ES2321819T3

ES2321819T3 - Promotres del crecimiento y/o diferenciacion de celulas madre hematopoyeticas y/o progenitores hematopoyeticos.

Info

Publication number: ES2321819T3
Application number: ES02793466T
Authority: ES
Inventors: Kenju Miura; Munetada Haruyama; Shiho Kodama
Original assignee: Asubio Pharma Co Ltd
Current assignee: Asubio Pharma Co Ltd
Priority date: 2001-12-28
Filing date: 2002-12-27
Publication date: 2009-06-12
Anticipated expiration: 2022-12-27
Also published as: US7282201B2; EP1459758A1; CN1499980A; DE60231328D1; KR100948346B1; BR0207725A; WO2003057241A1; IL157600A0; EP1459758A4; CA2439471A1; AU2002359951A1; AU2002359951B2; JPWO2003057241A1; ATE423567T1; US20040157326A1; EP1459758B1; KR20040075700A; JP4362066B2; CN1329078C; AU2002359951B8

Abstract

Uso de: (i) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEC ID Nº: 1, (ii) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de bases ilustrada en la SEC ID Nº: 2, (iii) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la Cofilina ilustrada en la SEC ID Nº: 1, excepto por que tiene de 1-5 deleciones, sustituciones y/o adiciones de aminoácidos, (iv) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de bases que se puede hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia de bases complementaria a la secuencia de bases que codifica la secuencia de aminoácidos de la Cofilina ilustrada en la SEC ID Nº: 1, (v) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 30% de homología de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la Cofilina ilustrada en la SEC ID Nº: 1, (vi) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de bases que se puede hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia de bases complementaria a la secuencia de bases que codifica la secuencia de bases de la Cofilina ilustrada en la SEC ID Nº: 2 o (vii) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por ADN que comprende una secuencia de bases que tiene al menos el 30% de homología de secuencia de bases con la secuencia de bases de la Cofilina ilustrada en la SEC ID Nº: 2, cada una de las cuales tiene la actividad de promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad que se selecciona del grupo que consiste en panhematopenia, hematopenia, síndrome de Fanconi, anemia aplásica, cánceres tales como linfoma maligno y leucemia aguda, hepatotopatía crónica, insuficiencia renal, pacientes con transfusión masiva, durante cirugía o de sangre conservada, infecciones graves, trombocitopenia mielopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), STE, mordedura de serpiente venenosa, síndrome urémico hemolítico, estasis de función esplénica, hemorragia, síndrome de Barnard-Soulier, trombocitastenia de Glanzmann, uremia, anticuerpos anti-plaquetas y enfermedades mieloproliferativas.

Description

Promotores del crecimiento y/o diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos.

Campo técnico

Esta invención se refiere al uso de promotores del crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos que contienen Cofilina como un ingrediente que constituyen una clase de proteínas de unión a actina o compuestos análogos de Cofilina. Los presentes promotores del crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos son útiles como agentes terapéuticos de enfermedades que se producen por el crecimiento y/o la diferenciación insuficiente de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos, en particular, como agentes terapéuticos de panhematopenia y/o enfermedades que vienen acompañadas por hipofunción hematopoyética. Los presentes promotores del crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos se pueden usar para expandir las células madre hematopoyéticas ex vivo y este método es útil en el trasplante de células madre hematopoyéticas y en terapia génica e incluso en medicina regenerativa.

Técnica anterior

La hematopoyesis está regulada por la interacción directa entre el grupo de células madre hematopoyéticas que tienen capacidad de auto renovación, progenitores hematopoyéticos suministrados por células madre hematopoyéticas y destinados a diferenciarse en una dirección predeterminada y células en diversos estadios de diferenciación continua del primer al último y células de estroma de soporte como un microentorno hematopoyético que rodea esos conjuntos de células o mediante la interacción indirecta entre el primer grupo mencionado de células y factores de regulación hematopoyéticos humorales secretados por las células de estroma. Se ha demostrado que un gran número de citoquinas participan en el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas en diversas células sanguíneas maduras por progenitores hematopoyéticos.

El desarrollo de la ingeniería genética ha presenciado la clonación génica de las citoquinas mencionadas anteriormente y su producción industrial también ha sido posible por tecnología de recombinación genética. Entre los factores hematopoyéticos recombinantes genéticos están el factor estimulante de colonias de granulocitos (abreviado en este documento más adelante como G-CSF) y el factor estimulante de colonias de macrófagos (abreviado más adelante en este documento como M-CSF) que se aplican clínicamente como agentes terapéuticos de hipofunción hematopoyética (por ejemplo, neutropenia) debido a exposición a radiación o quimioterapia, así como eritropoyetina (abreviada más adelante en este documento como EPO) que se aplica clínicamente como un agente terapéutico de anemia renal. Sin embargo, el tratamiento con estos factores hematopoyéticos conduce simplemente a una recuperación temporal de células sanguíneas maduras.

Por tanto, se ha realizado el auto- u homo-injerto de células madre hematopoyéticas como un medio de tratamiento para la mejora fundamental de la función hematopoyética.

Recientemente, el trasplante periférico de células madre hematopoyéticas se ha generalizado rápidamente y el trasplante de células madre hematopoyéticas de sangre de cordón umbilical está obteniendo atención. Sin embargo, estos también implican muchos problemas y, en particular, la escasez de células madre hematopoyéticas en células sanguíneas impone una carga sustancial sobre el donante y/o el receptor. Por lo tanto, es necesario establecer un método para la expansión ex vivo de células madre hematopoyéticas. Los pacientes con enfermedades hereditarias mortales, determinados tumores malignos y SIDA, que actualmente no tienen métodos de tratamiento eficaces, se están sometiendo a experimentos de terapia génica para complementar genes deficientes o mutados (Juya Ohashi, Jikken Igaku, 12: 333, 1994).

Las células madre hematopoyéticas, teniendo capacidad de supervivencia a largo plazo, se consideran células diana óptimas en terapia génica del tipo que se acaba de describir anteriormente. Sin embargo, para conseguir una transfección o infección eficaz con un vector de retrovirus que incorpore un gen deseado, se requiere habitualmente que un pequeño número de células madre hematopoyéticas en la fase de reposo se pongan en el ciclo celular y proliferen. Se han realizado estudios sobre el efecto de un factor de células madre (SCF) y ligando de flk-2/flt-3 que se considera que participan en el crecimiento de células madre hematopoyéticas y progenitores hematopoyéticos.

Estudios de experimentación han publicado que la señal c-kit/SCF es importante para el crecimiento de células madre hematopoyéticas y progenitores hematopoyéticos (Blood, 78: 1-19, 1991; Blood, 81: 2844-2853, 1993; Blood, 90: 4767-4778, 1997) y se ha demostrado que el factor de células madre (SCF) es un ligando para el c-kit que es el receptor de tipo tirosina quinasa expresado en células madre hematopoyéticas y progenitores hematopoyéticos (Cell, 63: 167-174, 1990; Cell, 63: 195-201, 1990; Cell, 63: 225-233, 1990), conduciendo a los investigadores a anticipar que SCF puede tener un efecto sobre el crecimiento de células madre hematopoyéticas y progenitores hematopoyéticos. Sin embargo, el c-kit se expresa solamente de forma débil en células madre hematopoyéticas humanas y progenitores hematopoyéticos (Blood, 87: 4136-4142, 1996) y SCF, si se usa solo, tiene una baja actividad de expansión y no es completamente eficaz para el crecimiento de células madre hematopoyéticas y progenitores hematopoyéticos.

flk-2/flt-3 es una tirosina quinasa de tipo receptor con expresión génica reconocida en diversos tejidos y, en células sanguíneas, se expresa dominantemente en células madre hematopoyéticas indiferenciadas, habiéndose identificado el ligando de flk-2/flt-3 (FL) como un factor que estimula el crecimiento de células hematopoyéticas indiferenciadas (Lyman, S.D. Curr. Opin. Hematol., 1998; 5(3): 192-6). Pero entonces, esta molécula, si se usa sola, tiene baja actividad de expansión y no es completamente eficaz para el crecimiento de células madre hematopoyéticas y progenitores hematopoyéticos.

Por tanto, ni SCF ni FL son completamente eficaces para el crecimiento de células madre hematopoyéticas y progenitores hematopoyéticos si se usan de forma única, de tal forma que se considera que combinar los mismos con diversas citoquinas es ideal como un método para la expansión de células madre hematopoyéticas y progenitores hematopoyéticos (Blood, 89: 2644-2653, 1997; Cancer Chemother. Pharmacol., 38[Suppl.]: 64-68, 1996) y se ha realizado un estudio sobre la combinación de estas moléculas con TPO (trombopoyetina), complejo de interleucina 6 (IL-6)/receptor de interleucina 6 soluble, Hyper IL-6 (proteína de fusión de IL-6 y receptor de IL-6), etc. (Exp. Hematol. 29: 822-832, 2001). Además, se desea aclarar y obtener un nuevo factor que tenga una actividad de expansión mayor.

La Cofilina es una proteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 19.000 y es un miembro de proteínas de unión a actina (ABP) que se une a filamentos de actina (F-actina) en una proporción molar de 1:1 en respuesta a una diversidad de señales, regulando de este modo las condiciones físicas de actina y realizando función primaria en la reconstitución del citoesqueleto basado en actina (Jikken Igaku, Vol. 12, Nº 4: 24-28, 1994). Se conoce que Cofilina, uniéndose a G-actina y cortando G-actina (monómero de actina) y despolimerizando la misma, controla muchas respuestas celulares que incluyen cambios en forma, movimientos (moción), división, secreción, acción fagocítica (pinocítica), diversas transducciones de señal, etc. (Seikagaku, Vol. 71, Nº 2: 101-114, 1999). La Cofilina se presenta en una célula en forma tanto fosforilada como desfoforilada y su actividad de unión a actina se suprime por fosforilación pero se promueve por desfosforilación.

Recientemente se ha conocido que la Cofilina se desfosforila en respuesta a diversos estímulos externos que incluyen la estimulación de plaquetas por trombina, la estimulación de células tiroideas por una hormona que estimula la glándula tiroides, la estimulación de células de parótida por isoproterenol y la estimulación de astrocitos por dibutiril AMPc (Moon, A. & Drubin, D.G. (1995) Mol. Biol. Cell. 6, 1423-1431). También se ha descrito que Cofilina se desfosforila cuando se activan neutrófilos o células T.

Se han propuesto métodos que tienen por objeto tratar determinados tipos de enfermedad mediante la función de proteínas de unión a actina (ABP) o regulando la función de ABP. Entre tales métodos se incluyen aquellos para el tratamiento o alivio de enfermedad administrando ABP a tejidos u órganos enfermos producidos por depósitos de actina (documentos JP 5-50603 A y JP 8-510998 A), así como agentes terapéuticos para una diversidad de enfermedades asociadas a fallo de control de apoptosis que actúan bajo el mecanismo de modulación de apoptosis por supresores de desfosforilación de Cofilina (documentos JP 10-67662 A y JP 10-87484 A).

La Cofilina también se ha propuesto para reducir la viscosidad de contenidos de vías respiratorias mucoides patológicos, documento WO 94/22465.

Sin embargo, hasta la fecha no se ha descrito que la Cofilina y sus compuestos análogos participen en el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos.

Un objeto de la presente invención es proporcionar el uso de promotores del crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos que sean útiles como agentes terapéuticos de enfermedades que se desarrollan a partir de crecimiento y/o diferenciación insuficiente de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos, en particular, panhematopenia y/o enfermedades que vienen acompañadas por hipofunción hematopoyética, como se define en las reivindicaciones. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para expandir células madre hematopoyéticas ex vivo que comprende administrar los promotores del crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos, método que también es útil en el trasplante de células madre hematopoyéticas, terapia génica y medicina regenerativa.

Sumario de la invención

Los presentes inventores previamente han tratado una línea celular leucémica de médula ósea humana y establecido una nueva línea celular caracterizada por expresión positiva de CD34 y expresión negativa de GP (glucoproteína) IIb/IIIa (documento JP 6-269284 A). Los inventores denominaron la célula como célula leucémica mieloide humana S6 SBM332 (que se denomina más adelante en este documento célula S6) y se depositó como FERM BP-4227 en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, Ministerio de Comercio Internacional e Industria (ahora el Depósito de Organismo de Patente Internacional, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada) en 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaragi, Japón en la fecha del 9 de marzo de 1993. CD34 es una glucoproteína que desaparece a medida que las células madre hematopoyéticas se diferencian y es un marcador de células madre hematopoyéticas humanas y GP (glucoproteína) IIb/IIIa es una glucoproteína de membrana de plaquetas que se expresa específicamente en plaquetas y megacariocitos y es un marcador de megacariocitos humanos que es un antígeno diferenciado que se potencia cuando los megacariocitos se diferencian.

La línea celular S6 es capaz de cultivo a largo plazo consistente en presencia de suero mientras que conserva la expresión positiva de CD34 y la expresión negativa de GP IIb/IIIa y, aun más, como el resultado de cultivo en presencia de 12-O-tetradecanoil forbol 13-acetato (TPA), la expresión de CD34 está atenuada mientras que la de GP IIb/IIIa está considerablemente aumentada. Por tanto, se ha observado que la línea celular S6 se diferencia a un linaje de megacariocitos, que tiene evidentemente la capacidad de diferenciación.

Los inventores de la presente invención realizaron estudios adicionales basándose en esos resultados experimentales convencionales y observaron que el sobrenadante de cultivo sin suero de células S6 contenía un factor que promovía la expansión de células formadoras de colonias de alto potencial proliferativo de ratón (HPP-CFC). A partir de las observaciones obtenidas hasta ahora y los resultados de sus estudios, los presentes inventores observaron que las células S6 tenían la naturaleza de células madre hematopoyéticas y experimentaban crecimiento autocrino en presencia de un factor desconocido (denominado más adelante en este documento factor S6) capaz de promover el crecimiento de células madre hematopoyéticas. Por tanto, se sugirió una posibilidad de que el factor S6 sea un factor de crecimiento novedoso para células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos. Basándose en esta posibilidad, los inventores purificaron el sobrenadante de cultivo sin proteína de células S6 y realizaron estudios intensos que abarcaban no solamente la separación y purificación del factor que tenía la capacidad de expansión de HPP-CFC, así como la determinación de su estructura o clonación del gen de ese factor, sino también la capacidad de expansión de HPP-CFC de un factor recombinado genético. De forma suficientemente inesperada, se observó que el factor de interés era Cofilina, proteínas de unión a actina de bajo peso molecular.

Esta observación condujo a los inventores de la presente invención a descubrir que la Cofilina que constituye un miembro de proteínas de unión a actina era un factor capaz de promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos y los inventores llegaron a conseguir la presente invención basándose en la observación de que la Cofilina podría promover la expansión de HPP-CFC en ratones, mostrando una actividad marcadamente mayor que citoquinas existentes que tienen la capacidad de expansión de HPP-CFC.

Por tanto, la presente invención proporciona promotores para el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos que contienen Cofilina como un ingrediente activo y que pueden contener además otra citoquina como un componente adicional, como se define en las reivindicaciones.

La presente invención también describe un método para promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos que comprende administrar al menos uno de los promotores mencionados anteriormente para el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos.

La presente invención también proporciona usos como se definen en las reivindicaciones para la preparación de medicamentos para tratar enfermedades que se producen a partir del crecimiento y/o diferenciación insuficiente de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos, más específicamente, panhematopenia y/o hipofunción hematopoyética que comprenden al menos uno de los promotores para el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos.

La presente invención proporciona adicionalmente un método para expandir células madre hematopoyéticas ex vivo que comprende administrar al menos uno de los promotores mencionados anteriormente para el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos.

La presente invención proporciona adicionalmente un método de medicina regenerativa que comprende las etapas de expandir células madre hematopoyéticas ex vivo usando al menos uno de los promotores para el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos y trasplantar las células madre hematopoyéticas expandidas.

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Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama que muestra la secuencia de la estructura primaria de Cofilina de tipo no muscular humana (AC: P23528);

La Figura 2 es un diagrama que muestra la secuencia de ADNc en Cofilina de tipo no muscular placentaria humana (AC: D00682), siendo las partes subrayadas los sitios en los que se sintetizaron dos oligómeros como cebadores, es decir, cebador SK013 (SEC ID Nº: 3) y cebador SK014 (SEC ID Nº: 4);

La Figura 3 muestra el alineamiento de las secuencias de bases para Cofilina de tipo no muscular obtenida de placenta humana (superior) y Cofilina de tipo no muscular obtenida de células S6 humanas (inferior), suponiendo que las diferencias en los números de bases 198 y 471 se deben ambas a mutación silenciosa;

La Figura 4 muestra el resultado de ensayo HPP-CFC sobre la acción de expansión de células madre hematopoyéticas de un sobrenadante de cultivo de células COS-1 en las que se ha expresado Cofilina de tipo no muscular humana recombinante;

La Figura 5 muestra que cuando la Cofilina de tipo no muscular humana se combinó con SCF y FL tuvo una capacidad marcada para expandir células positivas CD34 obtenidas de sangre de cordón umbilical humano en comparación con el caso en el que se añadieron solamente SCF y FL;

La Figura 6 muestra que la Cofilina de tipo no muscular humana cuando se combina con SCF + FL provocó una expansión marcada de células positivas a CD34 obtenidas de sangre de cordón umbilical humano;

Las Figuras 6B-6D muestran que cuando se sometieron células positivas a CD34 obtenidas de sangre de cordón umbilical humano cultivadas en la condición de Cofilina de tipo no muscular humana + SCF + FL a ensayo de formación de colonias, tuvieron lugar aumentos significativos en los números de colonias de CFU-GM, BFU-E y CFU-Mix, respectivamente:

La Figura 7 muestra que cuando se sometieron células positivas a CD34 obtenidas de sangre de cordón umbilical humano cultivadas en la condición de Cofilina de tipo no muscular + SCF + FL a ensayo de formación de colonias, tuvo lugar un aumento significativo en el número de colonias de CFU-Mk;

La Figura 8 es una micrografía que muestra que la Cofilina de tipo no muscular humana, cuando se combinó con SCF y FL, provocó que las células positivas a CD34 obtenidas de sangre de cordón umbilical humano se diferenciaran y crecieran hasta megacariocitos y

La Figura 9 es una micrografía que muestra que cuando se cultivaron células positivas CD34 obtenidas de sangre de cordón umbilical humano durante aproximadamente 2 semanas en presencia de Cofilina de tipo no muscular humana en combinación con SCF y FL, se observó que algunos de los megacariocitos formaban proplaquetas.

Descripción detallada de la invención

La actividad de la Cofilina de la presente invención para promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos se puede determinar con referencia a la actividad en la promoción de la expansión de HPP-CFC (denominada más adelante en este documento actividad de HPP-CFC). HPP-CFC indica células formadoras de colonia de alto potencial proliferativo que son las células más inmaduras entre las células que se pueden verificar por ensayo de formación de colonias in vitro que tienen un poder de expansión lo suficientemente fuerte para formar colonias macroscópicas; se considera que se han diferenciado una etapa más allá que células iniciadoras de cultivo a largo plazo (LTC-IC) que se detectan como células que conservan la capacidad de formación de colonias incluso después de cultivar células de médula ósea en células de estroma durante al menos 5 semanas. La expresión actividad de HPP-CFC como se usa en la presente invención se refiere a la actividad de una sustancia bajo ensayo de actuar sobre HPP-CFC para promover su expansión.

La actividad de HPP-CFC se puede determinar mediante el siguiente procedimiento: con miras a obtener células madre hematopoyéticas específicamente, células T, células B, granulocitos y macrófagos se retiraron de células de médula ósea murinas tratadas con el agente anticanceroso 5-fluorouracilo para preparar fracciones de células madre hematopoyéticas; después de añadir una muestra y/o citoquinas, las fracciones de células madre hematopoyéticas se someten a cultivo líquido y se somete parte del medio acondicionado que incluye las células madre hematopoyéticas a ensayo de colonias; se recuenta el número de colonias de HPP-CFC macroscópicas resultante. Mediante este procedimiento se puede determinar la actividad del promotor de la invención para el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos.

Cuando se usó Cofilina en la presente invención para determinar la actividad de HPP-CFC descrito anteriormente, se observó que actuaba sobre HPP-CFC y mostraba la actividad de inducir su crecimiento y/o diferenciación. Por lo tanto, la Cofilina actúa sobre células madre multipotentes o las células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos que están en el estadio muy temprano del proceso de su crecimiento y/o diferenciación, promoviendo de este modo el crecimiento y/o la diferenciación de tales células madre multipotentes.

La expresión "células madre hematopoyéticas" como se usa en la invención se refiere a células madre multipotentes que son capaces de diferenciarse en todas las células sanguíneas que incluyen eritrocitos, leucocitos y plaquetas. Estas son células que son CD34 positivas pero negativas para todos los demás marcadores de linaje. Por ejemplo, las "células madre hematopoyéticas" como se usa en la invención no solamente están contenidas en células positivas a CD34 obtenidas de médula ósea sino también en células positivas a CD34 obtenidas de sangre de cordón umbilical.

La expresión "progenitores hematopoyéticos" como se usa en la presente invención se refiere a los progenitores que se diferencian más allá de las células madre hematopoyéticas pero que todavía se tienen que diferenciar en progenitores de los respectivos linajes de células sanguíneas (células precursoras unipotentes). Por ejemplo, los "progenitores hematopoyéticos" como se usa en la presente invención incluyen progenitores asociados a granulocitos/macrófagos (granulocitos, macrófagos de unidades formadoras de colonias, CFU-GM), progenitores asociados a eritroides (unidad formadora de estallido eritroide, BFU-E), progenitores asociados a megacariocitos (unidad formadora de colonias megacariocícitas, CFU-Mk) y células madre asociadas a mieloide (unidad formadora de colonias mixtas, CFU-Mix).

El término "diferenciación" de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos como se usa en la invención se refiere tanto al cambio de células madre hematopoyéticas a progenitores hematopoyéticos como al cambio de progenitores hematopoyéticos a progenitores hematopoyéticos unipotentes y/o células que tienen funciones características, concretamente, células maduras que incluyen eritrocitos, leucocitos y megacariocitos.

En consecuencia, la actividad de promoción del crecimiento de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos como se usa en la invención se refiere a la actividad por la que las células madre hematopoyéticas y/o los progenitores hematopoyéticos que tienen las funciones descritos anteriormente se expanden para proliferar las células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos que tienen las mismas funciones. Además, la actividad de promover la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos como se usa en la invención se refiere a la actividad por la que las células madre hematopoyéticas y/o los precursores hematopoyéticos se diferencian de tal forma que cambian a los progenitores hematopoyéticos que tienen las funciones descritos anteriormente, células madre asociadas a mieloide, progenitores unipotentes y/o células sanguíneas maduras (eritrocitos, leucocitos y megacariocitos). En la presente invención, la expresión HPP-CPC se usa como un sinónimo de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos.

La Cofilina como un ejemplo de factores de escisión se refiere a un grupo de proteínas de unión a actina de bajos pesos moleculares (15-21 kDa) que se encuentran de forma universal en eucariotas y la Cofilina en cualquier animal vertebrado superior consiste cada una en 166 aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos en esas Cofilinas tienen una homología de longitud completa de al menos el 30% incluso entre especies filogenéticamente separadas. Por ejemplo, la Cofilina humana se encuentra tanto en tipos musculares como en tipos no musculares y se sabe que las mismas tienen una homología del 76,5%. Por lo tanto, cuando se usa el término "Cofilina" sin ninguna calificación en la presente invención, abarca no solamente la Cofilina que tiene la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEC ID Nº: 1 sino también sus compuestos análogos, como se define en las reivindicaciones.

Los compuestos análogos de Cofilina como se indican en la invención incluyen los siguientes que todos tienen la actividad de promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos: uno que comprende la secuencia de aminoácidos de Cofilina ilustrada por la SEC ID Nº: 1 excepto porque tiene de una a cinco deleciones, sustituciones y/o adiciones de aminoácidos; uno que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de bases que se puede hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia de bases complementaria a la secuencia de bases que codifica la secuencia de aminoácidos de Cofilina ilustrada por la SEC ID Nº: 1 y uno que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de secuencia de aminoácidos de al menos el 30%, preferiblemente al menos el 50%, más preferiblemente al menos el 60% y mucho más preferiblemente al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos de Cofilina (SEC ID Nº: 1). Los compuestos análogos de Cofilina como se indican en la invención también incluyen los siguientes, que todos tienen la actividad de promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos: uno codificado por una secuencia de bases que se puede hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia de bases complementaria a la secuencia de bases que codifica la secuencia de bases de Cofilina ilustrada por la SEC ID Nº: 2 y uno codificado por ADN que comprende una secuencia de bases que tiene una homología de secuencia de bases de al menos el 30%, preferiblemente al menos el 50%, más preferiblemente al menos el 60% y mucho más preferiblemente al menos el 70% con la secuencia de bases de la Cofilina ilustrada por la SEC ID Nº: 2.

En el caso de proteínas, "deleciones", "sustituciones" y "adiciones" se refieren a las que, como en el caso de Cofilina (SEC ID Nº: 1) tienen lugar de tal modo que presentan la actividad de promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos. Tómese, por ejemplo, el caso de "sustituciones" de aminoácidos; las mismas incluyen reemplazo de un aminoácido por otro que tenga una propiedad similar, digamos, reemplazo de un determinado aminoácido hidrófobo por otro aminoácido hidrófobo, reemplazo de un determinado aminoácido hidrófilo por otro aminoácido hidrófilo, reemplazo de un determinado aminoácido ácido por otro aminoácido ácido y reemplazo de un determinado aminoácido básico por otro aminoácido básico.

Las condiciones rigurosas como se refieren en la presente invención se refieren a las condiciones en las que una secuencia de bases deseada es capaz de hibridación específica con una secuencia de bases (por ejemplo SEC ID Nº: 2) que codifica para Cofilina (SEC ID Nº: 1) o una secuencia de bases degenerada de la misma. Las condiciones de hibridación se determinan considerando tales factores como temperatura y concentración iónica y se conoce generalmente que cuanto mayor sea la temperatura y cuanto menor sea la concentración iónica, mayor es el grado de rigurosidad. Cualquier especialista en la técnica puede ajustar condiciones rigurosas adecuadas basándose en las descripciones, por ejemplo, de Sambrook y Russel (Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3ª edición (2001)). Tales condiciones rigurosas se pueden ilustrar específicamente mediante el uso de condiciones de hibridación tales como SSC 6x, Denhardt 5 x, SDS al 0,1%, 25ºC - 68ºC. Una temperatura de hibridación más preferida puede ser 45ºC - 68ºC (sin formamida) o 25ºC - 50ºC (con formamida al 50%).

En la presente invención, la homología de secuencia de aminoácidos o bases se puede determinar mediante un ensayo visual y cálculos matemáticos. Alternativamente, la homología entre dos secuencias de proteínas se puede determinar comparando dos conjuntos de información de secuencia basándose en el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol., 48: 443-457, 1970) y usando un programa informático GAP disponible en el grupo Wisconsin University Genetics Computer Group (UWGCG). Los parámetros por defecto preferidos en el programa GAP incluyen: (1) matriz de puntuación blosum62 como se describe en Henikoff y Henikoff (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992); (2) 12 ponderaciones por huecos; (3) 4 ponderaciones de longitud de hueco y (4) ninguna penalización por huecos terminales.

Para análisis de homología de aminoácidos o de secuencia de bases en la presente invención, también se pueden emplear otros programas usados por los especialistas para la comparación de secuencias. Por ejemplo, se puede realizar la determinación de homología comparando información se secuencia usando el programa BLAST descrito en Altschul et al. (Nucl. Acids Res 25, p. 3389-3402, 1997). Específicamente, en el caso de análisis de secuencia de bases, la secuencia de bases Problema se puede introducir en el programa Nucleotide BLAST (BLASTN) y comprobar frente a bases de datos de secuencias de bases tales como GenBank, EMBL y DDBJ. En el caso de análisis de secuencias de aminoácidos, la secuencia de aminoácidos Problema se puede introducir en el programa de Protein BLAST (BLASTP) y comprobar frente a bases de datos de secuencias de aminoácidos tales como GenBank CDS, PDB, SwissProt y PIR. Los programas mencionados anteriormente están disponibles en Internet en la página web del Centro Nacional para Información Biotecnológica (NCBI) o el Banco de Datos de ADN de Japón (DDBJ). La diversidad de parámetros usados para preparar una búsqueda de homología con el programa BLAST se describe con detalle en esos sitios. Aunque los ajustes de algunos parámetros se pueden modificar cuando sea apropiado, la búsqueda de homología se realiza habitualmente con valores por defecto. También se pueden emplear otros programas usados por especialistas para la comparación de secuencia.

La Cofilina descrito anteriormente y sus compuestos análogos no están limitados a los de origen natural. También son útiles los que se pueden producir por estrategias de ingeniería genética ya conocidas en el campo técnico de la invención, por ejemplo, las que se producen por mutagénesis dirigida, mutagénesis aleatoria adoptando tratamiento con mutágeno o amplificación errónea por PCR y mutagénesis en casete. En otras palabras, la mutación puede haber tenido lugar de forma natural o mediante técnicas de ingeniería genética. Por ejemplo, la Cofilina que se conoce en términos de secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 1) y secuencia génica (SEC ID Nº: 2) se puede producir mediante técnicas de ingeniería genética establecidas basándose en esas secuencias. Se describen técnicas de ingeniería genética aplicables, por ejemplo, en Sambrook y Russel (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición (2001)). Los especialistas pueden preparar de manera sencilla esas proteínas mutadas mediante métodos convencionales.

La Cofilina se denomina con varios nombres diferentes dependiendo de la especie y habitualmente se denominan de forma conjunta una familia de Cofilina. En la presente invención, todas las moléculas de Cofilina incluyendo las que se originan de las especies de y que pertenecen a la familia de Cofilina se denominan de forma conjunta Cofilina. Por lo tanto, además de la que se denomina Cofilina que incluye Cofilina de tipo no muscular humana y Cofilina de tipo muscular humana, la Cofilina como se denomina en la invención incluye, por ejemplo, dextrina porcina, factor despolimerizante de actina de pollo (ADF), depactina del huevo de un erizo, Abpl de levadura, actoforina de acantamoeba y sus compuestos análogos.

La actividad de sustancias que tienen la actividad de Cofilina como el promotor del crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos no tiene especificidad de especie estricta, como se ilustra mediante la Cofilina obtenida de ratón que muestra efectos sobre células humanas. Por lo tanto, el ingrediente activo de los presentes promotores para el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos no se limita por ningún medio a Cofilina siempre que se pueda comparar con Cofilina en la actividad de promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos, el ingrediente activo no se tiene que originar de ninguna especie particular y se puede originar en diversos animales incluyendo vacas, cerdos, aves, cabras y ovejas. Sin embargo, se debe señalar que para el uso en seres humanos, se prefieren sustancias obtenidas de seres humanos que tengan la actividad de Cofilina, concretamente, Cofilina obtenida de ser humano o compuestos análogos de dicha Cofilina obtenidos de ser humano.

En una realización de la invención, los promotores del crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos pueden contener, además de Cofilina o sus compuestos análogos, una o más citoquinas como ingredientes activos auxiliares que tienen la capacidad de promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos.

Los ejemplos de citoquinas que se pueden incorporar adicionalmente como ingredientes activos auxiliares en la presente invención incluyen, pero sin limitación, interleucina (IL)-3, factor de células madre (SCF), ligando de flk-2/flt-3 (FL) y trombopoyetina (TPO). Las citoquinas que se pueden incorporar adicionalmente en la presente invención preferiblemente son el factor de células madre (SCF), ligando de flk-2/flt-3 (FL), trombopoyetina (TPO) y combinaciones de dos o más de los mismos.

Si esas citoquinas se incorporan como ingredientes activos auxiliares, la eficacia de Cofilina como los promotores del crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos aumenta de forma sinérgica. La cantidad de adición de esas citoquinas no está limitada de ningún modo particular pero, por ejemplo, se pueden añadir en el 0,0001 al 200000% en peso con Cofilina humana tomada como 100. La cantidad de adición de esos ingredientes activos auxiliares no se limita por ningún medio a los valores que se han señalado anteriormente y se puede determinar como sea apropiado para los síntomas de la enfermedad, edad del paciente, etc. Esas citoquinas no se tienen que administrar necesariamente en la misma forma de dosificación al mismo tiempo que la Cofilina y en un caso ilustrativo, la administración de Cofilina puede estar seguida de la administración de una citoquina.

En una realización de la presente invención, se puede añadir una sustancia diferente de la Cofilina que tenga la actividad de HPP-CFC como un ingrediente activo auxiliar adicional a los promotores del crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos descritos anteriormente. La sustancia diferente de Cofilina que tiene la actividad de HPP-CFC y que se puede añadir como un ingrediente activo auxiliar adicional se refiere a todas las sustancias diferentes de la Cofilina que sean capaces de promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos promoviendo la formación de colonias obtenidas de HPP-CFC. Administrando la Cofilina y esos ingredientes activos auxiliares adicionales simultáneamente, la acción de promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos se puede mejorar de forma sinérgica. Tales ingredientes activos auxiliares adicionales incluyen, pero sin limitación, SCF, ligando de flk2/flt-3 y TPO.

Los promotores de la invención para el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos que contienen Cofilina como ingrediente activo son eficaces, basándose en las funciones que muestran después de la administración al cuerpo, para mejorar métodos para tratar enfermedades que se producen por el crecimiento y/o diferenciación insuficientes de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos, en particular, panhematopenia y/o enfermedades que están acompañadas de hipofunción hematopoyética, o hematopenia o enfermedades que están acompañadas por función hematopoyética alterada y/o métodos de tratamiento que están acompañados de hematopenia o función hematopoyética alterada. Los ejemplos de las enfermedades mencionadas anteriormente incluyen síndrome de Fanconi, anemia aplásica, cánceres tales como linfoma maligno y leucemia aguda, hepatopatía crónica, insuficiencia renal, pacientes con transfusión masiva, durante cirugía o de sangre conservada, infecciones graves, trombocitopenia mielopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), STE, veneno de serpiente venenosa, síndrome urémico hemolítico, estasis de función esplénica, hemorragia, síndrome de Barnard-Soulier, trombocitastenia de Glanzmann, uremia, anticuerpos anti-plaquetas, enfermedades mieloproliferativas, etc.

El modo en el que los presentes promotores de crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos se formulan para la administración no está limitado particularmente pero generalmente son para administración parenteral, como por administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular y otras vías. En la presente invención, se prefiere la administración intravenosa.

La cantidad en la que los presentes promotores del crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos se usan como agentes terapéuticos o mitigantes varía con el modo de su uso, el objeto de su uso, etc. En el caso de administración por inyección, los promotores se administran preferiblemente en cantidades diarias de aproximadamente 0,002 \mug/kg a 20 mg/kg, más preferiblemente de aproximadamente 0,2 \mug/kg a 2 mg/kg como se calcula para la cantidad de proteína en Cofilina humana.

Los presentes promotores de crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos se pueden preparar en forma líquida o sólida.

Si los presentes promotores del crecimiento y/o diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos se tienen que preparar en forma líquida, la Cofilina se disuelve en primer lugar en disolventes tales como disolventes acuosos (por ejemplo, agua destilada), disolventes solubles en agua (por ejemplo, solución salina fisiológica y solución de Ringer) y disolventes oleosos (por ejemplo, aceite de sésamo y aceite de oliva) y después se elaboran por métodos convencionales. Si se desea, se pueden añadir agentes solubilizantes (por ejemplo, salicilato sódico y acetato sódico), tampones (por ejemplo, citrato sódico y glicina), agentes de isotonización (por ejemplo, glucosa y azúcar invertido), estabilizantes (por ejemplo, albúmina sérica humana y polietilenglicol), conservantes (por ejemplo, cloruro de benzalconio y fenol), agentes suavizantes (por ejemplo, alcohol bencílico y clorhidrato de procaína) y otros aditivos. El pH de la soluciones acuosas preparadas se ajusta preferiblemente a aproximadamente 3 - 8, más preferiblemente a aproximadamente 5 - 7. El ajuste a los intervalos de pH indicados se puede conseguir añadiendo, por ejemplo, ácidos diluidos (por ejemplo, ácido clorhídrico diluido) y en bases diluidas (por ejemplo, hidróxido sódico diluido e hidrogenocarbonato sódico diluido).

Cuando se preparan preparaciones farmacéuticas a partir de los presentes promotores para el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos, se puede incorporar albúmina sérica humana (HAS) como un estabilizante en preparaciones en solución que contengan Cofilina de tal forma que se ajustan para mostrar pH 3 - 8 en forma de solución. Este procedimiento se prefiere ya que solamente provoca una caída pequeña de actividad de Cofilina no solamente durante el almacenamiento sino también en el proceso de congelación o secado por congelación y debido a que permite que preparaciones congeladas se descongelen a una solución transparente. La HSA puede ser de cualquier tipo, pero para poner la presente invención en una aplicación clínica, la HSA preferiblemente es de una calidad tal que permita la administración parenteral. Por ejemplo, el plasma de personas sanas se puede fraccionar y purificar por el método seis del fraccionamiento de etanol de Cohn para preparar HAS útiles. También pueden estar contenidos acetiltriptofano sódico y caprilato sódico como estabilizantes. Cuando los componentes respectivos se preparan en solución acuosa, la HSA preferiblemente está contenida en cantidades de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 50 mg, particularmente de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 20 mg por mililitro de la solución acuosa.

Cuando se preparan preparaciones farmacéuticas a partir de los presentes promotores del crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos, además de la HAS, descrito anteriormente, se pueden incorporar uno o más compuestos a preparaciones en solución que contienen Cofilina seleccionados del grupo que consiste en aminoácidos tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico, alanina y prolina, en particular, aminoácidos alifáticos de tipo monoamino o aminoácidos cíclicos, monosacáridos tales como glucosa y manosa, alcoholes de azúcar tales como sorbitol y manitol, sales fisiológicamente aceptables de los mismos y derivados de los mismos. Cuando la Cofilina se prepara en solución acuosa, los compuestos mencionados anteriormente se incorporan preferiblemente en cantidades de aproximadamente 10 mg a 100 mg (si son monosacáridos o alcoholes de azúcar) y de aproximadamente 5 mg a 50 mg (si son aminoácidos) por mililitro de la solución acuosa. En el proceso de preparar preparaciones farmacéuticas, la solución acuosa se ajusta de tal forma que, cuando se toma como tal, muestra un pH de aproximadamente 3 a 8, preferiblemente de 5 a 7. Si se tiene que incorporar aminoácidos ácidos tales como ácido glutámico, el ajuste hasta el pH especificado se puede conseguir añadiendo los mismos en las cantidades especificadas anteriormente. Alternativamente, si se desea o en el caso en el que se no se incorporen aminoácidos ácidos, el ajuste hasta el pH especificado se puede conseguir usando ácidos minerales tales como ácido clorhídrico y ácido fosfórico o tampones tales como ácido succínico, ácido tartárico y ácido cítrico.

Los presentes promotores del crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos se pueden preparar en forma sólida, por ejemplo, congelando o secando por congelación Cofilina. En particular, desde los puntos de vista de sencillez de manipulación y estabilidad en almacenamiento, se prefiere el secado por congelación de Cofilina. Para preparar los presentes promotores del crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos mediante congelación, los promotores preparados como solución acuosa para promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos se usan como un material de partida y se congelan típicamente aproximadamente a -80ºC hasta -20ºC. Las composiciones congeladas se almacenan aproximadamente de -80ºC a 25ºC, preferiblemente de aproximadamente -80ºC a 15ºC, más preferiblemente de aproximadamente -80ºC a -10ºC. Para preparar los presentes promotores del crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos mediante secado por congelación, las composiciones congeladas descritas anteriormente se pueden secar bajo presión reducida de modo habitual o, alternativamente, la solución acuosa mencionada anteriormente o una solución acuosa obtenida descongelando la composición congelada descrita anteriormente se divide opcionalmente en porciones más pequeñas, después se congela del modo descrito anteriormente y se seca con presión reducida del modo
habitual.

En la presente invención, la Cofilina en forma sólida (por ejemplo, en polvo) se puede mezclar con diluyentes (por ejemplo, agua destilada, solución salina fisiológica y glucosa), vehículos (por ejemplo, carboximetil celulosa (CMC) y alginato sódico), conservantes (por ejemplo, cloruro de benzalconio y fenol), agentes suavizantes (por ejemplo, glucosa, alcohol bencílico y clorhidrato de procaína), etc.

Si las preparaciones farmacéuticas sólidas descritas anteriormente se preparan mediante secado por congelación, se pueden procesar adicionalmente hasta preparaciones en solución disolviendo las mismas en disolventes adecuados justo antes del uso. Más específicamente, las preparaciones farmacéuticas sólidas descritas anteriormente se disuelven en agua destilada, solución salina fisiológica o similares y se usan como preparaciones en solución. Si se desea, las preparaciones farmacéuticas sólidas se pueden usar después de que se hayan solubilizado con solubilizantes con ajuste de pH que contienen los monosacáridos, alcoholes de azúcar, aminoácidos, etc., mencionados anteriormente.

Si los presentes promotores del crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos se tiene que producir como preparaciones en solución o mediante congelación, las soluciones acuosas que contienen Cofilina se pueden esterilizar preferiblemente mediante filtración o similares. Si los promotores se tienen que producir como preparaciones en solución, la solución acuosa esterilizada se puede usar como tal; si los promotores se tienen que producir mediante congelación, la solución esterilizada se puede congelar.

Si los presentes promotores del crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos se tienen que producir por secado por congelación, las soluciones acuosas que contienen Cofilina se pueden esterilizar preferiblemente mediante filtración o similares o, alternativamente, la solución acuosa esterilizada de este modo se dispensa asépticamente en viales y similares en porciones menores antes de que se someta al tratamiento de secado por congelación mencionado anteriormente. En este caso, el espacio de cabeza de cada recipiente se puede convertir en vacío o purgar con gas de nitrógeno para mejorar la estabilidad de la composición en el recipiente. Si los productos secados por congelación se tienen que disolver en soluciones acuosas que contienen aminoácidos, monosacáridos o alcoholes de azúcar, tales soluciones acuosas preferiblemente se esterilizan por filtración, después se dispensan asépticamente en ampollas y similares en porciones menores antes de que se esterilicen con vapor del modo habitual.

Ya que los presentes promotores de crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos que contienen Cofilina como un ingrediente activo muestran los efectos farmacológicos descritos anteriormente, los presentes promotores del crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos también se pueden usar en medicina regenerativa.

Si los presentes promotores del crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos se tienen que usar en medicina regenerativa, se administran in vivo como se ha descrito anteriormente o se añaden ex vivo a un medio de cultivo. Si los promotores de crecimiento y/o de diferenciación de la presente invención se tienen que usar ex vivo, típicamente se puede emplear el siguiente método, pero también se pueden adoptar cualquier a de otros métodos que se conocen en el campo técnico de interés. En la primera etapa, las células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos se recogen de un sujeto mediante un método conocido en el campo técnico de interés y después se desarrollan por cultivo en un medio de cultivo que contiene los promotores de crecimiento y/o diferenciación de la presente invención, promoviendo de este modo el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos; después de esto, las células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos crecidos y/o diferenciados se transfieren de nuevo al sujeto.

Si los promotores de crecimiento y/o diferenciación de la presente invención se tienen que usar ex vivo, se añaden a un medio de cultivo líquido en cantidades tales que la concentración de Cofilina en el medio varía de 1 ng/ml a 100 \mug/ml, preferiblemente de 2,5 ng/ml a 50 \mug/ml, más preferiblemente de 25 ng/ml a 10 \mug/ml, mucho más preferiblemente de 250 ng/ml a 2,5 \mug/ml. Como se ha mencionado previamente, las citoquinas se pueden añadir adicionalmente a los promotores de crecimiento y/o diferenciación de la presente invención. Las citoquinas que se pueden añadir opcionalmente en la invención son preferiblemente factor de células madre (SCF), ligando de flk-2/flt-3 (FL), trombopoyetina (TPO) y combinaciones de dos o más de los mismos.

Modos de realizar la invención (1) Método para ensayar la sustancia que tiene la actividad de promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos

Para ensayar el crecimiento de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos, la invención usa un método que comprende las etapas de realizar cultivo líquido en una muestra y las células de médula ósea de ratón retiradas de células que han expresado marcadores de linaje y recontando el número de células formadoras de colonias de potencial proliferativo alto (HPP-CFC) presentes en el medio acondicionado incluyendo las células madre hematopoyéticas. Los sistemas de ensayo que usan HPP-CFC como un indicador se emplean ampliamente en estudios de células madre hematopoyéticas. Por ejemplo, el factor de células madre (SCF) que actúa sobre células madre hematopoyéticas se purifica con referencia a HPP-CFC.

(2) Purificación de la sustancia que tiene la actividad de promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos

Para purificar la sustancia que tiene la actividad de promover el crecimiento de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos, se usa un sobrenadante de cultivo sin proteína de células S6 (600 l) y células como materiales de partida y se concentra (a 18 l) mediante ultrafiltración a través de una membrana de UF que tiene un peso molecular de 10000, seguido de combinaciones secuenciales de tratamientos que incluyen precipitación con sulfato de amonio al 50% y diversos procesos cromatográficos en columna usando fenil-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech K.K.) heparina-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech K.K.), quelato-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech K.K), MonoS (Amersham Pharmacia Biotech K.K.), filtración en gel, etc. Las proteínas se verifican por absorbancia a 280 nm, cuantificación de Lowry y SDS-PAGE.

(3) Determinación de la estructura de la sustancia que tiene la actividad de promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos

Para determinar la estructura de la sustancia que tiene la actividad de promover el crecimiento de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos, se explora una base de datos de secuencias de proteína/ácido nucleico con referencia a los pesos moleculares de varios fragmentos peptídicos que se producen a partir de la descomposición limitada de proteínas y a los pesos moleculares que se producen por la disociación inducida por colisión y se identifica la proteína inicial. Los antecedentes técnicos de este método comprenden los siguientes tres aspectos: los avances de espectrómetro de masa y espectrometría de masa que hacen posible determinar los pesos moleculares de proteínas y péptidos con alta precisión; (2) el Proyecto Genoma y otros esfuerzos tecnológicos han acumulado grandes volúmenes de datos de secuencias de proteína/ácido nucleico y (3) la evolución de la tecnología informática que puede procesar grandes volúmenes de datos a alta velocidad. La ventaja del método es que se procesan cantidades muy pequeñas (\sim 10 ng más) de muestras mediante procedimientos sencillos para permitir la identificación rápida y positiva de proteínas desconocidas.

(4) Método para medir actividad de HPP-CFC

La medición de la actividad de HPP-CFC se realiza mediante el siguiente procedimiento: con miras a obtener células madre hematopoyéticas específicamente, se retiraron células T, células B, granulocitos y macrófagos de células de médula ósea murinas tratadas con el agente anti-canceroso 5-fluorouracilo para preparar fracciones de células madre hematopoyéticas; después de añadir una muestra de citoquinas, las fracciones de células madre hematopoyéticas se someten a cultivo líquido y parte del medio acondicionado que incluye las células madre hematopoyéticas se somete a ensayo de colonias; se recuenta el número de la colonias de HPP-CFC macroscópicas resultante.

Siempre que sea necesario en la presente memoria descriptiva, las bases, los aminoácidos, etc., se indican mediante abreviaturas de acuerdo con la Comisión de IUPAC-IUB de Nomenclatura Bioquímica o abreviaturas convencionales en la técnica de interés.

En las siguientes páginas se describen ejemplos. Los mismos se proporcionan solamente para ilustrar la presente invención con mayor detalle y de ningún modo tienen por objeto limitar el alcance de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Purificación e identificación de la sustancia que tiene la actividad de promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos (1) Preparación de células S6 humanas

Se cultivaron células S6 humanas en frascos rotativos (Corning, 430851) que tenían un área eficaz de 750 cm^{2}. Específicamente, se pusieron 1 x 10^{8} células en cada frasco y se cultivaron en 500 ml de un medio F-12 (Flow Laboratories) complementado con suero fetal bovino al 10% (FBS, Hyclone) a 37ºC durante 72 horas a 0,5 rpm. Después de 72 h de cultivo, el sobrenadante del cultivo se centrifugó y lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS, Nissui Seiyaku Co., Ltd.) tres veces. Después del lavado, el sedimento celular aclarado del sobrenadante por centrifugación se almacenó congelado a -20ºC.

(2) Ensayo de la sustancia que tiene la actividad de promover el crecimiento y la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos usando células de médula ósea de ratón

La actividad de la sustancia capaz de promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos se midió mediante el procedimiento siguiente: con miras a obtener específicamente células madre hematopoyéticas, se retiraron células T, células B, granulocitos y macrófagos de células de médula ósea murinas tratadas con el agente anticanceroso 5-fluorouracilo (KYOWA HAKKO KOGYO, Co., Ltd) para preparar fracciones de células madre hematopoyéticas; después de añadir una muestra y citoquinas, las fracciones de células madre hematopoyéticas se sometieron a cultivo líquido y parte del medio acondicionado que incluía las células madre hematopoyéticas se sometió a ensayo de colonias y se recontó el número de colonias de HPP-CFC macroscópicas resultante. Este procedimiento se denomina más adelante en este documento el método de determinación de actividad de HPP-CFC.

Específicamente, a ratones de DBF1 (hembra, 10-15 semanas de edad, adquiridas en Charles River Japan Inc.) se administró 5-fluorouracilo (150 mg/kg, i.v., KYOMA HAKKO KOGYO, Co., Ltd.) y 2 días más tarde, se recogieron células de médula ósea de los huesos femorales. Las células de médula ósea recogidas se marcaron con anticuerpo de rata anti-CD4 de ratón (CALTAG), anticuerpo CD8 (CALTAG), anticuerpo B220 (CEDERLANE), anticuerpo Gr-1 (CEDERLANE) y anticuerpo Mac-1 (CALTAG). Esos anticuerpos de rata eran todos IgG. Después de la reacción con anticuerpo de cabra anti-IgG de rata marcado con Dyna Beads (DYNAL), las células que se unían a la Dyna Beads se retiraron magnéticamente para obtener células de médula ósea negativas a marcador de linaje (Lin^{-} BMC). Las Lin^{-} BMC se ajustaron a una concentración de 2,5 x 10^{4} células/ml en un medio \alpha-MEM (Invitrogen) complementado con FCS al 10% (Invitrogen). A la suspensión celular se añadió IL-3 de ratón (a una concentración final de 10 ng/m, INTERGEN) y la mezcla se puso en cada pocillo de una placa de 24 pocillos (Corning) en una cantidad respectiva de 1 ml. Posteriormente, se puso una muestra en cada pocillo y se cultivó en un incubador de CO_{2}en condiciones de 37ºC y CO_{2} al 5%. A los días 6 y 10 del cultivo líquido, las células cultivadas en cada pocillo se suspendieron y se recogieron 200 \mul de la suspensión celular. En un tubo de centrífuga de 15 ml, se mezcló la suspensión celular recogida (200 \mul) con 1,5 ml de FCS (a una concentración del 30%), 0,5 ml de BSA (a una concentración final del 1%, ICN), 50 \mul de 2-ME (a una concentración final de 1 x 10^{-4} M, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2 ml de metil celulosa al 2,5% preparada en \alphaMEM (a una concentración final del 1%, Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.), 50 \mul de cada factor hematopoyético (es decir, IL-3 de ratón (INTERGEN), SCF (PreproTech), IL-6 humano (PreproTech), G-CSF (CHUGAI PHARMACEUTICAL COL., LTD) y M-CSF (The Green Cross Corp.); todos a una concentración final de 10 ng/ml y 0,5 ml de \alphaMEM, preparando un total de 5 ml. Después de esto, la mezcla se dejó reposar durante 20 minutos para retirar todas las burbujas y se transfirió 1 ml de la misma a cuatro placas de 35 mm (Corning) para cultivar células suspendidas. Se pusieron dos placas de 35 mm en una placa de Petri de 9 cm y una placa de 35 mm no recubierta llena con agua destilada también se puso durante 14 días de cultivo en un incubador de CO_{2} en condiciones de 37ºC y se CO_{2} al 5%. Se recontó el número de colonias mayores de 2 mm de diámetro como HPP-CFC.

(3) Purificación de la sustancia que tiene la actividad de promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos

A células S6 (peso húmedo, 269 g) que se habían lavado con PBS y almacenado en congelación, se añadió tampón Tris/HCl 20 mM (pH 7,0) y la mezcla se alteró con un homogeneizador de Teflón de tipo Potter-Elvehjem (marca comercial registrada) (IWAKI GLASS CO., LTD). El residuo celular se eliminó por centrifugación (8000 rpm, 20 min) para dar un sobrenadante, que se convirtió en saturado al 50% mediante la adición de sulfato de amonio. Después, el sobrenadante se cargó en fenil-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech K.K.) equilibrado con sulfato de amonio 2 M/tampón Tris/HCl 20 mM (pH 7,0) y se lavó minuciosamente; después de esto, la concentración de sulfato de amonio se disminuyó progresivamente hasta 1,5 M, 1 M, 0,5 M y 0 M para eluir las fracciones unidas correspondientes. El factor de interés, concretamente, el factor S6 que ya se ha descrito en esta memoria descriptiva, se eluyó en su mayoría a la fracción de tampón sulfato de amonio 1M/Tris/HCl 20 mM (pH 7,0), como se verificó por la misma estrategia como el método para determinar la actividad de HPP-CFC descrita anteriormente en (2).

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Las fracciones activas obtenidas en fenil-Sepharose se dializaron completamente frente a tampón NaCl 0,6 M/Tris/
HCl 20 mM (pH 7,0), se cargaron en una columna de heparina/Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech K.K) para lavarse y después de eso se trataron con tampón NaCl 2 M/Tris/HCl 20 mM (pH 7,0) para eluir las respectivas fracciones unidas. Cada una de las fracciones eluidas de heparina se diluyó cuatro veces con tampón Tris/HCl 20 mM (pH 7,0), se adsorbió sobre una columna de quelato de cobre (Cu)-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech K.K.) equilibrada con tampón NaCl 0,5 M/Tris/HCl 20 mM (pH 7,0) y se sometió a reemplazo de tampón a lo largo de un lavado de dos etapas con tampón NaCl 0,5 M y 0,3 M/fosfato sódico 20 mM (pH 6,8).

Las fracciones unidas se eluyeron con tampón imidazol 0,1 M/NaCl 0,3 M/fosfato sódico 20 mM (pH 6,8) y, como tales, se cargaron en una columna de intercambio iónico MonoS equilibrada con tampón NaCl 0,4 M/fosfato sódico 20 mM (pH 6,8) para realizar una elución en gradiente de NaCl 0,4 - 2 M a un caudal de 0,7 ml/min y los eluídos se almacenaron después de añadir un tensioactivo CHAP para dar una concentración final del 0,1%. La actividad de HPP-CFC se observó en las fracciones 47-50. Se verificó mediante ELISA que esas fracciones contenían tanto el factor S6 deseado como FGF básico. Las fracciones activas MonoS se dividieron en dos grupos, consistiendo el primer grupo en las fracciones 47 y 48 y consistiendo el segundo grupo en las fracciones 49 y 50 y se realizó un intento de aclarar las mismas del FGF básico mediante cromatografía en gradiente en una columna de heparina. Después de cargar en una columna de heparina-Sepharose equilibrada con tampón NaCl 0,4 M/fosfato sódico 20 mM (pH 6,8)/CHAPS al 0,1%, se realizó una elución en gradiente de NaCl 0,4 - 4 M a un caudal de 0,7 ml/min.

El primer grupo activo MonoS mostró actividad en las fracciones 30-32; mediante ELISA, se verificó que poseían FGF básica, aclarando de este modo que la actividad de interés procedía del FGF básico.

El segundo grupo MonoS mostró actividad de HPP-CFC en fracciones diferentes a las fracciones 30-32 (fracciones de FGF básico), concretamente, en las fracciones 22 y 23 en las que no se detectó FGF básico mediante ELISA. Las fracciones en la proximidad de las fracciones activas se sometieron a un ensayo de dosis y un ensayo en un sistema complementado con 1 ng/ml de FGF básico. La actividad se observó en las fracciones 22 y 23 de un modo dependiente de dosis y se mostró una mayor actividad de promoción de formación de colonias de HPP-CFC el día 10 del cultivo líquido que en el día 6. En el sistema de ensayo complementado con FGF básico, también se observó que las fracciones 22 y 23 tenían actividad de HPP-CFC que sobrepasaba la actividad completa de FGF básico tomado solo.

Para la reconfirmación de la actividad, se realizó otro procesamiento cromatográfico en una columna de heparina con una pendiente de gradiente variada. Después de la carga en una columna de heparina-Sepharose equilibrada con tampón NaCl 0,3 M/fosfato sódico 20 mM (pH 6,8)/CHAPS al 0,1%, se realizó elución en gradiente de NaCl a una pendiente menor de 0,3-2 M. La actividad de HPP-CFC se observó en las fracciones 25-27, que se verificó mediante ELISA que no tenía FGF básico. Se observó que la fracción activa 26 posee la actividad de un modo dependiente de dosis y el sistema complementado con FGF básico también poseía una actividad de HPP-CFC que sobrepasaba la actividad completa de FGF básico tomado solo. También se observó una banda de 20 kDa en las fracciones activas por análisis electroforético de SDS-poliacrilamida (densidad de gel: gradiente del 10-20%).

Como resultado de las anteriores etapas, las fracciones que muestran una banda de 20 kDa en el análisis electroforético en SDS-poliacrilamida se obtuvieron en una cantidad de aproximadamente 0,4 \mug a partir de 120 l de células S6. Ya que se verificó que esas fracciones tenían actividad de HPP-CFC, la banda de 20 kDa observada en las mismas obviamente era la sustancia que tenía la actividad de promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos.

(4) Propiedades de la sustancia que tiene la actividad de promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos

El factor de interés tiene las siguientes propiedades.

1. Peso molecular: aproximadamente 20 kDa (SDS-PAGE)

El factor se detectó como una única banda cerca de 20 kDa en análisis electroforético en SDS-poliacrilamida, sin diferencia en motilidad independientemente de si la condición era reductora o no reductora. Por tanto, el factor no tenía enlaces disulfuro intermoleculares.

2. Punto isoeléctrico: 8,1 \pm 0,5

El factor se detectó como un punto en el intervalo indicado en análisis electroforético bidimensional usando AFB Multiphor II (Amersham Pharmacia Biotech K.K.)

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(5) Determinación de la estructura de la sustancia que tiene la actividad de promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos

Se hizo un intento de determinar la estructura del factor mediante el siguiente procedimiento.

Preparación de muestras para mediciones de EM y EM/EM

Fracciones purificadas que contenían la banda de 20 kDa identificada como el factor de interés se sometieron a análisis electroforético en SDS-poliacrilamida en un gel de acrilamida al 12,5% y después de esto se tiñeron con CBB al 0,1%/MeOH al 40%/AcOH al 1%. Después de detectarse, la banda de 20 kDa se cortó y decoloró con MeOH al 40%/AcOH al 1%. El gel decolorado se sumergió en DTT 10 mM/NH_{4}CHO_{3} 100 mM (pH 8,7), se incubó a 56ºC durante 1 hora, se complementó con yodo acetamida 50 mM y se incubó en oscuridad durante 45 minutos para reducir y alquilar el factor. Después de eliminar el exceso de agentes reductores y alquilantes del gel, se añadieron 150 mg de tripsina (Promega)/CaCl_{2} 5 mM/NH_{4}HCO_{3} 50 mM y se realizó la digestión con tripsina dentro del gel a 37ºC durante 18 horas. Después del fin de la reacción, la mezcla de fragmentos peptídicos se extrajo y se secó con SPEED BACK (Savant). La mezcla de fragmento peptídico disuelta en TFA al 0,05% se sometió a PorosR2 (Perseptive Co., Ltd) equilibrado con TFA al 0,05% y se desalificó por elución con MeOH al 50%/FA al 0,2%. La mezcla de fragmento peptídico desalificado se usó como una muestra (compuesto de fragmento peptídico acondicionado) para cada una de espectrometría de masa (EM) y espectrometría de masas en tándem (EM/EM). Como un control negativo, un sitio del que se podría detectar una banda de 20 kDa se cortó de los carriles sometidos a análisis electroforético en SDS-poliacrilamida con solamente un tampón de muestra y se acondicionó mediante el mismo método que para el factor de interés. Para detalles de funcionamiento diferentes a los descrito anteriormente, se hace referencia al método de Wilm et al. (Wilm, M., Shevchenko, A., Houthaeve, T., Breit, S., Schweigerer, L., Fotsis, T y Mann, M., Nature 379, 466-469, 1996).

Determinación estructural por análisis de EM y EM/EM

Para determinar la estructura del factor se usó Q-TOF (aceleración ortogonal cuádruple tiempo de vuelo, espectrómetro de masa de Micromass Inc.) y se realizaron EM y EM/EM de acuerdo con los manuales de funcionamiento. En primer lugar, la mezcla de fragmento peptídico acondicionado y el control negativo se midieron a lo largo de un intervalo de mz de 100-1500 por EM. Para iones moleculares polivalentes que sirven como un indicador peptídico, se realizó una comparación mediante los dos métodos y se detectaron significativamente tres iones moleculares divalentes en la mezcla de fragmento peptídico acondicionado (véase Tabla 1).

TABLA 1 Iones Principales Obtenidos en Análisis de EM y EM/EM

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\quad: Número iónico molecular: 1

\quad: Ión molecular: 538,82 (divalente)

\quad: Número iónico molecular: 2

\quad: Ión molecular: 669,39 (divalente)

\quad: Ión de producto (ión y): 712,43, 827,45, 990,51, 1103,60, 1174,66

\quad: Ión de producto (ión i): 86,08, 136,07

\quad: Número iónico molecular: 3

\quad: Ión molecular: 670,9 (divalente)

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Esos tres iones moleculares divalentes se eligieron individualmente y analizaron por EM/EM. Basándose en la información obtenida con respecto a los iones de producto principales, los inventores realizaron una búsqueda usando ProteinProspector (http://prospector.uscf.edu/mshome3.2.htm), uno de los programas de búsqueda en bases de datos publicados en Internet y coincidieron con la Cofilina de tipo no muscular humana (AC: P23528, pI 8.22, 166aa), bien conocida como una proteína de regulación de actina de bajo peso molecular. El factor de interés era similar a la Cofilina de tipo no muscular humana en términos tales como peso molecular y punto isoeléctrico.

Sin embargo, dados los resultados de los análisis de EM y EM/EM solos, es difícil concluir positivamente que el factor de interés es una Cofilina de tipo no muscular humana. Por tanto, para realizar un estudio estrecho con respecto a la coincidencia entre la información descrita en la Tabla 1 y la Cofilina de tipo no muscular humana, se sintetizaron péptidos (véase la Tabla 2), como inferidos a partir de la información obtenida y se verificó su identidad midiendo los espectros para disociación inducida por colisión. Como resultado, se obtuvo que toda la información obtenida estaba de acuerdo con la información descrita en la Tabla 1. Es digno de mención especial que la información obtenida contenía información con respecto a los péptidos que tenían extremos N y C que se da en la Tabla 2, indicando de este modo que los extremos N y C en el factor son idénticos a los de la Cofilina de tipo no muscular humana. Basándose en estas observaciones, se identificó el factor como una Cofilina de tipo no muscular humana (de tipo activo desde el punto de vista de regulación de actina) que se había aclarado de la metionina al comienzo de la traducción, estando la alanina resultante acetilada y la serina posterior no fosforilada (véase la Figura 1).

TABLA 2 Secuencias de Aminoácidos Parciales Inferidas por Búsqueda en Base de Datos

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\quad: Número de ión molecular: péptido que tiene un extremo N inferido a partir de la información 1

\quad: (AcetN) ASGVAVSDGVIK + Na añadido

\quad: Número de ión molecular: péptido como inferido de la información 2

\quad: YALYDATYETK

\quad: Número de ión molecular: péptido que tiene un extremo C como se infiere de la información 3

\quad: LGGSAVISLEGKPL

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Ejemplo 2 Preparación de Cofilina (1) Preparación de una genoteca de ADNc obtenida de una línea celular de S6 humana

Se cultivaron células S6 (1,2 x 10^{8} células) durante 4 días en un frasco rotativo que contenía un medio F12 sin suero (Invitrogen) y se prepararon 37 \mug de ARN poliA de células S6 a partir de las células cultivadas usando el Kit de Aislamiento de ARNm FastTrack (Invitrogen). A partir de 5 \mug del ARN poliA de células S6, se preparó ADNc que tenía un sitio de enzima de restricción EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd.) y un sitio de enzima de restricción NotI (Takara Shuzo Co., Ltd.) en extremos opuestos usando el Kit de Síntesis de ADNc TimeSaver (Amersham Pharmacia Biotech K.K.) y Directional Cloning Toolbox (Amersham Pharmacia Biotech K.K.).

Después, el ADNc se insertó en el vector de clonación de fago \lambda \lambdaExcell NotI/EcoRI/CIP (Amersham Pharmacia Biotech K.K.) y se realizó el empaquetamiento in vitro usando el Extracto de Empaquetamiento Gigapack III Gold (Stratagene). Usando E. coli NM522 (Stratagene) como un hospedador, se recontó el número de placas en un medio agar para determinar el título, que se calculó que era 1,37 x 10^{6} ufp. Además, usando E. coli NM522 como un hospedador, se realizó la amplificación de genoteca para preparar una genoteca de ADNc de células S6 que tenía un título de 6,9 x 10^{10} ufp/ml. La genoteca de ADNc de células S6 tenía un tamaño de inserción promedio de 1,0 kb.

(2) Clonación de longitud completa de ADNc de Cofilina de tipo no muscular humana mediante PCR

Basándose en la secuencia de bases (Ac: D00682, 501 pb) que codifica la secuencia de aminoácidos de una Cofilina de tipo no muscular humana obtenida de placenta, se sintetizaron los oligómeros SK013 (correspondientes a los números 1-16 en la Figura 2; cebador SK013: SEC ID Nº: 3) y SK014 (correspondiente a los números 476-501 en la Figura 2; cebadores SK014: SEC ID Nº: 4).

Cebador SK013	5'-ATGGCCTCCGGTGTGGCTGTCTCTGA-3'	(SEC ID Nº: 3)

Cebador SK014	5'-TCACAAAGGCTTGCCCTCCAGGGAGA-3'	(SEC ID Nº: 4)

El ADNc de Cofilina de tipo no muscular humana se amplificó mediante PCR usando la polimerasa 2 de Advantage (CLONTECH), usando la genoteca de ADNc de células S6 como un molde y el cebador SK013 (SEC ID Nº: 3) y el cebador SK014 (SEC ID Nº: 4) como cebadores. Los productos amplificados se subclonaron en el vector pCR-Blunt II-TOPO usando el Kit de Clonación por PCR Zero Blunt TOPO (Invitrogen) para dar clones positivos que tenían fragmentos de ADN de aproximadamente 500 pares de bases. Los clones positivos se sometieron a un análisis de secuencia de bases con ABI PRISM 310 (Applied Biosystems) usando el Kit BigDye Terminador Cycle (Applied Biosystems), evaluando la adquisición de un ADNc de Cofilina de tipo no muscular de longitud completa de 501 pares de bases. La secuencia de bases del ADNc de Cofilina de tipo no muscular humana obtenida de células S6 era diferente de la del ADNc de Cofilina de tipo no muscular humana obtenido de placenta en dos bases pero ninguno venía acompañado de una mutación de aminoácidos (véase Figura 3).

(3) Construcción de un vector de expresión para ADNc de Cofilina de tipo no muscular humana

Los clones de ADNc de Cofilina de tipo no muscular y un vector pDE obtenido del vector pKDEMSS (Gitano K, Fukuda Y, Nagahira K, Nasu t, Izumi R, Kawashima Ky Nakanishi T; Immunol. Lett. 47, 215-222, 1995) se digirieron con EcoR I y desfosforilaron con una fosfatasa alcalina (Takara Shuzo Co., Ltd.). Después de esto, un fragmento de EcoR I que contenía el ADNc de Cofilina de tipo no muscular y el fragmento de ADN del vector pDE se sometieron a electroforesis en gel de agarosa y se cortó un gel que contenía ADN y se purificó mediante el sistema de extracción en gel rápida CONCERT Rapad Gel Extraction System (Invitrogen). Usando el Kit de Ligamiento de ADN (Takara Shuzo Co., Ltd.), el fragmento de ADNc de tipo no muscular de Cofilina se insertó en el fragmento de ADN del vector pDE y se usó para introducir por transformación E. coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.), preparando de este modo un vector de expresión para la Cofilina de tipo no muscular humana. Se verificó mediante una enzima de restricción que el ADNc de Cofilina de tipo no muscular humana insertado en el vector de expresión de orientó en una dirección directa con respecto al promotor de expresión.

(4) Expresión de la Cofilina de tipo no muscular humana en células COS-1

La Cofilina de tipo no muscular recombinante se expresó y su expresión se verificó mediante el siguiente procedimiento.

Expresión de la Cofilina de tipo no muscular humana en células COS-1

Mediante el uso del vector de expresión de ADNc de Cofilina de tipo no muscular humana, la Cofilina de tipo no muscular humana se expresó en células animales y se realizó una comprobación para observar si la proteína expresada tenía actividad de HPP-CFC. Mediante el uso de células COS-1, células animales hospedadoras (adquiridas en el Instituto de Investigación Física y Química), el vector de expresión de ADNc de Cofilina de tipo no muscular humana se introdujo por transfección mediante la técnica de lipofectina. Específicamente, se sembraron 1 x 10^{6} células COS-1 en placas de cultivo de 10 cm (Corning, 430167). El medio era un medio esencial mínimo de Dulbecco que contenía suero fetal bovino al 10% (DMEM, NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.). Al día siguiente, las células se enjuagaron una vez con 5 ml de medio Opti-MEM I (Invitrogen) y después se añadir 5 ml del medio Opti-MEM I, las células se cultivaron a 37ºC durante 2 horas. Después de 2 h de cultivo, se añadieron una mezcla líquida de 1 \mug de plásmido de expresión preparado en el Ejemplo 2(3) y 10 \mug de lipofectina (Invitrogen) y el cultivo se realizó durante 5 horas adicionales a 37ºC. Después del cultivo, se añadieron 5 ml de medio Opti-MEM para preparar un total de 10 ml y se realizó el cultivo durante 72 horas a 37ºC en presencia de CO_{2} al 5%. Después del cultivo de 72 h, el sobrenadante del cultivo se recuperó por centrifugación. Como un control negativo, se usó el vector de expresión inicial que no tenía ningún inserto de la Cofilina de tipo de no muscular humana y se sometió al mismo proceso de expresión.

Detección de Cofilina de tipo no muscular humana recombinante secretoria

El análisis del sobrenadante de cultivo mediante electroforesis en SDS-poliacrilamida mostró que el sobrenadante del cultivo transfectado con el vector de expresión de ADNc de Cofilina de tipo no muscular humana tenía una banda de 20 kDa significativamente visible que se pensaba que era la Cofilina de tipo no muscular humana recombinante. En análisis de transferencia de western, la banda de 20 kDa reaccionó específicamente con un anticuerpo policlonal de conejo anti-péptido de Cofilina (13-22) de tipo no muscular humana (Cytoskeleton). Por lo tanto, se verificó la secreción de la Cofilina de tipo no muscular humana recombinante. Mediante análisis de transferencia de western y análisis electroforético en SDS-poliacrilamida, se observó que la Cofilina de tipo no muscular humana recombinante secretoria se había expresado en una cantidad de 2,5 \mug por ml.

Detección de Cofilina de tipo no muscular humana natural secretoria

Un sobrenadante de cultivo transfectado con el vector de expresión inicial (vector pDE) que no tenía ningún inserto de la Cofilina de tipo no muscular humana se permitió que precipitara mediante la adición de ácido tricloroacético al 10% y 100 volúmenes del precipitado se sometieron a análisis de transferencia de western del mismo modo descrito anteriormente. Se detectó una banda débil de Cofilina de tipo no muscular humana natural. Este hecho muestra que la Cofilina de tipo no muscular que hasta ahora se pensaba que se encontraba solamente en células, también aparece como un tipo secretor en cantidades muy pequeñas.

Ejemplo 3 Verificación de la actividad de Cofilina de tipo no muscular humana recombinante como la sustancia que tiene la actividad de promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o células precursoras hematopoyéticas

Para conocer si la Cofilina de tipo no muscular humana recombinante secretoria que se expresó en células COS-1 era la sustancia que tenía la actividad de promover el crecimiento y/o diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos, se realizó un ensayo de HPP-CFC en el sobrenadante del cultivo.

A ratones de DBF1 (hembras, 10-15 semanas de edad, adquiridas en Charles River Japan Inc.) se administró 5-fluorouracilo (150 mg/kg, i.v., KYOWA HAKKO KOGYO, Co., Ltd.) y 2 días más tarde se recogieron células de médula ósea de los huesos femorales. Las células de médula ósea recogidas se marcaron con anticuerpo de rata anti-CD4 de ratón (CALTAG), anticuerpo CD8 (CALTAG), anticuerpo B220 (CEDERLANE), anticuerpo Gr-1 (CEDERLANE) y anticuerpo Mac-1 (CALTAG). Esos anticuerpos de rata eran todos IgG. Después de la reacción con anticuerpo de cabra anti-IgG de rata marcado con Dyna Beads (DYNAL), las células que se unían a las Dyna Beads se retiraron magnéticamente para obtener células de médula ósea negativas a marcador de linaje (Lin^{-} BMC). Esas células se usaron en ensayo de HPP-CPC como fracciones de células madre hematopoyéticas.

Las fracciones de células madre hematopoyéticas obtenidas se ajustaron hasta una concentración de 2,5 x 10^{4} células/ml en un medio \alpha-MEM complementado con FCS al 10%. A la suspensión celular se añadió IL-3 de ratón (a una concentración final de 10 ng/ml) y la mezcla se puso en cada pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos (Corning) en una cantidad respectiva de 1 ml. Además, se añadió el sobrenadante de cultivo de Cofilina preparado en el Ejemplo 2 o una citoquina a cada pocillo y se sometió a cultivo líquido. Una parte del medio acondicionado que incluía las células madre hematopoyéticas se sometió a ensayo de colonias y se recontó el número de las colonias de HPP-CFC macroscópicas resultante para determinar la actividad de HPP-CFC.

En la Figura 4, la Cofilina 1, 2, 3 y 4 se refieren a diluciones de factor 1-, 10- y 1000-, respectivamente, de la concentración de factor 10- del sobrenadante de cultivo de Cofilina. Ya que en el Ejemplo 2, la Cofilina de tipo no muscular humana recombinante secretoria se expresó en una cantidad de 2,5 \mug por ml, el medio \alphaMEM para cultivo líquido que tenía un décimo de volumen del sobrenadante de cultivo de Cofilina diluido añadido al mismo contenía Cofilina 1, Cofilina 2, Cofilina 3 y Cofilina 4 en cantidades respectivas de 2500 ng/ml, 250 ng/ml, 25 ng/ml y 2,5 ng/ml como la concentración de Cofilina humana recombinante. Con referencia adicional a la Figura 4, C1 y C2 representan los pocillos a los que se añadió PBS en la misma cantidad que el sobrenadante de cultivo de Cofilina diluido. SCF1, SCF5 y SCF10 se refieren a que el medio para el cultivo líquido contenía SCF en cantidades respectivas de 1 ng/ml, 5 ng/ml y 10 ng/ml. Los datos en la Figura 4 muestran el número de colonias de HPP-CFC en 200 \mul de la suspensión celular en cada pocillo a los días 6 y 10 del cultivo líquido. La entrada se refiere al número de colonias de HPP-CFC en 200 \mul de la suspensión celular antes del cultivo líquido.

En comparación con el control negativo, la Cofilina de tipo no muscular humana recombinante mostró la actividad de HPP-CFC en un modo significativo dependiente de la concentración que era característico del factor de interés cuya actividad en el día 10 del cultivo líquido tendía a ser mayor que en el día 6 (véase la Figura 4). La concentración a la que se observó la actividad era aproximadamente 25 ng/ml (señalada por Cofilina 3 en la Figura 4), que se podía comparar con 1 ng/ml de SCF (indicado por SCF1 en la Figura 4). La Cofilina de tipo no muscular humana natural secretoria se observó en el sobrenadante de cultivo del control negativo, sugiriendo que dicha Cofilina era responsable en algún alcance de la actividad de HPP-CFC (Figura 4).

Mediante el proceso descrito anteriormente, los inventores observaron que la Cofilina de tipo no muscular humana bien conocida como una proteína de regulación de actina de bajo peso molecular actuaría como la sustancia que tiene la actividad de promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos.

Ejemplo 4 Evaluación de la actividad de Cofilina de tipo no muscular humana recombinante en la promoción del crecimiento de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos (células positivas a CD34)

Para conocer si la Cofilina de tipo no muscular humana recombinante tenía la actividad de promover el crecimiento de células madre hematopoyéticas humanas y/o progenitores hematopoyéticos, los inventores realizaron un experimento en el que se añadió la Cofilina de tipo no muscular humana recombinante que contenía el sobrenadante de cultivo
de células COS-1 que se preparó en el Ejemplo 2 durante el cultivo de células madre hematopoyéticas humanas.

A sangre de cordón umbilical humano, se añadió una suspensión de gel de sílice para dar el 10% (v/v) y la mezcla se agitó suavemente y después se dejó reposar a 37ºC durante aproximadamente 1 hora. Después de recubrir con lymphoprep (NYCOMED) que tenía una gravedad específica de 1,077, se realizó la centrifugación de gravedad específica a 1600 rpm durante 30 minutos para obtener fracciones de células mononucleares. Posteriormente se adquirieron células positivas a CD34 usando el Kit de Aislamiento de Células Progenitoras CD34 Directo y Auto-MACS (Miltenyi Biotec). Las células positivas a CD34 obtenidas de este modo se ajustaron hasta una concentración de 1 x 10^{4} células/ml en un medio \alphaMEM (GIBCO) complementado con FCS al 20% (CCT) y BSA al 1% (SIGMA) y se añadieron a una placa de cultivo de 12 pocillos (Falcon) en cantidades respectivas de 1 ml/pocillo.

Para el grupo de SCF + FL, se añadieron SCF humano (100 ng/ml, R&D) y ligando de Flt-3 humano (Ligando 3 de tirosina quinasa similar a FMS, FL; 100 ng/ml, R&D) a la placa de cultivo preparada. Para el grupo de SCF + FL- Cofilina se añadieron SCF humano (100 ng/ml, R&D), FL humano (100 ng/ml, R&D) y la Cofilina de tipo no muscular humana recombinante que contenía el sobrenadante de cultivo de células COS-1 preparado en el Ejemplo 2, estando el último concentrado 10 veces y añadiéndose una porción de 100 \mul del concentrado. Después de esto, cada grupo se cultivó en un incubador de CO_{2} a 37ºC. Al grupo de PBS (grupo de control) no se añadió ninguno de los SCF, FL y Cofilina mencionados anteriormente, sino que solamente se añadió PBS en la misma cantidad. Los días 3, 5, 7, 9, 12 y 14 del cultivo se realizaron recuentos celulares con un hemocitómetro bajo un microscopio. El resultado se expresó como "Factor de Expansión" con respecto al recuento celular inicial al comienzo del cultivo y se muestra en la Figura 5.

Como resultado, la Cofilina de tipo no muscular humana en combinación con SCF + FL permitió que las células positivas a CD34 obtenidas de sangre de cordón umbilical humano proliferaran con el tiempo, mostrando actividad de crecimiento marcada en comparación con solamente la adición de SCF+FL. Específicamente, el día 14 del cultivo, las células se habían desarrollado para dar un recuento aproximadamente 90 veces superior al recuento celular inicial (véase la Figura 5).

Ejemplo 5 Evaluación de la actividad de Cofilina de tipo no muscular humana recombinante en la promoción del crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos

Para conocer si la Cofilina de tipo no muscular humana recombinante tenía la actividad de promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas humanas y/o progenitores hematopoyéticos, los inventores realizaron un experimento usando el sobrenadante de cultivo que contenía Cofilina de tipo no muscular humana recombinante de células COS-1 que se preparó en el Ejemplo 2, adoptándose la capacidad de diversas células para formar colonias como un índice de la actividad de promoción del crecimiento y/o la diferenciación.

En primer lugar, las células positivas a CD34 obtenidas de sangre de cordón umbilical humano se ajustaron hasta una concentración de 2,5 x 10^{4} células/ml como se ha indicado en el Ejemplo 4 y después se añadieron a una placa de cultivo de 12 pocillos en cantidades respectivas de 1 ml/pocillo. El sobrenadante de cultivo de células COS-1 que contenía Cofilina de tipo no muscular humana recombinante que se preparó en el Ejemplo 2 se concentró 10 veces y se añadió una porción de 100 \mul del concentrado en diversas combinaciones con SCF humano (10 ng/ml), FL humano (100 ng/ml) y/o TPO humano (100 ng/ml, R&D); después de 7 días de cultivo, se recontó el número de células con un hemocitómetro bajo un microscopio. El resultado se expresó como un factor de multiplicación con respecto al recuento celular inicial al comienzo del cultivo y se ilustra en la Figura 6A para los siguientes grupos: grupo T/C que se cultivó en presencia de TOP humano (100 ng/ml, R&D) y el sobrenadante de cultivo que contenía Cofilina mencionado anteriormente; grupo S/F/C cultivado en presencia de SCF humano (100 ng/ml), FL humano (100 ng/ml) y el sobrenadante de cultivo que contenía Cofilina que se ha mencionado anteriormente; grupo S/F/T en presencia de SCF humano (100 ng/ml), FL humano (100 ng/ml) y TPO humano (100 ng/ml, R&D); grupo S/F en presencia de SCF humano (100 ng/ml) y FL humano (100 ng/ml); grupo C en presencia del sobrenadante de cultivo que contiene Cofilina mencionado anteriormente y grupo T en presencia de TPO humano (100 ng/ml, R&D). El grupo de PBS se refiere al cultivo en presencia de solamente PBS añadido.

Como resultado, la Cofilina de tipo no muscular humana en combinación con SCF y FL (concretamente, grupo S/F/C) provocó que las células positivas a CD34 obtenidas de sangre de cordón umbilical humano se expandieran significativamente y mostraran una actividad de crecimiento que era aproximadamente 6 veces tan alta como la actividad del grupo S/F y aproximadamente el doble de la actividad del grupo S/F/T. En el día 7 del cultivo, la proliferación celular era aproximadamente 58 veces la Entrada (el número de células positivas a CD34 en 200 \mul de la suspensión celular antes del cultivo) (véase la Figura 6A).

Posteriormente, una porción (100 \mul) de la suspensión de células positivas a CD34 obtenidas de sangre de cordón umbilical humano que se habían cultivado durante 7 días en (1) anteriormente se recogió y sometió a un ensayo de formación de colonias mediante el método de metil celulosa.

El ensayo de formación de colonias mediante el método de metil celulosa se realizó del siguiente modo. Basándose en \alphaMEM, un medio semi-sólido se complementó con metil celulosa al 2,2% (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.), FCS al 30%, BSA al 1%, 2ME 5 x 10^{-5} M (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), SCF (100 ng/ml), IL-3 (20 ng/ml), TPO (10 ng/ml, R&D), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF; 10 ng/ml, CHUGAI PHARMACEUTICAL CO., LTD) y eritropoyetina (EPO; 2 U/ml, KIRIN BEVERAGE CO., LTD) y las células positivas a CD34 recogidas se cultivaron en el medio resultante durante 2 semanas a 37ºC en presencia de CO_{2} al 5% para formar una diversidad de colonias celulares.

Entre las diversas colonias celulares formadas, las colonias de progenitores asociados a granulocitos/macrófagos (unidad formadora de colonia de granulocitos, macrófagos, CFU-GM), progenitores asociados a eritroide (unidad formadora de estallido de eritroide, BFU-E) y células madre asociadas a mieloide (unidad formadora de colonia mixta, FU-Mix) se identificaron y los recuentos de colonias se tomaron basándose en la observación visual bajo un microscopio invertido. CFU-GM se refiere a las masas celulares que consisten en masas de granulocitos que eran agregados densos de células menores y masas de macrófagos gruesas que eran agregados de células mayores y tales colonias celulares se distinguieron de BFU-E que se refiere a masas mayores de células que viraron a rojo debido a síntesis de hemoglobina. Como para masas que eran difíciles de distinguir y las que no adoptaron una morfología de colonia típica, se prepararon muestras sometidas a citocentrífuga y se realizó la evaluación mediante tinción de May-Giemsa. Se evaluaron cincuenta y más masas celulares que consistían en granulocitos y macrófagos como una colonia de CFU-GM mientras que se evaluaron 500 y más masas celulares de eritrocitos como una colonia de BFU-E; una colonia que comprendía BFU-E y al menos 50 células de otros linajes se evaluó como una colonia CFU-Mix. Cada uno de los resultados se expresó como "Factor de Expansión" con respecto al recuento celular inicial al comienzo del cultivo y se ilustran en las Figuras 6B a 6D para colonias CFU-GM, BFU-E y CFU-Mix, respectivamente.

La Cofilina de tipo no muscular humana combinada con SCF y FL (como en el grupo S/F/C) permitió que las células positivas a CD34 obtenidas de sangre de cordón umbilical humano se expandieran y las células se sometieron después de esto a un ensayo de formación de colonias. Como resultado, los recuentos de colonias de CFU-GM, BFU-E y CFU-Mix se expandieron aproximadamente 4, 6 y 8 veces tantas veces como la entrada (el número de colonias en 200 \mul de la suspensión celular antes del cultivo), respectivamente (véase las Figuras 6B, 6C y 6D). En particular, los números de colonias BFU-E y CFU-Mix eran mucho mayores que cualquier otra combinación de citoquinas.

Ejemplo 6 Evaluación de la actividad de Cofilina de tipo no muscular humana recombinante en la promoción del crecimiento y/o la diferenciación de progenitores megacariocíticos humanos

Para conocer si la Cofilina de tipo no muscular humana recombinante tenía la actividad de promover el crecimiento y/o la diferenciación de progenitores megacariocíticos humanos, los inventores realizaron un experimento usando el sobrenadante de cultivo de células COS-1 que contenía Cofilina de tipo no muscular humana recombinante que se preparó en el Ejemplo 2, adoptándose la capacidad de progenitores de megacariocitos (unidad formadora de colonias de megacariocitos, CFU-Mk) de formar colonias como un índice de la actividad de promoción de crecimiento y/o diferenciación.

En primer lugar, las células positivas a CD34 obtenidas de sangre de cordón umbilical humano se ajustaron hasta una concentración de 2,5 x 10^{4} células/ml como se ha indicado en el Ejemplo 4 y después se añadieron a una placa de cultivo de 12 pocillos en cantidades respectivas de 1 ml/pocillo. El sobrenadante de cultivo de células COS-1 que contenía Cofilina de tipo no muscular humana recombinante que se preparó en el Ejemplo 2 se concentró 10 veces y se añadió una porción de 100 \mul del concentrado, SCF humano (100 ng/ml), FL humano (100 ng/ml) y/o TPO humano (100 ng/ml, R&D) a las combinaciones descritas en el Ejemplo 5, concretamente, para proporcionar grupo T/C, grupo S/F/C, grupo S/F/T, grupo S/F, grupo C y grupo T se realizó cultivo durante 7 días. El grupo de PBS se refiere al cultivo en presencia solamente de PBS añadido.

Posteriormente, una porción de una suspensión de células positivas a CD34 obtenidas de sangre de cordón umbilical humano que se habían cultivado durante 7 días se recogió y cultivó usando MegaCult-C (Stem Cell Technologies) para formar colonias CFU-Mk, seguido de identificación de los megacariocitos y recontando el número de sus colonias. Para ser más específicos, se añadió una parte (100 \mul) de la suspensión celular a un gel de colágeno (que contenía IL-3, IL-6 y TPO); la mezcla agitada se transfirió a cámaras de portaobjetos de cultivo y se cultivó durante 12-14 días para formar colonias CFU-Mk. Las células en los portaobjetos se fijaron con metanol/acetona y los megacariocitos se detectaron mediante inmunotinción con anti-GP (glucoproteína) IIb/IIIa (marcador de megacariocitos humanos) y tinción del núcleo celular con Azul de Evans. En el Ejemplo 6, se determinó que una masa celular observada que consistía en 20 o más megacariocitos mediante observación a microscopio era una colonia CFU-Mk. El resultado se expresó como "Factor de Expansión" con respecto al recuento celular inicial al comienzo del cultivo y se ilustra en la Figura 7.

La Cofilina de tipo no muscular humana combinada con SCF y FL permitió que las células positivas a CD34 obtenidas de sangre de cordón umbilical humano se expandieran y después de esto las células se sometieron a un ensayo de formación de colonias. Como resultado, las colonias CFU-Mk se expandieron aproximadamente 4 veces como la Entrada (el número de colonias en 200 \mul de la suspensión celular antes del cultivo) (véase la Figura 7). La expansión conseguida mediante otras combinaciones de citoquinas era sustancialmente igual que la Entrada.

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Ejemplo 7 Evaluación de la actividad de Cofilina de tipo no muscular humana recombinante en formación de proplaquetas de megacariocitos humanas

Para conocer si la Cofilina de tipo no muscular humana recombinante tenía la actividad de formación de proplaquetas de megacariocitos humanas, los inventores realizaron un estudio morfológico usando el sobrenadante de cultivo de células COS-1 que contenía la Cofilina de tipo no muscular humana recombinante preparado en el Ejemplo 2.

Las células positivas a CD34 obtenidas de sangre de cordón umbilical humano se ajustaron hasta una concentración de 5 x 10^{4} células/ml en un medio \alphaMEM complementado con BSA al 1% y suplemento GIBCO (insulina, 10 \mug/ml; transferrina, 5,5 \mug/ml; etanolamina; 2 mg/ml; ácido selenioso, 6,7 mg/ml) y se añadieron después de esto a cada uno de los pocillos de una placa de cultivo de 12 pocillos en una cantidad de 1 ml. Posteriormente, el sobrenadante de cultivo de células COS-1 que contenía Cofilina de tipo no muscular humana recombinante preparado en el Ejemplo 2 se concentró 10 veces y se añadió una porción de 100 \mul del concentrado y TPO humano (100 ng/ml), individualmente o en combinación, seguido de cultivo a 37ºC en presencia de CO_{2} al 5%. El día 7 del cultivo, el medio en cada pocillo se rellenó con 1 ml de un medio con la misma composición y se continúo el cultivo. Después de esto, se realizó la observación bajo un microscopio para visualizar si se habían formado proplaquetas de megacariocitos.

La Cofilina de tipo no muscular humana combinada con TPO permitió que las células positivas a CD34 obtenidas de sangre de cordón umbilical humano se diferenciaran y crecieran hasta megacariocitos de forma tan marcada (Figura 8) que aproximadamente a las 2 semanas de cultivo, algunos de los megacariocitos maduros formaron pro-plaquetas visibles que se pensaba que reflejaban el estadio preliminar de la liberación de plaquetas (Figura 9). Sin embargo, no fue visible formación de pro-plaquetas cuando se añadieron Cofilina de tipo no muscular humana o TPO de forma única.

Aplicabilidad industrial

Esta invención proporciona el uso de promotores del crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos que contienen Cofilina como un ingrediente activo y, haciendo esto, ofrece la ventaja de ser capaz de promover el crecimiento y/o la diferenciación de un amplio conjunto de células sanguíneas. Mediante esta ventaja, los promotores son útiles como agentes terapéuticos de panhematopenia y/o enfermedades que vienen acompañadas por hipofunción hematopoyética. Además, los promotores permiten la regeneración eficaz de células asociadas a sangre en el campo de medicina regenerativa.

<110> DAIICHI ASUBIO PHARMA Co., Ltd.

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<120> Agentes que promueven la proliferación y/o diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o células precursoras hematopoyéticas

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<130> YCT-785

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<140> EP02793466.0

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<141> 27-12-2002

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<150> JP 2001-400330

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<151> 28 de diciembre de 2001

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<160> 4

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<200> 1

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<211> 166

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<223> Secuencia de aminoácidos de Cofilina humana.

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<400> 1

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1

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<200> 2

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<211> 501

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<223> Secuencia de nucleótidos de Cofilina humana.

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<400> 2

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2

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<200> 3

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia de cebador para amplificar gen de Cofilina humana.

Claims

1. Uso de

(i): una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos ilustrada en la SEC ID Nº: 1,

(ii): una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de bases ilustrada en la SEC ID Nº: 2,

(iii): una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la Cofilina ilustrada en la SEC ID Nº: 1, excepto por que tiene de 1-5 deleciones, sustituciones y/o adiciones de aminoácidos,

(iv): una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de bases que se puede hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia de bases complementaria a la secuencia de bases que codifica la secuencia de aminoácidos de la Cofilina ilustrada en la SEC ID Nº: 1,

(v): una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 30% de homología de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la Cofilina ilustrada en la SEC ID Nº: 1,

(vi): una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de bases que se puede hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia de bases complementaria a la secuencia de bases que codifica la secuencia de bases de la Cofilina ilustrada en la SEC ID Nº: 2 o

(vii): una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por ADN que comprende una secuencia de bases que tiene al menos el 30% de homología de secuencia de bases con la secuencia de bases de la Cofilina ilustrada en la SEC ID Nº: 2,

cada una de las cuales tiene la actividad de promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos,

para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad que se selecciona del grupo que consiste en panhematopenia, hematopenia, síndrome de Fanconi, anemia aplásica, cánceres tales como linfoma maligno y leucemia aguda, hepatotopatía crónica, insuficiencia renal, pacientes con transfusión masiva, durante cirugía o de sangre conservada, infecciones graves, trombocitopenia mielopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), STE, mordedura de serpiente venenosa, síndrome urémico hemolítico, estasis de función esplénica, hemorragia, síndrome de Barnard-Soulier, trombocitastenia de Glanzmann, uremia, anticuerpos anti-plaquetas y enfermedades mieloproliferativas.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la proteína como se define en la reivindicación 1 se produce por una técnica recombinante génica.

3. Uso de

(ii): una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de bases ilustrada en la SEC ID Nº: 2,

cada una de las cuales tiene la actividad de promover el crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos y

citoquina o citoquinas seleccionadas del grupo que consiste en trombopoyetina (TPO), IL-3 y la combinación de factor de células madre (SCF) y ligando de flk-2/flt-3 (FL) (SCF/FL) como ingredientes activos en un promotor del crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos en medicina.

4. El uso de la reivindicación 3, en el que la proteína como se define en la reivindicación 3 se produce mediante una técnica recombinante génica.

5. El uso de la reivindicación 3 ó 4 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades que se producen por el crecimiento y/o la diferenciación insuficiente de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos.

6. El uso de la reivindicación 5 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de panhematopenia y/o enfermedades que vienen acompañadas por hipofunción hematopoyética.

7. Un método para expandir células madre hematopoyéticas ex vivo usando al menos un promotor de crecimiento y/o la diferenciación de células madre hematopoyéticas y/o progenitores hematopoyéticos de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4.