ES2239814T3 - Metodo de movilizacion de celulas madre hematopoyeticas. - Google Patents
Metodo de movilizacion de celulas madre hematopoyeticas.Info
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Abstract
El uso de una cantidad efectiva de una proteína gro modificada que tiene una secuencia proteínica que comprende los aminoácidos 5 a 73 de la SEQ ID NO:3, en la que el aminoácido 69 ha sido desamidado hasta ácido aspártico o ácido isoaspártico, en la fabricación de un medicamento para uso en la movilización de las células madre he matopoyéticas de un paciente.
Description
Método de movilización de células madre
hematopoyéticas.
La presente invención se refiere en general a
métodos para movilizar las células madre hematopoyéticas y a una
nueva quimioquina desamidada.
Todos los miembros de la familia de las
intercrinas o quimioquinas son polipéptidos básicos que se ligan a
la
heparina, que tienen cuatro restos de cisteína que forman dos puentes disulfuro. Todas estas proteínas que han sido
caracterizadas funcionalmente, parece que están involucradas en funciones proinflamatorias y/o restaurado-
ras.
heparina, que tienen cuatro restos de cisteína que forman dos puentes disulfuro. Todas estas proteínas que han sido
caracterizadas funcionalmente, parece que están involucradas en funciones proinflamatorias y/o restaurado-
ras.
En situaciones clínicas para el uso de altas
dosis de quimioterapia, la biomolécula de elección ha sido
G-CSF. Generalmente, en tal tratamiento, los
pacientes se preparan con una dosis baja de un agente quimioterápico
como ciclofosfamida. Durante la remisión, el paciente se trata con
un factor estimulante de la formación de colonias hematopoyéticas
(CSF), tal como el factor estimulante de colonias de granulocitos
(G-CSF), que causa la movilización eventual de
células desde la médula ósea a la circulación periférica para la
recogida de sangre tras leucoforesis. Se administra después al
paciente una dosis alta de quimioterapia para inducir la remisión
clínica de su cáncer. La insuficiencia resultante de la médula ósea,
se trata por perfusión de las células sanguíneas almacenadas,
recogidas previamente. Este procedimiento puede ser modificado, por
ejemplo, por la omisión de la dosis inicial de quimioterapia y/o por
protocolos alternativos de recogida de sangre.
Aunque el uso de estas técnicas de trasplante de
células madre hematopoyéticas parece prometedor, se requieren
procedimientos múltiples de aféresis para recoger suficientes
células madre para un injerto satisfactorio, para tratar la
mielodepresión grave cuando se usa G-CSF solo [véase
por ejemplo Bensinger et al., Blood, 81: 3158
(1993) y R. Haas et al., Sem. in Oncology,
21:19(1994)]. Por tanto, a pesar de estos avances
significativos y de la disponibilidad de ciertas biomoléculas
reguladoras, el retraso de la recuperación hematopoyética sigue
siendo una fuente importante de morbilidad y mortalidad para los
pacientes mielodeprimidos.
El documento WO 97 15595 describe un método para
movilizar las células madre hematopoyéticas mediante la
administración, entre otros, de ciertas formas modificadas de
gro\beta.
Existe una necesidad permanente en la técnica, de
composiciones y métodos que mejoren la recuperación hematopoyética,
particularmente en los casos de quimioterapia asociada a
mielodepresión.
En un aspecto, la presente invención proporciona
el uso de una nueva forma desamidada de una proteína gro\beta
modificada (aminoácidos 5-73 de la SEQ ID NO. 3) que
está desamidada en el resto 69 y es útil para movilizar las células
madre hematopoyéticas, en la preparación de un medicamento para la
estimulación de las células madre hematopoyéticas y sus formas
multiméricas.
En otro aspecto más, la presente invención
proporciona un método para movilizar las células madre
hematopoyéticas en un animal, que comprende administrar a un animal
una cantidad efectiva de una quimioquina gro\beta modificada o
multimérica como se describe aquí.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona una nueva forma desamidada de una proteína gro\beta
modificada (los aminoácidos 5-73 de la SEQ ID NO:3)
que está desamidada en el resto 69 y es útil para movilizar las
células madre hematopoyéticas.
Otros aspectos y ventajas de la presente
invención se describen adicionalmente en la siguiente descripción
detallada de las realizaciones preferidas de la misma.
La Figura 2 es un gráfico que demuestra el efecto
de gro\beta modificada (los aminoácidos 5-73 de la
SEQ ID NO:3) en el ensayo de movilización con agente único del
Ejemplo 1 (ejemplo comparativo).
La Figura 3 es un gráfico de barras que demuestra
la comparación de la solución salina tamponada de fosfato (PBS),
IL-8, gro\beta (los aminoácidos
1-73 de la SEQ ID NO:3) y gro\beta modificada (los
aminoácidos 5-73 de la SEQ ID NO:3) en el ensayo de
movilización con agente único (Ejemplo 1 - ejemplo comparativo).
La presente invención proporciona métodos para el
tratamiento de la mielodepresión, movilizando las células madre
hematopoyéticas desde la médula ósea a la sangre periférica usando
las quimioquinas gro\beta modificadas o multiméricas que se
describen aquí.
Más particularmente, la presente invención
proporciona una nueva forma desamidada de una gro\beta truncada
(los aminoácidos 5-73 de la SEQ ID NO:3) desamidada
en el resto 69, una composición farmacéutica de la misma, y su uso
en el tratamiento de la mielodepresión.
La desamidación tiene lugar en la posición 69
(usando la nomenclatura 1-73 para definir la
longitud completa de gro\beta). La desamidación forma los
productos isómeros \alpha o \beta de aspartato; ácido aspártico
y ácido iso-aspártico.
Se ha demostrado de forma sorprendente, que esta
forma desamidada retiene la actividad para movilizar, de la proteína
gro\beta truncada padre (5-73). Esto era
inesperado, puesto que otros péptidos, han perdido la actividad
cuando el Asn ha sido cambiado a Asp o a Iso-Asp
(Bongers et al., Int. J. Pept. Protein Res. 1992 Apr;
39(4):364-74; Friedmen et al., Int.
J. Pept. Protein Res. 1991 Jan;
37(1):14-20). La gro\beta truncada
(aminoácidos 5-73 de la SEQ ID NO:3) desamidada
(posición 69), sola y en mezcla con la gro\beta truncada padre no
desamidada, se puede usar también para el tratamiento de la
mielodepresión por la movilización de las células madre
hematopoyéticas desde la médula ósea a la sangre periférica.
Como se define aquí, "factor hematopoyético
sinérgico" o "HSF" se refiere a una clase de proteínas,
incluyendo las quimioquinas presentes en la naturaleza y las
quimioquinas modificadas, que se caracterizan por tener actividad
sinérgica para estimular la hematopoyesis cuando se administran
in vivo e in vitro con otro factor hematopoyético, tal
como un factor estimulante de colonias, o cuando se combinan con los
factores estimulantes de colonias (CSF) que circulan en la
naturaleza.
El término "quimioquinas maduras", también
conocidas como "intercrinas", como se usa aquí, define las
proteínas convencionalmente denominadas en la técnica como KC,
gro\alpha, gro\beta, y gro\gamma. Por conveniencia, las
secuencias de aminoácidos de la proteína murina KC que contiene 72
restos, se proporcionan en la SEQ ID NO:1. Estas secuencias están
disponibles en Genbank, número de acceso J04596. Las secuencias de
la proteína humana gro\alpha (aa 1-73) se
proporcionan en la SEQ ID NO:2. Las secuencias de la proteína humana
gro\beta (aminoácidos 1-73) se proporcionan en la
SEQ ID NO:3. Las secuencias de la proteína humana gro\gamma se
proporcionan en la SEQ ID NO:4. El cDNA y las secuencias de
aminoácidos de gro\gamma, se proporcionan también en la Solicitud
de Patente Internacional, Publicación Nº WO 92/00326 (Enero 9,
1992). Estas secuencias de gro\gamma han sido publicadas también
en la Solicitud de Patente Internacional, Publicación Nº WO 94/29341
(Diciembre 22, 1994).
Las quimioquinas modificadas de la presente
invención se derivan de gro\beta. Las quimioquinas modificadas
incluyen desamino-proteínas caracterizadas por la
eliminación de los 4 primeros aminoácidos en el terminal
(N)-amino. Opcionalmente, particularmente cuando se
expresan por técnicas recombinantes, las
desamino-quimioquinas útiles en esta invención
pueden contener una Met insertada en el N-terminal.
La metionina en el N-terminal que se inserta en la
proteína para propósitos de expresión, se puede separar o bien
durante el procesado de la proteína por una célula huésped o
sintéticamente usando técnicas conocidas. Alternativamente, si se
desea, este aminoácido se puede separar por medio de digestión
enzimática o por otros medios conocidos.
Por el término "proteína multimérica" o
"multímero" se identifican aquí las formas multiméricas de las
proteínas modificadas útiles en esta invención, por ejemplo,
dímeros, trímeros, tetrámeros y otras formas agregadas. Se pueden
preparar tales formas multiméricas por síntesis o por expresión
recombinante y pueden contener quimioquinas producidas por una
combinación de técnicas sintéticas y recombinantes como se detalla
más adelante. Los multímeros se pueden formar naturalmente por
expresión o se pueden construir en tales formas múltiples. Las
quimioquinas multiméricas pueden incluir multímeros de la misma
quimioquina modificada. Se pueden formar otros multímeros por la
agregación de diferentes proteínas modificadas. Además, se puede
formar otro multímero por la agregación de una quimioquina
modificada de esta invención y una quimioquina madura, conocida.
Preferiblemente, un dímero o un multímero útiles en la invención
deben contener al menos una proteína
desamino-quimioquina desamidada de la invención y al
menos otra quimioquina u otra proteína caracterizada por tener el
mismo tipo de actividad biológica. Esta otra proteína puede ser una
desamino-quimioquina adicional, u otra proteína
conocida.
En general, las quimioquinas útiles en el método
de la invención incluyen la proteína gro\beta modificada
(aminoácidos 5-73 de la SEQ ID NO. 3) que está
desamidada en el resto 69 y las proteínas multiméricas derivadas de
la misma. Las quimioquinas y las quimioquinas modificadas que pueden
ser incluidas en tales multímeros están descritas con detalle en la
Solicitud de Patente Internacional, Publicación Nº WO 94/29341.
En una realización preferida, el método de la
invención utiliza una proteína desamino-quimioquina
desamidada de la invención. Preferiblemente, el método de la
invención es la desamino-gro\beta desamidada que
tiene la secuencia proteínica que comprende los aminoácidos 5 a 73
de la SEQ ID NO:3, en la que el aminoácido de la posición 69 ha sido
desamidado hasta ácido isoaspártico o ácido aspártico o una mezcla
de desamino-gro\beta, desamidada y no desamidada,
que comprende los aminoácidos 5 a 73 de la SEQ ID NO:3.
Como se describe en el documento WO 94/29341, se
pueden hacer modificaciones similares a las proteínas KC,
gro\alpha, y gro\gamma que son útiles en los métodos de la
invención. Estas proteínas están todas descritas en la bibliografía
y son conocidas por los expertos en la técnica.
Las proteínas multiméricas preferidas útiles en
esta invención incluyen, dímeros o multímeros que contienen al menos
una proteína gro\beta desamino-quimioquina
desamidada de la invención, y al menos otra quimioquina u otra
proteína, caracterizada por tener el mismo tipo de actividad
biológica. Esta otra proteína puede ser una
desamino-quimioquina adicional, u otra proteína
conocida. Por ejemplo, un dímero deseable útil en los métodos de la
invención comprende dos desamino-proteínas como se
han descrito antes, preferiblemente ligadas por enlaces disulfuro.
Un multímero deseable puede ser un agregado de dos o más proteínas
desamino-gro\beta, particularmente dos proteínas
constituidas por los aminoácidos 5 a 73 de la SEQ ID NO:3.
Alternativamente, otro dímero de la invención puede ser una proteína
desamino-gro\beta desamidada de la invención en
combinación con una proteína gro\beta madura. Similarmente, varias
combinaciones de dímeros u otras formas multiméricas pueden contener
una combinación de gro\beta desamidada modificada y otras
quimioquinas, tales como las proteínas KC, gro\alpha, y
gro\gamma. Por ejemplo, una proteína
desamino-gro\beta desamidada de la invención puede
formar un dímero con una proteína gro\alpha madura no modificada.
Un experto en la técnica puede obtener otros multímeros deseables
usando las quimioquinas desamidadas modificadas de la invención. Sin
embargo, el uso de formas multiméricas de dos o más proteínas
diferentes modificadas, como se definen aquí, es útil en el método
de esta invención. La quimioquina empleada en este método puede
también ser una forma multimérica de una quimioquina desamidada
modificada como se ha discutido antes y otra proteína madura
conocida.
Estas proteínas y monómeros has sido descritos en
detalle en la bibliografía y se pueden sintetizar o se pueden
producir por técnicas recombinantes, usando técnicas convencionales
y/o las técnicas descritas en la Patente Internacional, Publicación
Nº WO 94/29341.
Deseablemente, las quimioquinas gro\beta
desamidadas modificadas o multiméricas útiles en el método de la
invención se usan en la preparación de medicamentos y/o son útiles
en forma de una composición farmacéutica. Así pues, las quimioquinas
se pueden formular en composiciones farmacéuticas y se pueden
administrar de la misma manera que se describe, por ejemplo, en las
Solicitudes de Patente Internacional, Publicación Nº WO 90/02762
(Marzo 22, 1990) y Publicación Nº WO 94/29341 (Diciembre 22,
1994).
Estos medicamentos o composiciones farmacéuticas
útiles en la movilización de las células madre hematopoyéticas
contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una quimioquina
desamidada, modificada o multimérica como se ha definido aquí y un
vehículo farmacéutico aceptable. Como se usa aquí, el término
"farmacéutico" incluye las aplicaciones veterinarias de la
invención.
El término "cantidad terapéuticamente
efectiva" se refiere a aquella cantidad de una quimioquina, tanto
en forma monomérica como multimérica, que es útil para movilizar las
células madre en cantidades suficientes para conseguir el deseado
efecto fisiológico.
Generalmente, una
desamino-quimioquina modificada, desamidada, útil en
la invención, se administra en una cantidad entre aproximadamente
0,01 ng/kg de peso corporal hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso
corporal y preferiblemente de aproximadamente 0,01 ng/kg de peso
corporal a 10 mg/kg de peso corporal, por dosis. Deseablemente,
cuando se usa una quimioquina multimérica en el método de la
invención, el medicamento o la composición contiene cantidades de la
proteína multimérica en el extremo inferior de este intervalo.
Preferiblemente, estas composiciones farmacéuticas se administran a
los individuos humanos u otros mamíferos por inyección. Sin embargo,
la administración puede ser por cualquier vía interna apropiada, y
se puede repetir según sea necesario, por ejemplo, una a tres veces
al día durante periodos de 1 día hasta aproximadamente una
semana.
Los vehículos farmacéuticos adecuados son bien
conocidos para los expertos en la técnica y se pueden seleccionar
fácilmente. Actualmente, el vehículo preferido es la solución
salina. Opcionalmente, las preparaciones farmacéuticas de la
invención pueden contener otros ingredientes activos o ser
administradas conjuntamente con otros agentes terapéuticos.
Ingredientes opcionales u otros agentes terapéuticos adecuados
incluyen los convencionales para tratar trastornos de esta
naturaleza, por ejemplo otros antiinflamatorios, diuréticos, e
inmunodepresores, entre otros. Deseablemente, estas quimioquinas
modificadas son particularmente muy adecuadas para administración
conjunta con el factor estimulante de colonias hematopoyéticas.
La invención proporciona mejores métodos para
tratar los trastornos que se caracterizan por inmunodepresión o por
un número bajo de células madre hematopoyéticas y de células
diferenciadas de las mismas, incluyendo, sin limitarse a ellos,
inflamación, fiebre, infecciones víricas, fúngicas y bacterianas,
cáncer, disfunción mielopoyética, trastornos de hematopoyesis,
anemia aplásica, y enfermedades autoinmunes, y los trastornos que se
caracterizan por la baja producción y/o diferenciación de células
hematopoyéticas y/o células de la médula ósea. Este método incluye
administrar a un mamífero seleccionado una composición farmacéutica
de la invención. Preferiblemente, esta composición se administra
junto con un factor estimulante de colonias o contiene dicho factor.
Las fuentes adecuadas del factor estimulante de colonias son bien
conocidas e incluyen, por ejemplo GM-CSF,
M-CSF, G-CSF y IL-3,
naturales, sintéticos y recombinantes. En otra realización
preferida, se puede administrar in vivo una
desamino-quimioquina útil en la invención y se deja
que actúe en sinergia con los factores estimulantes de colonias
naturales, encontrados en un paciente seleccionado.
En una realización preferida, el método de la
invención usa las desamino-quimioquinas desamidadas
descritas aquí conjuntamente con GM-CSF (o
G-CSF). El uso de una quimioquina modificada, tal
como una desamino-gro\beta desamidada o una mezcla
de desamino-gro\beta desamidada y
desamino-gro\beta, según el método de la invención
en combinación con G-CSF (se ha observado que esta
combinación es sinérgica) permite que se administren a un paciente
dosis más bajas de G-CSF, reduciendo los efectos
secundarios extremadamente desagradables causados por
GM-CSF (G-CSF).
Las quimioquinas desamidadas modificadas o
multiméricas útiles en el método de la invención se caracterizan por
la capacidad para movilizar las células madre hematopoyéticas cuando
se administran solas o por tener actividad sinérgica para estimular
la hematopoyesis cuando se administran in vivo e in
vitro con otro factor hematopoyético, tal como un factor
estimulante de colonias o un factor de crecimiento, o se combinan
con los CSF que circulan en la naturaleza, o se administran en un
protocolo con quimioterapia.
En una realización preferida, la invención
proporciona un método para movilizar las células madre
hematopoyéticas en un animal administrando a un animal una cantidad
efectiva de una proteína modificada derivada de la quimioquina
humana gro\beta [SEQ ID NO:3], que está desamidada en el resto
69.
En otro aspecto más, la presente invención
proporciona un método para movilizar las células madre
hematopoyéticas en un animal, que comprende administrar a un animal
una cantidad efectiva de una proteína multimérica, que comprende una
asociación de al menos una quimioquina gro\beta desamidada
modificada como se ha descrito antes y una segunda quimioquina.
En la práctica del método para movilizar las
células madre hematopoyéticas, el término "cantidad efectiva"
de estas proteínas se puede definir como la cantidad que cuando se
administra a un paciente por medios adecuados, moviliza las células
madre hematopoyéticas, y aumenta el número de células madre
hematopoyéticas en la sangre periférica. Esta cantidad se espera que
sea mayor que la cantidad requerida para estimular el crecimiento o
desarrollo de las células progenitoras hematopoyéticas. La cantidad
efectiva aumenta en la circulación las células que se han
diferenciado de las células madre hematopoyéticas en situaciones
aplicables clínicas o veterinarias. Una cantidad efectiva deseable
puede ser aproximadamente 0,01 ng/kg hasta 10 mg/kg de peso
corporal, por dosis.
Medios adecuados de administración para movilizar
las células madre, incluyen, sin limitación, inyección de una vez o
administración progresiva de la cantidad efectiva por inyección,
goteo i.v., o cualquier otra vía interna apropiada incluyendo la
inyección subcutánea. Las dosis se pueden repetir según sea
necesario, por ejemplo una a tres veces al día durante periodos de
un día hasta aproximadamente una semana.
Adicionalmente, el método de esta invención que
emplea las quimioquinas desamidadas modificadas o multiméricas
identificadas antes, se puede usar en los regímenes de transplante
de células madre hematopoyéticas de la sangre periférica. Por
ejemplo, después de una dosis inicial opcional de un agente
quimioterápico, las quimioquinas desamidadas modificadas o
multiméricas identificadas antes, se administran en lugar de los CSF
usados ahora para movilizar las células madre hematopoyéticas desde
la médula ósea a la circulación periférica para su recogida, así
como para su readministración después de altas dosis de
quimioterapia. Los agentes quimioterápicos adecuados, incluyen, sin
limitarse a ellos, agentes bien conocidos tales como ciclofosfamida,
cisplatino, ARA-C, 5-fluorouracilo,
etopósido, epirrubicina, carboplatino, busulfano, mitosantrona y
carmustatina. Cuando se administran con las quimioquinas según esta
invención, las cantidades de los agentes quimioterápicos son las
cantidades empleadas convencionalmente, es decir, aproximadamente
1,2 g/m^{2} de etopósido, 800 mg/m^{2} de ARA-C,
200 mg/kg de ciclofosfamida etc. Véase para tales dosis Hass et
al., Seminars in Oncol., 21:19-24 (1994),
que se incorpora aquí como referencia.
Las nuevas quimioquinas identificadas antes, se
pueden usar para complementar los CSF usados convencionalmente en
los regímenes de tratamiento. Alternativamente, las quimioquinas
identificadas antes, se puede usar en terapias de combinación con
otras biomoléculas reguladoras hematopoyéticas, tales como las
moléculas involucradas en la hematopoyesis indicada antes, o con
factores de crecimiento, compuestos farmacéuticos y/o fármacos
convencionales, para los mismos propósitos. Fuentes adecuadas de
tales factores de crecimiento son bien conocidas e incluyen,
sin limitarse a ellos, GM-CSF, G-CSF, el factor de las células madre, y el ligando Flt-3, naturales, sintéticos o recombinantes. Otras biomoléculas adecuadas incluyen (S)-5-oxo-L-prolil-a-glutamil-L-a-aspartil-N^{8}-(5-amino-1-carboxipentil)-8-oxo-N^{7}-[N-{N-(5-oxo-L-prolil)-L-a-glutamil}-L-a-aspartil]-L-threo-2,7,8-triaminooctanoil-lisina [(pGlu-Glu-Asp)_{2}-Sub-(Lys)_{2}] [Pelus et al., Exp. Hematol., 22;239-247 (1994)]. Además, otros compuestos farmacéuticos y fármacos pueden ser fácilmente seleccionados por los expertos en la técnica para la co-administración.
sin limitarse a ellos, GM-CSF, G-CSF, el factor de las células madre, y el ligando Flt-3, naturales, sintéticos o recombinantes. Otras biomoléculas adecuadas incluyen (S)-5-oxo-L-prolil-a-glutamil-L-a-aspartil-N^{8}-(5-amino-1-carboxipentil)-8-oxo-N^{7}-[N-{N-(5-oxo-L-prolil)-L-a-glutamil}-L-a-aspartil]-L-threo-2,7,8-triaminooctanoil-lisina [(pGlu-Glu-Asp)_{2}-Sub-(Lys)_{2}] [Pelus et al., Exp. Hematol., 22;239-247 (1994)]. Además, otros compuestos farmacéuticos y fármacos pueden ser fácilmente seleccionados por los expertos en la técnica para la co-administración.
Las ventajas del uso de esta invención en
sustitución de los métodos tradicionales de transplante de las
células madre hematopoyéticas de la sangre periférica, o
conjuntamente con ellos, son que tiene lugar una más rápida
recuperación de las células polimorfonucleares (PMN) y/o de las
plaquetas que con el transplante de médula ósea, que se reduce el
riesgo de infección y que el método permite que se administren dosis
curativas de quimioterapia potencialmente más altas, o una serie de
quimioterapia con dosis intensificadas.
Los siguientes ejemplos son solamente
ilustrativos y no limitan el alcance de la invención. Los ejemplos
1-3 son ejemplos comparativos; los ejemplos
4-5 son ejemplos de realizaciones de la
invención.
Las quimioquinas derivadas de las proteínas KC
[SEQ ID NO:1], gro\beta [SEQ ID NO:3], y gro\gamma [SEQ ID
NO:4], incluyendo las quimioquinas modificadas y multiméricas, se
preparan usando técnicas conocidas. Véase, por ejemplo, el documento
WO 94/29341 para discusión adicional en relación con la preparación
de tales quimioquinas. Estas quimioquinas se ensayan en cuanto a su
capacidad para movilizar las células madre hematopoyéticas en
ratones. Cada quimioquina se ensaya en concentraciones de 50, 10 y 2
microgramos/ratón y se administra por vía subcutánea, intramuscular,
intraperitoneal, intravenosa, u oral. Se hace seguimiento de la
cinética de la movilización por la quimioquina de las células madre
hematopoyéticas, a intervalos de 15 minutos, durante un periodo de
60 minutos recogiendo muestras de sangre por punción cardiaca de los
ratones. Las células madre hematopoyéticas movilizadas se someten a
fraccionamiento y se recogen por separación sobre un gradiente de
densidad "Lympholyte-M®". Las células se lavan
para utilización futura.
Los elementos celulares sanguíneos maduros se
cuentan usando un analizador de hematología "Technicon® H1",
equipado con programa informático de veterinaria. La movilización de
las células inflamatorias maduras, tales como células
polimorfonucleares (PMN), eosinófilos, y basófilos, se tiene en
cuenta cuando se evalúa el perfil inflamatorio potencial global.
Para hacer seguimiento al principio y más tarde
de las células progenitoras hematopoyéticas, se realiza un ensayo de
CFU-GM, esto es, las muestras de sangre recogidas
durante la fase de movilización se evalúan en cuanto a unidades
formadoras de colonias (CFU-GM) en los días 7 y 14.
Las células se ajustan a 10^{6}células/ml en medio McCoys sin
suero. Se usa un sistema de ágar de una sola capa constituido por
medio McCoys enriquecido con nutrientes (NaHCO_{3}, piruvato,
aminoácidos, vitaminas, y solución tampón HEPES), 0,3% de
bacto-ágar, y 15% de suero fetal bovino. Las células de las muestras
de sangre (concentración final de 10^{5}células/ml) se añaden al
sistema de ágar. Las placas con ágar se incuban a 37ºC, con 7,5% de
CO_{2} durante 7-14 días. Las colonias de células
que proliferan (CFU-GM) se cuentan usando un
microscopio.
Adicionalmente, los primeros progenitores
hematopoyéticos con alto potencial proliferativo (HPP), se cuentan
en los cultivos de CFU del día 14.
La quimioquina IL-8, que moviliza
las células madre hematopoyéticas como factor único, se incluye en
estos estudios como testigo positivo.
Los experimentos preliminares han demostrado que
la administración de gro\beta [SEQ ID NO:3], da como resultado una
movilización dosis-dependiente de
CFU-GM, similar a los resultados obtenidos con el
testigo. La proteína Gro\beta modificada, proteína (aa
5-73) de gro\beta con truncación del aminoácido 4
del N-terminal, movilizó un número
significativamente mayor de células progenitoras hematopoyéticas que
gro\beta (aminoácidos 1-73) o que
IL-8. No se observaron cambios significativos (>3
veces) en los elementos celulares maduros en ratones tratados con
gro\beta, indicando movilización específica de células
progenitoras hematopoyéticas. Este resultado demuestra que las
desamino-quimioquinas modificadas pueden tener
mejores características de movilización en comparación con las
proteínas maduras.
Se ensayaron hematoestimulantes en combinación
con las quimioquinas identificadas antes como factores de
movilización. Los hematoestimulantes incluyen G-CSF,
GM-CSF,
(S)-5-oxo-L-prolil-a-glutamil-L-a-aspartil-N^{8}-(5-amino-1-carboxipentil)-8-oxo-N^{7}-[N-{N-(5-oxo-L-prolil)-L-a-glutamil}-L-a-aspatil]-L-threo-2,7,8-triaminooctanoil-lisina
[(pGlu-Glu-Asp)_{2}-Sub-(Lys)_{2}]
[Pelus, citado antes] y el ligando FLT-3. Se puede
usar cualquier mimético de G-CSF, esto es un
hematoestimulante que no es un CSF, como G-CSF o
GM-CSF, pero que tiene actividad hematopoyética.
En los ensayos de combinación, el
hematoestimulante, por ejemplo G-CSF, se administra
a los ratones a 50 microgramos/kg, cuatro días antes de las
quimioquinas o de las quimioquinas modificadas o multiméricas
derivadas de KC [SEQ ID NO:1], gro\beta [SEQ ID NO:3], y
gro\gamma [SEQ ID NO:4]. Como en el Ejemplo 1, la dosis de
quimioquina y el tiempo de recogida de la sangre varía.
Se realiza un ensayo de CFU-GM
como se ha descrito antes en el Ejemplo 1, con SCF,
IL-1 y GM-CSF como fuente de
actividad estimulante de las colonias. Al principio, los elementos
celulares sanguíneos maduros, y más tarde los progenitores, se miden
como en el Ejemplo 1.
Los estudios de combinación con
pre-tratamiento con hematoestimulante, utilizan
MIP-1\alpha como testigo positivo.
Se realizó el siguiente experimento en un modelo
de transplante de células madre in vivo para determinar si la
proteína gro\beta truncada en el N-terminal [aa
5-73 de la SEQ ID NO:3; denominada
gro\beta-T], moviliza las células madre primitivas
que se multiplican a largo plazo. En este modelo, los receptores de
las células de la médula ósea son ratones irradiados con rayos
gamma. Se hizo seguimiento de los ratones durante 100 días en cuanto
a su supervivencia.
Se evaluó la capacidad de las células madre
sanguíneas recogidas de los ratones tratados o con PBS,
gro\beta-T (50 microgramos en
15-30 minutos), G-CSF (1
microgramo/ratón dos veces al día x 4), o G-CSF,
después gro\beta-T para salvar a los ratones que
si no, estarían letalmente irradiados. Las células mononucleares
sanguíneas (hasta 1 x 10^{6}) recogidas de los ratones tratados
con PBS protegieron a 0-10% de los ratones, 100
días después del transplante. Los ratones que recibieron células de
médula ósea como testigo positivo del ensayo, tuvieron el 100% de
supervivencia en el día 100. Las células sanguíneas movilizadas (1 x
10^{6}células/ratón) recogidas de los ratones tratados con
gro\beta-T solo, protegieron al 70% de los
receptores. Las células sanguíneas movilizadas (1 x
10^{6}células/ratón) recogidas de los donantes tratados con
G-CSF, protegieron al 80% de los receptores. Las
células sanguíneas movilizadas recogidas de los donantes tratados
con G-CSF y gro\beta-T movilizaron
mayor número de células repobladoras que el G-CSF
solo.
Se evaluó la velocidad a la que las células madre
de sangre periférica movilizadas por gro\beta-T
recuperaron las líneas celulares sanguíneas maduras en un huésped
irradiado. Se inyectaron 1 x 10^{6}células sanguíneas periféricas
de baja densidad (LDPBC) a receptores irradiados, y se sangraron
estos por punción cardiaca en los días 7-19 después
de la irradiación. Se recogieron las LDPBC de los diferentes grupos
en condiciones óptimas para la movilización por
CFU-GM. Los grupos comparados en este experimento
fueron PBS, gro\beta-T solo (50 microgramos, 15
minutos), G-CSF solo (dos veces al día x 5 días, 1
microgramo/ratón) y gro\beta-T +
G-CSF. Se sangraron diariamente ratones normales
para comparar con los animales transplantados.
Los ratones que recibieron un transplante de
donantes tratados con PBS, fallaron en la recuperación de los
elementos celulares sanguíneos maduros y murieron. La velocidad de
recuperación de los neutrófilos en los ratones que recibieron
células movilizadas por gro\beta truncada, fue más rápida que la
de aquellos que recibieron células movilizadas por
G-CSF. Los ratones transplantados con LDPBC
movilizadas por la combinación de gro\beta-T +
G-CSF tuvieron una velocidad más rápida de
recuperación de neutrófilos que las células movilizadas por
gro\beta-T.
La recuperación del número de plaquetas en estos
mismos ratones siguió la misma pauta: gro\beta-T +
G-CSF > gro\beta-T >
G-CSF >>PBS. Sin embargo, el día 19, el número
de plaquetas aún estaba muy lejos de volver a los valores normales.
Estos datos indican que las células madre sanguíneas movilizadas por
gro\beta-T se injertan en los ratones receptores,
con velocidades resultantes de recuperación de neutrófilos y de
plaquetas iguales o mejores que las células madre movilizadas por
G-CSF.
GRO\beta-T se expresó
intracelularmente en E. coli usando la cepa huésped LW14 y un
vector de expresión (pEAHy). Se controló la expresión por el
promotor PL de fase lamda sobre el vector y un represor cI857
sensible a la temperatura. La expresión es inducida por una subida
de temperatura de las células en crecimiento. La proteína inducida
estaba en el sedimento insoluble del lisado celular. Las células
recogidas de 10 litros de fermentación se congelaron a -70ºC.
Las células congeladas se dispersaron en solución
tampón de citrato de sodio 20 mM de pH 6,0 conteniendo ClNa 40 mM y
EDTA 2 mM (10 ml/g de células) y se lisaron por medio de dos pases a
través de un "Microfluidics M110Y" o de un "Gaulin" a
758,6 bar. El lisado se centrifugó a 10.000 g durante una hora a
4ºC. Toda la GRO\beta-T estaba en el sedimento y
se desechó el sobrenadante del lisado. Se solubilizó el sedimento en
guanidina HCl 2 M, Tris-HCl 50 mM de pH 7,0 (2 ml/g
de células), durante dos horas a 25ºC. Se diluyó la solución con
igual volumen de agua y se separó el material insoluble por
centrifugación a 15.000 g durante una hora. Para convertir toda la
GRO\beta-T a la forma reducida, se ajustó el
sobrenadante a DTT 20 mM y se incubó durante dos horas a 25ºC. Se
diluyó la solución a 10 ml/g de células con HCl 5 mM, lo que dio
como resultado una precipitación masiva. El precipitado (que no
contiene GRO\beta-T) se separó por centrifugación
a 25.000 g durante una hora. Se dializó (3K) el sobrenadante claro o
se dializó-filtró ("Filtron" con corte en 3 K) frente a HCl 5
mM. La GRO\beta-T reducida en HCl 5 mM, se
neutralizó hasta pH 7,5 con base Trizma 2 M y se ajustó a cisteamina
1 mM, cistamina 0,2 mM y EDTA 1 mM. Se dejó que tuviera lugar la
re-oxidación durante dos horas a 25ºC. Se ajustó la
solución a pH 6,5 con HCl 1 M y se aplicó a una columna Toyopearl SP
650 M (2 ml resina/g de células) equilibrada con Mes 50 mM de pH 6,5
(solución tampón A). Se lavó la columna con 5 veces el volumen de la
columna de solución tampón A y después con 5 veces el volumen de la
columna del 22% de solución tampón B (NaCl 1 M en solución tampón
A). Se eluyó la GRO\beta-T con 35% de solución
tampón B, con una pureza > 95%. El eluido reunido se hizo fluir
a través de Q-sefarosa en NaCl 0,4 M para separar
cualquier DNA o endotoxina asociados, se dializó en fosfato de
potasio 1 mM de pH 6,5 (solución tampón P), conteniendo NaCl 50 mM y
se aplicó a una columna de hidroxiapatita (BioRad MacroPrep Ceramic
Hydroxiapatite Tipo I). La columna de hidroxiapatita se lavó con
NaCl 0,15 M en solución tampón P para eliminar impurezas y se eluyó
la GRO\beta-T con NaCl 0,5 M en solución tampón P.
El eluido total de la columna de hidroxiapatita se dializó frente a
solución salina y se almacenó a -70ºC, donde es estable por tiempo
indefinido. Para obtener la GRO\beta-T homogénea
no desamidada, el eluido total de la columna SP se fraccionó usando
una columna C18-RP-HPLC en lugar de
las columnas de Q-sefarosa y de hidroxiapatita. El
eluido total de la columna SP se ajustó a 0,1% de TFA y se aplicó a
una columna Vydac C18 (2,2 x 25 cm, 10 micrones, Nest Group) que se
equilibró con 12,5% de solución tampón R (80% de acetonitrilo en TFA
al 0,1%). Se lavó la columna con una vez el volumen de la columna
del 30% de solución tampón R. Se eluyó la
GRO\beta-T con cinco veces el volumen de la
columna de un gradiente lineal, 30 a 40% de solución tampón R. El
eluido total de la columna C18 se liofilizó hasta sequedad, se
resuspendió en solución salina a 10 mg/ml, se dializó extensamente
frente a solución salina, y se almacenó a -80ºC antes de usarlo en
estudios animales.
Cuando la proteína GRO\beta-T
purificada anteriormente, se incubó en solución tampón de fosfato de
sodio 0,1 M de pH 8,0 durante 5 días a 25ºC, se desamidó
completamente la GRO\beta-T en base al análisis
por electroforesis capilar. Solamente se identificó un único sitio
de desamidación por espectrofotometría de NMR como N69D.
La resolución de las formas
iso-Asp 69, Asp 69 y la nativa Asn 69 de
GRO\beta-T en su estado con puentes de disulfuro
(no reducidas) se consiguió usando una columna de HPLC de fase
inversa, Zorbax 300SB-C8 (2,1 mm x 150 mm, número de
catálogo 883750.906, Rockland Technologies, Inc.) dispuesta en un
sistema de cromatografía HP1090 (Hewlett Packard). Un análisis
típico incluyó la inyección de 16 \mug de mezcla de
GRO\beta-T disuelta en 40 \mul de TFA al 0,1% en
agua. La separación se consiguió usando una elución por gradiente
lineal (Tabla 1) mezclando Solución tampón A que contiene 1 ml de
TFA de grado cromatográfico ("Baker analyzed") añadido a 1
litro de agua obtenida de "Nanopure II", y Solución tampón B
que contiene 80% de acetonitrilo, 0,1% de TFA (800 ml de
acetonitrilo de grado cromatográfico añadido a 200 ml de agua
seguido por 1 ml de TFA de grado cromatográfico). La temperatura de
la columna se mantuvo a 60ºC y se detectaron los picos a las dos
longitudes de onda, 210 y 215 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
| Tiempo (min) | Caudal (ml/min) | Sol. Tampón A (%) | Sol. Tampón B (%) |
| 0,0 | 0,2 | 71,0 | 29,0 |
| 60,0 | 0,2 | 68,0 | 32,0 |
| 65,0 | 0,2 | 68,0 | 32,0 |
| 68,0 | 0,2 | 71,0 | 29,0 |
| 80,0 | 0,2 | 71,0 | 29,0 |
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos de GRO\beta-T,
iso-Asp 69, Asp 69 y la nativa Asn 69, dieron
tiempos de retención de 44,2 min, 51,9 min y 47,7 min
respectivamente.
Usando un gradiente ligeramente modificado y las
mismas condiciones cromatográficas que se han descrito antes, se
realizó el análisis tanto de los productos nativos como de las
GRO\beta-T desamidadas con puentes de disulfuro
reducidos.
\vskip1.000000\baselineskip
| Tiempo (min) | Caudal (ml/min) | Sol. Tampón A (%) | Sol. Tampón B (%) |
| 0,0 | 0,2 | 68,0 | 32,0 |
| 60,0 | 0,2 | 64,0 | 36,0 |
| 65,0 | 0,2 | 64,0 | 36,0 |
| 68,0 | 0,2 | 68,0 | 32,0 |
| 80,0 | 0,2 | 68,0 | 32,0 |
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos de GRO\beta-T
reducidos, iso-Asp 69, Asp 69 y el nativo Asn 69
dieron tiempos de retención de 43,7 min, 50,6 min y 46,9 min
respectivamente.
Numerosas modificaciones y variaciones de la
presente invención están incluidas en la memoria descriptiva
identificada anteriormente y se espera que resulten obvias para los
expertos en la técnica. Tales modificaciones y alteraciones a las
composiciones y procedimientos de la presente invención se considera
que están incluidos en el alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\;
SmithKline Beecham Corporation
\hskip4cmKing, Andrew G.
\hskip4cmQian, Yangiu
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Método para movilizar las células primordiales hematopoyéticas
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: SmithKline Beecham Corporation - Corporate Patents
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 709 Swedeland Road
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: King of Prussia
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: PA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 19406-2799
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1,0, Versión #1,30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US98/A ser asignado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 27 - Noviembre - 1998
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/999.804
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 26 - Noviembre - 1997
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US96/17074
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 24 - Octubre - 1996
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/547.142
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 24 - Octubre - 1995
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL AGENTE/APODERADO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Hall, Linda E.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 31.763
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: P50161-3
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 215-270-5016
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 215-270-5090
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 72 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 73 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 73 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 73 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (7)
1. El uso de una cantidad efectiva de una
proteína gro\beta modificada que tiene una secuencia proteínica
que comprende los aminoácidos 5 a 73 de la SEQ ID NO:3, en la que el
aminoácido 69 ha sido desamidado hasta ácido aspártico o ácido
isoaspártico, en la fabricación de un medicamento para uso en la
movilización de las células madre hematopoyéticas de un
paciente.
2. El uso según la reivindicación 1 de una
combinación de una proteína gro\beta desamidada modificada según
la reivindicación 1, y una proteína gro\beta modificada que
comprende los aminoácidos 5 a 73 de la SEQ ID NO:3, en la
fabricación de un medicamento para uso en la movilización de las
células madre hematopoyéticas de un paciente.
3. El uso según la reivindicación 1, en el que
dicha proteína gro\beta desamidada modificada comprende entre
aproximadamente 0,01 ng hasta aproximadamente 1 g de dicha proteína
gro\beta desamidada modificada.
4. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha proteína gro\beta
desamidada modificada se utiliza en la fabricación de un medicamento
para uso en una terapia de combinación con una biomolécula
reguladora hematopoyética o con un factor de crecimiento.
5. El uso según la reivindicación 4, en el que
dicho factor de crecimiento se selecciona del grupo que consiste en
GM-CSF, G-CSF, factor de las células
madre, y ligando Flt-3.
6. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la fabricación de un medicamento para uso
en la movilización de las células madre hematopoyéticas de un
paciente que recibe un transplante de células madre hematopoyéticas
de sangre periférica.
7. Una quimioquina que consiste en los
aminoácidos 5 a 73 de la SEQ ID NO:3, en la que el aminoácido número
69 ha sido desamidado hasta ácido aspártico o ácido
isoaspártico.
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
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