋障害は、高血圧症、再狭窄症、動脈硬化症、急性非代償性心不全、鬱血性心不全、心性浮腫、腎性浮腫、肝性浮腫、急性腎不全、および慢性腎不全である。

骨の伸長に適した病態
骨の伸長が奏効すると思われる任意の病態、障害、疾患、または他の異常は、本明細書で説明した組成物および方法を用いて治療可能である。これらの病態、障害、疾患、および他の異常は、骨折、腎障害もしくは腎不全、粗食、ビタミン欠乏症、またはホルモン欠乏症に起因する不十分なまたは損なわれた骨成長を含むが、これらに限定されるものではない。また、本明細書で説明した組成物および方法を用いて、たとえば、美容目的で、健常被験体、たとえば、骨または軟骨に関連付けられるいかなる病態、障害、疾患、または他の異常もない被験体を治療することが可能である。

骨格異形成症はまた、長骨の短縮分節にも関連付けられる。例示的骨格異形成症は、近位肢短縮症（または肢の近位分節、たとえば、上腕骨または大腿骨の短縮）、たとえば、軟骨無形成症、骨形成不全症、先天性大腿骨短縮症、捻曲性骨異形成症、軟骨低形成症、ヤンセン型骨幹端異形成症、近位肢型点状軟骨異形成症、先天性脊椎骨端異形成症、および致死性骨異形成症、中位肢短縮症（または肢の中位分節、たとえば、橈骨、尺骨、脛骨、または腓骨の短縮）、たとえば、ランガー型およびニーベルゲルト型の中位肢異形成症、ロビノー症候群、およびラインハルト症候群、先端異骨症および末梢骨形成不全症などの遠位肢短縮症（または肢の遠位分節、たとえば、中手骨または指骨の短縮）、遠位中位肢短縮症（または肢の中位分節および遠位分節、たとえば、前腕および手の短縮）、たとえば、遠位中位肢異形成症、小肢症（または全肢の短縮）、たとえば、軟骨無発生症、繊維軟骨形成症、分節異常骨異形成症、クニースト骨異形成症、およびロバーツ症候群、または短体幹症、たとえば、ディグヴー・メキオー・クローセン疾患、クニースト症候群、変容性骨異形成症、モルキオ症候群、脊椎骨端骨幹端異形成症、および先天性脊椎骨端異形成症に関連付けられるものを含む。

組合せ療法
本発明のポリペプチドの組合せ(例えばsALPポリペプチドとNPポリペプチドの組合せ、例えばsALP融合タンパク質とNP融合タンパク質の組合せ)は本明細書に記載の任意の疾患または症状の治療に有用である。治療は単独でまたは他の治療(例えば外科手術、放射線療法、免疫療法または遺伝子治療)と併せて行うことができる。さらに、
本明細書に記載の疾患を発症するリスクの高い個体(例えば神経皮膚症候群を以前に有していたかまたは神経皮膚症候群を罹患する遺伝的傾向を有する者)は疾患形成を阻止または遅延させるために予防的な処置を受けうる。併用療法の継続期間は、処置されている疾患又は症状の種類、患者の年齢と症状、患者の疾患のステージと種類、および患者が治療にどのように応答するかに応じて変化する。治療は休息期間を含むオンおよびオフ周期で行ってもよおく、これにより患者の体は未だに予見されない何らかの副作用から回復する機会がある。

本発明のポリペプチドの組合せ(例えばsALPポリペプチドとNPポリペプチドの組合せ)の投与は、各ポリペプチドのより低い用量の投与を可能とし、いずれかのポリペプチドを単独で投与した場合と比較して同様の効果とより低い毒性をもたらす。あるいは、かかる組合せは、本明細書に記載の疾患(例えば神経皮膚症候群、例えば神経線維腫症)の治療において、単一薬剤のみと比較して、中程度または高用量で、同様のまたは不利なイベントの低減とともに、改善された効力をもたらす。

製剤
製剤は、投与経路さらには他の治療目標に依存するであろう。本明細書で説明したポリペプチドおよび核酸分子は、当技術分野で公知の任意の経路により、たとえば、皮下（たとえば、皮下注射により）、静脈内、経口的、経鼻的、筋肉内、舌下、髄腔内、または皮内に投与可能である。例として、本発明に係る医薬組成物は、液体剤、溶液剤、サスペンジョン剤、丸剤、カプセル剤、錠剤、ゲルキャップ剤、粉末剤、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、ネブラ剤、ミスト剤、アトマイズ蒸気剤、エアロゾル剤、またはフィトソーム剤の形態をとりうる。

本発明のいくつかの実施形態では、本発明に係る組成物は、皮下投与可能である。比較的非侵襲性でありかつ望ましい薬動学的プロファイルを呈するので、皮下投与は有利である。好適な量は、当業者に公知であり、典型的には、５ｍＬ以下（たとえば、４ｍＬ、３．５ｍＬ、３ｍＬ、２．７ｍＬ、２．５ｍＬ、２．３ｍＬ、２．２ｍＬ、２．１ｍＬ、２．０ｍＬ、１．９ｍＬ、１．８ｍＬ、１．７ｍＬ、１．５ｍＬ、１．３ｍＬ、１．０ｍＬ、０．７ｍＬ、０．５ｍＬ、０．３ｍＬ、０．１ｍＬ、０．０５ｍＬ、０．０１ｍＬ、またはそれ以下）である。典型的には、本発明に係る組成物は、皮下投与に供する場合１ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬ（たとえば、１０ｍｇ／ｍＬ〜３００ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ〜１２０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ〜１５０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ〜８０ｍｇ／ｍＬ、または６０ｍｇ／ｍＬ〜７０ｍｇ／ｍＬ）の濃度で製剤化可能である。

経口投与に供する場合、錠剤またはカプセル剤は、結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤、または湿潤剤などの製薬上許容される賦形剤と共に従来の手段により調製可能である。錠剤は、当技術分野で公知の方法によりコーティング可能である。経口投与に供される液状製剤は、たとえば、溶液剤、シロップ剤、またはサスペンジョン剤の形態をとることが可能であり、または使用前に生理食塩水もしくは他の好適な液状媒体を用いて構成すべく乾燥製剤として提供可能である。経口投与に供される本発明に係る組成物はまた、必要に応じて、懸濁化剤、乳化剤、非水性媒体、保存剤、緩衝塩、風味剤、着色剤、および甘味剤などの製薬上許容される賦形剤を含有可能である。経口投与に供される製剤はまた、好適には、活性成分の制御放出を行うべく製剤化可能である。

さらに、強酸性胃液との長時間接触には耐えるが、弱酸性または中性の腸内環境では溶解するように、腸溶コーティングを本発明に係る錠剤で使用することが可能である。そのように限定されるものではないが、本発明に係る医薬組成物の腸溶コーティングでは、セルロースアセテートフタレート、Ｅｕｄｒａｇｉｔ^ＴＭ、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）を使用することが可能である。一般に使用されるセルロースアセテートフタレート濃度は、コア重量の０．５〜９．０％である。可塑剤の添加により、このコーティング材料の耐水性が向上し、そのような可塑剤を用いた製剤は、セルロースアセテートフタレートが単独で使用された場合よりも効果的である。セルロースアセテートフタレートは、アセチル化モノグリセリド、ブチルフタリルブチルグリコレート、ジブチルタルトレート、ジエチルフタレート、ジメチルフタレート、エチルフタリルエチルグリコレート、グリセリン、プロピレングリコール、トリアセチン、トリアセチンシトレート、およびトリプロピオニンをはじめとする多くの可塑剤と相溶可能である。また、薬剤制御放出製剤では、エチルセルロースなどの他のコーティング剤と組み合わせて使用される。

本発明に係る化合物は、製薬上許容される無菌の水性または非水性の溶媒、サスペンジョン、またはエマルジョンと組み合わせて、投与可能である。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、魚油、および注射可能な有機エステルである。水性担体は、水溶液、水アルコール溶液、エマルジョン、またはサスペンジョン、たとえば、生理食塩水、および緩衝化医療用非経口媒体、たとえば、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース溶液、デキストロース＋塩化ナトリウム溶液、ラクトース含有リンゲル溶液、または固定油を含む。静脈内投与媒体は、流体・栄養補液、電解質補液、たとえば、リンゲルデキストロース系補液などを含みうる。

いくつかの実施形態では、本発明に係る医薬組成物は、制御放出系で送達可能である。いくつかの実施形態では、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、架橋両親媒性ブロックコポリマーおよびヒドロゲル、ポリヒドロキシ酪酸、ならびにポリジヒドロピランをはじめとする高分子材料を使用することが可能である（ＳｍｏｌｅｎａｎｄＢａｌｌ，ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＤｒｕｇＢｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇｐｒｏｄｕｃｔｄｅｓｉｇｎａｎｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，１９８４，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＲａｎａｄｅａｎｄＨｏｌｌｉｎｇｅｒ，ＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ，ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙａｎｄｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙｓｅｒｉｅｓ，２００３，２^ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＲＣＰｒｅｓｓをも参照されたい）。他の実施形態では、ポンプを使用することが可能である（Ｓａｕｄｅｋｅｔａｌ．，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４）。

本発明に係る組成物は、希釈剤として適切な賦形剤溶液（たとえばスクロース溶液）を用いて、凍結乾燥粉末の形態で製剤化可能である。

さらに、神経皮膚症候群、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、たとえば、軟骨無形成症、骨障害もしくは軟骨障害、または血管平滑筋障害を有する者、または骨伸長が奏効すると思われる者から、細胞を単離し、本発明に係る核酸でトランスフォームし、そして罹患者（たとえば、皮下注射または静脈内注射）に再導入することが可能である。他の選択肢として、たとえば注射により、核酸を罹患者に直接投与することが可能である。また、特定の細胞型にターゲッティングされるように設計可能であるかつさまざまな経路を介して投与されるように工学操作可能であるリポソームなどの媒体を介して、核酸を送達することも可能である。

本発明に係るポリペプチドまたは組成物はまた、たとえば軟骨無形成症表現型、神経線維腫症、HPPまたは本明細書に記載の任意の他の疾患又は症状を修正すべく、少なくとも１つの他の活性成分と組み合わせて使用することも可能である。

組合せ療法については、本発明の２以上のポリペプチド(例えばsALPポリペプチドおよびNPポリペプチド)は、当技術分野で公知の種々の方法により製剤化される。例えば第１および第２のポリペプチドは一緒にまたは別々に製剤化されうる。一部の実施形態では、第１および第２のポリペプチドは、該ポリペプチドの同時投与のためにまたはほぼ同時投与のために一緒に製剤化される。かかる共製剤化された組成物は、同じピル、カプセル、液剤など中に製剤化されたsALPポリペプチドおよびNPポリペプチドを含みうる。

制御放出製剤での各化合物の投与は、sALPポリペプチドまたはNPポリペプチドが、(i) 治療係数が低い(例えば有害な副作用または毒性反応をもたらす血漿濃度と、治療効果をもたらす血漿濃度の違いが小さい；一般に治療係数TIは中央致死用量(LD50)と中央効果的用量(ED50)との比として定義される); (ii) 胃腸管における吸収ウィンドウが狭い; (iii) 生物学的半減期が短い、例えばNEPおよび／またはIDEによる生体内での分解により半減期が短い; あるいは(iv)各成分の薬物動態プロファイルを新生物の各薬剤への曝露を最大化するように、一緒に、すなわち治療的に有効であるように改変しなければならないである場合に有用である。したがって両方の薬剤の血漿レベルを治療レベルに保つために必要となる頻繁な投与を回避するために、持続放出製剤を用いることができる。

治療ポリペプチドの放出の速度が代謝の速度に勝る制御放出を得るために、種々の戦略を用いることができる。例えば制御放出は製剤化パラメーターおよび成分の適切な選択(例えば適当な制御放出組成物およびコーティング)により達成することができる。例としては、単一または複数単位錠剤またはカプセル組成物、油溶液剤、懸濁液剤、エマルション、マイクロカプセル、マイクロスフェア、ナノ粒子、パッチおよびリポソームが挙げられる。制御放出メカニズムはALPポリペプチド化合物が最初に放出され、次いでNPポリペプチドが放出されるというものであってもよく、またはその逆順であってもよい。放出メカニズムはまた、２種のポリペプチドが定期的な間隔で放出されるように制御されてもよく、特定の薬剤の放出が他方の放出よりも優先される場合には、同時または一方の遅延された放出であってもよい。

制御放出製剤は、分解可能なまたは分解不可能なポリマー、ヒドロゲル、有機ゲル、または薬剤の生体吸収、半減期または生物分解を改変する他の物理的構築物を含みうる。制御放出製剤は、塗布される、または罹患部位に外部的にもしくは内部的に適用される材料であり得る。ある例では、ヒドロゲル、例えば米国特許第5,626,863号に記載されているものを、本発明の組成物の制御放出製剤に用いることができる。こうした生物分解性ポリマーは、適当なモノマー、調製方法および分子量を選択することにより、所望の速度で分解するように調整することができる。モノマーの結晶化度における違いは分解速度を変更し得る。ほとんどのポリマーの相対的に疎水性の性質に起因して、実際の質量喪失が開始され得るのはオリゴマー断片が水溶性となりうる程度に十分に小さいときであり、したがって初期の分子量さえも分解速度に影響を及ぼしうる。

個々にまたは別々に製剤化されたポリペプチドは、一緒にキットにパッケージ化することができる。非限定的な例としては、例え２つのピル、１つのピルと１つの散剤、坐剤とバイアル中の液体、２つの塗り薬などを有するキットが挙げられる。キットは、患者への単位用量の投与を補助する任意的追加成分、例えば散剤の再構成のためのバイアル、注射または皮下投与のためのシリンジ、カスタム化されたIV送達システム、吸入器などを含みうる。さらに、単位投与キットは、組成物の調製と投与のための説明書を含みうる。キットは、一人の被験体用の単回使用単位用量、特定の被験体のための複数使用のためのもの(一定用量でまたは治療が進行するにつれて個々にポリペプチドの効力が変動しうる)として製造されてもよく、あるいはキットは複数の被験体への投与に適した複数用量を含みうる（「バルクパッケージ化」）。キットの構成要素は、カートン、ブリスターパック、ボトル、チューブなどとしてアセンブリすることができる。

遺伝子療法
本明細書で説明したポリペプチドはまた、タンパク質をコードする外因性核酸が対象の組織に送達されてｉｎｖｉｖｏで発現される遺伝子療法を介して、有利に送達可能である。遺伝子療法は、たとえば、Ｖｅｒｍｅｅｔａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ３８９：２３９−２４２，１９９７）、Ｙａｍａｍｏｔｏｅｔａｌ．（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ１７：Ｓ６７−Ｓ６８，２００９）、およびＹａｍａｍｏｔｏｅｔａｌ．，（Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２６：１３５−１４２，２０１１）（それらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる）で考察されている。ウイルスおよび非ウイルスの両方のベクター系を使用することが可能である。ベクターは、たとえば、複製起点と、場合により、ウイルスポリペプチドをコードする核酸を発現させるためのプロモーターと、場合により、プロモーターのレギュレーターと、を備えた、プラスミドベクター、人工染色体ベクター（たとえば、細菌、哺乳動物、または酵母の人工染色体）、ウイルスベクター、またはファージベクターでありうる。ベクターは、１つ以上の選択性マーカー遺伝子、たとえば、細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性もしくはカナマイシン耐性の遺伝子、または菌類ベクター用の耐性遺伝子を含有しうる。ベクターは、たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはウイルスポリペプチドを産生するために、ｉｎｖｉｔｒｏで使用可能であり、またはたとえば、ベクターによりコードされるウイルスポリペプチドを産生するために、宿主細胞たとえば哺乳動物宿主細胞をトランスフェクトもしくはトランスフォームすべく使用可能である。ベクターはまた、ｉｎｖｉｖｏで、たとえば、ワクチン接種法または遺伝子療法で使用すべく適合化可能である。

好適なウイルスベクターの例は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスを含む）、アルファウイルス、ポックスウイルス（たとえばカナリアポックス）、およびワクシニアウイルスに基づく系を含む。これらのウイルスを用いた遺伝子移入技術は、当技術分野で公知である。たとえば、レトロウイルスベクターは、本発明に係る核酸を宿主ゲノム中に安定に組み込むべく使用可能である。これとは対照的に、複製欠損アデノウイルスベクターは、エピソーム性を維持するので、一過性発現を可能にする。昆虫細胞中（たとえば、バキュロウイルスベクター）、ヒト細胞中、酵母中、または細菌中で発現を駆動可能なベクターは、たとえば、サブユニットワクチンでまたはイムノアッセイで使用するために、本発明に係る核酸によりコードされるウイルスポリペプチドを多量に産生すべく利用可能にする。有用な遺伝子療法は、タンパク質産生細胞としての肝細胞に対象の核酸をターゲッティングすべくアデノウイルスベクターを使用する、国際公開第０６／０６０６４１号パンフレット、米国特許第７，１７９，９０３号明細書、および国際公開第０１／３６６２０号パンフレット（それらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものを含む。

さらなる例では、複製欠損サルアデノウイルスベクターを生ベクターとして使用することが可能である。このウイルスは、Ｅ１欠失を含有し、Ｅ１遺伝子でトランスフォームされた細胞系で増殖させることが可能である。この複製欠損サルアデノウイルスベクターの例は、米国特許第６，０８３，７１６号明細書および国際公開第０３／０４６１２４号パンフレット（それらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。このベクターは、コードウイルスポリペプチドが発現されうるように、本発明に係る核酸を挿入すべく操作可能である。

プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、発現が設計される宿主細胞に適合しうるように選択可能である。たとえば、哺乳動物プロモーターは、カドミウムなどの重金属に応答して誘導可能なメタロチオネインプロモーターおよびβ−アクチンプロモーターを含む。ウイルスプロモーター、たとえば、ＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期（１Ｅ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルスプロモーター、またはＨＰＶプロモーター、特定的には、ＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）を使用することが可能である。すべてのこれらのプロモーター、さらには追加のプロモーターは、当技術分野で十分に説明されている。

本明細書で説明した核酸分子はまた、非ウイルスに基づく系を用いて投与することも可能である。たとえば、これらの投与系は、マイクロスフェアカプセル化、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ナノ粒子、およびリポソームに基づく系を含む。また、非ウイルスに基づく系は、「裸の」ポリヌクレオチドの送達を促進する技術（たとえば、電気穿孔、「遺伝子銃」送達、およびポリヌクレオチドの導入に使用された種々の他の技術）も含む。

導入されたポリヌクレオチドは、安定的または一過的に宿主細胞内に維持可能である。安定な維持は、典型的には、導入されたポリヌクレオチドが、宿主細胞に適合可能な複製起点を含有するか、あるいは染色体外レプリコン（たとえばプラスミド）または核染色体もしくはミトコンドリア染色体などの宿主細胞のレプリコン中に組み込まれるか、のいずれかを必要とする。

投与量
任意の量の本発明に係るポリペプチドまたは医薬組成物を被験体に投与することが可能である。投与量は、投与形態および被験体の年齢をはじめとする多くの因子に依存するであろう。典型的には、単回用量に含有される本発明に係る組成物の量は、有意な毒性を誘導することなく、神経皮膚症候群、ＦＧＦＲ３の過剰活性化に関連付けられる障害、骨障害もしくは軟骨障害、または血管平滑筋障害を治療するのに、または骨を伸長させるのに、有効な量であろう。たとえば、本明細書で説明したポリペプチドは、たとえば、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ（たとえば、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、もしくは２．０ｍｇ／ｋｇ〜３．０ｍｇ／ｋｇ）、または１μｇ／ｋｇ〜１，０００μｇ／ｋｇ（たとえば、５μｇ／ｋｇ〜１，０００μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜７５０μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ〜７５０μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜７５０μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇ、もしくは１０μｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇ）の範囲内の個別用量で被験体に投与可能である。例示的用量は、たとえば、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、２．５、５、１０、２０、２５、５０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、もしくは５００ｍｇ／ｋｇ、または１、２、２．５、５、１０、２０、２５、５０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、５００、７５０、９００、もしくは１，０００μｇ／ｋｇを含む。本明細書に挙げられたすべての投与量または範囲に対して、「約」という用語は、これらの投与量を記載値または範囲終点の±１０％だけ変更すべく使用可能である。

用量はまた本発明の２以上のポリペプチドまたは組成物が投与されるときに調節することができる。例示的な用量としては、sALPポリペプチド(例えばsALP融合タンパク質)が約0.2 mg/kg〜約20 mg/kgの用量で存在し、NPポリペプチド (例えばNP融合タンパク質)が約0.5 mg/kg〜約500 mg/kgの用量で存在するという用量が挙げられる。特定の実施形態では、各個別のポリペプチドまたは組成物の用量は、単独で投与される場合における単一ポリペプチドまたは単一組成物の治療的用量よりも低い。

用量は、たとえば、１時間に１回、２時間に１回、毎日１回、２日に１回、毎週２回、毎週３回、毎週４回、毎週５回、毎週６回、毎週１回、２週間に１回、毎月１回、２ヶ月に１回、または毎年１回投与可能である。他の選択肢として、用量は、たとえば、毎日２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、または１２回投与可能である。特定の実施形態では、投与レジメンは、毎週１回である。投与レジメンの継続期間は、たとえば、日数、週数、または月数で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０、さらには被験体の残りの寿命でありうる。投与の量、頻度、および継続期間は、疾患の程度や被験体からのさまざまなパラメーターなどの通常の因子に基づいて、臨床医により適合化されるであろう。

本発明に係る核酸は、本明細書で説明した処方に従って遺伝子療法に好適な投与量で患者に投与可能である。投与される核酸の量は、核酸の長さおよび性質、使用されるベクター（たとえば、ウイルスまたは非ウイルス）、コードされるポリペプチドの活性、賦形剤の存在、投与の経路および方法、ならびに被験体の全身状態および適応能力をはじめとする当業者に公知のいくつかの因子に依存するであろう。例示的な投与量および投与経路は、たとえば、Ｍｅｌｍａｎｅｔａｌ．（Ｉｓｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．Ｊ．９：１４３−１４６，２００７、勃起不全を治療すべくプラスミド中のヒトｃＤＮＡを０．５ｍｇ〜７．５ｍｇで陰茎内注射することが記載されている）、Ｐｏｗｅｌｌｅｔａｌ．（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ１１８：５８−６５，２００８、重症肢虚血を治療すべく肝細胞増殖因子プラスミドを０．４ｍｇ〜４．０ｍｇで筋肉内注射することが記載されている）、Ｗａｄｄｉｌｌｅｔａｌ．（ＡＪＲＡｍ．Ｊ．Ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｌ．１６９：６３−６７，１９９７、黒色腫を治療すべくＭＨＣ抗原をコードするプラスミドＤＮＡを０．０１ｍｇ〜０．２５ｍｇでＣＴガイド下腫瘍内注射することが記載されている）、Ｋａｓｔｒｕｐｅｔａｌ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４５：９８２−９８８，２００５、重症狭心症を治療すべくＶＥＧＦプラスミドを０．５ｍｇで心筋内注射することが記載されている）、およびＲｏｍｅｒｏｅｔａｌ．（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．１５：１０６５−１０７６，２００４、デュシェンヌ／ベッカー筋ジストロフィーを治療すべくプラスミドを０．２ｍｇ〜０．６ｍｇで筋肉内注射することが記載されている）（それらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

特定の実施形態では、本発明に係る核酸は、たとえば、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ（たとえば、０．０５ｍｇ〜５０ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、０．３ｍｇ〜３ｍｇ、または約１ｍｇ）の範囲内の核酸用量で被験体に投与可能である。核酸の投与可能な全量は、その濃度に依存するであろう。また、たとえば、１μＬ〜１０ｍＬ（たとえば、１０μＬ〜１ｍＬ、５０μＬ〜５００μＬ、７０μＬ〜２００μＬ、９０μＬ〜１５０μＬ、または１００μＬ〜１２０μＬ）の範囲内でありうる。

核酸は、たとえば、１時間に１回、２時間に１回、毎日１回、２日に１回、毎週２回、毎週３回、毎週４回、毎週５回、毎週６回、毎週１回、２週間に１回、毎月１回、２ヶ月に１回、または毎年１回投与可能である。他の選択肢として、核酸は、たとえば、毎日２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、または１２回投与可能である。投与レジメンの継続期間は、たとえば、日数、週数、または月数で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０、さらには被験体の残りの寿命でありうる。

実際の用量は、各被験体に特有の臨床因子に基づいて、主治医または栄養士により注意深く選択調整すべきであるので、これらは、ガイドラインである。最適な反復用量は、当技術分野で公知の方法により決定されるであろう。また、以上に示された被験体の年齢などの因子および他の臨床関連因子により影響されるであろう。それに加えて、被験体は、他の疾患または病態に対する投薬を受けることも可能である。他の投薬は、本発明に係るポリペプチドまたは核酸が被験体に投与される期間にわたり継続されるが、そのような場合、有害な副作用を起こすかを調べるために、低用量から始めることが推奨される。

以下の実施例は、本発明を例証する目的で与えられ、いずれの方法においても本発明を限定することを意味しない。

[実施例１]
NF1欠損マウスにおける骨芽細胞の特徴付け
骨マトリックスの石灰化におけるNF1の効果を決定するために、骨軟骨前駆細胞におけるNF1を欠損したマウスを開発し、特徴付けを行った。これらのマウスは、神経線維腫症I型の患者に類似した骨格形成異常欠陥を示した。この場合、これらの欠陥は、進行性の脊柱側弯症及び脊柱後湾曲、脛骨ボーイング、及び頭蓋骨と前胸壁形成の異常を含んだ。特に、NF1_col2 ^-/-骨芽細胞は、野生型マウス由来の骨芽細胞と比較して、レベルが増加した(PP_i)を分泌した(図1A)。成体NF1_col2 ^-/-マウスから抽出され、インビトロにおいて骨形成培地下で増殖させた骨髄付着性間質細胞(BMSC)は、野生型マウスから抽出されたBMSCと比較して、より小さなアルカリホスファターゼ(AP)陽性及びより小さな石灰化(アリザリンレッド陽性)された結節を形成し、これは、24時間にわたって培地中に放出されたPP_i量の増加を伴った。PP_iの蓄積は、適当な骨マトリックスの石灰化を阻止し、おそらくはNF1_col2 ^-/-マウスにおいて観察された欠陥に対して少なくとも部分的に寄与する。従って、PPiの蓄積を低下させる化合物、例えば、sALP又はsALP類似体は、NF1の治療に有用であり得た。

さらに、NF1_col2 ^-/-骨芽細胞は、野生型マウス由来の骨芽細胞と比較して、進行性強直遺伝子(Ank)のレベルが増加したmRNAを発現させた(図1B)。二重特異性のMEK1/MEK2キナーゼ阻害剤(U0126)を用いた処置は、ビヒクルと比較して、NF1_col2 ^-/-骨芽細胞において、Ankのレベルが減少したmRNA発現を与えた。これらの観察されたレベルは、野生型の骨芽細胞と類似していた(図1B、2番目と3番目のバー)。従って、キナーゼ経路を阻害する化合物、例えば、NP又はNP類似体は、NF1の治療に有用であり得た。

まとめると、これらのデータは、sALPポリペプチド単独、NPポリペプチド単独、又はsALPポリペプチドとNPポリペプチドの両方の組み合わせが、神経線維腫症などの骨病変を伴ういずれかの神経皮膚症候群、又は本明細書に記載されるいずれかの他の障害の治療に有用であり得た。

[実施例２]
神経線維腫症の治療のための併用療法
図2は、疾患に寄与する複数の不均衡(例えば、PP_iの増加、又はRAS若しくはERKなどの1つ以上のキナーゼの過剰活性化)を含むことができるNF1_col2 ^-/-マウスにおける欠陥骨マトリックスの石灰化のための仮想的な作業モデルを提供する。理論によって限定されることを望んでいないが、PP_iの蓄積は、可溶性アルカリホスファターゼ(sALP)又はsALP類似体(例えば、配列番号1204のポリペプチド)を含む、本明細書に記載される組成物及び方法のいずれかを使用することによって最小化することができた。さらに、1つ以上のキナーゼの過剰活性化は、NP又はNP類似体を含む、本明細書に記載される組成物及び方法のいずれかを使用することによって制御することができた。本明細書に記載されるように、NPR-B活性化から生じるcGMPの細胞内生成は、MAP-キナーゼ経路を阻害することが知られている。このように、NPR-Bシグナル伝達経路を活性化することができたNP又はNP類似体は、神経線維腫症などの神経皮膚症候群の治療に使用することができる。従って、sALP又はsALP類似体(例えば、sALPポリペプチド)とNP又はNP類似体(例えば、NPポリペプチド)の併用は、このような疾患の治療に特に有用であり得た。

[実施例３]
NF1_col2 ^-/-表現型におけるsTNALP-FcD₁₀のインビトロ及びインビボの効果
NF1表現型におけるsALPポリペプチドの効果を評価するために、NF1_col2 ^-/-マウス由来の骨芽細胞の培養物を、骨形成タンパク質2(BMP2)又はsTNALP-FcD₁₀(配列番号1204)のsALP融合タンパク質のいずれかを用いて処置した。

野生型とNF1_col2 ^-/-の骨芽細胞の両方を、濃度増加させた組換えヒトBMP2(rhBMP2、図3A)を用いて処置した。NF1_col2 ^-/-骨芽細胞において、rhBMP2は、rhBMP2の用量増加に応じたアルカリホスファターゼの存在の増加によって証明されるように、分化欠陥を救済した(図3A、2行目)。しかしながら、カルシウム沈着の欠如(アリザリンレッドS染色の欠如によって示される)によって証明されるように、石灰化の増加は観察されなかった(図3A、4行目)。

対照的に、sTNALP-FcD₁₀による処置は、NF1_col2 ^-/-骨芽細胞に存在する石灰化欠陥を救済した(図3B)。sTNALP-FcD₁₀の用量増加は、用量依存的に石灰沈着の増加をもたらした(図3B下段、図3c)。

さらに、BMSCにおけるNF1遺伝子のインビトロでの標的化欠失は、石灰化の有意な低下をもたらした。これは、少なくとも部分的には、0.5μg/mLのsTNALP-FcD₁₀を用いた処置によって救済された(図3D)。

また、sTNALP-FcD₁₀を用いて、インビボ実験を行った。NF1_col2 ^-/-マウスは、第1日から第18日において、8.2mg/kgのsTNALP-FcD₁₀で処置された。石灰化された骨体積(BV)と全骨体積(TV)の比によって決定されるように、sTNALP-FcD₁₀を用いたマウスの処置は、ビヒクルと比較して(*p<0.5)、NF1_col2 ^-/-マウスにおける骨石灰密度不足を増加させた(図3E)。

従って、本明細書に記載されるsALPポリペプチドは、単独で又は本明細書に記載されるいずれかのポリペプチドと組み合わせて、神経線維腫症、又は骨病変を伴ういずれかの神経皮膚症候群の治療に特に有用であり得た。

[実施例４]
NF1_col2 ^-/-表現型におけるNC2-KGANKKのインビトロ及びインビボの効果
NF1表現型におけるNPポリペプチドの効果を評価するために、NPR-B遺伝子の発現レベルをNF1_col2 ^-/-マウスにおいて評価した(図4A)。NPR-Bは、分化の全ての段階にあるBMSCにおいて発現した。この場合、NF1発現の欠如は、NPR-B発現に影響を及ぼさなかった。

さらなる実験を行った。ここでは、NF1_col2 ^-/-マウス由来の軟骨細胞の培養物は、NC2-KGANKK(配列番号512)のNP融合ポリペプチドで処置された。P0マウス由来の肋骨初代軟骨細胞は、野生型マウスとNF1_col2 ^-/-マウスから入手し、濃度増加させたNC2-KGANKKを用いて30分間処置された。いずれの処置もせずに、リン酸化EFK(p-ERK)のレベルの増加が、野生型軟骨細胞におけるレベルと比較して、NF1_col2 ^-/-軟骨細胞において観察された。NC2-KGANKKによる処置後、p-ERKのレベルの減少がNF1_col2 ^-/-軟骨細胞において観察された。これらの結果は、ERKなどの1つ以上のキナーゼの過剰活性化を阻害するためのNPポリペプチド、例えばNC2-KGANKKの使用を支持する。

インビボ実験も行った。NF1_col2 ^-/-マウスをNC2B(配列番号504)で処置した。処理は、少なくとも部分的に、NF1_col2 ^-/-マウスにおける体長欠陥(図4C)、NF1_col2 ^-/-マウスにおける骨成長欠陥(図4D)、NF1_col2 ^-/-マウスにおける増殖性及び肥大性軟骨ゾーン欠陥(図4E)を救済した。

従って、本明細書に記載されているいずれかのNPポリペプチドは、単独で又は本明細書に記載されているsALPポリペプチドと組み合わせて、神経線維腫症又は骨病変を伴ういずれかの神経皮膚症候群などの、1つ以上のキナーゼの過剰活性化に関連した障害の治療に特に有用であり得た。

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他の実施形態
本明細書に挙げたすべての刊行物、特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、記載された本発明の方法およびシステムの種々の改変およびバリエーションが当業者に明らかとなる。本発明を特定の実施形態との関連で説明してきたが、特許請求の範囲に係る発明がかかる具体的な実施形態に不当に制限されることがあってはならないと理解されなければならない。当業者に自明な、記載された本発明の実施の形態の種々の改変は本発明の範囲内にあることが意図される。

他の実施形態は特許請求の範囲にある。

Claims

対象における神経皮膚症候群を治療する方法であって、
(a)構造A-sALP-Bを含むポリペプチド;及び
(b)製薬上許容される賦形剤
を含む、治療上有効な量の医薬組成物を前記対象に投与することを含み、
sALPは、アルカリホスファターゼの細胞外ドメインであり、
Aは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Bは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
それによって前記対象における前記症候群を治療する、方法。
前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号1204又は1221のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
前記sALPのアミノ酸配列が、配列番号1215のアミノ酸残基23〜508、配列番号1216のアミノ酸残基18〜498、配列番号1218のアミノ酸残基23〜508、若しくは配列番号1219のアミノ酸残基18〜498を含む、又は
前記sALPのアミノ酸配列が、配列番号1215のアミノ酸残基23〜512、配列番号1216のアミノ酸残基18〜502、配列番号1218のアミノ酸残基23〜512、若しくは配列番号1219のアミノ酸残基18〜502からなる、請求項1に記載の方法。
前記sALPのアミノ酸配列が、配列番号1205と少なくとも85%の配列同一性、又は配列番号1205と少なくとも95%の配列同一性、又は配列番号1205と少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1又は3に記載の方法。
前記sALPのアミノ酸配列が、配列番号1205のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなる、請求項4に記載の方法。
A及び/又はBが存在しない、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
A又はBが、結晶化可能断片領域(Fc)を含む、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
前記FcがC_H2ドメイン、C_H3ドメイン、及びヒンジ領域を含む、又は前記Fcが、IgG-1、IgG-2、IgG-3、及びIgG-4からなる群から選択される免疫グロブリンの定常ドメインである、請求項1から7のいずれか1項に記載の方法。
前記Fcのアミノ酸配列が、配列番号401と少なくとも85%の配列同一性、又は配列番号401と少なくとも95%の配列同一性、又は配列番号401と少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の方法。
前記Fcのアミノ酸配列が、配列番号401のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなる、請求項9に記載の方法。
A又はBがI_nを含み、Iはアスパラギン酸又はグルタミン酸を表し、n=10から16である、請求項1から10のいずれか1項に記載の方法。
前記ポリペプチドが、3つの連続したアスパラギン酸又はグルタミン酸残基よりも長いポリアスパラギン酸又はポリグルタミン酸領域を含まない、又は前記ポリペプチドが、2つの連続したアスパラギン酸又はポリグルタミン酸残基よりも長いポリアスパラギン酸又はポリグルタミン酸領域を含まない、請求項1から10のいずれか1項に記載の方法。
前記ポリペプチドが骨標的化部分を含まない、請求項1から10のいずれか1項に記載の方法。
前記ポリペプチドが、構造C-sALP-D-Fc-E又は構造C-Fc-D-sALP-Eを含み、
Cは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Dは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Eは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である、
請求項1から10のいずれか1項に記載の方法。
C及び/又はEが存在しない、請求項14に記載の方法。
前記ポリペプチドは、構造C-sALP-D-Fc-G-I_n-H又は構造C-Fc-D-sALP-G-I_n-Hを含み、
Cは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Dは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Gは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Hは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Iは、アスパラギン酸又はグルタミン酸を表し、n=10から16である、
請求項1から10のいずれか1項に記載の方法。
C及び/又はHが存在しない、請求項16に記載の方法。
Gが2つのアミノ酸残基である、請求項16又は17に記載の方法。
Gがアスパラギン酸-イソロイシンである、請求項18に記載の方法。
Iがアスパラギン酸であり、n=10である、請求項16から19のいずれか1項に記載の方法。
Dが2つのアミノ酸残基である、請求項14から20のいずれか1項に記載の方法。
Dがロイシン-リジンである、請求項21に記載の方法。
前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号1201、1204、1220、又は1221のアミノ酸配列からなる、請求項1から22のいずれか1項に記載の方法。
前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号1204のアミノ酸配列からなる、請求項23に記載の方法。
対象における神経皮膚症候群を治療する方法であって、
(a)構造V-NP-Wを含むポリペプチド、及び
(b) 製薬上許容される賦形剤
を含む治療上有効な量の医薬組成物を前記対象に投与することを含み、
NPは、ナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR-B)のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、
Vは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Wは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
それによって前記対象における前記症候群を治療する、方法。
前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号504、512、530、又は572のアミノ酸配列を含む、請求項25に記載の方法。
前記NPが、構造[N末端伸長]-[短鎖セグメント]-[環ドメイン]-[C末端伸長]を含み、
前記環ドメインは、配列番号6、配列番号30のアミノ酸残基11-27、又は配列番号95のアミノ酸配列を含み、前記N末端伸長、短鎖セグメント、及びC末端伸長のそれぞれは、独立して、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である、請求項25に記載の方法。
前記環ドメインが、配列番号126のアミノ酸残基6〜22を含む、請求項27に記載の方法。
配列番号126の17位のアミノ酸が、Phe、Leu、Ile、Thr、Val、Ala、Ser、Glu、Arg、Tyr、Cys、Pro、又はAspである、請求項28に記載の方法。
前記環ドメインが、配列番号12のアミノ酸配列を含む、請求項27に記載の方法。
前記短鎖セグメント及び前記環ドメインが一緒になって、配列番号4、13〜30、119〜122、126、又は156〜161のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項27から30のいずれか1項に記載の方法。
前記短鎖セグメントのアミノ酸配列が、配列番号4のアミノ酸残基1〜5、2〜5、3〜5、4〜5、若しくは5、配列番号17のアミノ酸残基1〜10、配列番号19のアミノ酸残基1〜5、配列番号20のアミノ酸残基1〜3、配列番号21のアミノ酸残基1〜5、又は配列番号29のアミノ酸残基1〜6からなる、請求項27から31のいずれか1項に記載の方法。
前記N末端伸長のアミノ酸配列が、配列番号11のアミノ酸残基1〜31又は17〜31を含む、請求項27から32のいずれか1項に記載の方法。
前記N末端伸長のアミノ酸配列が、KGANKK(配列番号314)又はKGANQK(配列番号315)を含む、請求項27から32のいずれか1項に記載の方法。
前記N末端伸長、短鎖セグメント、及び環ドメインが一緒になって、配列番号11のアミノ酸配列を含む、請求項27に記載の方法。
前記C末端伸長が、配列番号117若しくは118のアミノ酸配列を含む、又は配列番号101〜116のいずれか1つから選択されるアミノ酸残基23〜37を含む、請求項27から35のいずれか1項に記載の方法。
前記NPのアミノ酸配列が、配列番号4若しくは11、又は配列番号31〜94のいずれか1つのアミノ酸配列、又は少なくとも環ドメインを含むこれらの断片、又は配列番号13〜29、100〜116、119〜125、127〜233、若しくは1001〜1155のいずれか1つのアミノ酸配列からなる、請求項27に記載の方法。
V及び/又はWが存在しない、請求項27から37のいずれか1項に記載の方法。
V又はWが、結晶化可能断片領域(Fc)を含む、請求項27から38のいずれか1項に記載の方法。
前記Fcが、C_H2ドメイン、C_H3ドメイン、及びヒンジ領域を含む、又は前記Fcが、IgG-1、IgG-2、IgG-3、及びIgG-4からなる群から選択される免疫グロブリンの定常ドメインである、請求項39に記載の方法。
前記Fcのアミノ酸配列が、配列番号401と少なくとも85%の配列同一性、又は配列番号401と少なくとも95%の配列同一性、又は配列番号401と少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項40に記載の方法。
前記Fcのアミノ酸配列が、配列番号401のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなる、請求項41に記載の方法。
V又はWが、グリシンリッチ領域を含む、請求項27から42のいずれ1項に記載の方法。
V又はWのアミノ酸配列が、1つ以上のグリシン及び1つ以上のセリンからなる、請求項43に記載の方法。
V又はWのアミノ酸配列が、[(Gly)_m(Ser)]_n(Gly)_p又は(Gly)_p[(Ser)(Gly)_m]_nを含み、m、n、及びpのそれぞれは、独立して、0から20の間である、請求項43又は44に記載の方法。
mが1から6の間にあり、nが1から10の間にあり、pが0から4の間にある、請求項45に記載の方法。
mが4であり、nが1〜6である、請求項46に記載の方法。
m、n、及びpの組み合わせが表2の一列から選択される、又はV若しくはWのアミノ酸配列が配列番号301〜391のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項46に記載の方法。
V又はWが、骨標的化部分を含まない、請求項27から48のいずれか1項に記載の方法。
V又はWが、骨標的化部分を含む、請求項27から48のいずれか1項に記載の方法。
前記骨標的化部分が、6個の連続した酸残基を含む、請求項50に記載の方法。
前記骨標的化部分が、10個の連続した酸残基を含む、請求項51に記載の方法。
前記酸残基が、アスパラギン酸又はグルタミン酸である、請求項51又は52に記載の方法。
前記骨標的化部分が、E₆、E₁₀、D₆、又はD₁₀を含む、請求項53に記載の方法。
V又はWが、カテプシン切断配列を含む、請求項27から54のいずれか1項に記載の方法。
前記カテプシン切断配列が、カテプシンK切断配列を含む、請求項55に記載の方法。
前記カテプシン切断配列が、HGPQG(配列番号374)又はHKLRG(配列番号375)である、請求項55又は56に記載の方法。
前記ポリペプチドが、構造V-NP-Wを含み、
NPは、ナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR-B)のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、
V及びWのそれぞれは、独立して、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
前記NPは、配列番号17〜29、31〜40、42〜94、101〜116、119〜122、128〜161、若しくは163〜233のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、又はV若しくはWは、配列番号304〜313、322〜333、若しくは337〜391のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、
請求項27から57のいずれか1項に記載の方法。
前記ポリペプチドが、構造V-NP又はNP-Wを含み、
NPは、ナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR-B)のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、
V及びWのそれぞれは、独立して、配列番号304〜313、322〜333、又は337〜391のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、
請求項27から57のいずれか1項に記載の方法。
前記ポリペプチドが、構造X-Fc-Y-NP-Z又は構造X-NP-Y-Fc-Zを含み、
NPは、ナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR-B)のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、
X、Y、及びZは、独立して、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である、
請求項27から57のいずれか1項に記載の方法。
Yが、グリシンリッチ領域を含む、請求項60に記載の方法。
Yのアミノ酸配列が、1つ以上のグリシン及び1つ以上のセリンからなる、請求項61に記載の方法。
Yのアミノ酸配列が、[(Gly)_m(Ser)]_n(Gly)_p又は(Gly)_p[(Ser)(Gly)_m]_nを含み、m、n、及びpのそれぞれは、独立して、0から20の間である、請求項62に記載の方法。
Xが存在しない、Zが存在しない、又はXとZがともに存在しない、請求項60から63のいずれか1項に記載の方法。
X、Y、又はZが骨標的化部分を含む、請求項60から64のいずれか1項に記載の方法。
前記骨標的化部分が、6個又は10個の連続した酸残基を含む、請求項65に記載の方法。
前記酸残基が、アスパラギン酸又はグルタミン酸である、請求項66に記載の方法。
前記骨標的化部分が、E₆、E₁₀、D₆、又はD₁₀を含む、請求項65から67のいずれか1項に記載の方法。
X、Y、又はZが、カテプシン切断配列を含む、請求項60から68のいずれか1項に記載の方法。
前記カテプシン切断配列が、カテプシンK切断配列を含む、請求項69に記載の方法。
前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号501〜608のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項25から70のいずれか1項に記載の方法。
前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号502、504、506、512、514、516、530、560、562、564、572、574、576、584、586、588、596、598、600、又は608のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項71に記載の方法。
前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号504、512、530、若しくは572のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなる、請求項72に記載の方法。
前記ポリペプチドが二量体形態である、請求項1から73のいずれか1項に記載の方法。
前記ポリペプチドが、グリコシル化又はペグ化されている、請求項1から74のいずれか1項に記載の方法。
前記医薬組成物が、約0.2mg/kgから約20mg/kgの前記ポリペプチドの投薬量で投与される、請求項1から75のいずれか1項に記載の方法。
前記医薬組成物が、約0.5mg/kgから約500mg/kgの前記ポリペプチドの投薬量で投与される、請求項1から75のいずれか1項に記載の方法。
前記医薬組成物が、約10μg/kgから約1,000μg/kgの前記ポリペプチドの投薬量で投与される、請求項1から75のいずれか1項に記載の方法。
前記医薬組成物が皮下に投与される、請求項1から78のいずれか1項に記載の方法。
前記医薬組成物が、週1回、2回、又は3回投与される、請求項1から79のいずれか1項に記載の方法。
前記対象がヒトである、請求項1から80のいずれか1項に記載の方法。
前記神経皮膚症候群が神経線維腫症I型である、請求項1から81のいずれか1項に記載の方法。
第1のポリペプチドと第2のポリペプチドを含む組成物であって、
a)前記第1のポリペプチドは構造A-sALP-Bを含み、
i)sALPは、アルカリホスファターゼの細胞外ドメインであり、
ii)Aは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
iii)Bは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
b)前記第2のポリペプチドは構造V-NP-Wを含み、
i)NPは、ナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR-B)のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、
ii)Vは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
iii)Wは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である、
組成物。
前記第1のポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号1204又は1221のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号504、512、530、又は572のアミノ酸配列を含む、請求項83に記載の組成物。
前記第1のポリペプチドの前記sALPのアミノ酸配列が、配列番号1215のアミノ酸残基23〜508、配列番号1216のアミノ酸残基18〜498、配列番号1218のアミノ酸残基23〜508、若しくは配列番号1219のアミノ酸残基18〜498を含む、又は
前記第1のポリペプチドの前記sALPのアミノ酸配列が、配列番号1215のアミノ酸残基23〜512、配列番号1216のアミノ酸残基18〜502、配列番号1218のアミノ酸残基23〜512、若しくは配列番号1219のアミノ酸残基18〜502からなる、又は
前記第1のポリペプチドの前記sALPのアミノ酸配列が、配列番号1205と少なくとも85%の配列同一性、又は配列番号1205と少なくとも95%の配列同一性、又は配列番号1205と少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項83に記載の組成物。
前記第1のポリペプチドのA及び/又はBが存在しない、請求項83又は85に記載の組成物。
前記第1のポリペプチドのA又はBが結晶化可能断片領域(Fc)を含む、請求項83から86のいずれか1項に記載の組成物。
前記第1のポリペプチドのA又はBがI_nを含み、Iはアスパラギン酸又はグルタミン酸を表し、n=10から16である、請求項83から87のいずれか1項に記載の組成物。
前記第1のポリペプチドが、構造C-sALP-D-Fc-G-I_n-Hを含み、
Cは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Dは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Gは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Hは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Iは、アスパラギン酸又はグルタミン酸を表し、n=10から16である、
請求項83から88のいずれか1項に記載の組成物。
前記第1のポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号1204のアミノ酸配列を含む、又は該アミノ酸配列からなる、請求項83から89のいずれか1項に記載の組成物。
前記第2のポリペプチドの前記NPが、構造:
[N末端伸長]-[短鎖セグメント]-[環ドメイン]-[C末端伸長]
を含み、前記環ドメインは、配列番号6、配列番号30のアミノ酸残基11〜27、又は配列番号95のアミノ酸配列を含み、前記N末端伸長、短鎖セグメント、及びC末端伸長のそれぞれは、独立して、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である、請求項83から89のいずれか1項に記載の組成物。
前記環ドメインが、配列番号126のアミノ酸残基6〜22を含む、請求項91に記載の組成物。
配列番号126の17位のアミノ酸が、Phe、Leu、Ile、Thr、Val、Ala、Ser、Glu、Arg、Tyr、Cys、Pro、又はAspである、請求項92に記載の組成物。
前記N末端伸長のアミノ酸配列が、配列番号11のアミノ酸残基1〜31若しくは17〜31,、KGANKK(配列番号314)又はKGANQK(配列番号315)を含む、請求項91から93のいずれか1項に記載の組成物。
前記C末端伸長が、配列番号117若しくは118のアミノ酸配列を含む、又は配列番号101〜116のいずれか1つから選択されるアミノ酸残基23〜37を含む、請求項91から94のいずれか1項に記載の組成物。
前記NPのアミノ酸配列が、配列番号4若しくは11、又は配列番号31〜94のいずれか1つのアミノ酸配列、又は少なくとも環ドメインを含むこれらの断片、又は配列番号13〜29、100〜116、119〜125、127〜233、若しくは1001〜1155のアミノ酸配列からなる、請求項91に記載の組成物。
前記第2のポリペプチドのV及び/又はWが存在しない、請求項83から96のいずれか1項に記載の組成物。
前記第2のポリペプチドのV又はWが、結晶化可能断片領域(Fc)を含む、請求項83から97のいずれか1項に記載の組成物。
前記第2のポリペプチドのV又はWが、グリシンリッチ領域を含む、請求項83から98のいずれか1項に記載の組成物。
前記第2のポリペプチドのV又はWが、骨標的化部分を含む、請求項83から99のいずれか1項に記載の組成物。
前記第2のポリペプチドのV又はWが、カテプシン切断配列を含む、請求項83から100のいずれか1項に記載の組成物。
前記第2のポリペプチドが、構造V-NP-Wを含み、
NPは、ナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR-B)のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、
V及びWのそれぞれは、独立して、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
前記NPは、配列番号17〜29、31〜40、42〜94、101〜116、119〜122、128〜161、若しくは163〜233のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、又はV若しくはWは、配列番号304〜313、322〜333、又は337〜391のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、
請求項83から101のいずれか1項に記載の組成物。
前記第2のポリペプチドが、構造V-NP又はNP-Wを含み、
NPは、ナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR-B)のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、
V及びWのそれぞれは、独立して、配列番号304〜313、322〜333、又は337〜391のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、
請求項83から102のいずれか1項に記載の組成物。
前記第2のポリペプチドが、構造X-Fc-Y-NP-Z又は構造X-NP-Y-Fc-Zを含み、
NPは、ナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR-B)のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、
X、Y、及びZは、独立して、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である、
請求項83から103のいずれか1項に記載の組成物。
Yがグリシンリッチ領域を含む、請求項104に記載の組成物。
Xが存在しない、Zが存在しない、又はXとZがともに存在しない、請求項104又は105に記載の組成物。
X、Y、又はZが骨標的化部分を含む、請求項104から106のいずれか1項に記載の組成物。
X、Y、又はZが、カテプシン切断配列を含む、請求項104から107のいずれか1項に記載の組成物。
前記第2のポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号501〜608のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項83から108のいずれか1項に記載の組成物。
前記第2のポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号502、504、506、512、514、516、530、560、562、564、572、574、576、584、586、588、596、598、600、又は608のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項109に記載の組成物。
前記第2のポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号512のアミノ酸配列を含む又は該アミノ酸配列からなる、請求項110に記載の組成物。
前記第1のポリペプチド及び/又は前記第2のポリペプチドが二量体形態である、請求項83から111のいずれか1項に記載の組成物。
前記第1のポリペプチド及び/又は前記第2のポリペプチドが、グリコシル化又はペグ化されている、請求項83から112のいずれか1項に記載の組成物。
前記組成物が、製薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物である、請求項83から113のいずれか1項に記載の組成物。
前記組成物が凍結乾燥されている、請求項83から114のいずれか1項に記載の組成物。
前記第1のポリペプチが約0.2mg/kgから約20mg/kgの投薬量で存在し、前記第2のポリペプチドが約0.5mg/kgから約500mg/kgの投薬量で存在する、請求項83から115のいずれか1項に記載の組成物。
前記第1のポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号1204のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号504、512、530、又は572のアミノ酸配列を含む、請求項83から116のいずれか1項に記載の組成物。
対象における疾患又は状態を処置する方法であって、治療上有効な量の第1のポリペプチドと第2のポリペプチドを前記対象に投与することを含み、
a)前記第1のポリペプチドは構造A-sALP-Bを含み、
i)sALPは、アルカリホスファターゼの細胞外ドメインであり、
ii)Aは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
iii)Bは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
b)前記第2のポリペプチドは構造V-NP-Wを含み、
i)NPは、ナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR-B)のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、
ii)Vは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
iii)Wは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
前記疾患又は状態は、神経皮膚症候群、FGFR3の過剰活性化と関連した障害、骨又は軟骨障害、血管平滑筋障害、及び骨の伸長の状態からなる群から選択され、
それによって前記対象における前記疾患又は前記状態を処置する、方法。
前記第1のポリペプチ及び前記第2のポリペプチドが、互いに10日以内、5日以内、又は24時間以内に投与される、請求項118に記載の方法。
前記第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドが同時に投与される、請求項118に記載の方法。
前記第1のポリペプチド及び前記第2のポリペプチドが、組成物中に一緒に製剤化され、又は組成物中にそれぞれ別々に製剤化される、請求項118から120のいずれか1項に記載の方法。
前記組成物が、製薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物である、請求項121に記載の方法。
前記組成物が凍結乾燥されている、請求項122に記載の方法。
前記組成物が、請求項83から117のいずれか1項に記載の組成物である、請求項121から123のいずれか1項に記載の方法。
前記第1のポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号1204のアミノ酸配列を含み、前記第2のポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号504、512、530、又は572のアミノ酸配列を含む、請求項118から124のいずれか1項に記載の方法。
前記第1のポリペプチが約0.2mg/kgから約20mg/kgの投薬量で存在し、前記第2のポリペプチドが約0.5mg/kgから約500mg/kgの投薬量で存在する、請求項118から125のいずれか1項に記載の方法。
前記第1のポリペプチが約0.2mg/kgから約20mg/kgの投薬量で存在し、前記第2のポリペプチドが約10μg/kgから約1,000μg/kgの投薬量で存在する、請求項118から125のいずれか1項に記載の方法。
前記第1のポリペプチド及び前記第2のポリペプチドが皮下に投与される、請求項118から127のいずれか1項に記載の方法。
前記第1のポリペプチド及び前記第2のポリペプチドが、週1回、2回、又は3回投与される、請求項118から128のいずれか1項に記載の方法。
前記対象がヒトである、請求項118から129のいずれか1項に記載の方法。
前記疾患が前記神経皮膚症候群である、請求項118から130のいずれか1項に記載の方法。
前記神経皮膚症候群が神経線維腫症I型である、請求項131に記載の方法。
a)構造A-sALP-Bを含む第1のポリペプチド、ここで
i)sALPは、アルカリホスファターゼの細胞外ドメインであり、
ii)Aは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
iii)Bは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である、
及び
b)神経皮膚症候群と診断された患者、又は神経皮膚症候群を発症するリスクを有する患者に前記第1のポリペプチドを投与するための指示書
を含むキット。
c)構造V-NP-Wを含む第2のポリペプチド、ここで
i)NPはナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR-B)のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、
ii)Vは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
iii)Wは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である、
をさらに含む、請求項133に記載のキット。
a)構造V-NP-Wを含むポリペプチド、ここで
i)NPはナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR-B)のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、
ii)Vは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
iii)Wは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である、
及び
b)神経皮膚症候群と診断された患者、又は神経皮膚症候群を発症するリスクを有する患者に前記ポリペプチドを投与するための指示書
を含むキット。
a)構造A-sALP-Bを含む第1のポリペプチド、ここで
i)sALPは、アルカリホスファターゼの細胞外ドメインであり、
ii)Aは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
iii)Bは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である、
及び
b)構造V-NP-Wを含む第2のポリペプチド、ここで
i)NPはナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR-B)のアゴニストであるナトリウム利尿ペプチドであり、
ii)Vは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
iii)Wは、存在しないか、又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列である、
を含むキット。
前記第1のポリペプチド及び前記第2のポリペプチドが一緒に製剤化される、請求項136に記載のキット。
前記第1のポリペプチド及び前記第2のポリペプチドが、別々に、個々の投薬量で製剤化される、請求項136に記載のキット。