KR20150128043A

KR20150128043A - Trail을 분비하는 줄기세포 및 tmz의 조합에 따른 향상된 항암 용도

Info

Publication number: KR20150128043A
Application number: KR1020140054764A
Authority: KR
Inventors: 전신수; 김성묵
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2014-05-08
Filing date: 2014-05-08
Publication date: 2015-11-18

Abstract

본 발명은 TRAIL(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)을 분비하는 줄기세포 및 TMZ의 조합에 따른 항암 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 이들의 조합에 따른, DR5 발현의 상향조절, ERK 활성화, 세포사멸 억제 단백질 하향조절, 카스파아제 활성화 등의 분자적 메커니즘에 의해 신경교종 세포를 민감화(sensitizing)시킴으로써 TRAIL-매개된 세포사멸능을 강화시키는 기능에 관한 것이다.

Description

TRAIL을 분비하는 줄기세포 및 TMZ의 조합에 따른 향상된 항암 용도{Anti-Tumor Use of Combination of TRAIL-Secreting Stem Cells and TMZ}

신경아교종은 원발성 뇌 종양의 가장 흔한 종류이고, 대개 심각한 예후와 연관된다. 교모세포종 (GBM) 및 역형성 별아교세포종 (AA)을 포함하는 고등급 (high-grade) 별아교세포종은 성인에서 가장 흔한 내인성 뇌종양이다. 고등급 별아교세포종의 분자 유전학에 대한 이해 정도는 증가하였지만 (Kitange et al., Curr.Opin. Oncol. 15: 197-203 (2003), 기원 세포 종류(들)은 여전히 불명확하고, 질병 공격성의 분자 결정자는 잘 이해되지 못하고 있다.

특히, 신경교종 세포(glioma cell)들은 종래의 전통적인 치료들에 대해 저항적이기 때문에 가장 흔한 악성 신경교종인 다형교아종(glioblastoma multiforme (GBM)) 환자에 대한 예후가 매우 나쁜 편이며, 수술에 의한 제거 역시 주변의 기능적인 뇌 실질(parenchyma)에 대한 침습의 위험 때문에 어려운 편이다(Donaldson SS, Laningham F,Fisher PG. Advances toward an understanding of brainstem gliomas. J Clin Oncol 2006;24:1266~1272).

또한, 신경교아종(glioblastoma)은 성인의 가장 일반적인 1차 CNS 악성 종양이고, 증례의 약 75%의 비율을 차지하고 있으며, 뇌영상(neuro-imaging), 미세 수술 및 방사선의 개량에 의한 치료방법에 있어서 꾸준한 진보가 있었지만, 아직까지 완치할 수 있는 방법은 개발되지 못하고 있는 실정이다(McDonald, 2001; Burton, 2000;Prados, 2000). 또한, 평균 기대 수명은 진단으로부터 1년 미만이고, 육안 종양 절제(gross tumor resection)를 포함하는 적극적 치료를 한 후에 5년 생존률은 10% 미만인 것으로 보고되고 있으며(Burton, 2000; Nieder,2000; Napolitano, 1999; Dazzi, 2000), 신경교아종은 뇌에서의 급속하고, 공격적이며, 침윤성인 증식에 의해 죽음에 이르게 한다.

최근에 이에 대한 수술적인 기법, 방사선 치료, 항암제 치료, 뇌신경 방사선 진단기술의 발전에도 불구하고 악성 뇌종양에 대한 예후는 최근 수십년간 향상되지 않고 있어 보다 효과적인 치료에 대한 연구가 진행되고 있다

유망한 치료 방법중 하나로 유전자 이식 기법은 악성종양의 치료에 있어서 최근 활발히 연구가 진행되고 있는 분야이다. 또 효소/전구약물 합성치료 기법은 새로운 치료기법으로 악성종양에 대해 선택적으로 항종양효과를 나타낸다는 점에서 활발히 연구가 진행되고 있다

암 유전치료에 있어서 자살 유전자 전구약물 치료법은 비독성 전구약물을 독성있는 항암제로 전환시킬수 있는 효소(CD/TK)를 종양세포에 전달함으로써 항암제와 관련된 전신적인 독성을 최소화시키는 개념을 기초로 한다. 즉, 종양의 주변 부위에서 독성 물질의 농도를 높이고 이로 인해 치료 효과를 최대화 할 수 있는 것이다

가장 많이 연구되고 있는 자살 유전자 중 하나의 예로, TRAIL(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)을 들 수 있는데, 정상적인 세포나 조직들을 손상시키지 않고 다양한 범위의 형질전환 세포들의 세포사멸을 선택적으로 유도하기 때문에 암 치료에 있어 가장 유망한 후보 물질 중의 하나로 꼽히고 있다(Pollack IF, Erff M,Ashkenazi A. Direct stimulation of apoptotic signaling by soluble Apo2l/tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand leads to selective killing of glioma cells, Clin Cancer Res 2001;7:1362~1369).

그러나, 상기 TRAIL은 우선적으로 세포사멸을 유도하기는 하지만, 모든 종양 세포들이 TRAIL에 반응하는 것은 아니다. 특히, 대부분의 악성 신경교종 세포들은, 표면의 사멸 유도 TRAIL 수용체들의 발현에도 불구하고, TRAIL-유도 세포독성에 저항적이며(Dyer MJ, MacFarlane M, Cohen GM. Barriers to effective TRAIL-targeted therapy of malignancy. J Clin Oncol 2007;25:4505~4506), 이것은 TRAIL 처리가 그 자체로는 암 치료에 효율적이지 않을 수 있으며 TRAIL 저항성을 극복하기 위한 새로운 방법이 필요한 실정이다.

한편, TMZ는 고 악성도 신경아교종의 임상 치료에 널리 사용되는 경구용 알킬화제로, TMZ는 DNA 불일치를 유도하고, DNA 복제 주기를 억제하여 효과적으로 혈관-뇌 장벽을 횡당하고 신경 교종 세포의 죽음을 유도하는 작은 친유성 분자이다. 최근, TMZ는 악성 신경 교종에 대한 치료제로써 많은 주목을 받고 있으며, TRAIL 단백질과 TMZ의 병용 투여는 단독 투여에 비해 훨씬 나은 효과를 나타내는 것으로 보고된 바 있다. 그러나, TMZ가 어떠한 분자 기전에 의해 TRAIL에 의해 유도되는 세포사멸의 민감성을 증진시키고 항암 효과를 향상시키는지는 아직 명확히 밝혀진 바 없다.

이에 본 발명자들은 TRAIL를 분비하는 중간엽 줄기세포와 TMZ를 조합하여 사용하면, (i) ERK 활성화에 의해 DR5의 발현을 상향조절하고 (ii) 세포사멸 억제 단백질을 하향조절하고 (iii) 카스파아제의 활성을 증가시키는 등의 분자적 메커니즘에 의해 신경교종 세포를 민감화(sensitizing)시킴으로써 TRAIL 저항성을 극복하여 TRAIL에 의한 세포사멸능을 강화시켜 궁극적으로 항암 효과를 상승시키는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-1305834호

본 발명은 TRAIL를 분비하는 줄기세포 및 TMZ의 조합 사용에 따른 신규 용도에 관한 것으로, 본 발명의 주된 목적은 TRAIL를 분비하는 줄기세포 및 TMZ를 포함하는 항암용 조성물 및 이의 이용한 암의 치료방법을 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 TRAIL(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)을 분비하는 줄기세포 및 TMZ(temozolomide)를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 인간 유래일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 지방, 자궁, 골수, 근육, 태반, 제대혈, 모낭 및 피부로 구성된 군에서 선택된 조직 유래일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 TRAIL을 분비하는 줄기세포는 TRAIL를 발현하는 바이러스 벡터로 형질감염된 줄기세포일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노 바이러스 벡터일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 전이성 흑색종; 악성 흑색종, 악성 신경아교종, 아교모세포종 및 기타 뇌암; 폐암; 유방암, 고환암; 결장 및 직장암; 암종; 육종; 림프종; 백혈병; 역형성별세포종; 및 균상식육종으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 암종일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 악성 신경아교종 또는 아교모세포종일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 (i) ERK 활성화에 의해 DR5의 발현을 상향조절하고 (ii) 세포사멸 억제 단백질을 하향조절하고 (iii) 카스파아제의 활성을 증가시킴으로써, TRAIL-유도된 세포사멸능을 강화시키는 것일 수 있다.

본 발명은 TRAIL을 분비하는 줄기세포 및 TMZ의 조합에 따른 TRAIL-매개된 세포사멸능을 강화시킨 신규한 항암 용도에 관한 것으로, (i) ERK 활성화에 의해 DR5의 발현을 상향조절하고 (ii) 세포사멸 억제 단백질을 하향조절하고 (iii) 카스파아제의 활성을 증가시키는 등의 분자적 메커니즘에 의해 신경교종 세포를 민감화(sensitizing)시킴으로써 TRAIL-매개된 세포사멸능을 현저히 증가시키므로, 이를 이용하여 TRAIL-매개된 세포사멸을 이용하는 다양한 암질환 치료에 대하여 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 신경 교종 세포에 TMZ와 TRAIL을 병용 투여하였을 때 세포 독성을 확인한 결과로, (A)는 3 종류의 신경 교종 세포에서 TMZ 민감성을 확인한 결과이고, (B)는 3종류의 신경 교종 세포에서 TMZ와 TRAIL 병용 투여에 따른 효과를 관찰한 결과이며, (C, D)는 U-87MG 세포주에서 TRAIL 유도된 세포사멸에 대한 TMZ의 효과를 유세포 분석기로 분석한 결과이다.
도 2는 중배엽 줄기세포와 신경 교종 세포에서 TMZ와 병용 투여된 중배엽 줄기세포에 의해 전달된 TRAIL의 효과를 (A) U-87MG 세포주 (B) U-373MG 세포주에서 확인한 결과 및 (C) 중배엽 줄기세포에서 TMZ 민감성, (D) TMZ, MSC-TRAIL 또는 TMZ와 MSC-TRAIL 병용 처리에 따른 MSC의 생존율을 확인한 결과이다.
도 3은 신경 교종 마우스 모델에서 TMZ와 MSC-TRAIL의 병용 처리가 종양 성장에 미치는 영향을 (A) 생물발광 이미지 (B) 생존율 그래프 (C) Kaplan-Meier법에 따른 log-rank test 및 (D) H&E 염색, TUNEL 염색, Cleaved Caspase-3 염색으로 확인한 결과이다.
도 4는 TMZ 처리에 따라 사멸 수용체 과발현에 통해 TRAIL-유도된 세포사멸이 증가되는 양상을 확인한 결과로, U-87MG 세포주에 TMZ 처리에 따른 DR4, DR5, DcR1, DcR2 사멸 수용체 발현 양상을 유세포 분석기로 분석하고(A), 이를 그래프화하거나(B), DR5 siRNA 처리에 따른 DR5 발현과 Caspase 3 활성화를 웨스턴 블라팅으로 관찰하고(C), DR5 넉다운이 U-87MG 세포 생존에 미치는 영향을 MTT assay로 확인한 결과이다(D).
도 5는 DR5 상향발현과 TRAIL-유도된 세포사멸에서 TMZ-유도된 ERK 활성화를 관찰한 것으로, TMZ와 TRAIL을 병용 처리 하였을 때, (A) ERK와 p38 MAPK 발현 (B) MAPK 넉다운이 DR5 발현 및 (C) 세포사멸 관련 단백질의 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블라팅으로 확인한 결과이다.
도 6은 TMZ가 항세포사멸 단백질을 하향조절하고 caspase 활성화를 통해 TRAIL-유도된 세포사멸을 강화시키는 효과를 관찰한 것으로, (A) TMZ는 신경 교종 세포주에서 TMZ에 의한 항세포사멸 단백질의 발현 양상을 웨스턴 블라팅으로 관찰하고 (B) TRAIL과 TMZ 병용 처리에 따른 다양한 caspase 활성을 웨스턴 블라팅으로 관찰하였으며, (C) caspase 저해제 처리 유무에 따른 세포 생존율을 관찰한 결과이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"암", "종양" 또는 "악성"은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다.

"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.

"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.

임의로, 조직 또는 세포 샘플은 원발성 또는 전이성 종양으로부터 얻는다. 조직 샘플은 특성상 조직과 서로 혼합되지 않는 화합물, 예를 들어 보존제, 항응고제, 버퍼, 고정액, 영양물질, 항생제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 조직 샘플의 "절편"은 조직 샘플의 하나의 일부 또는 조각, 예를 들어 조직 샘플로부터 절단한 조직 또는 세포의 얇은 슬라이스를 의미한다. 본 발명이 조직 샘플의 동일한 절편이 형태학적 및 분자적 수준 모두에 분석되거나 단백질 및 핵산 모두에 대해 분석되는 방법을 포함함을 이해한다면, 조직 샘플의 다수의 절편을 취하여 본 발명에 따른 분석에 적용할 수 있음이 이해된다.

"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.

"폴리뉴클레오티드(polynucleotide)" 또는 "핵산(nucleic acid)"이라는 용어는 리보뉴클레오티드 뿐만 아니라 디옥시리보뉴클레오티드 등 온갖 길이의 뉴클레오티드 중합체를 의미한다. 이 용어는 분자의 1차적 구조만을 의미하고, 따라서 이중 또는 단일 사슬의 DNA 또는 RNA를 의미한다. 이것은 또한 변형의 알려진 유형, 예를 들어 당해 분야에서 알려진 표지(label), 메틸화, "caps", 유사체의 하나 혹은 그 이상의 자연 발생의 뉴클레오티드 치환, 탈결합(예: methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoamidate, carbarnate, 등)과 결합(예:phosphorothioate, phosphorodithioate, 등), 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드(signal peptide), poly-Llysine,등) 등의 부속물을 포함하는 것, 삽입물(예: 아크리딘, Psolalen, 등)을 가지는 것, 킬레이트(예: 금속원소, 방사성 금속원소, 붕소, 산화 금속원소, 등)을 가지는 것, 알킬화합물을 가지는 것, 변형된 결합(예: alpha anomeric 핵산, 등)을 가지는 것, 또한 폴리뉴클레오티드의 비변형을 포함한 뉴클레오티드간 변형을 의미한다.

"벡터(vector)"라는 용어는 다른 핵산을 그것이 연관된 곳으로 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. "발현벡터(expression vector)"라는 용어는 벡터에 의해 운반된 각각의 재조합 유전자에 의해 암호화된 목적 단백질을 합성할 수 있는 플라스미드, 코스미드(cosmid) 또는 파지(phage)를 포함한다.

"형질감염 또는 트랜스펙션"은 세포외부 DNA가, 수반물질이 있고 없는 상태로 숙주 세포로 들어가는 과정을 말한다. "트랜스펙션된 세포"란 세포 외부 DNA가 세포 내로 도입되어 세포 외부 DNA를 가지고 있는 세포를 가리킨다. DNA는 세포로 도입되어 핵산이 염색체에 삽입되거나 혹은 염색체 외 물질로 복제될 수 있다. 본 명세서에서는 형질감염 및 트랜스펙션이라는 용어를 혼용하여 사용하고 있다.

"줄기세포"는 (stem cell)는 어떤 조직으로든 발달할 수 있는 세포를 의미한다. 기본적인 특징으로는 두 가지가 있는데, 우선 반복 분열하여 자신을 만들어 내는 자기 재생산(self-renewal), 그리고 환경에 따라 특정한 기능을 지닌 세포로 분화할 수 있는 다분화 능력을 갖는다.

"분화(differentiation)"라는 용어는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다.

"미분화성"은 줄기세포에서 적어도 1개 이상의 미분화 마커 또는 여러가지 항원 분자의 발현에 의해 확인할 수 있는 미분화한 상태를 나타내는 성질을 의미한다. 줄기세포의 미분화한 상태는 줄기세포가 거의 영구적으로 또는 장기간 세포 증식 가능하고, 정상적인 핵(염색체)형을 나타내며, 적당한 조건에서 3배엽의 모든 계보의 세포로 분화가능한 능력을 가진 상태를 의미한다.

"세포사멸"은 넓은 의미로 사용되고, 일반적으로 세포질 압축, 형질막 미세융모의 상실, 핵의 분할, 염색체 DNA의 분해 또는 미토콘드리아 기능의 상실을 포함하는 하나 이상의 특징적인 세포 변경이 수반되는 포유동물의 규칙에 따르거나 조절된 세포 치사를 의미한다.

"상향조절(up-regulation)"이라는 표현은, 정상조직세포에 비하여, 활성화된 세포에서 세포내 전사(gene transcription) 또는 번역(gene translation)에 의해서 특정 유전자의 mRNA로의 발현 또는 단백질로 발 현량이 현저하게 증가된 것을 의미한다.

"억제제 또는 저해제(inhibitor)"는 특정 유전자의 발현 또는 활성을 억제, 차단 또는 감소시키는 물질을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 HER2 저해제 및 ECM 저해제(억제제)는 각각 HER2 및 ECM(Extracellular Matrix)의 발현 또는 활성을 억제, 차단 또는 감소시키는 물질이다. 억제제의 활성 메커니즘은 특별히 제한되지 않는다. 예로서는 유기 또는 무기 화합물, 단백질, 탄수화물, 지질과 같은 폴리머 화합물, 다양한 화합물의 컴포지트(composite)를 포함한다.

"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.

"유전자 치료(gene therapy)"는 돌연변이를 일으킨 유전자를 정정하여 유전병을 치료하거나, 유전자 혹은 RNAi를 이용하여 단백질 발현을 조절하여 질병을 치료하는 것을 말한다. 즉 환자의 세포에 외부에서 정상유전자를 이식하여 그 세포의 표현형을 변화시킴으로써 병을 치료하는 방법이다.

"유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 저해제 화합물의 유효량은 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다. 만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.

"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 세포성 운반체로 최근 사용되고 있는 줄기세포에 TRAIL(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand) 유전자를 발현시켜, TMZ(temozolomide)를 조합하여 처리함으로써, TRAIL-매개된 세포사멸에 대한 저항성을 극복함으로써 악성 신경교종 등의 암질환에서 TRAIL-매개의 세포사멸능을 강화시킴을 발견하였다.

즉, 본 발명은 TRAIL를 분비하는 줄기세포 및 TMZ의 조합된 사용에 의한 TRAIL-매개된 세포사멸능 향상과 관련된 분자적 메커니즘 및 이의 항암적 용도에 관한 것이다.

본 발명은 일 관점에서, TRAIL를 분비하는 줄기세포 및 TMZ를 포함하는 항암용 조성물 및 이를 이용한 암질환 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명의 치료 대상이 될 수 있는 암으로는, TRAIL-매개된 세포사멸을 이용하여 치료하던 종래 암질환이라면 제한은 없으나, 바람직하게는 전이성 흑색종; 악성 흑색종, 악성 신경아교종, 아교모세포종 및 기타 뇌암; 폐암; 유방암, 고환암; 결장 및 직장암; 암종; 육종; 림프종; 백혈병; 역형성별세포종; 및 균상식육종 등을 예로 들 수 있다. 더욱 바람직하게는 악성 신경아교종, 아교모세포종 등이다.

TRAIL(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)은 TNF family 중에 type II 트랜스멤브레인 사이토카인 분자로 분류되며, 리간드-타입의의 세포사멸을 유도하는 단백질을 의미한다.

TRAIL은 세포 표면에 존재하는 TRAIL 관련 수용체들즉, 세포사멸 수용체(Death Receptor)-4(DR-4), DR-5, 데코이(Decoy) 수용체 그리고 데코이 수용체-2와 결합함으로써 세포사멸 신호 전달계를 조절 및 활성화시켜 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다. TRAIL은 특히 암세포에만 특이적으로 작용하여 세포사멸을 유도하는 것으로 보고 되어 있으며, 정상세포에서는 아무런 독성이 없는 것으로 나타나, 새로운 종양 치료제로서 많은 연구가 진행중이다.

그러나, 종래에 rhTRAIL 처리 및 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus)(Shah K, Tang Y, Breakefield X et al. Real-time imaging of TRAIL induced apoptosis of glioma tumors in vivo. Oncogene 2003;22:6865.6872.) 또는 아데노바이러스(Lee J, Hampl M, Albert P et al. Antitumor activity and prolonged expression from a TRAIL-expressing adenoviral vector. Neoplasia 2002;4:312.323.)를 이용한 TRAIL 전달과 관련된 신경교종에 대한 TRAIL-기반 암 치료들이 보고되었지만, 독성(systemic toxicity), 짧은 생물학적 반감기, 성장하는 신경교종 세포로의 불충분한 전달, 및 바이러스-매개 면역반응으로 인해, 임상적인 적용에는 제한을 받았었다(Griffith TS, Anderson RD, Davidson BL et al. Adenoviral-mediated transfer of the TNF-related apoptosis-inducing ligand/Apo-2 ligand gene induces tumor cell apoptosis. J Immunol 2000;165:2886.2894., Ashkenazi A, Holland P, Eckhardt SG. Ligand-based targeting of apoptosis in cancer: The potential of recombinant human apoptosis ligand 2/tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand (rhApo2L/TRAIL). J. Clin. Oncol. 2008;26:3621.3630.).

특히, 대부분의 악성 신경교종 세포들은, 표면의 사멸 유도 TRAIL 수용체들의 발현에도 불구하고, TRAIL-유도 세포독성에 저항적이며(Dyer MJ, MacFarlane M, Cohen GM. Barriers to effective TRAIL-targeted therapy of malignancy. J Clin Oncol 2007;25:4505~4506), 이것은 TRAIL 처리가 그 자체로는 암 치료에 효율적이지 않을 수 있으며 TRAIL 저항성을 극복하기 위한 새로운 방법이 필요함을 의미한다.

그러므로, 본 발명에서는 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 TRAIL의 운반체로 줄기세포를 이용하면서 하기 식으로 표시되는 TMZ(temozolomide)를 함께 조합하여 이용하는 것을 주요한 특징으로 한다.

<화학식 1>

즉, 본 발명은 TRAIL를 분비하는 줄기세포 및 TMZ의 조합된 사용에 의해 TRAIL-매개된 세포사멸능 향상시킨다.

줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포로서, 본 발명에서는 바람직하게는 성체 줄기세포, 예를 들어, 지방, 자궁, 골수, 근육, 태반, 제대혈 또는 피부(상피) 등의 조직 유래 줄기세포를 사용할 수 있다. 특히, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)인 것이 바람직하고, 본 발명의 일 실시예에서는 골수 유래 MSCs를 사용하였다.

상기 중간엽 줄기세포는 일반적으로 골수(bone marrow)에서 조혈작용을 돕는 지지세포(stroma)로서, 뼈, 연골, 지방, 근육세포를 포함한 여러 가지 중배엽성 세포로 분화하는 능력을 지녔으며, 미분화상태를 유지하면서 쉽게 증식시킬 수 있는 특징이 있고, 암세포로 이동하는 능력이 있어, 뇌관련 종양치료를 위한 항암치료제의 전달매체로서 그 사용가치가 매우 높다.

또한, MSCs는 인간 신경교종 세포에 대해 강한 이동능이 있고 유전적으로 변형된 MSCs 또한 인간 신경교종에 대한 향성(tropism)을 가지며, 종양 내 투여 후 신경교종 성장을 억제시킨다. 게다가, MSCs는 in vivo 수득 및 확장이 보다 용이하고, 이들 사용에 관련된 윤리적 문제가 거의 없는 장점이 있다.

이러한 중간엽 줄기세포는 환자 자신으로부터 채취하거나 혈액은행의 데이터베이스를 이용하여 HLA(human leukocyte antigen) 타입이 일치되는 골수로부터 분리하여 사용함으로써 개체간의 면역거부반응을 최소화시킬 수 있다.

본 발명의 TRAIL를 분비하는 줄기세포는, 줄기세포를 TRAIL을 암호화하는 핵산(폴리뉴클레오티드) 또는 이를 포함한 벡터(재조합 벡터)로 형질전환하여 제조될 수 있다.

그러므로, 본 발명의 일 구체예로써, 따른 TRAIL을 분비하는 줄기세포는 (a) TRAIL을 암호화하는 핵산을 발현 벡터에 삽입시키는 단계; 및 (b) 상기 발현 벡터를 줄기세포에 도입하는 단계를 통해 제작될 수 있다.

상기 TRAIL을 암호화하는 핵산은 당업계에 공지된 TRAIL을 암호화하는 염기서열을 가지는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 또한 상기 핵산은 TRAIL의 기능적 동등물을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있다.

상기 '기능적 동등물'이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, TRAIL과 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 TRAIL과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, '실질적으로 동질의 생리활성'이란 종양 세포의 사멸을 유도하는 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, TRAIL의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr,Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 상기 TRAIL의 기능적 동등물의 범위에는 TRAIL의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다. 또한 상기 TRAIL을 암호화하는 핵산은 당업계에 공지된 유전자 재조합 방법에 의하여 제조될 수 있다(Sambrook, Fritsch and Maniatis, 'Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory press, 1989; Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992).

또한 본 발명에서 '발현 벡터'라 함은 TRAIL을 암호화하는 핵산이 삽입될 수 있고, 숙주 세포 내에서 상기 핵산을 발현할 수 있는 당업계에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미한다. 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있다.

상기 바이러스 벡터로는, 이에 제한되지는 않으나, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 아비폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등이 있다. 상기 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전자가 모두 제거되었거나 또는 변경되어 비-바이러스 단백질이 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포 내에서 만들어지도록 제작된 것이다. 유전자 요법을 위한 레트로바이러스 벡터의 주요 장점은 다량의 유전자를 복제세포 내에 전달하고, 세포 DNA 내로 전달된 유전자를 정확하게 통합하며, 유전자 형질 감염 후 연속적인 감염이 유발되지 않는 것이다(Miller, A.D., Nature, 357:455-460, 1992). 비-레트로바이러스 벡터로는 상기에서 언급한 바와 같은 아데노바이러스가 있다(Rosenfeld et al., Cell, 68:143-155, 1992; Jaffe et al.,Nature Genetics, 1:372-378, 1992; Lemarchand et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6482-6486, 1992). 아데노바이러스의 주요 장점은 다량의 DNA 단편(36kb 게놈)을 운반하고, 매우 높은 역가로 비-복제세포를 감염시킬 수 있는 능력이 있다는 것이다. 또한, 허피스 바이러스도 사람 유전자 요법을 위해 유용하게 사용될 수 있다(Wolfe, J. H., et al., Nature Genetics, 1:379-384, 1992). 이외에도, 공지된 적절한 바이러스 벡터가 본발명에 사용될 수 있다. 본 발명에서는 아데노바이러스 벡터를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법 등에 의해 줄기세포 내로 도입할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 TRAIL을 분비하는 줄기세포는 당업계에 공지된 방법에 따라 증식 및 배양될 수 있다.

적절한 배지는 동물 세포 및 특히, 포유동물 세포의 배양을 위해 개발되거나, 또는 동물 세포 성장에 필요한 적절한 성분, 예컨대 동화성 탄소, 질소 및/또는 미량 영양소와 함께 실험실 내에서 제조될 수 있는 임의의 이용가능한 배지를 사용할 수 있다. 상기 배지는 동물 세포 성장에 적절한 임의의 기본 배지, 비제한적인 예로서, 이스코브 변형된 둘베코 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM), 둘베코 변형된 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagles medium, DMEM), 알파 MEM (지브코, Gibco), RPMI 1640, 또는 임의의 기타 적절한 시판 배지를 포함한다. 기본 배지에, 탄소, 질소 및 미량 영양소의 동화성 공급원, 비제한적인 예로서, 혈청 공급원, 성장 인자, 아미노산, 항생제, 비타민, 환원제, 및/또는 당 공급원이 첨가될 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 TRAIL 분비 줄기세포는, 먼저 분리한 줄기세포에 TRAIL를 도입하여 선별한 후 이를 시험관 내에서 적절한 조건으로 증식 및 분화시켜 얻거나, 줄기세포를 충분히 증식시킨 다음 여기에 TRAIL를 도입하고 이를 중간엽 줄기세포로 분화시켜 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 TRAIL를 분비하는 줄기세포와 함께 하기 화학식 1로 표시되는 TMZ를 포함한다.

<화학식 1>

한편, 항암 작용을 구비하고 있다. 테모졸로마이드는 임상 항암 작용 연구를 통해 악성 흑색종, 균상 식육종(mycosis fungoides) 및 진행 신경 아교종(advanced glioma)에 대하여 효과를 나타내는 것이 증명되었다. 또한, 테모졸로마이드는 마우스에 이종 이식된 뇌종양 및 폐종양의 피하 치료에 효과가 있다. 시험관 내 항종양 시험을 통해, 테모졸로마이드는, 뇌종양, 난소암, 흑색종과, 다카바진(dacarbazine), 카르머스틴(carmustine), 시스플라틴(cisplatin), 독소루비신(doxorubicin), 5-플루오로라실(5-fluorouracil), 에토포시드(etoposide) 및 빈블라스틴(vinblastine)과 같은 종래 약물을 사용한 화학요법에 내성이 있는 종양 등 광범위한 종양에 대하여 항-종양 활성을 구비하고 있음이 증명되었다.

그러나, TRAIL-매개된 항암 치료법에 있어서, TMZ가 종양세포주의 TRAIL 저항성을 약화시키는 기능 및 이와 관련한 TRAIL-매개 세포사멸의 분자적 메커니즘에 있어서의 기능에 대해서는 전혀 알려진 바 없었다.

이에 본 발명자들은 TRAIL를 분비하는 중간엽 줄기세포와 TMZ를 조합하여 사용하면 신경교종 세포를 민감화(sensitizing)시킴으로써 TRAIL 저항성을 극복하여 TRAIL에 의한 세포사멸능을 강화시켜 궁극적으로 항암 효과를 상승시키는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 TMZ 화합물, 화합물 그 자체, 약제학적으로 허용되는 그것의 염, 수화물, 용매화물, 이성질체 및 프로드럭을 모두 포함한다.

본 발명자들은 TRAIL를 분비하는 줄기세포 및 TMZ의 조합된 사용에 의한, 이하의 TRAIL-매개된 세포사멸능 향상과 관련된 분자적 메커니즘을 규명하였다.

(i) TMZ 는 DR5 상향조절에 의해 신경교종 세포를 민감화(sensitizing)시킨다 .

TMZ는 용량 의존적으로 DR5 발현을 증가시키고, 이러한 DR5 상향 조절은 ERK 활성화에 의해 조절된다. 즉, TRAIL-유도된 세포사멸 상에서 TMZ는 ERK의 인산화를 유도하여 DR5를 상향조절시킴으로써 신경교종 세포를 민감화시키고, 이에 따라 신경교종 세포의 TRAIL에 대한 저항성을 약화시킴으로써 TRAIL-매개된 세포사멸능을 향상시킨다.

본 발명의 일 실시예에서는 TMZ가 U-87MG 세포에서 MSC-TRAIL 의 존재 하 세포사멸능을 현저히 향상시킴을 확인하였다(도 5 참조).

(ⅱ) TMZ 는 세포사멸 억제 단백질의 발현을 하향조절하고, caspase 의 활성을 증가시킴으로써 TRAIL - 매게된 세포사멸능을 향상시킨다.

TMZ는 TRAIL-유도된 세포사멸에 대한 저항성에 중요한 항세포사멸성 단백질인 c-FLIP과 XIAP의 발현을 용량 의존적으로 하향 조절함으로써, 저항성을 약화시킨다(도 6A 참조). 또한, caspase의TRAIL-유도된 활성화를 증가시킴으로써, 세포사멸능을 강화시킨다.

이와 같은 기작들의 발견에 기초하여, TRAIL-매개된 세포사멸에서의 TMZ는 (i) ERK 활성화에 의해 DR5의 발현을 상향조절하고 (ii) 세포사멸 억제 단백질을 하향조절하고, caspase의 활성을 증가시킴으로써, TRAIL-유도된 세포사멸능을 강화하여 신경교종 세포를 민감화시키는 새로운 용도를 알 수 있고, 이를 통해, 본 발명은 TRAIL를 분비하는 줄기세포 및 TMZ의 조합을 특징으로 하는, 앞서 설명한 새로운 항암용 조성물 및 이의 용도를 제공한다.

한편, 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 희석제를 추가로 포함할 수 있다. "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 사람에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다

또한, 조직 또는 장기에 주입하기에 적합한 주사제의 형태로 제형화하는 것이 바람직하며, 등장성 멸균 용액, 또는 경우에 따라 멸균수나 생리식염수를 첨가하여 주사 가능한 용액이 될 수 있는 건조 제제(특히 동결 건조제제)로 제형화할 수도 있다

본 발명의 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈(lactose), 덱스트로즈, 수크로스(sucrose), 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 무엇보다도, 치료대상 개체의 상태, 치료 대상 암의 특정한 카테고리 또는 종류, 투여 경로, 사용되는 치료제의 속성, 및 상기 특정한 치료제에 대한 종양의 감수성에 의존적일 것이다

본 발명의 조성물은 원하는 조직 부위로 직접 이식하거나 이동하는 방식으로 투여되어, 종양세포의 사멸을 유도하거나, 기능적으로 결핍된 부위를 재구성하거나 재생한다. 바람직하게는 신경교종 치료를 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

공지의 방법에 따라 환자의 생체 내로 주입될 수 있는데, 예를 들어 뵈클룬트와 스테네비(Bjorklund and Stenevi, Brain Res. 177, 555-560(1979)) 또는 린드발 등(Lindvall et al., Arch. Neurol. 46, 615-31(1989))이 발표한 임상 방법을 이용할 수 있다.

1회 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자를 고려하여 증감이 가능하다.

본 발명의 암 치료용 조성물은 활성 성분인 중간엽 줄기세포를 특히 환자 자신의 골수에서 채취하는 경우에는 이식 후 면역거부반응이 전혀 없으며, 혈액은행의 HLA 타입이 일치되는 골수로부터 얻는 경우에도 면역거부반응이 거의 없으므로, 암을 근절시킬 때까지 지속적인 투여가 가능하다. 또한, 중간엽 줄기세포는 발암유전자를 사용하지 않아도 대량배양이 가능하며, 환자이식에 필요한 충분한 양으로 얻을 수 있는 장점이 있다. 그리고, TRAIL을 분비하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 본 발명의 암 치료용 조성물은 면역항진 기능에 의존하지 않으므로 면역감시를 벗어난 암에도 적용할 수 있다

앞서 살핀 바와 같이, 본 발명에 따른 TRAIL를 발현하는 줄기세포, 바람직하게는 TRAIL를 분비하는 중간엽 줄기세포에, TMZ를 조합하여 처리함으로써, 악성 신경교종 등의 질환에서 TRAIL를 이용한 종양세포의 사멸능을 현저히 강화시켜 항암 치료의 용도로 다양하게 활용할 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

모든 데이터들을 평균±표준편차로 표현하였고, 다른 테스트 조건 사이의 유의성 차이는 Students't test를 이용하여 결정하였다. P <0.05인 경우 유의한 것으로 간주하였다. 생존의 통계 분석은 log-rank test에 의해 수행되었다. TRAIL과 TMZ의 시너지 효과는 CalcuSyn software (Biosoft, Cambridge, U.K.)를 이용한 아이소볼로그랩 분석으로 확인하였다.

< 실시예 1>

재료 및 방법

1-1. 골수 유래 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양

인간 골수 천자는 서울 성모병원(승인번호 KIRB-00344-009 및 KIRB-00362-006) 기간 감사 위원회의 승인 후, 22~55세의 건강한 기증자의 장골릉(illac crest)에서 얻을 수 있었다. 기증된 골수천자는 수집되어 중간엽 줄기세포의 분리, 증식 및 품질 관리를 위하여 가톨릭 세포 치료 연구소(한국, 서울)의 의약품 제조 품질 관리 기준에 따른 기관으로 보냈다. 골수 혼합물은 골수 펠렛을 얻기 위하여 4, 793g에서 7분간 원심분리하였고, 상층액을 제거한 후, 10배 부피의 멸균 증류수로 현탁시켜 적혈구를 제거하였다. 적혈구 세포에서 유도된 샘플을 원심분리하여 얻어진 세포 펠렛은 약 5~8×10³ cells/cm²의 밀도로 20% FBS(PAA Laboratories, 오스트리아, Linz)를 함유한 DMEM-low glucose(PAA Laboratories)에서 배양하였다. 세포는 5% CO2를 포함하는 습식 배양기에서 37℃로 배양하였고, 세포 밀도가 70~90%에 달할 때까지 일주일 2번씩 배양 배지를 교체하였다. 중간엽 줄기세포는 의약품 제조 품질 관련 기술에 따른 기관에서 2~4 세대까지 계대배양으로 증식시켰다. 세포 증식 과정에서, 세포는 박테리아 무균, 마이코플라스마 무균, 엔도톡신 수치(<3 엔도톡신 단위/ml)에 대해 평가하였다. 또한, 4회 계대배양 후, 세포의 다분화 잠재성(지방 형성, 연골 및 골 형성 분화)과 세포 표면 항체(CD90/CD73, >95%; 양성, CD34/CD45, >95% 음성)를 분석하였다.

1-2. 인간 신경 교종 세포주 및 그 배양

인간 신경교종 세포주(U-87MG, U-373MG 및 U-98MG)를 American Type Culture Collection으로부터 얻고(Manassas, VA, http://www.atcc.org), DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Media; Invitrogen)에서 배양하였다

반딧불 루시퍼라아제를 발현하는 U-87MG 세포(U87-Luc)는 반딧불 루시퍼라아제를 발현하는 렌티바이러스를 이용하여 안정적으로 형질도입하였다. 모든 세포는 항생제와 10% FBS(Invitrogen)을 보충하여 사용하였으며, 세포는 5% CO₂를 포함하는 습식 환경에서 37℃로 배양하였다.

1-3. 아데노바이러스 감염

TRAIL 유전자의 분비성 삼량체(secretable trimeric) 형태를 가진 아데노바이러스(Ad-TRAIL)를 동아제약(용인)에 의해 제공받았다. 강화된 그린 형광 단백질(Ad-EGFP)을 인코딩하고 있는 재조합성 복제 결핍 아데노바이러스 벡터를 AdEasy vector system (QBioGene, Carlsbad, CA)을 이용하여 설계하였다. 세포에 형질도입하기 위하여 사용된 모든 Ad 농도는 세포당 PFU(plaque-forming units)에서 MOI(multiplicity of infection)로 제공되었으며, MSC 형질도입을 위하여 50 MOI의 Ad와 50mmol/l의 Fe3⁺의 혼합물을 무혈청 배지에서 30분간 상온 전반응 시킨 후, MSC로 감염시켰다. 한편, 세포 배양액으로의 TRAIL 단백질 분비량은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)로 분석하였다.

1-4. siRNA 트랜스펙션

TRAIL DR5(death receptor 5), p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase) siRNAs를 Santa Cruz Biotechnology로부터 구입하였고, ERK(extracellular signal-regulated kinase)는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA)에서 구입하였다. siRNA로 암세포에 트랜스펙팅하기 위해, 세포 (2x10⁵ cells/well)를 6-웰 플레이트에 씨딩하고 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 이용하여 트랜스펙션을 수행하였다. 세포들을 scrambled siRNA (Santa Cruz Biotechnology)에 노출시키고, Lipofectamine 2000만을 사용하여 가-트랜스펙션(mock transfection)하여 대조군으로 사용하였다.

1-5. 세포 생존능 분석( Cell viability assay )

세포 생존능은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 기초로 한 세포독성 실험(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)으로 실시하였다. 신경교종 세포 또는 중간엽 줄기세포(MSCs)를 5×10³이 되도록 96-웰 플레이트에 분주하고 TRAIL-유도된 세포독성 및 TMZ-매개된 세포 죽음을 측정하였다. 세포에 TMZ (Sigma-Aldrich), 재조합 인간 TRAIL 단백질(R&D Systems Inc.,Minneapolis,MN) 또는 이들을 함께 적정 농도로 처리하고 72시간 후에 분석해 보았다. 공배양 실험을 위해, MSC-TRAIL를 0.4 mm 포어가 삽입된 트랜스웰(Corning Enterprises, Corning, NY)에 다양한 세포 밀도로 플레이팅하고, 신경 교종 또는 중간엽 줄기세포(MSCs)를 24-웰 플레이트의 하부 웰에서 성장시켰다.

억제능을 알아보기 위해, DR5/Fc 키메라 단백질 (100 ng/mL; R&D Systems)을 첨가하거나, 카스파아제 억제제인 z-VAD-fmk (10 mmol/L; R&D Systems)을 처리하여 각 실험전 1시간 동안 전-배양하였다. 플레이트는 570nm의 파장에서 흡광도 플레이트 리더(MolecularDevices Corporation, Sunnyvale, CA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

1-6. 세포사멸 분석

아넥신V 및 PI(propidium iodide) 염색-기반의 FITC(fluorescein isothiocyanate) Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences)를 이용하여 세포사멸(Apoptosis)을 측정하였다. U-87MG 세포(2×10⁵ cells/well)를 6-웰 플레이트에 분주하고, TRAIL (100 ng/mL)의 존재 또는 부존재하에 TMZ(0-1 mM)과 함께 24시간 동안 배양하고 PI 및 fluorescein isothiocyanate Annexin V로 15분간 염색한 후, 유세포 분석기(Moflo; Beckman Coulter Inc.)로 분석하였다.

1-7. TRAIL 수용체의 유세포 분석

TRAIL 세포사멸 수용체의 표면 발현에 대하여 PE(phycoerythrin)-컨쥬게이트된 항 인간 DR4(death receptor 4), DR5(death receptor 5) 항체 및 DcR2 항체(1㎍/10⁶ cells; R&D Systems)를 이용하여 세포들을 분석하였다. PE-컨쥬게이트된 마우스 IgG1(1㎍/10⁶ cells; R&D Systems)를 아이소타입 대조군으로 사용하였다. 세포 2.5×10⁵ 에 각 항체를 이용하여 얼음 위에서 30분간 염색하고, PBS로 세척한 후, 유세포 분석기를 이용하여 상기 수용체들의 발현양을 분석하였다.

1-8. 웨스턴 블라팅

세포를 프로테아제 저해제 칵테일(Roche, Indianapolis, IN)을 포함하는 RIPA 버퍼(50 mM Tris-hydrochloride, pH 8.0, with 150 mM sodium chloride, 1% IGEPAL CA-630(Nonidet P-40), 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate)(Sigma-Aldrich)로 용해하였다. 단백질 추출물(30㎍)은 SDS-PAGE로 분리한 후, nitrocellulose membranes (Invitrogen)로 트랜스퍼하고 하기 항체들과 반응하였다. goat anti-TRAIL (1:1,000; R&D Systems Inc.), goat anti-DR5 (1:500; R&D Systems Inc.), rabbit anti-Bid (1:1,000), rabbit anticaspase3 (1:1,000), mouse anti-caspase 8 (1:250), rabbit anti-caspase 9 (1:500), rabbit anti-Bcl-2 (1:1,000), rabbit anti-Bcl-XL(1:1,000), rabbit anti-Bax (1:500), rabbit anti-survivin (1:1,000), rabbit anti-X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP; 1:500), mouse anti-cellular FLICE-inhibitory protein (c-FLIP; 1:500; Alexis Biochemical, Lausen, Switzerland, http://www.axxora.com), rabbit anti-phospho-(p)-ERK1/2 (1:1,000), rabbit anti-ERK1/2(1:1,000), rabbit anti-p-p38MAPK(1:500), rabbit anti-p38MAPK(1:1,000), rabbit anti-poly(ADP-ribose) polymerase (1:1,000), mouse anti-b-actin (1:1,000; Sigma-Aldrich). 모든 항체는 별도의 기재가 없는한 Cell Signaling Technology에서 구입하여 사용하였다. 이후, 멤브레인은 horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies (1:1,000; Santa Cruz Biotechnology)와 반응시킨후, 블랏은 Amersham ECL detection reagents (GE Healthcare, Little Chalfont, U.K.)를 이용하여 감지하였다.

1-9. 시험관 내 세포이동 분석

MSC(중배엽 줄기세포)의 세포이동능은 8-mm pores (Corning Enterprises)를 갖는 Transwell inserts를 이용하여 실험하였다. U-87 MG 세포주(1×10⁶)를 48시간 동안 무혈청 배지에서 배양하고, 상기 조건 배양 배지를 화학주성인자로 사용하였다. MSC 또는 MSC-TRAIL(2×10⁴)를 Transwell inserts에 넣고, 무혈청 배지 또는 조건 배지를 하부 웰에 넣은 후, 필터를 three-step stain set (Diff-Quik; Sysmex Corporation, Kobe, Japan)로 염색하였다 필터의 하부로 이동한 세포를 five high-power fields(×100)를 갖는 광학 현미경(Axio Imager A1; Carl Zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 확인하였다.

1-10. 생체 내 생물발광 이미지를 이용한 치료효과 확인

모든 동물 실험은 가톨릭대학교 동물실험윤리위원회(IACUC)의 가이드라인과 승인에 따라 진행되었다. 수컷의 무흉선 누드 마우스(6~8주령; Charles River Laboratories)을 사용하여, 인간 신경교종 세포(1×10⁵ U87-Luc cells in 3ml of PBS)를 뇌의 우측부에 주축성 유도하 주사하고, 4개의 그룹으로 구분하였다(n = 40, 10/group; tumor control group, TMZ-treated group, MSC-TRAIL-treated group, TMZ plus MSC-TRAIL-treated group). 본 발명의 조합한 처리의 치료적 효과를 확인해보기 위해, TMZ를 종양 접종 후 5일째로부터 5일 동안 복강 내에 투여하고(식염수 혼합물에서 5 mg/kg),이어서, MSC TRAIL (2×10⁵ cells in 5 mL of PBS)을 종양 접종 후 7일째 종양 내로 이식하였다. 생존 실험 과정에서 Maestro In Vivo Imaging System (CRI Inc.)을 이용하여 직접적으로 종양 성장의 억제 효과를 가시화하여 평가하기 위해, 생물발광 이미지화에 앞서 10분 전 루시퍼라아제의 기질인 D-luciferin (150mg of luciferin per kilogram of body weight; Xenogen, Alameda, CA)를 복강내로 주입하였다.

1-11. 면역조직 화학법

조직학적 분석을 이용하여 종양 성장 억제를 평가하기 위해, 마우스를 종양 접종 후 14일째 이미징 실험을 수행하였다. 마취 하, 마우스(n = 12, 3/group; tumor control group, TMZ-treated group, MSC-TRAIL-treated group, and TMZ plus MSC-TRAIL-treated group) 뇌를 4% 파라포름알데히드로 관류시켰다. 적출된 뇌를 고정하고, 액체 질소에 동결하여 실험할 때까지 -70℃에서 보관하였다. 고정된 조직을 동결절단하고(14 mm-thick sections) H&E(hematoxylin and eosin)로 염색하였다. 세포사멸 활성을 TUNEL(terminal deoxyribonucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling) 분석 키트(Roche)를 이용하여 염색을 통해 검출하고, Cy3-결합된 스트렙타비딘(1:1000, Jackson ImmunoResearch Laboratories)으로 발현하였다. 일부 절편은 cleaved caspase-3 antibody (1:250; Cell Signaling Technology)으로 염색하고 Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (1:1,000; Molecular Probes, Eugene, OR) 2차 항체로 반응시켰다. 핵은 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Sigma)으로 대조염색하였다.

< 실시예 2>

TMZ 와 TRAIL 병용 투여에 따른 시너지 효과 분석

인간 악성 신경 교종 세포에 대한 TMZ의 세포독성을 평가하기 위하여, U-87MG, U-373MG, T98G 세포주에 TMZ를 0~1mM 농도 범위 내에서 72시간 동안 노출시킨 후, 상기 실시예 1-5에 기재된 방식에 따라 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay를 실시하였다. 그 결과, 도 1A에서 볼 수 있듯이 U-87MG, U-373MG 세포주에서는 농도 의존적으로 TMZ에 따른 세포 사멸을 유도하였으나, T98G 세포주는 TMZ에 강한 내성을 나타내는 것으로 나타났다.

한편, 본 발명자들은 인간 신경교종 세포에서 TRAIL에 의한 세포 사멸을 관찰한 바 있는데, 이 때 T98G 세포주는 TRAIL에 매우 민감하게 반응하였고, U-373MG 세포주는 TRAIL에 내성을 나타내었으며, U-87MG 세포주는 TRAIL에 대해 중간 정도의 민감성을 나타내는 것을 확인한 바 있다. 이에 본 발명자들은 TRAIL을 TMZ와 함께 처리하는 경우 세포 독성을 강화시킬 수 있는지 확인해 보고자, 24-웰 플레이트에 종양 세포주를 분주하고, TMZ(0.5mM)과 TRAIL(100ng/ml)을 72시간 처리한 후 상기 실시예 1-5에 기재된 방법에 따라 MTT assay를 실시하였다. 그 결과, 도 1B에서 볼 수 있듯이, U-87MG와 T98G 세포주에서 TMZ(0.5mM)과 TRAIL(100ng/ml)의 병용 처리에 따라 TMZ가 TRAIL-유도된 세포 사멸을 더 강화시키는 것을 알 수 있었다. 그러나, TRAIL에 내성을 나타내는 U-373MG 세포주에서는 미약한 세포 독성을 나타내었다.

본 발명자들은 TRAIL-유도된 세포사멸에 TMZ의 농도에 따라 미치는 영향을 확인해 보고자, U-87MG 세포주를 이용하여 TRAIL(100ng/ml) 처리 유무에 따라 TMZ를 0~1 mM 농도범위로 처리하고 세포사멸을 Annexin V/PI-기초한 유세포 분석기로 분석하였다. 그 결과, U-87MG 세포에서 세포사멸된 세포는 TMZ(1mM) 처리시 15.2%, TRAIL(100ng/ml) 처리시 15.3%이었으나, 이들을 병용 처리한 결과 54%까지 증가하는 것으로 나타났다(도 1C, 1D 참조). 또한, 병용 처리한 효과가 시너지 효과인지 확인하고자 두 약물 제제 사이의 상호 작용의 정도를 정량적으로 측정하여 조합 인덕스 값을 제공하는 isobologram 분석을 실시해 본 결과, TMZ와 TRAIL은 세포 생존율을 50%까지 저해하는 시너지 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3>

TMZ 와 MSC 에 의해 전달된 TRAIL 의 병용 처리에 따른 효과 분석

상기 실시예를 통하여 TMZ가 TRAIL과 병용 처리하는 경우 2 종류의 신경 교종 세포주에서는 시너지 효과를 나타내는 것을 확인하였으나, TRAIL에 강한 내성을 나타내는 U-373 세포주에서는 미약한 효과만을 관찰한 바, 본 발명자들은 TRAIL을 지속적이고 농축된 형태로 제공할 수 있는, MSC에 이해 전달된 TRAIL과 TMZ의 병용 처리에 따른 효과를 상기 세포주에서 다시 한 번 확인해 보고자 하였다.

이를 위하여 MSC-TRAIL은 아데노바이러스 매개 형질 도입으로 설계하여 제작한 후, ELISA를 이용하여 배양 배지에서 MSC-TRAIL로부터 분비된 TRAIL의 농도를 확인하고, 웨스턴 블라팅으로 TRAIL 단백질이 제대로 발현됨을 확인하였다.

이후, 본 발명자들은 MSC에 기초한 유전자 치료에 있어 매우 유용한 치료 양상을 나타내는 줄기 세포의 고유하고 매우 중요한 특성인 MSC-TRAIL이 종양 세포를 향해 이동하는 능력을 시험관 내 세포이동 실험(실시예 1-9 참조)을 통해 관찰해 보았다. 그 결과, MSC-TRAIL은 효과적으로 종양 세포로 이동하는 능력을 유지하고 있음을 확인할 수 있었다.

이에, 본 발명자들은 상기 제작된 MSC-TRAIL과 U-87MG 세포주 또는 U-373MG 세포주를 72시간 동안 Transwell plates를 이용하여 공배양하고, 이후, MTT assay를 이용하여 세포 독성을 분석하였다. 그 결과, U-87MG 세포주에서 MSC-TRAIL이 재조합 TRAIL에 비해 훨씬 좋은 치료 효과를 나타내었고, TMZ 병용 처리에 의해 그 효과가 훨씬 증가함을 확인할 수 있었으며(도 2A 참조), U-373MG 세포주에서도 U-87MG 세포주보다는 미약하지만, TMZ 병용 처리에 의해 세포 사멸 효과가 현저히 증가함을 확인할 수 있었다(도 2B 참조).

또한, 본 발명자들은 MSC에서 TMZ의 민감성을 확인해 보고자 MSC 세포에 TMZ를 0~1mM 농도로 처리하거나(도 2C), TMZ 0.5mM, MSC-TRAIL(4×10⁴) 또는 상기 TMZ와 MSC-TRAIL을 병용 처리한 후 Transwell plates를 이용하여 공배양하여(도 2D), 72시간 경과 후 MTT assay를 통하여 MSC 생존율을 측정하였는데, 이는 TMZ와 TRAIL이 병용 치료시 전달체인 MSC에는 세포 독성을 야기하지 말아야 하기 때문이다. 실험 결과, MSC는 병용 처리에 내성을 나타내는 것으로 나타났고, 따라서, TMZ는 TRIAL 유도된 신경 교종 세포의 사멸을 현저히 강화시킴으로써, TRAIL 내성 신경 교정세포에 대한 MSC-TRAIL 유전자 치료 효과를 향상시키기 위한 물질로 병용 투여가 가능함을 알 수 있었다(도 2C, 2D 참조).

< 실시예 4>

이종 이식 신경 교종 마우스 모델에서 병용 치료에 따른 치료 효과 분석

본 발명자들은 두개 내 이종 이식 마우스 모델에서 TMZ와 TRAIL의 병용 처리에 따른 치료 효과를 확인하고자, U87-Luc 세포를 이용하여 종양 이식 마우스을 제작하고 생체 내 생물발광 이미지 분석을 이용하여 종양의 성장을 모니터링하였다.

이를 위하여 U87-Luc 세포주(1×10⁵cells)를 주입한 이종 이식 마우스를 각 3마리씩 4개의 그룹으로 나누어 각각 TMZ(5mg/kg), MSC-TRAIL(2×10⁵ cells) 또는 TMZ 처리 후 MSC-TRAIL 주입하였다.

그 결과, 대조군, TMZ 단독 투여군 또는 MSC-TRAIL 단독 투여군에 비해 TMZ와 MSC-TRAIL을 병용 투여한 그룹에서 생물발광 발현이 현저히 감소함을 확인할 수 있었다(도 3A, 3B 참조).

또한, 신경 교종 세포를 이식한 마우스의 생존율을 각 그룹당 7마리의 마우스에 대하여 Kaplan-Meier법에 따라 log-rank test로 분석한 결과, MSC-TRAIL을 단독 투여한 그룹에 비해 MSC-TRAIL과 TMZ를 병용 투여한 그룹에서 생존 기간이 연장되는 것을 확인할 수 있었다(도 3C 참조). 본 발명자들은 종양 주입 후 90일이 경과한 본 실험의 종결 시점에서 MSC-TRAIL과 TMZ를 병용 투여한 그룹 7마리 마우스 중 3마리의 종양이 완전히 치료되었음을 확인하였다.

또한, 종양 주입 후 14일 경과하여 종양 덩어리에서 세포 사멸을 확인하고자 H&E 염색, TUNEL염색, cleaved caspase 3 염색, 핵 염색을 실시한 결과, TMZ와 MSC-TRAIL을 병용 투여한 마우스에서 상기 조성물을 단독 투여한 마우스와 비교하여 세포사멸이 현저히 증가하였음을 알 수 있었다(도 3D 참조).

이러한 결과를 통하여 본 발명자들은 악성 신경 교종에 대해 MSC-TRAIL과 TMZ의 병용 투여가 그 치료 효과를 현저히 증가시킴을 전임상 단계에서 확인할 수 있었다.

< 실시예 5>

TMZ 가 신경교종 세포에서 TRAIL 유도된 세포 사멸을 증가시키는 기전 분석

종래 사멸 수용체(death receptors)의 발현이 많은 유형의 암에서 TRAIL-유도된 세포사멸에 매우 중요한 기능을 담당하고 있음이 보고된 바 있어, 본 발명자들도 신경교종 세포에서 사멸 수용체인 DR4, DR5, DcR1, DcR2의 발현에 TMZ가 미치는 영향을 조사해 보았다.

우선, U-87MG 세포에 TMZ를 0.5mM 또는 1mM 농도로 24시간 동안 처리하고, TRAIL 수용체의 발현을 유세포 분석기를 이용하여 비처리 대조군과 비교해 보았다. 음성 대조군으로는 마우스 아이소타입 IgG1 항체를 사용하였다.

그 결과, TMZ 처리에 따라 U-87MG 세포 표면의 DR5 수치가 농도 의존적으로 증가함을 확인할 수 있었다(도 4A, 4B 참조).

한편, 비록 종래 연구에서는 TRAIL-유도된 세포사멸이 다른 종양 세포에서 DR4에 의해 우선적으로 매개되는 것으로 나타났으나, 본 발명자들은 본 발명에 따른 실험 결과 다른 사멸 수용체인 DR4는 TMZ 처리에 의해 크게 영향을 받지 않는 것을 확인할 수 있었다. 본 발명자들은 세포사멸의 증가가 DR5의 과발현에 의해 매개되는지 확인하고자, DR5와 TRAIL간의 상호결합을 차단하기 위하여 DR5/Fc 키메라 단백질을 이용하였는데, DR5/Fc는 효과적으로 상기 병용 투여에 의한 세포사멸 효과를 차단하는 것을 확인할 수 있었다.

이에, 본 발명자들은 siRNA를 이용하여 DR5의 발현을 감소시키는 경우, TMZ에 의한 TRAIL-유도된 세포사멸을 증가에 어떠한 영향을 미치는지 확인해 보았다. 웨스턴 블라팅 분석을 통해 본 발명자들은 DR5가 siRNA에 의해 효과적으로 넉다운 되었으며, 이는 U-87MG 세포에서 대조군 siRNA를 처리한 경우와 비교하여 TRAIL 유도된 caspase 활성의 증가를 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다(4 C 참조). 또한, Transwell plates를 이용하여 U-87MG 세포(4×10⁴)를 TMZ(0~1mM) 및/또는 MSC-TRAIL(1×10⁴)와 함께 72시간 공배양 한 후 MTT assay를 분석한 결과, 대조군 siRNA를 처리한 세포에 비하여 DR5 siRNA를 처리한 세포에서 TMZ와 MSC-TRAIL의 병용 처리에 따른 세포 사멸이 현저하게 저해됨을 알 수 있었다(도 4D 참조).

이들 결과를 통하여, 본 발명자들은 TMZ에 의해 유도되는 TRAIL 유도된 신경 교종세포의 세포사멸에서 DR5의 과발현이 중요한 요소로 작용한다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 6>

TMZ 에 의한 DR5 과발현 조절 기전에 대한 분석

MAPK 활성화가 TRAIL 수용체 유도에 중요한 역할을 한다고 알려져 있는바, 본 발명자들은 TMZ가 U-87MG 세포주에서 MAPK를 활성화시킬 수 있는지 확인해 보았다. 이를 위하여, U-87MG 세포주에 TMZ 0.5mM을 시간 의존적으로 처리하고, 웨스턴 블라팅을 통하여 인산화된 ERK와 p38 MAPK 발현을 분석하였다. 그 결과, TMZ는 시간 의존적으로 ERK의 인산화를 유도하였으나, p38 MAPK의 인산화에는 별다른 영향을 미치지 않았다(도 5A 참조).

다음으로, 이들 MAPK의 활성화가 TMZ에 의한 DR5의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자, 본 발명자들은 ERK 및 p38 MAPK의 siRNA를 트랜스펙션하고 48시간 경과 후, 세포에 TMZ (0~1mM)를 24시간 동안 처리하고, 이 후 세포 추출물을 DR5 및 MAPK 항체를 이용하여 웨스턴 블라팅 하였다. 그 결과, siRNA에 의한 ERK 발현 감소가 TMZ에 의해 유도되는 DR5의 과발현의 억제와 농도 의존적으로 연관되어 있음을 확인할 수 있었다(도 5B 참조). 그러나, p38의 억제는 TMZ에 의해 유도된 DR5 발현에 별다른 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

한편, 본 발명자들은 siRNA를 이용한 ERK 발현 억제가 TMZ에 의한 TRAIL에 의해 유도되는 세포사멸의 증가를 억제하는 효과를 나타내는지 확인해 보고자 하였다. 이를 위하여 U-87MG 세포주에 TMZ 0.5mM 및 재조합 TRAIL 100ng/ml을 24시간 동안 처리한 후 세포사멸 관련 단백질인 PARP와 caspase 3의 발현 변화를 웨스턴 블라팅으로 확인하였다. 그 결과, ERK의 넉다운은 TRAIL에 의해 유도되는 PARP 절단과 caspase3의 활성화를 현저히 저해하는 것으로 확인되었다(도 5C 참조).

이들 결과들을 통하여 본 발명자들은 신경 교종 세포에서 TRAIL에 의해 유도되는 세포사멸을 TMZ가 민감화 하는데 DR5의 과발현이 중요한 기작으로 작용하고, ERK 활성화가 DR5의 과발현에 중요하다는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 7>

TMZ 가 세포사멸 억제 단백질의 발현에 미치는 영향 분석

본 발명자들은 추가적으로, 세포 내에 신호전달 단백질로써 TRAIL에 의해 유도되는 세포사멸에 관여하는 것으로 알려진 세포사멸 억제 단백질의 발현에 TMZ가 어떠한 영향을 미치는지 확인해 보고자 하였다.

이를 위하여, U-87MG, U-373MG 및 T98G와 같은 신경 교종 세포주에 TMZ(0~2 mM)를 24시간 처리한 후, DR5 및 세포사멸 억제 단백질인 c-FLIP, survivin, XIAP의 발현을 웨스턴 블라팅으로 확인해 보았다. 그 결과, 이들 신경 교종 세포주에서는 농도 의존적으로 TMZ가 c-FLIP 및 XIAP의 발현을 억제하는 것을 확인하였다(도 6A 참조). c-FLIP과 XIAP의 억제가 TRAIL에 대한 화학치료 매개 민감화에 매우 중요한 요인임이 종래 보고된 바 있어, 본 발명의 결과와 일치함을 확인할 수 있었다. 한편, Survivin은 U-87MG, T98G 세포주에서는 다소 발현양이 감소하였으나, U-373MG 세포주에서는 TMZ 처리에 의해 발현양이 미약하게 증가하는 것으로 확인되었다. 또한, 다른 세포사멸 관련 달백질인 Bcl-XL, Bax의 발현양에는 큰 변화가 없는 것으로 확인되었다(데이터 미도시). 그리고, 이들 세포에서 TMZ를 처리한 결과 DR5의 발현은 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명자들은 TMZ와 TRAIL의 병용 투여에 따른 치료 효과가 caspase 활성과 연관이 있는지 확인해 보고자, U-87MG 세포주에 DR5/Fc 키메라 단백질(100ng/ml) 처리 유무에 따라 TMZ 0.5mM, TRAIL 100ng/ml 또는 TMZ와 TRAIL을 병용 처리하고, 24시간 경과 후 전체 세포 추출물을 caspase 8, caspase 9, casepase 3 및 Bid 항체를 이용하여 웨스턴 블라팅으로 분석해 보았다. 그 결과, TRAIL 단독 처리에 비해, TRAIL과 TMZ를 병용 처리하였을 때 caspase 8의 활성화 형태가 증가하는 것으로 나타났다. 한편, 고유 경로(intrinsic pathway) 관련 단백질인 Bid와 caspase 9도 역시 활성화되었으며, 병용 처리는 주요 활성 caspase인 절단된 caspase 3의 발생을 유도하였다. 또한, TRAIL 유도된 세포사멸 있어서 DR5의 역할을 결정하기 위하여, 본 발명자들은 DR5/Fc를 사용하였는데 DR5/Fc 처리한 U-87MG 세포주에서는 세포사멸이 억제되는 것으로 나타났다(도 6B 참조).

다음으로, 본 발명자들은 TMZ와 MSC-TRAIL에 의해 유도되는 세포 사멸에 미치는 caspase 저해제의 영향을 관찰해 보고자, U-87MG 세포주(4×10⁴ cells)에 caspase 저해제인 Z-VAD-FMK(10μmol/l)를 1시간 동안 처리하고, TMZ(0.5mM), MSC-TRAIL(1×10⁴), 또는 이들을 함께 72시간 동안 처리하였다. 이후, 세포 생존율을 MTT assay로 측정하였는데, caspase 저해제인 Z-VAD-FMK를 처러한 경우 TMZ와 MSC-TRAIL의 병용 처리에 의해 유도되는 세포사멸을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다(도 6C 참조).

이들 결과를 통하여, 본 발명자들은 TMZ가 세포사멸 억제 단백질의 발현을 저해하고, 이로써 다양한 caspase를 활성화시켜 TRAIL에 의해 유도되는 세포사멸의 증폭제(enhancer)로 작용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

TMZ : temozolomide
TRAIL: tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand
MSC-TRAIL: TRAIL-secreting mesenchymal stem cells
H&E: hematoxylin and eosin
TUNEL: terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling
DR: death receptor
DcR: decoy receptor
siRNA: small interfering RNA
ERK: extracellular signal-regulated kinase
p38 MAPK: p38 mitogen-activated protein kinase
PARP: poly(ADP-ribose) polymerase
Bid: BH3 interacting-domain death agonist
c-FLIP: cellular FLICE-inhibitory protein (L, long isoform; S, short isoform)
XIAP : Xlinked inhibitor of apoptosis protein

Claims

TRAIL(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)을 분비하는 줄기세포 및 TMZ(temozolomide)를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 인간 유래인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 지방, 자궁, 골수, 근육, 태반, 제대혈, 모낭 및 피부로 구성된 군에서 선택된 조직 유래인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 TRAIL을 분비하는 줄기세포는 TRAIL를 발현하는 바이러스 벡터로 형질감염된 줄기세포인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
제5항에 있어서,
상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 암은 전이성 흑색종; 악성 흑색종, 악성 신경아교종, 아교모세포종 및 기타 뇌암; 폐암; 유방암, 고환암; 결장 및 직장암; 암종; 육종; 림프종; 백혈병; 역형성별세포종; 및 균상식육종으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 암종인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 암은 악성 신경아교종 또는 아교모세포종인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 (i) ERK 활성화에 의해 DR5의 발현을 상향조절하고 (ii) 세포사멸 억제 단백질을 하향조절하고 (iii) 카스파아제의 활성을 증가시킴으로써, TRAIL-유도된 세포사멸능을 강화시키는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.