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Diese
Erfindung betrifft das Gen eines menschlichen CNP (menschliches
C-Typ natriuretisches Peptid, das hier als hCNP abgekürzt ist)
sowie das hCNP-Vorläuferprotein
(prepro hCNP), das durch dieses Gen codiert wird.
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In
den letzten Jahren sind verschiedene Peptide, insgesamt als "natriuretische Peptide" (NP) bezeichnet,
aus Atria und Gehirnen verschiedener Tiere isoliert worden. Heute
können
diese NPs in drei Typen klassifiziert werden, dem A-Typ natriuretischen
Peptid (ANP), dem B-Typ natriuretischen Peptid (BNP) und dem C-Typ
natriuretischen Peptid (CNP), wobei dies von der Ähnlichkeit
der primären
Aminosäuresequenz
und der Struktur dieser Vorläufer
abhängt.
Unter diesen drei Typen wurden zuerst ANP und BNP isoliert und aus
dem Atrium und Gehirn identifiziert und werden daher manchmal als "atriales natriuretischer
Peptid" beziehungsweise "Gehirn-natriuretisches
Peptid" bezeichnet
(Matsuo, H. und Nakazato, H., Endocrinol. Methab. Clin. North Am.,
16, 43, 1987; Sudoh, T. et al., Nature, 332, 78, 1988). Es ist heute
jedoch bekannt, daß ANP
nicht nur im Atrium, sondern auch im Gehirn und daß BNP nicht
nur im Gehirn, sondern auch im Atrium auftaucht. Außerdem entfalten
ANP und BNP wesentliche natriuretische und hypotensive Wirkungen,
so daß klar
geworden ist, daß jedes
dieser Peptide nicht nur als aus dem Atrium in das Blut abzusonderndes
Hormon, sondern auch als Neurotransmitter im Gehirn dient, wobei
sie in beiden Fällen
dazu beitragen, das homöostatische Gleichgewicht des
Körperflüssigkeitsvolumen
und den Blutdruck in Säugern
zu regulieren.
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Das
CNP wurde erst kürzlich
von Sudoh et al. als ein dritter NP-Typ, der weder ANP noch BNP
zugeordnet werden kann, aus Schweinehirn isoliert und identifiziert
(Sudoh, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Communication., 168, 863,
1990). Das zuerst entdeckte CNP bestand aus 22 Aminosäureresten
(dieses Peptid ist hier als "pCNP-22" bezeichnet). Wie
ANP und BNP enthält
CNP zwei Cysteinreste, die eine intramolekulare Disulfidbindung
bilden, wobei ein Ring, bestehend aus 17 Aminosäureresten, hergestellt wird.
Außerdem
wurde festgestellt, daß die
primäre
Aminosäuresequenz,
die die Ringstruktur in pCNP-22 bildet, mit denen in ANP und BNP
hoch homolog ist.
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pCNP-22
unterscheidet sich jedoch von ANP und BNP dadurch, daß die letzteren
verschiedene Aminosäurereste
zusätzlich
an den C-Terminus der Ringstruktur gebunden haben, während keine
solche "Endstruktur" in pCNP-22 vorhanden
ist. Mit anderen Worten endet der C-Terminus von pCNP-22 mit einem
Cysteinrest. Auf der Basis dieser Tatsachen wurde festgestellt,
daß die
Struktur von pCNP-22 ähnlich,
aber eindeutig unterschiedlich zu denen von ANP und BNP ist. Außerdem entfaltete
pCNP natriuretische und hypotensive Wirkungen und es wurde auch
festgestellt, daß es
eine höhere
Aktivität
als ANP und BNP in relaxierenden Aktivitätsuntersuchungen in Stuhlproben
von Küken
aufzeigte. Aufgrund dieser Beobachtungen wurde festgestellt, daß pCNP-22
einem neuen Typ von NP zuzuordnen ist, dessen Peptide als "CNPs" bezeichnet wurden.
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Im
Anschluß an
pCNP-22 wurde ein zweites als CNP bezeichnetes Peptid von den Erfindern
aus Schweinehirn isoliert und identifiziert. Es wurde festgestellt,
daß das
Peptid aus 53 Aminosäureresten
besteht, wobei pCNP-22 an dem C-Terminus vorhanden ist (dieses Peptid
wird hier als pCNP-53 abgekürzt).
Mit anderen Worten wurde festgestellt, daß pCNP-53 ein Peptid ist, das
31 mehr Aminosäurereste
an den C-Terminus von pCNP-22 gebunden hat. Interessant ist, daß pCNP-53
in größeren Mengen
als pCNP-22 in Schweinehirn auftritt (gewöhnlich zugeordnet:
japanische Patentanmeldung Nr.
186582/1990 ).
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Eine
andere kürzlich
durchgeführte
Studie identifizierte die Struktur des Vorläufers von pCNP-22 und pCNP-53
durch Genanalyse erfolgreich und dies trug dazu bei, den Mechanismus,
der hinter der Biosynthese dieser Peptide steht, zu enträtseln (
Europäische Patentanmeldung Nr. 91
111 630.0 ). Die Erfinder isolierten und identifizierten
ein Schweine-chromosomales Gen und die cDNA, die für pCNP-22 und pCNP-53 codiert; durch
ihre Analyse wurde die Struktur des Schweine-CNP Vorläuferproteins
(prepro pCNP) enträtselt;
zur gleichen Zeit wurde festgestellt, daß sowohl pCNP-22 als auch pCNP-53
zuerst von mRNA als ein prepro pCNP, bestehend aus 126 Aminosäureresten
translatiert wird und daß das
in dem N-terminalen Bereich des Vorläuferproteins vorhandene Signalpeptid
anschließend
in dem Sekretionsverfahren gespalten wird, so daß es in pCNP umgewandelt wird,
das wiederum spezifisch durch Weiterverarbeitungsenzyme gespalten
und wie geeignet in pCNP-53 oder pCNP-22 umgewandelt wird. Auf der
Basis dieser Beobachtungen wurde festgestellt, daß, wie im
Fall von ANP und BNP, sowohl pCNP-22 als auch pCNP-53 sekretorische
Peptide sind, die von einem gemeinen Vorläuferprotein biosynthetisiert
werden (prepro pCNP).
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In
starker Kontrast zu den ANP und BNP zuzuordnenden Peptiden, über die
in vorherigen Studien festgestellt wurde, daß sie nicht nur als aus dem
Atrium in das Blut abzusondernde Hormone, sondern auch als Neurotransmitter
im Gehirn wirken, wodurch sie das homöostatische Gleichgewicht des
Körperflüssigkeitsvolumens
und Blutdrucks regulieren, bleibt CNP in vielen Punkten in Bezug
auf Details über
seine Verbreitung in vivo und seine physiologischen Wirkungen unklar.
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Was
ANP und BNP betrifft, sind ihre Strukturen im Menschen etabliert
worden und Anstrengungen, sie als Pharmazeutika anzuwenden, sind
im Gange. Bis jetzt ist die Struktur von CNP im Menschen noch nicht identifiziert
worden.
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Die
vorliegende Erfindung wurde unter diesen Umständen vervollständigt und
hat zum Ziel, die Strukturen von CNPs im Menschen (hCNP) zu identifizieren,
insbesondere diejenigen von menschlichen CNPs, die zu pCNP-53 korrespondieren,
wie auch die Struktur ihres Vorläuferproteins,
das zu prepro pCNP im Schwein korrespondiert.
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1 zeigt die Restriktionsenzymkarte für hgEco-2
und hgEco-1, sowie die Strategie für die Bestimmung der Rasensequenz;
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2 zeigt die DNA-Rasensequenz von hgEco-3,
die für
das hCNP-Vorläuferprotein
codiert, sowie die Aminosäuresequenz
des hCNP-Vorläuferproteins,
das durch Exons im strukturellen Genbereich codiert wird; und
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3 zeigt
die ganze Rasensequenz der hCNP-cDNA, sowie die Aminosäuresequenz
des hCNP-Vorläuferproteins,
das durch sie codiert ist.
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In
Anbetracht dessen, daß die
Aminosäuresequenz
von ANP und die Rasensequenz, die diese codiert, beide mit hoher
Homologie über
die Tierarten beibehalten werden, nahmen die Erfinder an, daß diese Situation
auch mit hoher Wahrscheinlichkeit bei CNP vorkommt. Da außerdem CNP
in viel kleineren Mengen im Schweinehirn als ANP und BNP vorkommt
und da das Hirngewebe für
die Herstellung dieser Peptide noch zu identifizieren ist, dachten
die Anmelder, daß es
schwierig wäre,
das CNP-Peptid direkt aus menschlichem Hirn zu identifizieren, und
daß es
auch schwierig wäre,
die cDNA zur Identifikation menschlichen CNPs zu isolieren und zu
analysieren. Auf Basis dieser Annahmen entwarfen die Erfinder ein
Programm, in dem das menschliche CNP-Gen unter Verwendung einer
Sonde, die vorher vom Schweine-CNP-Gen oder cCNP erhalten wurde,
isoliert wurde, und das isolierte menschliche CNP-Gen wurde zur
Identifizierung der Struktur von menschlichem CNP-Vorläuferprotein
sowie auch der Strukturen von menschlichen CNPs, die pCNP-53 und pCNP-22
entsprechen, untersucht.
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Sudoh
T. et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm. 168 (1990) 863–870) haben
C-Typ natriuretisches Peptid (CNP) identifiziert, wobei es sich
um ein neues Mitglied der natriuretischen Peptid-Familie handelt.
Das darin offenbarte Peptid wurde von Gehirnextrakten von Schweinen
erhalten.
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Gemäß diesem
Programm schnitten die Erfinder zuerst ein DNA-Fragment von ca.
70 Basen (pC cDNA) von der pCNP cDNA (siehe
Europäische
Patentanmeldung Nr. 91 111 630.9 ) durch Behandeln mit einem Restriktionsenzym
DdeI aus und verwendeten dieses Fragment als Sonde. Die Sonde kann
auch chemisch synthetisiert werden. Unter Verwendung dieser Sonde
haben die Erfinder eine menschliche chromosomale Genbibliothek (λ-Phagenvektor,
in dem ein menschliches chromosomales Genfragment eingefügt ist)
gescreent. Die menschliche chromosomale Genbibliothek kann leicht
durch den Fachmann hergestellt werden oder alternativ ist sie von
Clonetech Co. im Handel erhältlich.
Als Ergebnis wurde ein Klon hybridisierender pC cDNA erhalten. Die
Analyse dieses Klons (λhCNP2)
zeigte, daß er
ca. 15 kbp des menschlichen chromosomalen Gens aufwies und daß ein EcoRI
DNA-Fragment (hgEco-2), umfassend ca. 2 kbp der 15 kbp, mit der pC
cDNA-Sonde hybridisierte. Wenn dieses hgEco-2, umfassend ca. 2 kbp,
untersucht wurde, wurde offenbar, daß dieses DNA-Fragment ein Teil
des hCNP-Gens enthielt
(für die
Restriktionsenzymkarte für
hgEco-2 und die Strategie für
die Basensequenzbestimmung siehe
1).
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Im
nächsten
Schritt haben die Erfinder im Hinblick auf die Identifizierung der
gesamten Struktur des hCNP-Vorläuferproteins
die menschliche chromosomale Genbibliothek wieder unter Verwendung
von hgEco-2 als Sonde gescreent. Als Ergebnis wurde ein Klon, der
mit der hgEco-2-Sonde hybridisierte, erhalten. Die Analyse dieses
Klons (λhCNP1)
bestätigte,
daß er
ein menschliches chromosomales Gen von 15 kbp und mehr enthält und daß ein EcoR1-Fragment
(hgEco-1) dieses Klons, das ca. 4 kbp umfaßte, mit der hgEco-2-Sonde hybridisierte.
Die Erfinder haben anschließend
eine Restriktionsenzymkarte für
das hgEco-1-Fragment konstruiert und diese mit der schon konstruierten
Karte für
hgEco-2 (siehe 1) verglichen. Als
Ergebnis wurde klar, daß hgEco-1
eine DNA war, die ein menschliches chromosomales Gen von ca. 2 kbp
zusätzlich
an die 5'-Stelle
von hgEco-2 gebunden aufwies. Basierend auf dieser Feststellung
bestimmten die Erfinder die Basensequenz des DNA-Fragments von Interesse
(zur Strategie für
die Basensequenzbestimmung von hgEco-1 siehe 1).
Als Ergebnis wurde festgestellt, daß, wie in 2 gezeigt,
daß hgEco-1
nicht nur ein strukturelles Gen enthielt, das für die gesamte Aminosäuresequenz
des menschlichen CNP-Vorläuferproteins
codiert, sondern auch den Promotorbereich des menschlichen CNP-Gens
enthält.
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Zunächst ist
zu dem Promotorbereich zu sagen, daß eine TATA-Box, die sich die
Promotorbereiche eukaryontischer Gene teilen, an den Positionen
1546–1551
der DNA-Basensequenz,
die in 2 gezeigt ist, vorhanden ist
und es wurde auch festgestellt, daß zwei GC-Kästen und ein Y-Kasten stromaufwärts der
TATA-Box vorhanden sind, wobei beide voraussichtlich an der Kontrolle
der Genexpression teilnehmen. Basierend auf diesen Tatsachen schlußfolgerten
die Erfinder, daß der
Bereich von Interesse der Promotorbereich des CNP-Vorläufergens
war.
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Zum
strukturellen Genbereich ist zu sagen, daß ATG an Position 172–174 der
Rasensequenz stromabwärts
(auf der 3'-Seite)
der TATA-Box vorhanden war. Da dieses ATG das erste Methionin-Codon,
das stromaufwärts
(auf der 3'-Seite) der TATA-Box
auftrat, war und da die Basensequenz um das Codon herum sich in Übereinstimmung
mit der Consensus-Sequenz eines Translationsstartcodons befand,
A/G NNATG (N bedeutet entweder A, T, G oder C), von dem bekannt
ist, daß es
in Eukaryonten vorhanden ist, schätzten die Erfinder, daß das ATG
von Interesse ein Translationsstartcodon für den menschlichen CNP-Vorläufer ist.
Wenn von diesem ATG angenommen wird, daß es ein Translationsstartcodon
ist, zeigte ein Vergleich mit der bereits identifizierten Struktur
des Schweine-CNP chromosomalen Gens, daß der Bereich bis zu dem Codon
(AAG) des Leucin-Rests, der an Position 1809–1811 der Rasensequenz vorkommt,
dem ersten Exon entspricht. Ein ähnlicher
Vergleich zeigte auch, daß das
zweite Exon mit dem Codon (GTC) des Valinrestes, der an Position 2256–2258 der
Rasensequenz vorkommt, anfängt.
Das erste untersuchte hgEco-2 ist ein DNA-Fragment, das für den Bereich
des zweiten Exons an Position 2286 aufwärts der Rasensequenz codiert.
Diese Tatsachen werden auch durch das folgende gestützt: Basensequenzen ähnlich zu
C/A AGGT und A/G AGT, die als die Consensussequenzen eines Splicedonors
bekannt sind, kommen in der Nachbarschaft der Position 1810 der Rasensequenz
vor, und eine Rasensequenz ähnlich
zu (Py)nNC/T AGG (Py bedeutet den Pyridinrest und N bedeutet entweder
A, T, C oder G), die als die Consensussequenz eines Spliceakzeptors
bekannt ist, kommt an der 5'-Seite
der Position 2256 der Rasensequenz vor. Basierend auf diesen Beobachtungen
nahmen die Erfinder an, daß der
DNA-Bereich an Positionen
1812–2255
der Rasensequenz ein Intron war und daß dieses Intron durch Splicen
während
der Bildung einer reifen mRNA, die für das hCNP-Vorläuferprotein
kodiert, entfernt werden könnte.
Mit anderen Worten, es wurde deutlich, daß das hCNP-Vorläuferprotein
durch das erste Exon, das an der Position 1722 der Basensequenz
beginnt und das an der Position 1811 und auch durch das zweite Exon,
das an der Position 2256 beginnt, codiert wurde und daß dieses
Vorläuferprotein
ein Polypeptid war, das gänzlich
aus 126 Aminosäureresten,
wie im Schwein, zusammengesetzt war.
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Das
so identifizierte hCNP-Vorläuferprotein
(das hier als das "prepro
hCNP" bezeichnet
wird) wurde in seiner primären
Aminosäuresequenz
mit der des pCNP-Vorläuferproteins
verglichen. Es wurde festgestellt, daß die beiden Vorläuferproteine
identisch sind, außer
dem Unterschied in 5 Positionen der Aminosäuresequenz (Position 37, 40,
56, 90 und 101 der primären
Aminosäuresequenz
von prepro hCNP, gezeigt in 3). Es war
besonders interessant, daß die
folgenden zwei Aminosäuresequenzen
vollständig
die gleichen in Menschen und Schweinen waren: Die primäre Aminosäuresequenz
des Signalpeptids, die im N-terminalen Bereich von prepro CNP vorkommt,
von der bereits festgestellt wurde, daß sie an der Sekretion des
CNP-Vorläuferproteins
in dem Mechanismus der Biosynthese von Schweine-CNP teilnimmt; und
die Aminosäuresequenz
in den Bereichen in der Nähe
des N-Terminus von CNP-22 und CNP-53, die durch weiterverarbeitende
Enzyme während
der Bildung von CNP-22 und CNP-53 erkannt werden würde und
aus prepro CNP gespalten werden würde.
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Unter
Anbetracht der oben diskutierten Tatsachen wird das menschliche
CNP vermutlich durch den folgenden Weg biosynthetisiert, der ähnlich zu
dem ist, der mit Schweinen assoziiert ist. Zunächst wird prepro hCNP, umfassend
126 Aminosäurereste,
durch die mRNA translatiert. Anschließend wird das Signalpeptid, das
in dem n-terminalen Bereich von prepro hCNP vorhanden ist, zur Umwandlung
zu pro hCNP im Verlauf der Sekretion gespalten. Außerdem wird
das pro hCNP weiterverarbeitende Enzym an den spezifischen Positionen
(zwischen Position 73 und 74 der primären Aminosäuresequenz, die in 3 gezeigt
ist, und zwischen den Positionen 104 und 105 der gleichen Aminosäuresequenz)
zur Umwandlung in menschliches CNP-53 (Position 74–126 der
primären
Aminosäuresequenz,
die in 3 gezeigt ist), die pCNP-53 entspricht, sowie
auch zu menschlichem CNP-22 (Position 105–126 der gleichen Sequenz),
die pCNP-22 entspricht, gespalten. Im Hinblick auf hCNP-22 ist seine
primäre
Aminosäuresequenz
vollständig
zu der von pCNP-22 identisch; daher gibt es keinen Zweifel daran,
daß es
die gleichen physiologischen Aktivitäten wie pCNP-22 (z. B. natriuretische und
hypotensive Wirkungen) entfaltet.
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Auf
der anderen Seite unterscheidet sich die hCNP-53 Aminosäuresequenz
von der von pCNP-53 in zwei Positionen (Position 90 und 101 der
primären
Aminosäuresequenz,
die in 3 gezeigt ist); daher ist hCNP-53 ein neues Peptid
und seine physiologischen Wirkungen sind nicht bekannt. Folglich
synthetisierten die Erfinder chemisch hCNP-53 und untersuchten die
physiologischen Aktivitäten
dieses neuen Peptids. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß hCNP-53
eine Hühnerrektum
relaxierende Wirkung zeigte, zur gleichen Zeit zeigte es deutliche
natriuretische und hypotensive Wirkungen, wenn es an Ratten verabreicht
wurde.
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Zusammenfassend
läßt sich
sagen, daß die
Erfinder ein chromosomales Gen, das für das hCNP-Vorläuferprotein
codiert, isolierten und daß sie
es untersuchten, um seine primäre
Aminosäuresequenz
zu identifizieren. Als Ergebnis identifizierten sie erfolgreich
die Strukturen von menschlichen CNPs (hCNP-22 und hCNP-53) entsprechend
pCNP-22 und pCNP-53. Zur gleichen Zeit synthetisierten sie chemisch
hCNP-53 und belegten seine physiologischen Aktivitäten. Diese
Erfindung wurde unter diesen Umständen vollendet.
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Es
ist hier zu bemerken, daß,
wenn das hCNP chromosomale Gen dieser Erfindung in eine geeignete Säugerzelle
(z. B. COS-Zelle, die von Affennierenzellen abstammt) entweder direkt
transduziert wird oder, da es an einem Bereich stromabwärts eines
geeigneten Promotors (z. B. des Anfangspromotors von SV 40) gebunden
ist, hCNP cDNA erhalten werden kann, und diese Tatsache ist innerhalb
des Umfangs der Offensichtlichkeit (siehe
Europäische
Patentanmeldung Nr. 91 111 630.9 ).
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Die
gesamte Rasensequenz der so erhaltenen hCNP cDNA und die primäre Aminosäuresequenz
des hCNP-Vorläuferproteins,
die durch diese cDNA codiert wird, ist in 3 gezeigt.
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Die
folgenden Beispiele werden zum Zweck der weiteren Darstellung dieser
Erfindung zur Verfügung gestellt.
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BEISPIEL 1
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Herstellung der DNA-Sonde (pC cDNA):
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Die
DNA-Sonde (pC cDNA), die für
das Klonieren eines chromosomalen Gens verwendet wird, das das menschliche
CNP-Vorläuferprotein
codiert, wurde durch das Verfahren, bestehend aus einer Spaltung
der Schweine CNP cDNA hergestellt (siehe
Europäische
Patentanmeldung Nr. 91 111 630.9 ) mit einem Restriktionsenzym
DdeI, wodurch ein DNA-Fragment
von 700 bp isoliert wurde, woraufhin die DNA mit [α-
32P] dCTP durch Nick-Translation markiert
wurde.
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BEISPIEL 2
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Isolierung des chromosomalen Gens, das
für einen
Teil des menschlichen CNP-Vorläuferproteins
codiert:
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Der
von LE 392 abstammende E. coli Stamm K12 wurde mit einer menschlichen
chromosomalen Genphagen-DNA-Bibliothek, die bei 4°C aufbewahrt
wurde, infiziert. Die Zellen wurden auf einem LB Medium plattiert
(10 g, Bactotrypton; 5 g, Hefeextrakt; 5g, NaCl; 1,5 % Bactoagar;
Gesamtvolumen, 1 1) und über
Nacht bei 37°C
kultiviert. Die Platten wurden bei 4°C für 30 Minuten gekühlt und
ein Nitrozellulosefilter (Erzeugnis von Schleicher & Schnell Co.)
wurde auf dem Phagenplaque für
5 Minuten stehen gelassen. Anschließend wurde der Filter von der
Platte abgelöst,
in der Luft getrocknet, für
1 Minute in eine alkalische Zersetzungslösung (0,5 M NaOH und 1,5 M
NaCl) eingetaucht und anschließend
in eine Neutralisationslösung
(0,5 M Tris-HCl; pH 7,0; 1,5 M NaCl) für 1 Minute eingetaucht. Danach
wurde der Nitrozellulosefilter mit einer 3 × SSC Lösung (20 × SSC NaCl; 175,3 g; Trinatriumcitrat,
88,2 g; Gesamtvolumen, 1 1) abgewaschen, in der Luft getrocknet
und unter Vakuum bei 80°C
für 120
Minuten wärmebehandelt.
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Unter
Verwendung des so hergestellten Nitrozellulosefilters wurde eine
Plaquehybridisierung unter den folgenden Bedingungen durchgeführt. Zunächst wurde
ein Prähybridisierungslösung [3X
SSC, 1 × Denhardt's Lösung (bestehend
aus Albumin, Polyvinylpyrrolidon und Ficoll, wobei jedes 0,2 mg/l
wog), Lachsspermien-DNA, 50 μg/ml;
0,1% SDS] zu dem Nitrozellulosefilter gegeben und die Prähybridisierung
wurde bei 60°C für 3 Stunden
durchgeführt.
Anschließend
wurde unter Verwendung von 106 cpm der pC
cDNA-Sonde und 1 ml der Prähybridisierungslösung für 2 Blätter des
Nitrozellulosefilters eine Hybridisierung über Nacht bei 60°C durchgeführt. Anschließend wurde
der Filter dreimal mit einer 3 × SSC-Lösung, enthaltend
0,1 % SDS, gewaschen, wobei jedes Waschen bei 60°C für 30 Minuten erfolgte; die
gewaschenen Filter wurde an der Luft getrocknet und eine Autoradiographie
bei –80°C für 24 Stunden
durchgeführt.
Durch Screenen von ca. 2 × 105 Klonen auf diese Weise wurde ein Klon,
der mit der pC cDNA-Sonde hybridisierte, erhalten. Dieser Klon wurde "λhCNP 2" genannt und eine Analyse in den anschließenden Schritten
durchgeführt.
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BEISPIEL 3
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Analyse des λhCNP 2-Phagen und Bestimmung
seiner DNA-Basensequenz:
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A. Analyse der λhCNP 2-Phagen DNA:
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DNA
wurde vom λhCNP
2-Phagen auf gewöhnliche
Weise hergestellt. Anschließend
wurde die Phagen-DNA mit einem Restriktionsenzym EcoRI gespalten
und das resultierende DNA-Fragment wurde getrennt und durch Elektrophorese
auf einem Agarosegel untersucht. Es wurde festgestellt, daß λhCNP 2 ein
Phage ist, der ein ca. 15-kbp menschliches chromosomales Gen enthält. Die
Analyse durch Southern Blot unter Verwendung der pC cDNA-Sonde zeigte,
daß das
EcoRI-Fragment von hCNP-2 (hgEco-2) mit einer Länge von ca. 2 kbp mit der pC
cDNA-Sonde hybridisierte.
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B. Bestimmung der Besensequenz des hgEco-2
DNA-Fragments:
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Um
die Besensequenz des hgEco-2-Fragments zu bestimmen wurde das letztere
in einem Plasmidvektor pUC 18 (Takara Shuzo Co., Ltd.) an der EcoR-1
Stelle zur Herstellung von pUC hCNP-2 subkloniert. Das puC hCNP-2
wurde anschließend
mit einem geeigneten Restriktionsenzym gespalten und das resultierende
DNA-Fragment wurde in einen M13 Phagen subkloniert. Die Rasensequenz
des hgEco-2 DNA-Fragments wurde durch das Didesoxyverfahren bestimmt.
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Als
Ergebnis wurde festgestellt, daß das
DNA-Fragment von Interesse einen Teil des menschlichen CNP-Gens
codiert.
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BEISPIEL 4
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Isolierung des chromosomalen Gens, das
für den
gesamten Bereich des menschlichen CNP-Vorläuferproteins codiert:
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Unter
Verwendung des Nitrozellulosefilters, der durch das Verfahren, das
in Beispiel 1 beschrieben ist, konditioniert wurde, wurde eine Plaquehybridisierung
unter den Bedingungen, wie oben beschrieben, durchgeführt. Die
zu verwendende Sonde wurde durch Markieren von hCNP-2, das von hgEco-2
(ca. 2 kbp) abstammt, mit [α-32P] dCTP durch Nick-Translation hergestellt.
Die so hergestellte Sonde wird hier als hgEco-2 DNA bezeichnet.
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Zunächst wurde
eine Prähybridisierungslösung [3X
SSC, 1 × Denhardt's Lösung (bestehend
aus Albumin, Polyvinylpyrrolidon und Ficoll, wobei jedes 0,2 mg/l
wiegt); Lachsspermien-DNA, 50 μg/ml;
0,1% SDS] zu dem Nitrozellulosefilter gegeben und eine Prähybridisierung
wurde bei 65°C
für 3 Stunden
durchgeführt. Anschließend wurde
unter Verwendung von 106 cpm der hgEco-2
DNA-Sonde und 1 ml der Prähybridisierungslösung für 2 Blätter des
Nitrozellulosefilters eine Hybridisierung über Nacht bei 65°C durchgeführt. Anschließend wurde
der Filter dreimal mit einer 3 × SSC-Lösung, enthaltend
0,1 % SDS, gewaschen, wobei jedes Waschen bei 65°C für 30 Minuten erfolgte; der
gewaschene Filter wurde an der Luft getrocknet und eine Autoradiographie
bei –80°C für 24 Stunden
durchgeführt.
Durch Screenen von ca. 5 × 105 Klonen auf diese Weise wurden fünf Klone,
die mit der pC cDNA-Sonde hybridisierten, erhalten. Einer dieser
Klone wurde "λhCNP 1" genannt und den
Untersuchungen in den folgenden Schritten unterworfen.
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BEISPIEL 5
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Analyse der λhCNP 1-Phagen-DNA und Bestimmung
der DNA-Basensequenz:
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A. Analyse der λhCNP 1-Phagen-DNA:
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Die
DNA wurde von dem λhCNP
1-Phagen auf gewöhnliche
Weise hergestellt. Anschließend
wurde die Phagen-DNA mit einem Restriktionsenzym EcoRI gespalten
und das resultierende DNA-Fragment wurde getrennt und durch Elektrophorese
auf einem Agarosegel untersucht. Als Ergebnis wurde festgestellt,
daß λhCNP 1 ein
Phage ist, der ein menschliches chromosomales Gen von ca. 15 kbp
oder mehr enthält.
Die Analyse durch Southern Blot unter Verwendung der hgEco-2 DNA-Sonde
zeigte, daß das
EcoRI-DNA-Fragment (hgEco-1) von ca. 4 kbp mit der hgEco-2-Sonde hybridisierte.
Folglich wurde die Rasensequenz dieses DNA-Fragments, das mit dem
hgEco-2-DNA-Fragment hybridisierte, durch das folgende Verfahren
bestimmt.
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B. Bestimmung der Besensequenz des hgEco-1
DNA-Fragments:
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Um
die Rasensequenz des hgEco-1-Fragments zu bestimmen, wurde das letztere
in einen Plasmidvektor pUC 118 (Takara Shuzo Co., Ltd.) an der EcoR-I
Stelle subkloniert, um pUC CNP-1 herzustellen. Das pUC CNP-1 wurde
anschließend
mit einem geeigneten Restriktionsenzym gespalten und das resultierende
DNA-Fragment wurde in einen M13 Phagen subkloniert. Die Rasensequenz
des DNA-Fragments von Interesse wurde durch das Didesoxyverfahren
bestimmt. Der durch das oben beschriebene Verfahren bestimmte Bereich
der Rasensequenz ist durch ausgefüllte Pfeile in 1 gezeigt.
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In
einem getrennten Schritt zur Bestimmung des Rasensequenz des niedrigeren
Stranges des hgEco-1 DNA-Fragments
(hgEco-1) wurde das letztere in einen Phagenvektor M13 mp18 an der
EcoRI Stelle subkloniert, um M13 hCNP-1 herzustellen. Anschließend, unter
Verwendung dieses M13 hCNP-1 als Matrize, wurde die Besensequenz
des DNA-Fragments von Interesse durch das Didesoxyverfahren unter
Verwendung eines universellen Primers und dem Oligonucleotidprimer,
der chemisch auf Basis der bereits bestimmten Rasensequenz synthetisiert
wurde, bestimmt. Der so bestimmte Bereich ist durch gestrichelte
Pfeile in 1 gezeigt. Die durch das
oben beschriebene Verfahren bestimmte Rasensequenz wurde mit der
Rasensequenz des hgEco-2 DNA-Fragments verbunden, um die gesamte
Rasensequenz des hgEco-1 DNA-Fragments zu vervollständigen.
Die vervollständigte
Basensequenz und die Aminosäuresequenz,
die an der Exon-Stelle, wie von dieser Basensequenz vorhergesagt,
codiert wird, sind in 2 gezeigt.
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BEISPIEL 6
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Chemische Synthese von hCNP-53:
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Das
hCNP-53 wurde durch ein Festphasenverfahren mit einer Peptidsynthetisiervorrichtung
von Applied Biosystems Co. synthetisiert. Es wurde danach mit Wasserstofffluorid
von Schutzgruppen befreit, um eine intramolekulare S-S-Bindung zu
bilden, gefolgt von einer Reinigung.
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Die
Ergebnisse des Aminosäuresequenzierens
des endgültigen
reinen Produkts und die Daten der Aminosäureanalyse sind in den Tabellen
1 bzw. 2 dargestellt. Diese Ergebnisse und Daten belegten positiv, daß das chemisch
synthetisierte hCNP-53 genau das beabsichtigte Produkt war. Tabelle
1 zeigt die Erträge der
PTH-Aminosäuren,
erhalten aus sukzessiven Zyklen einer Analyse an chemisch synthetisiertem
hCNP-53 durch das Edman-Verfahren. In Tabelle 1 ist jede Aminosäure durch
einen einzelnen Buchstaben bezeichnet. Tabelle 2 zeigt die Daten
der Aminosäureanalyse
an dem chemisch synthetisierten hCNP-53. TABELLE 1 Aminosäuresequenzanalyse
von synthetischem menschlichen CNP-53
| Zyklus Nr. | Zyklus Nr. |
| 1 | D | 349,8
pmol | 28 | A | 1.621,0 |
| 2 | L | 4.000,6 | 29 | N | 418,3 |
| 3 | R | 105,9 | 30 | R | 1.910,6 |
| 4 | V | 3.060,8 | 31 | K | 1.164,7 |
| 5 | D | 292,0 | 32 | G | 771,0 |
| 6 | T | 851,1 | 33 | L | 1.277,0 |
| 7 | K | 2.860,4 | 34 | S | 159,7 |
| 8 | S | 595,3 | 35 | K | 1.204,8 |
| 9 | R | 290,6 | 36 | G | 552,8 |
| 10 | A | 2.761,5 | 37 | C | ND |
| 11 | A | 2.714,6 | 38 | F | 998,2 |
| 12 | W | 1.038,4 | 39 | G | 668,2 |
| 13 | A | 2.386,8 | 40 | L | 959,6 |
| 14 | R | 151,6 | 41 | K | 634,2 |
| 15 | L | 2.628,7 | 42 | L | 1.251,3 |
| 16 | L | 2.701,2 | 43 | D | 141,1 |
| 17 | Q | 762,3 | 44 | R | 339,1 |
| 18 | E | 418,7 | 45 | I | 778,9 |
| 19 | H | 71,0 | 46 | G | 702,7 |
| 20 | P | 758,0 | 47 | S | 163,2 |
| 21 | N | 478,6 | 48 | M | 420,9 |
| 22 | A | 1.322,9 | 49 | S | 68,8 |
| 23 | R | 138,9 | 50 | G | 430,1 |
| 24 | K | 1.176,9 | 51 | L | 408,6 |
| 25 | Y | 678,9 | 52 | G | 223,7 |
| 26 | K | 1.204,6 | 53 | C | ND |
| 27 | G | 1.674,0 | | | |
TABELLE 2 Aminosäure-Zusammensetzungsanalyse
von synthetischem menschlichen CNP-53
| Aminosäure | Angetroffen | Berechnet |
| Asx | 4,95 | 5 |
| Thr | 0,92 | 1 |
| Ser | 3,59 | 4 |
| Glx | 2,06 | 2 |
| Gly | 7,04 | 7 |
| Pro | 1,01 | 1 |
| Ala | 4,90 | 5 |
| 1/2Cys | 1,21 | 2 |
| Val | 0,97 | 1 |
| Met | 0,97 | 1 |
| Ile | 0,99 | 1 |
| Leu | 7 | 7 |
| Tyr | 0,97 | 1 |
| Phe | 1,02 | 1 |
| Lys | 6,92 | 7 |
| His | 0,97 | 1 |
| Trp | ND | 1 |
| Arg | 5,04 | 5 |
-
BEISPIEL 7
-
Messung der physiologischen Aktivitäten von
hCNP-53:
-
A. Relaxierende Wirkung von hCNP-53 auf
das Hühnerrektum:
-
Eine
das Hühnerrektum
relaxierende Aktivitätsmessung
wurde gemäß dem Verfahren
von Currie et al, beschrieben in Nature, 221, 1–13, 1983, durchgeführt. Der
EC50 von hCNP-53 lag bei 0,87 ± 0,1 nM,
was ungefähr
dreimal so hoch ist wie die Aktivität von α-ANP.
-
B. Natriuretische und hypotensive Wirkungen
von hCNP-53:
-
Die
natriuretischen und hypotensiven Wirkungen von hCNP-53 wurden gemäß des Verfahrens
von DeBold et al, das in Life Science 28, 89–94, 1981 beschrieben wird,
gemessen. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß hCNP-53, wenn in einer Dosis
von 100 nmol/kg verabreicht, die Urinclearance 2,5 × erhöht, während der
Blutdruck um 10 % verringert wird.
-
Wie
auf den vorgenannten Seiten beschrieben, isolierten die Erfinder
einen Teil des hCNP-Gens aus einer menschlichen chromosomalen Genbibliothek
unter Verwendung von pCNP cDNA als Sonde. Mit der Verwendung des
isolierten hCNP-Gens als Sonde wurde ein Gen, das für den gesamten
Bereich des hCNP-Vorläufers
codiert, erfolgreich isoliert. Das isolierte Gen enthielt auch den
Promotorbereich von hCNP. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß ein Gen,
das für
CNP codiert, in Menschen wie auch in Schweinen vorhanden ist. Außerdem wurde
die gesamte Struktur des hCNP-Vorläuferproteins bestimmt. Wie
in Schweinen setzte sich das hCNP-Vorläuferprotein aus 126 Aminosäureresten
zusammen und enthielt am C-Terminus die Aminosäuresequenzen, die den aus Schweinehirn
isolierten pCNP-53 und pCNP-22 entsprachen. Da die Aminosäuresequenzen
dieser Peptide an der Prozessierungs-Stelle zwischen Schweinen und Menschen
vollständig übereinstimmten,
wurde vorhergesagt, daß diese
Peptide auch in Menschen durch einen Weg biosynthetisiert werden
können,
der ähnlich
zu dem ist, der in Schweinen vorliegt und daß sie auch als Hormone oder
Neurotransmitter fungieren, die das homöostatische Gleichgewicht des Körperflüssigkeitsvolumens
und den Blutdruck in vivo steuern.
-
Was
insbesondere in dieser Erfindung zu bemerken ist, ist, daß festgestellt
wurde, daß hCNP-53
sich strukturell von pCNP-53 an zwei Positionen der Aminosäuresequenz
unterscheidet. Die gegenwärtigen
Erfinder synthetisierten daher hCNP-53 chemisch und untersuchten
seine physiologischen Aktivitäten
in Bezug auf das Hühnerrektum
relaxierende Wirkungen, sowie seine natriuretischen und hypotensiven
Wirkungen. Folglich erwies sich hCNP-53 als ein physiologisch aktives
Peptid. Dies wird besondere Bedeutung auf die Anwendung dieser Peptide
der CNP-Familie hinsichtlich Pharmazeutika tragen. Zum Beispiel,
wenn pCNP-53, das strukturell unterschiedlich von hCNP-53 ist, als
Pharmazeutikum verwendet wird, wird es vermutlich als Fremdmaterie
im menschlichen Körper
erkannt werden und eine Antikörperherstellung
verursachen. Als Konsequenz kann die Aktivität von pCNP-53 neutralisiert
werden oder Nephrotoxizität
kann durch einen Antigen-Antikörper-Komplex verursacht
werden. Außerdem
kann pCNP-53 eine geringere Affinität für den CNP-Rezeptor menschlicher
Zellen besitzen, als hCNP-53 sie hat, und, in diesem Fall, kann
die Wirkung von pCNP-53 als solche abgeschwächt werden. Diese Probleme
kommen bei hCNP-53 nicht vor und dies ist auch wahr für andere
Peptide, die von dem hCNP-Vorläuferprotein
biosynthetisiert werden können
[zwischen Position 24 und 102 der primären Aminosäuresequenz von prepro hCNP,
gibt es mindestens 9 Leucinreste (an Position 24, 30, 51, 52, 55,
65, 89, 97 und 99) und mindestens 8 Argininreste (an Position 33,
68, 70, 73, 76, 82, 87 und 96) und pro hCNP kann durch weiterverarbeitende
Enzyme in vivo an spezifischen Positionen auf der C-terminalen Seite
dieser basischen Aminosäurereste
gespalten werden, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, daß in vivo solche
Peptide, die zusätzliche
Aminosäuren
an den N-Terminus von hCNP-53 gebunden haben, vorkommen].
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Es
wurde außerdem
festgestellt, daß das
Gen des hCNP-Vorläuferproteins,
das in 2 gezeigt ist, nicht nur den
strukturellen Genbereich, der für
das Protein codiert, enthält,
sondern auch den Promotorbereich, der das strukturelle Gen exprimiert.
Durch Zusammenführen,
zum Beispiel des CAT-Gens (Chloramphenicolacetyltransferase) mit
einem Bereich stromabwärts
von diesem Promotorbereich und durch Transduzieren dieser Kombination
in eine geeignete menschliche Zelle wird es möglich, den Mechanismus, der
hinter der Regulation der hCNP-Expression steht, genau zu untersuchen.
-
Folglich
werden die durch diese Erfindung erhaltenen Informationen bezüglich des
chromosomalen Gens des hCNP-Vorläuferproteins
und seiner primären
Aminosäuresequenz
einen großen
Beitrag leisten, nicht nur in Bezug auf zukünftige Studien zum Enträtseln des
Mechanismus, der hinter der Biosynthese steht, und der physiologischen
Wirkungen von CNPs im Menschen, sondern auch hinsichtlich der Anstrengungen, pharmazeutische
Anwendungen dieser Peptide, die der CNP-Familie angehören, festzusetzen.
