CN1280503A - 促使造血干细胞运动的方法 - Google Patents

Abstract

提供了一种通过给动物施用有效数量的成熟的、经过修饰的或多聚体形式的KC、groβ、groα或groγ以使造血干细胞从骨髓运动到外周循环的方法。

Description

促使造血干细胞运动的方法

发明的领域

本发明总体上涉及用于使造血干细胞运动的方法以及一种脱酰胺趋化因子。

发明的背景

所有的intercrine或趋化因子家族都是碱性的肝素结合多肽，它们都含有四个半胱氨酸，形成两对二硫键。所有这些功能已经被确定的蛋白被发现参与了前期炎症前和／或促修复功能。

在使用高剂量化学治疗的临床情形中，首选的生物分子是G-CSF。通常，在这种治疗中，先用低剂量的化学治疗剂，如环磷酰胺，使患者具有易感性。在缓解的过程中，用CSF，如用G-CSF，给患者进行治疗，这使得细胞最终从骨髓运动到外周循环中，以便获得用于白细胞分离复置法的血液。此后，给患者施用高剂量的化学治疗剂以诱导其癌症的临床上的缓解。由此造成的骨髓衰竭通过输注原先收集并储存的血细胞来治疗。这一过程可以通过，例如省略初始的化学治疗剂量及／或改变血液收集方法进行修改。

虽然这些造血干细胞移植技术的应用看起来是有希望的，但是为了获得足以成功地进行移植的干细胞以治疗单独使用G-CSF时的严重的骨髓抑制，必须进行多次血浆分离置换步骤[看，例如Bensinger et al．，血液，81：3158(1993)以及R．Haas et al．，肿瘤学研讨报告21：19(1994)]。因此，虽然有了这些显著的进展和一些特定的调控性生物分子的有效性，对于骨髓抑制患者来说，造血功能恢复的滞缓仍是发病和致死的一个重要原因。

本领域对用于增强造血功能恢复，具体地是用于与化学治疗相关的骨髓抑制情形中，的组合物和方法有持续的需要。

本发明的概述

在一个方面，本发明提供了把趋化因子用于制备用于刺激造血干细胞的药剂的应用方法。这一趋化因子包括源于KC、groβ、groα、以及groγ的蛋白，包括这些趋化因子的成熟的、经过修饰的以及多聚体的形式。

在另一方面，本发明提供了一种促使动物造血干细胞运动的方法，包括给动物施用有效量的此处所述的成熟的、经过修饰的或多聚体形式的趋化因子。

在另一方面，本发明提供了经过修饰的groβ(序列标号第三号的第5-73号氨基酸)的一种新颖的脱酰胺形式，它对于使造血干细胞运动是有用的。

本发明的其它方面及优点在下列本发明的优选实施例的详细描述中进行进一步的描述。

附图的简要说明

图1：显示groβ(序列标号第三号的第1-73号氨基酸)在实施例1中的单药剂促动(mobilization*)化验中的作用。

图2：显示经过修饰的groβ(序列标号第三号的第5-73号氨基酸)在实施例1中的单药剂促动化验中的作用。

图3：该条线图显示了在实施例1中的单药剂促动化验中磷酸盐缓冲液(PBS)、IL-8、groβ(序列标号第三号的第1-73号氨基酸)以及经过修饰的groβ(序列标号第三号的第5-73号氨基酸)之间的比较。

本发明的详细描述

本发明提供了用于治疗骨髓抑制的方法，通过使用此处所述的成熟的、经过修饰的或多聚体形式的趋化因子使造血干细胞从骨髓运动到外周血液中。

本发明还提供了截短的groβ(序列标号第三号的第5-73号氨基酸)的一种新颖的脱酰胺形式，以及它的一种药学组合物以及它在骨髓抑制治疗中的应用。

脱酰胺主要发生在第69位(用1-73命名法来定义Groβ的全长)。脱酰胺形成a及b两种天冬氨酸同质异构体，即天冬氨酸和异天冬氨酸。

令人吃惊地发现这种脱酰胺的形式保持了原体截短的groβ(5-73)的促动活性。这是出人意料的，因为其它的肽在其天冬酰胺被变为天冬氨酸或异天冬氨酸时都丧失了活性(Bongers et al．，国际肽蛋白研究杂志1992年4月：364-74；Friedmen et al．，国际肽蛋白研究杂志1991年1月：37(1)：14-20)。单独的脱酰胺(第69位)的截短的groβ(序列标号第三号的第5-73号氨基酸)或者其与没有脱酰胺的截短的groβ原体的混合物也可以被用于通过促使造血干细胞从骨髓运动到外周血管中来治疗骨髓抑制。

1．定义

如此处所定义的，“造血协同因子”或“HSF”指的是一族蛋白，包括天然及经过修饰的趋化因子，其特征在于当把其与另外一种造血因子，如集落刺激因子，或与循环中天然的CSF一起体内或体外结合施用时，它具有刺激造血作用的协同活性。

此处所用的术语“成熟的趋化因子”(也称“intercrine)定义的是本领域经常提及的KC、groα、groβ以及groγ蛋白。为了方便，鼠蛋白KC的氨基酸序列(含72个残基)被提供于序列标号第一号中。这些序列可从Genbank获得，登记号为J04596．人蛋白groα(氨基酸1-73)提供于序列标号第二号中。人蛋白groβ(氨基酸1-73)提供于序列标号第三号中。人蛋白groγ(氨基酸1-73)提供于序列标号第四号中。groγ的cDNA及氨基酸序列也被提供于国际专利申请出版号W0 92／00326(1992年1月9日)中。这些groγ的序列还进一步被发表于国际专利申请出版号WO 94／29341(1994年12月22日)中，其内容作为参照结合于此文中。

术语“经过修饰的趋化因子”如上面所引用的国际申请中所定义。经过修饰的趋化因子来源于KC、groβ、groα以及groγ，优选地来源于groβ、groα、groγ，最优选地来源于groβ。经过修饰的趋化因子包括在成熟蛋白的N端去除2至8个氨基酸的脱氨基蛋白。在本发明方法中有用的脱氨基趋化因子优选地是从成熟蛋白的N端去除2至8个氨基酸。最优选地，经过修饰的趋化因子优选地是从N端去除前4个氨基酸。可选地，特别是在重组表达时，在本发明中有用的脱氨基趋化因子在其N端可插入一个甲硫氨酸。为了表达而被插入N端的甲硫氨酸可以在宿主细胞对蛋白进行处理的过程中被除去，或者用已知的技术用合成的方法除去。可选地，如果需要，该氨基酸也可以通过酶解或其它已知的方法除去。

术语“经过修饰的趋化因子”还包括这些蛋白的具有成熟蛋白相同生物学活性的类似物或衍生物。如此处所定义的，此类类似物或衍生物包括对一些蛋白(如序列标号第1至4号中所提供的蛋白)的已知的氨基酸序列进行改变以后所获得的经过修饰的蛋白。这些类似物的特征是其氨基酸序列与成熟蛋白的有8个或更少残基的区别，优选的是只有大约5个或更少残基的区别。优选的是这些蛋白氨基酸序列的区别仅是保守氨基酸的替换。保守氨基酸替换发生于用一个带电荷与其所替换的氨基酸基本相同的氨基酸进行替换，而且这种替换并不显著地影响该蛋白的局部构象及其生物学活性。可选地，也可以优选通过例如在序列中插入一个可能影响蛋白稳定性的特定的氨基酸来改变蛋白，或者允许蛋白在所需的宿主细胞中进行表达。这些经过修饰的蛋白的另外一个特征是与成熟的蛋白相比，它们的生物活性增强了。

“多聚体蛋白”或“多聚体”于此指的是在本发明中有用的成熟的和／或经过修饰的蛋白的多聚体形式，如二体、三体、四体或其它的聚集态形式。这些多聚体形式可以通过合成或重组表达进行制备，而且可以含有通过如下所具体描述的合成与重组技术相结合的形式生产的趋化因子。多聚体可以是在表达的时候自然形成的，或者是通过构建形成这样的多聚体形式。多聚体趋化因子可以包括由同种经过修饰的趋化因子组成的多聚体。另外一种多聚体可以通过不同的经过修饰的蛋白的聚集来形成。还有另外一种多聚体是通过把本发明的一种经过修饰的蛋白与一种已知的成熟的趋化因子相聚集来形成。优选地，在本发明中有用的二体或多聚体可含有至少一种脱氨基趋化因子蛋白以及至少一种另外的趋化因子或其它的具有同种生物活性的蛋白。上述的另外的蛋白可以是一种另加的脱氨基趋化因子，或一种已知的蛋白。

Ⅱ在本发明中有用的蛋白

总体上，在本发明方法中有用的趋化因子包括成熟的趋化因子，或其经过修饰的或多聚体形式的蛋白，它们在国际专利申请出版号WO94／29341中有详细的描述。优选地，这些趋化因子选自KC、groα、groβ、以及groγ，最优选地这种趋化因子是groβ。

在一个优选实施例中，本发明方法使用本发明的一种脱氨基趋化因子蛋白。这一蛋白含有在本发明中有用的成熟趋化因子(序列标号第1-4号)的N端第2至8位残基截短的氨基酸序列。优选地，本发明的脱氨基蛋白的蛋白序列取用序列标号第2-4号中的5-73位氨基酸，或者是序列标号第1号的5-72位氨基酸。最优选的，本发明的方法是脱氨基的groβ，其氨基酸序列为序列标号第3号的5-73位氨基酸，或者是脱酰胺脱氨基的groβ，其氨基酸序列为序列标号第3号的5-73位氨基酸，而且其第69位氨基酸被脱酰胺变为异天冬氨酸或天冬氨酸，或者是脱酰胺及没有脱酰胺的含有序列标号第3号中的第5-73位氨基酸的脱氨基的groβ。

如WO 94／29341中所述，可以对在本发明方法中有用的KC、groα以及groγ蛋白进行类似的修改。这些蛋白在该文献中都有描述而且是本领域技术人员所共知的。

优选的在本发明中有用的多聚体蛋白包括含有至少一个脱氨基趋化因子蛋白以及至少一种其它的趋化因子或其它的具有同种生物学活性的蛋白。上述的其它的蛋白可以是一种另加的脱氨基趋化因子，或另外一种已知的蛋白。例如，一种在本发明中有用的合乎需求的二体含有两个如上所述的脱氨基蛋白，优选地是通过二硫键连接的。一种合乎需求的多聚体可以是两个或多个脱氨基groβ蛋白的聚集体，特别是两个含有序列标号第3号中的第5-73位氨基酸的蛋白。可选地，本发明的另外一种二体可以是本发明的脱氨基groβ蛋白与成熟groβ蛋白的组合。类似地，二体或其它的多聚体形式的各种不同的组合可以是成熟的或经过修饰的groβ与其它趋化因子，如KC、groα、groβ以及groγ，的组合，例如，本发明的一种脱氨基groβ蛋白可以与一个未经过修饰的成熟的groα蛋白形成二体。本领域的技术人员可以通过使用本发明的经过修饰的趋化因子来获得其它的合乎需求的多聚体。然而，使用由两种或多种不同的如此处所定义的经过修饰的蛋白组成的多聚体形式在本发明中是有用的。用于此种方法中的趋化因子也可以是由如上所讨论的一种经过修饰的趋化因子与另外一种已知的成熟蛋白组成的多聚体形式。

这些蛋白和单体已被详细描述于上述文献中而且可以用常规的技术和／或在国际专利申请出版号WO 94／29341中所描述的方法进行合成，或通过重组进行生产。

Ⅲ药学组合物

优选地，在本发明方法中有用的趋化因子被用于制备药剂，也／或以药学组合物的形式被使用。因此，这些趋化因子可以被配制成药学组合物并用，例如，在国际专利申请出版号WO 90／02762(1990年3月22日)以及WO 94／29341(1994年12月22日)中所描述的同种方法进行施用。

这些在造血干细胞的促动中有用的药剂药学组合物含有治疗有效量的一种如此处所定义的成熟的、经过修饰的或多聚体形式的趋化因子以及一种可接受的药学载体。如此处所使用的，术语“药学的”包括本发明的兽医应用。

术语“治疗有效量”指的是所用的对促动造血干细胞有用的趋化因子的数量，不管是单体还是多聚体形式，足以实现所需要的生理学作用。

一般地，一种在本发明中有用的成熟的、经过修饰的或脱氨基的趋化因子(如groβ)的单次施用剂量介于大约0．01ng／kg体重至10mg／kg体重之间。优选地，当在本发明方法中使用一种多聚体形式的趋化因子时，所使用的药剂或组合物所含有的这种多聚体蛋白的数量接近这个范围的下限。优选地，这些药学组合物是通过注射的形式施用给人或其它哺乳动物实验者的。然而，可以用任何一种合适的内部途径进行施用，而且可以根据需要进行重复施用，例如，一天1至3次，持续1天至大约一周。

合适的药学载体对于本领域的技术人员是熟知的，可以任意选用。目前，优选的载体是生理盐水。可选地，本发明的药学化验可以含有其它的活性成分或与其它的治疗剂结合施用。合适的可选的成分或其它的治疗剂包括那些通常被用于治疗具有此种特性的疾病的物质，如其它的消炎剂、利尿剂及免疫抑制剂，等等。优选地，这些经过修饰的趋化因子是特别适于与集落刺激因子结合施用的。

Ⅳ使造血干细胞运动的方法

本发明提供了用于对免疫抑制或造血干细胞或由此分化的细胞数目少疾病进行治疗的方法，这些疾病包括但不局限于，发炎、发烧、病毒性、真菌性和细菌性感染、癌症、骨髓衰竭、造血功能紊乱、再生障碍性贫血、自身免疫疾病；以及造血及／或骨髓细胞产量或分化低下疾病。这一方法包括给一选定的哺乳动物施用本发明的药学组合物。优选地，这一组合物是与集落刺激因子一起施用的，或者，这一组合物中含有集落刺激因子。合适的集落刺激因子来源是众所周知的，并且包括，例如，天然的、合成的以及重组的GM-CSF、M-CSF、G-CSF以及IL-3。在另一个优选实施例中，一个在本发明中有用的脱氨基趋化因子可被体内施用并允许与在被选的患者中发现的天然的集落刺激因子协同作用。

在一个优选实施例中，本发明的方法把此处所述的脱氨基趋化因子与GM-CSF(或G-CSF)结合使用。根据本发明把一种经过修饰的趋化因子，如脱氨基的groβ或脱酰胺的脱氨基的groβ与脱氨基groβ的混合物与G-CSF结合使用(这种结合已经被发现具协同性)使得可给患者施用低剂量的G-CSF，从而减少了由GM-CSF(G-CSF)造成的极其令人难受的副作用。

在本发明中有用的成熟的趋化因子以及经过修饰的或多聚体形式的趋化因子的特征在于当被单独施用时，它们具有使造血干细胞运动的能力；或者当被与另外一种造血因子，如集落刺激因子或生长因子一起体内或体外施用，或者与天然循环中的CSF相结合，或者在一个与化学治疗剂一起的方法中施用时，在刺激造血作用时具有协同活性。

在一个实施例中，本发明提供了一种用于使动物的造血干细胞运动的方法，通过给动物施用有效数量的含有选自人groβ[序列标号第3号]、人groα[序列标号第2号]、人groγ[序列标号第4号]以及鼠KC[序列标号第1号]的成熟的趋化因子的组合物或药剂。

在本发明的另外一个实施例中，一种用于使造血干细胞运动的方法，包括给动物施用有效数量的来源于选自groβ、groα、groγ及KC的一种趋化因子的经过修饰的蛋白。作为一个优选实施例，提供了一个给动物施用有效数量的来源于趋化因子人groβ[序列标号第3号]的经过修饰的蛋白促使造血干细胞运动的方法。

在另一方面，本发明提供了一种用于使造血干细胞运动的方法，包括给动物施用有效数量的多聚体蛋白，该多聚体蛋白包括至少一种如上所述的趋化因子以及第二种趋化因子。

在执行使造血干细胞运动的方法的过程中，术语这些蛋白的“有效数量”可以被定义为当把用合适的方法给患者施用该数量时，它可以使造血干细胞运动并增加外周血液中造血干细胞的数量。这一数量预期比刺激造血祖细胞的生长和发育所需的数量更多。在可应用的临床或兽医疾病中，这一有效数量增加了循环中从造血干细胞分化的细胞的数量。合乎需要的有效数量为每次0．01ng／kg至10mg／kg体重之间。

合适的用于使干细胞运动的施用方法包括但不局限于，把有效数量进行快速注射或通过注射、静脉点滴、或其它的任何一种合适的内部途径(包括皮下注射)进行增量施用。用药剂量可以根据需要进行重复，例如一天1至3次，持续1天至大约一周。

另外，使用了上面所鉴定的成熟的趋化因子，或经过修饰的或多聚体形式的趋化因子的本发明的方法可以被用于外周血液造血干细胞移植疗法中。例如，在施用一可选的初始剂量的化学治疗剂之后，作为对CSF的替代，施用上面所鉴定的成熟的趋化因子，或经过修饰的或多聚体形式的趋化因子，以便使造血干细胞从骨髓运动到外周循环中以进行收获并在接受高剂量的化学治疗之后重新施用回去。合适的化学治疗剂包括但不局限于众所周知的药剂，如环磷酰胺、顺铂、ARA-C，5-氟尿嘧啶、依托泊甙、卡铂、白消安(busulphan)、米托蒽醌以及卡莫司汀。当与根据本发明的趋化因子一起施用时，化学治疗剂的数量是通常所使用的，例如大约1．2g／m²的依托泊甙、800mg／m²的ARA-C、200mg／m²的环磷酰胺，等等。此类剂量可参考Hass et al．肿瘤学研讨报告，21：19-24(1994)，该文被作为参照结合于此文中。

上面所鉴定的趋化因子可被用于补充在治疗中通常所使用的CSF。可选地，上面所鉴定的趋化因子可结合其它的造血调控生物分子，如上面所提及的参与造血作用的分子，或生长因子、通常的配药剂及／或药物，进行治疗。这类生长因子的合适的来源是众所周知的，包括但不局限于天然的、合成的以及重组的GM-CSF、G-CSF、干细胞因子、以及Flt-3配体。其它合适的生物分子包括(S)-5-氧-L-脯氨酰-a-谷氨酰-L-a-天冬氨酰-N⁸-(5-氨基-1-carboxypentyl)-8-氧-N⁷-[N-{N-(5-氧-L-脯氨酰)-L-a-谷氨酰}-L-a-天冬氨酰]-L-苏氨-2，7，8-三氨基辛酰基-赖氨酸-[(p谷氨酸-谷氨酸-天冬氨酸)₂-Sub*-(赖氨酸)₂][Pelus et al．，Exp．Hematol．，22：239-247(1994)]。本领域的技术人员可以任意选择用于同时施用的其它药剂及药物。

用本发明替代或结合传统的外周血管造血干细胞移植方法的优点在于PMN以及／或血小板的恢复比骨髓移植的还要快，感染的风险减少，而且此种方法允许施用潜在的更高治疗剂量的化学治疗，或一系列的剂量更加密集的化学治疗。

下列的实施例仅仅是解释性的，并不局限本发明的范围。

实施例1-促动化验

来源于KC[序列标号第1号]、groβ[序列标号第3号]以及groγ[序列标号第4号]的趋化因子，包括经过修饰的以及多聚体形式的趋化因子，是用已知的技术制备的。涉及此类趋化因子制备的另外的讨论请参照WO 94／29341。对这些趋化因子使小鼠造血干细胞运动的能力进行了测验。每一种趋化因子的测试浓度为50、10、2mg／小鼠并通过皮下、肌肉内、腹膜内、静脉、或口服途径施用。趋化因子对造血干细胞的促动作用的动力学是通过心脏穿刺从小鼠收集血样，在60分钟的范围内每15分钟监测一次。用Lympholyte-M密度梯度把被促动的造血干细胞分离，并分步收集。把细胞清洗备用。用一架装备有兽医学软件的TechniconHl血液学分析仪计算成熟血细胞因子。成熟炎症细胞，如多形核(PMN)细胞、嗜酸性粒细胞以及嗜碱性粒细胞的运动在评估总体的潜在炎症特征时被加以考虑。

为了监测早期及晚期的造血祖细胞，进行了CFU-GM化验，即，在第7及第14天对在促动阶段收集的血样进行集落形成单位(CFU-GM)的评估。把在不含血清的McCoys培养基中的细胞调整到10⁶细胞／ml。使用一单层琼脂系统，它含有McCoys培养基，并加强有营养物(NaHCO₃，丙酮酸，氨基酸，维生素以及HEPES缓冲液)、0．3％Bacto琼脂、以及15％胎牛血清。把来源于血液的细胞(终浓度10⁵细胞／ml)加到琼脂体系中。把琼脂平板在37℃，7．5％ CO₂保温7-14天。用显微镜计算增殖细胞(CFU-GM)的集落。

另外，在第14天的CFU培养物中计算早期的造血高增殖潜能(HPP)祖细胞。

趋化因子IL-8能够作为一个单一的因子使造血干细胞运动，把它作为阳性对照包括在这些研究中。

初步实验显示施用groβ[序列标号第3号]使CFU-GM发生剂量依赖的运动，这与对照的结果是相似的．经过修饰的groβ，即去掉4个氨基酸的groβ(氨基酸5-73)所刺激的造血母细胞的数量比groβ(氨基酸1-73)或IL-8显著增加。在用groβ治疗的小鼠中，没有观察到成熟细胞因子有显著的变化(＞3倍)，显示造血母细胞特定的运动。这一结果显示经过修饰的脱氨基趋化因子比起成熟的蛋白，其促动特征增强了。

实施例2-结合造血刺激剂的促动化验

把造血刺激剂与被如上鉴定为促动因子的趋化因子一起化验。造血刺激剂包括G-CSF、GM-CSF、(s)-5-氧-L-脯氨酰-a-谷氨酰-L-a-天冬氨酰-N⁸-(5-氨基-1-carboxypentyl)-8-氧-N⁷-[N-{N-(5-氧-L-脯氨酰)-L-a-谷氨酰}-L-a-天冬氨酰]-L-苏氨-2，7，8-三氨基辛酰基-赖氨酸-[(p谷氨酸-谷氨酸-天冬氨酸)₂-Sub-(赖氨酸)₂][Pelus，如上所引用的]以及FLT-3配体。也可使用任何一种G-CSF模仿物，即任何一种非CSF类G-CSF或GM-CSF、但却具有造血活性的造血刺激剂。

在结合化验中，在施用源于KC[序列标号第1号]、groβ[序列标号第3号]以及groγ[序列标号第4号]的趋化因子或经过修饰的或多聚体形式的趋化因子的四天之前，给小鼠施用50mg／kg的造血刺激剂，如G-CSF。如在实施例1中，可以选择不同的趋化因子剂量和血液收集时间。

如上面实施例1中所述，用SCF、IL-1以及GM-CSF作为集落刺激活性的来源进行CFU-GM化验。如实施例1中所述，对成熟的血液细胞因子、早期及晚期的祖细胞进行测量。

在结合造血刺激因子进行预处理的研究中，使用MIP-1α作为阳性对照。

实施例3-小鼠外周血液干细胞移植模型

A．原始长期种群恢复(Primitive Long Term Repopulating)干细胞的促动

以下实验是在一体内干细胞移植模型中进行的，用以确定氨基端截短的groβ[序列标号第3号的5-73位氨基酸；称groβ-T]是否可以使原始长期种群恢复干细胞运动。在这一模型中，给经γ射线照射的小鼠施用骨髓细胞。小鼠存活100天。

从经PBS、groβ-T(50mg，15-30分钟)、G-CSF(1mg／小鼠，BID×4)处理，或先经G-CSF，再经groβ-T治疗(以拯救要不然会因致命照射而致死的小鼠)的小鼠中收集血液干细胞。在移植后第100天从经过PBS处理或0-10％蛋白的小鼠收集血液单核细胞(达1E+6)或接受骨髓细胞作为化验阳性对照的小鼠在第100天的存活率为100％。从经过groβ-T治疗的小鼠收集的被促动的血液细胞(1E+6／小鼠)单独可以保护70％的接受者。从经过G-CSF治疗的提供者收集的被促动的血液细胞(1E+6／小鼠)可以保护80％的接受者。从经过G-CSF以及groβ-T治疗的提供者收集的被促动的血液细胞所促动的种群恢复细胞的数目比单独的G-CSF所促动的还要多。

B．外周血液干细胞的促动

对在经照射的宿主中由groβ-T所恢复的成熟血液细胞谱系对外周血液干细胞的促动速率进行了评估。给经过照射的接受者注射1E+6低密度外周血液细胞(LDPBC)并在照射后第7-19天通过心脏穿刺取血。来源于不同组别的LDPBC都是在最佳条件下收集的，以用于CFU-GM的促动。在此实验中被比较的组别有：PBS、单独的groβ-T(50mg，15分钟)、单独的G-CSF(BID×5天，1mg／小鼠)、以及groβ-T+G-CSF。每天都从正常的小鼠中取血用于与经移植的动物作比较。

接受经PBS治疗的提供者的移植的小鼠未能恢复成熟细胞因子并死亡。在接受经截短的groβ-T促动的细胞的小鼠中，中性粒细胞的恢复速率比那些接受经G-CSF促动的细胞的还要快。移植有经groβ-T+G-CSF组合促动的LDPBG的小鼠的中性粒细胞的恢复速率比经groβ-T促动的细胞的还要快。

在同样的小鼠中，血小板计数的恢复速率的模式是一样的，即：groβ-T+G-CSF＞groβ-T＞G-CSF＞＞PBS。然而，在第19天，血小板计数仍然远远没有恢复到正常值。这些数据表明经groβ-T促动的血液干细胞移植到接受的小鼠中，使得小鼠的中性粒细胞核血小板的恢复速率与经G-CSF促动的干细胞相等或比它更好。

实施例4．Groβ-T的制备

Groβ-T的表达

Groβ-T是在大肠杆菌中用LW14宿主菌株以及一个表达载体(pEAHy)进行胞内表达的。表达是通过位于载体上的λ噬菌体的PL启动子以及一个温度敏感的c1857阻遏子来控制的。表达是通过生长中细胞的温度变化来诱导的。被诱导的蛋白位于细胞裂解物不溶性沉淀物中。把从10升发酵物中收获的细胞冷冻于-70℃。

细胞的裂解、重新折叠以及Groβ-T的纯化

把冷冻的细胞分散在20mM的柠檬酸钠缓冲液(pH6．0，含40mM NaCl，2mM EDTA(10ml／g细胞)中，通过两种途径通过Microfluidics M110Y或Gaulin在11，000psi进行裂解。裂解物在4℃，离心10，000g 1小时。所有的Groβ-T都在沉淀物中，把裂解物的上清倒掉。在25℃，把裂解物用2 M盐酸胍，50 mM Tris HCl pH7．0(2ml／g细胞)溶解2小时。溶液用等体积的水稀释，不溶物通过15，000g，1小时离心除去。为了把所有的Groβ-T转化为还原型的，把上清调到含20mM DTT并在25℃保温2小时。用5mM HCl把溶液稀释到10ml／g细胞，从而产生大量的沉淀。沉淀物(不含有Groβ-T)通过25，000g，1小时离心除去。清澈的上清液对着5mM HCl进行透析(3K截流)或透析过滤(Filtron，3K截流)。把在5mM HCl中的Groβ-T用2 M的Trizma碱中和到pH7．5并把它调到含1mM半胱氨，0．2mM胱氨，1mM EDTA。在25℃放置2小时让其重新氧化。用1 M HCl把溶液调到pH6．5，然后把其上到用缓冲液A(50mM Mes，pH6．5)平衡的Toyopreal SP 650 M柱(2ml树脂／g细胞)上。用5倍柱体积的缓冲液A，然后用5倍柱体积的22％的缓冲液B(1 M NaCl，溶于缓冲液A中)，清洗柱子。用35％的缓冲液B把Groβ-T洗脱出来，其纯度大于95％。把汇集样品用0．4 M NaCl过Q-Sepharose柱以便除去任何有关的DNA或内毒素，然后用含有50mM NaCl的1mM磷酸钾pH6．5(缓冲液P)透析，再过羟基磷灰石柱(BioRadMacroPrep Ceramic Hydroxyapatite Type Ⅰ)。羟基磷灰石柱用含有0．15M NaCl的缓冲液P清洗以除去杂质，用含0．5 M NaCl的缓冲液P洗脱Groβ-T。把羟基磷灰石柱的汇集样品用盐水进行透析，然后保存于-70℃，在这个温度样品极其稳定。为了获得同源的没有脱酰胺的Groβ-T，把来自SP柱的汇集样品用C18 RP-HPLC柱(代替Q-Sepharose及羟基磷灰石柱)进行部分收集。把SP汇集样品调节到含有0．1％TFA并把其上到用12．5％缓冲液R(80％乙腈，溶于0．1％TFA中)平衡的Vydac C18柱(2．2×25cm，10微米，Nest Group)上。用一倍柱体积的33％的缓冲液R清洗柱子。用5倍柱体积的线性梯度(30％-40％)的缓冲液R清洗Groβ-T。把来源于C18柱的汇集样品冻干，用盐水重悬到10mg／ml，对着盐水彻底透析，然后保存在-80℃，以备动物研究使用。

脱酰胺Gro-T的制备

当把经过如上纯化的Gro-T在25℃在0．1M磷酸钠缓冲液(pH 8．0)中保温5天后，根据毛细管电泳分析，Gro-T被完全脱酰胺。用NMR谱仅鉴定到一个单一的脱酰胺位置，即N69D。

实施例5．

用反向高压液相色谱检测Gro-T的脱酰胺产品

用一支连接到HP 1090色谱系统(Hewlett Packard)的Zorbax300SB-C8反向高压液相色谱柱(2．1mm×150mm，部件号883750．906，Rockland Technologies，Inc．)对Iso-Asp 69、Asp 69以及Groβ-T不同的天然Asn69型(非还原型，不同的是其二硫键状态)进行了分辨。典型的分析是注入16μg的Gro-T混合液(溶解于40μl的0．1％TFA水溶液中)。用线性梯度洗脱(见表1)实现分离，通过把缓冲液A(含有1 ml‘Baker Analyzed’HPLC级TFA，加入到1L的Nanopure Ⅱ水中)和缓冲液B(含有80％乙腈，0．1％TFA，即把800ml HPLC级的乙腈加入到200毫升水中，然后再加入1毫升的HPLC级TFA)。把柱温保持在60℃，在210和215nm处检测峰。

表1．

时间(分钟)	流速(毫升／分钟)	缓冲液A(％)	缓冲液B(％)
				0．0	0．2	71．0	29．0
60．0	0．2	68．0	32．0
				65．0	0．2	68．0	32．0
68．0	0．2	71．0	29．0
				80．0	0．2	71．0	29．0

Iso-Asp 69、Asp 69以及天然的Asn 69 Groβ-T肽的持留时间分别为44．2分钟51．9分钟以及47．7分钟。

使用上述的相同的层析条件并把梯度稍作修改，实现了用还原的二硫键(还原型)对天然的和Groβ-T脱酰胺产品的分析。

表2．

时间(分钟)	流速(毫升／分钟)	缓冲液A(％)	缓冲液B(％)
				0．0	0．2	68．0	32．0
60．0	0．2	64．0	36．0
				65．0	0．2	64．0	36．0
68．0	0．2	68．0	32．0
				80．0	0．2	68．0	32．0

还原型的Iso-Asp 69、Asp 69以及天然的Asn69 Groβ-T肽的持留时间分别为43．7分钟50．6分钟以及46．9分钟。

在上述的详细说明中，包括了对本发明进行的多种多样的修饰和变化，它们对于本领域的技术人员应该是显而易见的。对本发明的组合物及工序进行的此类的修饰和变化被认为是包含在此处所增补的权利要求的范围中的。序列表(1)．一般信息：(ⅰ)申请者：SmithKline Beecham Corporation

King，Andrew G．

Qian，Yanqiu(ⅱ)发明的题目：促使造血干细胞运动的方法(ⅲ)序列数目：4(ⅳ)联系地址：

(A)地址：SmithKline Beecham Corporation-

Corporate Patents

(B)街道：709 Swedeland Road

(C)城市：King of Prussia

(D)州：PA

(E)国家：美国

(F)邮编：19406-2799(ⅴ)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS／MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release #1．0，Version #1．30(ⅵ)此次申请日期：

(A)申请号：PCT／US98／待定

(B)入档日期：27-11-1998

(C)分类：(ⅶ)先前申请日期：

(A)申请号：08／999，804

(B)入档日期：26-11-1997

(A)申请号：PCT／US96／17074

(B)入档日期：24-10-1996

(A)申请号：US 08／547，142

(B)入档日期：24-10-1995(ⅷ)代理人／律师信息：

(A)姓名：Hall，Linda E．

(B)注册号：31，763

(C)参考号码／关税完税证：P50161-3(ⅸ)通讯信息：

(A)电话：215-270-5016

(B)电传：215-270-5090(2)SEQ ID 1的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：72个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链的性质：

(D)拓扑学：未知(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID 1：Ala Pro Ile Ala Asn Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Met1               5                  10                  15Ala Gly Ile His Leu Lys Asn Ile Gln Ser Leu Lys Val Leu Pro

             20                  25                  30Ser Gly Pro His Cys Thr Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys

             35                  40                  45Asn Gly Arg Glu Ala Cys Leu Asp Pro Glu Ala Pro Leu Val Gln

             50                  55                  60Lys Ile Val Gln Lys Met Leu Lys Gly Val Pro Lys

             65                  70(2)SEQ ID 2的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：73个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链的性质：

(D)拓扑学：未知(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID 2：Ala Ser Val Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu1               5                  10                  15Gln Gly Ile His Pro Lys Asn Ile Gln Ser Val Asn Val Lys Ser

             20                  25                  30Pro Gly Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys

             35                  40                  45Asn Gly Arg Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Ile Val Lys

             50                  55                  60Lys Ile Ile Glu Lys Met Leu Asn Ser Asp Lys Ser Asn

             65                  70(2)SEQ ID 3的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：73个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链的性质：

(D)拓扑学：未知(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID 3：Ala Pro Leu Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu1               5                  10                  15Gln Gly Ile His Leu Lys Asn Ile Gln Ser Val Lys Val Lys Ser

             20                  25                  30Pro Gly Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys

             35                  40                  45Ash Gly Gln Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Lys

             50                  55                  60Lys Ile Ile Glu Lys Met Leu Lys Asn Gly Lys Ser Asn

             65                  70(2)SEQ ID 4的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：73个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链的性质；

(D)拓扑学：未知(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID 4：Ala Ser Val Val Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu1                 5                    10                    15Gln Gly Ile His Leu Lys Asn Ile Gln Ser Val Asn Val Arg Ser

               20                    25                    30Pro Gly Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys

             35                  40                  45Asn Gly Lys Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Gln

             50                  55                  60Lys Ile Ile Glu Lys Ile Leu Asn Lys Gly Ser Thr Asn

             65                  70

Claims (8)

1．促使造血干细胞运动的方法，包括给患者施用有效数量的一种选自以下的经过修饰的gro?蛋白：

(a)SEQ ID NO：3的5至73号氨基酸，其中第69位氨基酸已经被脱脱酰胺基变为天冬氨酸或异天冬氨酸；以及

(b)(a)与含有SEQ ID NO：3的5至73号氨基酸的经过修饰的gro?蛋白的结合。

2．如权利要求1中所述的方法，其中上述的经过修饰的gro?蛋白含有介于大约0．01ng至1g的上述的经过修饰的gro蛋白。

3．如权利要求1中所述的方法，其中上述的经过修饰的gro?蛋白是与生长因子或其它的造血调节生物分子一起施用的。

4．如权利要求3中所述的方法，其中上述的生长因子选自GM-CSF、G-GSF、干细胞因子、或Flt-3配体。

5．如权利要求1中所述的方法，其中经过修饰的gro?蛋白被用于对接受了外周血液造血干细胞移植的患者进行治疗。

6．如权利要求5中所述的方法，其中患者在接受gro?蛋白治疗之前已经接受了一定剂量的所选定的化学治疗剂；已经从接受治疗的患者的外周血液收集了造血干细胞；并施用一种化学治疗剂；然后把所提取的细胞重新输注给患者。

7．如权利要求6中所述的方法，其中上述的化学治疗剂选自：环磷酰胺、顺铂、ARA-C、5-氟尿嘧啶、依托泊甙、表亚霉素、卡铂、白消安(busulphan)、米托蒽醌以及卡莫司汀。

8．一种含有SEQ ID NO：3的5至73号氨基酸的新颖的趋化因子，其中氨基酸第69号已经被脱脱酰胺基变为天冬氨酸或异天冬氨酸。

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