KR20040075700A

KR20040075700A - 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는분화 촉진제

Info

Publication number: KR20040075700A
Application number: KR10-2003-7011301A
Authority: KR
Inventors: 미우라겐주; 하루야마무네타다; 고다마시호
Original assignee: 다이이찌 산토리 파마 가부시키가이샤; 가부시키가이샤 다이이찌 산토리 세이부쓰 이가쿠 겐큐쇼
Priority date: 2001-12-28
Filing date: 2002-12-27
Publication date: 2004-08-30
Also published as: JP4362066B2; US7282201B2; DE60231328D1; CN1499980A; IL157600A0; AU2002359951A1; AU2002359951B8; ATE423567T1; EP1459758A4; AU2002359951B2; BR0207725A; US20040157326A1; EP1459758A1; JPWO2003057241A1; CA2439471A1; KR100948346B1; ES2321819T3; EP1459758B1; WO2003057241A1; CN1329078C

Abstract

본 발명은 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화가 충분하지 않기 때문에 생기는 질환, 특히 범조혈 세포 감소증 및/또는 조형 기능 저하를 수반하는 질환의 치료약으로서 유용한 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제를 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명은 코필린을 유효 성분으로 하는 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제를 제공함으로써 상기 과제를 해결한다.

Description

조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제{AGENTS PROMOTING THE PROLIFERATION AND/OR DIFFERENTIATION OF HEMATOPOIETIC STEM CELLS AND/OR HEMATOPOIETIC PRECUSOR CELLS}

생체에 있어서의 성숙·분화된 말초 혈구계의 항상성(恒常性)은 자기복제능을 가지는 조혈 줄기 세포, 그로부터 공급되어 분화의 방향이 결정지어진 조혈 전구 세포 및 양자 사이의 연속적인 분화 단계의 세포군과, 또한 이들 일련의 세포를둘러싸는 조혈 미소환경으로서의 지지 간질 세포(stroma cell)와의 직접 상호작용 또는 후자가 분비하는 액성 조혈 조절 인자와의 간접 상호작용에 의해 조절되고 있다. 조혈 줄기 세포로부터 조혈 전구 세포를 거쳐 성숙한 각종 혈구로의 증식 및/또는 분화에는 다수의 사이토카인이 관여하는 것으로 밝혀져 있다.

유전자 공학의 진보에 의해, 이들 사이토카인의 유전자는 클로닝되어, 유전자 재조합 기술에 의해 공업 생산도 가능하게 되었다. 유전자 재조합형 조혈 인자로는 과립구(顆粒球)-콜로니 자극 인자(granulocyte co1ony-stimulating factor, 이하, "G-CSF"라 함) 및 대식세포-콜로니 자극 인자(macrophage colony-stimulating factor, 이하 "M-CSF"라 함)가 방사선 조사 또는 화학 요법 등에 의한 조혈 기능 저하(호중구감소 등)에 대한 치료약으로서, 에리스로포이에틴(erythropoietin, 이하 "EPO"라 함)이 신장성 빈혈 등의 치료약으로서 임상 응용되고 있다. 그러나, 이들 조혈 인자에서의 치료는 일과성으로 성숙 혈구의 회복을 가져오는 것에 불과하다.

따라서, 근본적인 조혈 기능을 개선하는 치료 수단으로서, 자기 또는 동종 조혈 줄기 세포 이식이 행해지고 있다. 최근에는 말초혈 조혈 줄기 세포 이식이 급속히 보급되고 있고, 또, 제대혈 조혈 줄기 세포 이식이 주목되고 있다. 그러나, 과제도 많고, 특히 조혈 줄기 세포는 매우 소량 존재하기 때문에 도너 및/또는 레시피언트의 부담도 크다. 이로 인해, 조혈 줄기 세포의 체외 증폭법의 확립이 필요하다. 또, 현재 효과적인 치료법이 없는 치사적 유전성 질환이나, 특정 종류의 악성 종양, 에이즈 환자에 대하여, 결실 또는 변이 유전자를 상보하는 유전자치료가 시도되고 있다(大橋十也, 實驗醫學, 12:333, 1994).

조혈 줄기 세포는 항구적으로 생존할 수 있기 때문에, 이러한 유전자 치료에 있어서 최적의 표적 세포로 생각된다. 그러나, 목적 유전자를 삽입한 레트로바이러스 벡터를 효율적으로 트렌스팩션 또는 감염시키기 위해서는 통상 정지기에 있는 소수의 조혈 줄기 세포를 세포 주기에 넣어, 증폭시키는 것이 필요하다. 조혈 줄기 세포나 조혈 전구 세포의 증식에 관여하고 있다고 생각된 줄기 세포 인자(SCF; stem cell factor)나 flk-2/flt-3 리간드에 관해, 증식에 대한 유효성이 검토되었다.

조혈 줄기 세포나 조혈 전구 세포의 증식에 있어서, c-kit/SCF계 시그널이 중요하다는 것이 실험적 연구에 의해 밝혀지고(Blood, 78:1-19, 1991; Blood, 81:2844-2853, 1993; Blood, 90:4767-4778, 1997), 줄기 세포 인자(SCF; stem cell factor)가 조혈 줄기 세포나 조혈 전구 세포에 발현되고 있는 티로신 키나제형 수용체인 c-kit의 리간드인 것으로 나타남으로써(Cell, 63: 167-174, 1990; Cel1, 63: 195-201, 1990; Cel1, 63: 225-233, 1990), 조혈 줄기 세포나 조혈 전구 세포의 증식에 대한 SCF의 효과가 기대되었다. 그러나, 인간 조혈 줄기 세포나 조혈 전구 세포 상의 c-kit의 발현은 약해서(Blood, 87:4136-4142, 1996), SCF 단독으로는 증폭 활성이 낮고, 조혈 줄기 세포나 조혈 전구 세포의 증식에 있어서 충분히 유효하지 않다.

또, 여러 가지 조직에 유전자 발현이 확인되어 있는 수용체형 티로신 키나제인 fLk-2/flt-3는 혈액 세포에서는 특히 미분화 조혈 줄기 세포에 발현되어 있고,flk-2/flt-3 리간드(FL)는 미분화 조혈 세포의 증식을 자극하는 인자로서 발견되었다(Lyman SD. Curr. Opin. Hematol. 1998; 5(3):192-6). 그러나 이 분자도 단독으로는 증폭 활성이 낮아서, 조혈 줄기 세포나 조혈 전구 세포의 증식에 있어서 충분히 유효하지 않다.

이와 같이, SCF나 FL을 단독으로 사용하더라도 조혈 줄기 세포나 조혈 전구 세포의 증식에 있어서 충분히 유효하지 않기 때문에, 조혈 줄기 세포나 조혈 전구 세포의 증식법으로는 여러 가지의 사이토카인과의 조합이 이상적이라고 생각되고 있고(Blood, 89:2644-2653, 1997; Cancer Chemother. Pharmaco1., 38[Supp1.]:64-68, 1996), 이들 분자와 TPO(thrombopoietin), 인터로이킨 6(IL-6)/가용성 인터로이킨 6 수용체(soluble IL-6 receptor) 복합체 또는 Hyper IL-6(IL-6과 가용성 IL-6 수용체와의 융합 단백질) 등과의 조합이 검토되고 있다(Exp. Hemato1. 29:822-832, 2001). 또한, 증폭 활성이 강한 새로운 인자를 해명하고 취득할 것이 소망되고 있다.

한편, 코필린은 분자량이 약 19000인 단백질이며, 여러 가지 시그널에 대하여 액틴 필라멘트(F-액틴)에 1:1의 몰비로 결합하고, 그 결과, 액틴의 물리적 상태를 조절하여 액틴계 세포 골격의 재구축에 있어서 중요한 기능을 실행하는 액틴 결합 단백질(actin-binding protein; ABP)의 일원이다(實驗醫學, 제12권, 제4호:24-28, 1994). 그리고 코필린은 G-액틴과 결합하여 G-액틴(액틴 단량체)을 절단, 탈중합함으로써, 형태 변화, 이동(운동), 분열, 분비, 식(음) 작용, 각종 시그널 전달 등의 많은 세포 응답을 제어하고 있음이 알려져 있다(生化學, 제71권,제2호:101-114, 1999). 코필린은 세포 내에서 인산화형과 탈인산화형이 공존하고 있어, 액틴에 대한 결합 활성은 인산화에 의해 억제되고, 탈인산화에 의해 촉진된다.

최근, 혈소판에 대한 트롬빈에 의한 자극, 갑상선 세포에 대한 갑상선 자극 호르몬에 의한 자극, 이하선(耳下腺) 세포에 대한 이소프로테레놀(isoproterenol)에 의한 자극, 성상 세포에 대한 디부티릴 cAMP에 의한 자극 등, 여러 가지의 외적 자극에 따라 코필린이 탈인산화되는 것을 알게 되었다(Moon, A. & Drubin, D.G. (1995) Mo1. Biol. Cell. 6, 1423-1431). 또한, 호중구(好中球) 또는 T 세포의 활성화와 함께 코필린이 탈인산화된다는 보고도 있다.

한편, 액틴 결합 단백질(ABP)의 기능 또는 ABP 기능의 조절에 의해, 특정 종류의 질환 치료법이 제시되어 있다. 예를 들면, 액틴 침착(沈着)이 원인이 되는 병태 조직, 장기로의 ABP 투여에 의한 치료 또는 병태 경감법(일본 특표평 5-50603호, 일본 특표평 8-510998호), 코필린의 탈인산화 억제제에 의한 아포토시스 모듈레이션을 메카니즘으로 한 아포토시스 제어부전이 관여하는 각종 질환 치료약(일본 특개평 10-67662호, 일본 특개평 10-87484호)을 들 수 있다.

그러나, 이들 코필린 및 그 동족 화합물이 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화에 관여한다는 보고는 지금까지 없었다.

본 발명은 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화가 충분하지 않기 때문에 생기는 질환, 특히 범조혈 세포 감소증 및/또는 조혈 기능 저하를 수반하는 질환의 치료약으로서 유용한 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구세포의 증식 및/또는 분화 촉진제를 제공하는 것을 과제로 한다. 또, 본 발명은 조혈 줄기 세포 이식, 유전자 치료 및 재생 의료에도 유용한 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제를 투여하는 것을 포함하는 조혈 줄기 세포의 생체 외 증식 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명은 액틴 결합 단백질의 1종인 코필린 또는 그 동족(analogous) 화합물을 유효 성분으로 하는 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제와 그것의 새로운 용도에 관한 것이다. 본 발명의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제는 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화가 충분하지 않기 때문에 생기는 질환, 특히 범조혈(汎造血) 세포 감소증 및/또는 조혈 기능 저하를 수반하는 질환의 치료약으로서 유용하다. 또, 본 발명의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제를 이용하여 조혈 줄기 세포를 생체 외에서 증식시키는 방법은 조혈 줄기 세포 이식이나 유전자 치료에도 유용하며, 또한 재생 의료에 유용한 것이다.

도 1은 인간 비근형(非筋型) 코필린(AC: P23528)의 1차 구조 서열을 도시한 도면이다.

도 2는 인간 태반 비근형 코필린(AC: DO0682)의 cDNA의 서열을 도시한 도면이다. 밑줄친 부분은 프라이머로서 올리고머, 프라이머 SKO13(SEQ ID NO:3) 및 프라이머 SK014(SEQ lD N0: 4)을 합성한 부위를 나타낸다.

도 3은 인간 태반 유래(상단)과 인간 S6 세포 유래(하단)의 비근형 코필린의염기 서열의 얼라인먼트를 나타낸다. 양자의 비교로부터 염기 198번 및 염기 471번이 상이하지만, 모두 잠재성 돌연변이(silent mutation)인 것을 나타낸다.

도 4은 재조합형 인간 비근형 코필린을 발현시킨 C0S-1 세포의 배양 상청에 대해, HPP-CFC 분석에 의해, 조혈 줄기 세포 증폭 작용을 평가한 결과를 나타낸다.

도 5은 인간 비근형 코필린이, SCF 및 FL과의 공존에 의해, 인간 제대혈 유래 CD34 양성 세포에 대하여, SCF 및 FL만을 첨가한 경우와 비교하여, 현저한 증식 활성을 가지는 것을 나타낸다.

도 6a는 인간 비근형 코필린이, SCF + FL과의 공존에 의해, 인간 제대혈 유래 CD34 양성 세포를 현저하게 증식시킨 것을 나타내고, 도 6b 내지 6d는 인간 비근형 코필린 + SCF + FL의 조건 하에서 인간 제대혈 유래 CD34 양성 세포를 증식시킨 후에 콜로니 형성 분석에 제공한 바, CFU-GM, BFU-E 및 CFU-Mix의 콜로니수를 현저하게 증가시킨 것을 나타낸다.

도 7은 인간 비근형 코필린 + SCF + FL의 조건 하에서 인간 제대혈 유래 CD34 양성 세포를 증식시킨 후에 콜로니 형성 분석에 제공한 바, CFU-Mk의 콜로니수를 현저하게 증가시킨 것을 나타낸다.

도 8은 인간 비근형 코필린이, SCF 및 FL과의 공존에 의해, 인간 제대혈 유래 CD34 양성 세포를 거핵구로 분화 및 증식시키는 것을 나타낸 현미경 사진이다.

도 9는 인간 비근형 코필린이, SCF 및 FL과의 공존 하에서 인간 제대혈 유래 CD34 양성 세포를 2주간 전후 배양했을 때에, 성숙 거핵구의 일부에 포체(胞體) 돌기가 확인된 것을 나타내는 현미경 사진이다.

본 발명자는 이전에 인간 골수성 백혈병 세포주로부터, CD34가 양성이며, 또한 GP(glycoprotein) IIb/IIIa가 음성이라고 하는 특징을 가지는 새로운 세포주를 수립했다(일본 특개평 6-269284). 본 발명자들은 이 세포를 Human myeloid leukemic cel1 S6 SBM332로 명명하고(이하 "S6 세포"라 칭함), 1993년 3월 9일자로 일본국 이바라키켄 쓰꾸바시 히가시 1-I-I 소재 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(현 독립행정법인 산업기술 종합연구소, 특허생물 기탁센터)에 FERM BP-4227로서 기탁했다. CD34는 조혈 줄기 세포의 분화에 따라 소실되는 당단백질로 인간 조혈 줄기 세포의 마커(marker)이며, 한편 GP(glycoprotein) IIb/IIIa는 혈소판과 거핵구(megakaryocyte)에 특이적으로 발현되는 혈소판막 당단백질로서, 거핵구의 분화에 따라 증강되는 분화 항원이며, 인간 거핵구의 마커이다.

S6 세포주는 혈청 첨가 조건으로 CD34 양성 및 GPIIb/IIIa 음성의 표현형을 유지한 채로 장기적으로 안정되게 배양할 수 있고, 또한 12-O-테트라데카노일 포르볼 13-아세테이트(TPA)의 첨가 배양에 의해 CD34의 발현이 감쇠되고, GPIIb/IIIa의 발현이 현저하게 증강하여, 이에 따라 S6 세포주는 거핵구계로 분화되는 것이 알려지고, 분화능을 가지는 것도 밝혀졌다.

본 발명의 발명자들은 이들 종래의 실험 결과에 기초하여 추가의 연구를 행하여, S6 세포의 무혈청 배양 상청 중에 마우스 고증식능 콜로니 형성 세포, HPP-CFC(high proliferative potential-colony forming cells)의 증폭을 촉진하는 인자의 존재를 발견하였다. 이제까지의 지견 및 이 연구 결과로부터, S6 세포는 조혈 줄기 세포의 성질을 가지고, 조혈 줄기 세포의 증식을 촉진할 수 있는 미지의 인자(이하 "S6 인자"라 칭함)에 의해 오토크린 증식(autocrine growth)하고 있는 것을 발견했다. 즉, S6 인자는 새로운 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 인자일 가능성이 시사되었다. 이에 기초하여 S6 세포의 무단백질 배양 상청을 정제하여, HPP-CFC 증폭능을 가지는 인자의 분리 정제 및 구조의 결정, 내지 상기 인자의 유전자의 클로닝 및 유전자 재조합형 인자의 HPP-CFC 증폭능에 관해서 예의 연구를 거듭한 결과, 의외로 상기 인자가 저분자 액틴 결합 단백질인 코필린인 것을 발견했다.

본 발명의 발명자들은 이 지견으로부터, 액틴 결합 단백질의 하나인 코필린이 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화를 촉진할 수 있는 인자인 것을 발견하여, 마우스의 HPP-CFC 증폭을 촉진시키며, 또한 HPP-CFC 증폭능을 가지는 기존의 사이토카인보다 그 활성이 현저하게 높다는 지견에 기초하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 코필린을 유효 성분으로 하여, 경우에 따라 다른 사이토카인을 추가로 함유하는 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제를 제공한다.

본 발명은 또한, 전술한 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제 중 최소한 1종을 투여하는 것을 포함하는 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화를 촉진하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제 중 최소한 1종을 이용하여, 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화가 충분하지 않기 때문에 생기는 질환, 보다 구체적으로는 범조혈 세포 감소 또는 조혈 기능 저하를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 전술한 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제 중 최소한 1종을 투여하는 것을 포함하는 조혈 줄기 세포를 생체 외에서 증식시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제 중 최소한 1종을 이용하여 조혈 줄기 세포를 생체 외에서 증식시키고, 증식시킨 조혈 줄기 세포를 이식하는 것에 의한 재생 의료 방법을 제공한다.

본 발명에서의 코필린의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성은 HPP-CFC의 증폭 촉진 활성(이하 "HPP-CFC 활성"이라 칭함)을 지표로 하여 결정할 수 있다. 이 HPP-CFC(high proliferative potential-colony forming cells)는 증식력이 강하여 거대콜로니 형성능을 가지는 시험관 내 콜로니 형성법으로 확인할 수 있는 가장 미숙한 세포이며, 골수 세포를 골수 간질 세포(stroma cell) 상에서 5주간 이상 배양한 후에도 콜로니 형성능을 가지는 세포로서 검출되는 장기 배양 개시 세포(long term culture-initiating cell, LTC-IC)로부터 일단계 분화된 것으로 간주된다. 그리고 본 발명에서 HPP-CFC 활성이라고 하는 경우, 피검물질이 HPP-CFC에 작용하여, 그 증폭을 촉진하는 활성을 말한다.

HPP-CFC 활성의 측정은 예를 들면, 조혈 줄기 세포를 특이적으로 취득할 목적으로 마우스에 항암제인 5-플루오로우라실을 투여하여, 이 마우스로부터 얻은 골수 세포로부터, 추가로 T 세포, B 세포, 과립구 및 대식세포의 마커 항원을 발현하고 있는 세포를 제거한 조혈 줄기 세포 분획에, 샘플 및/또는 사이토카인을 첨가하여 액체 배양하여, 그 배양액의 일부를 콜로니 분석에 제공함으로써 형성되는 거대한 HPP-CFC 콜로니의 수를 측정함으로써 행한다. 이 측정법에 의해, 본 발명의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제의 활성을 측정할 수 있다.

본 발명에서, 코필린을 이용하여 전술한 HPP-CFC 활성 측정을 행한 바, 코필린은 이러한 HPP-CFC에 작용하여, 그의 증식 및/또는 분화를 유도하는 활성을 발휘하는 것을 알았다. 따라서, 코필린은 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화의 지극히 초기 단계에 있는 세포(즉 다능성 줄기 세포)에 기능하여, 그의 증식 및/또는 분화를 촉진하는 활성을 갖고 있다.

본 발명에서 "조혈 줄기 세포"란, 적혈구, 백혈구, 혈소판 등의 모든 혈액 세포로 분화할 수 있는 다능성 줄기 세포를 의미한다. 이 세포는 CD34 양성이지만, 다른 세포계보 마커(Lineage maker)는 모두 음성인 세포이다. 예를 들면, 본 발명에서의 "조혈 줄기 세포"는 골수 유래의 CD34 양성 세포뿐 아니라 제대혈 유래의 CD34 양성 세포에도 함유되어 있다.

본 발명에서 "조혈 전구 세포"란, 조혈 줄기 세포로부터 분화 단계가 진행되어, 각각의 혈액 세포 계열의 전구 세포(단능성 전구 세포)로 분화되는 미분화 전구 세포인 것을 말한다. 예를 들면 본 발명에서의 "조혈 전구 세포"에는 과립구·대식세포계 전구 세포(Co1ony-forming unit Granu1ocyte, Macrophage, CFU-GM), 적아구계 전구 세포인 적아구 버스트 형성 세포(Burst-forming unit erythroid, BFU-E), 거핵구계 전구 세포(Colony-forming unit megakaryocyte, CFU-Mk) 및 골수계 다능성 줄기 세포(Co1ony-forming unit mixed, CFU-Mix) 등이 포함된다.

본 발명에서 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 "분화"라고 하는 용어는 조혈 줄기 세포가 조혈 전구 세포에, 조혈 전구 세포가 단능성 조혈 전구 세포 및/또는 특유의 기능을 가지는 세포, 즉 적혈구, 백혈구, 거핵구 등의 성숙 세포로 전환되는 것을 말한다.

따라서, 본 발명의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포 증식 촉진 활성이란, 전술한 기능을 갖는 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포를 증식시켜, 동일한 기능을 가지는 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포를 증폭하는 활성을 의미한다. 또, 본 발명의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포분화 촉진 활성이란, 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포를 분화시켜, 전술한 기능을 가지는 조혈 전구 세포나 단능성 전구 세포 및/또는 성숙 혈액 세포(적혈구, 백혈구, 거핵구)로 전환하는 활성을 의미한다. 본 발명에서는 HPP-CPC을 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포와 동일한 의미로 사용한다.

절단 인자의 일례인 코필린은 진핵생물(眞核生物)에 보편적으로 존재하는 분자량이 15-21 kDa인 저분자 액틴 결합 단백질이며, 고등 척추동물의 코필린은 모두 166개의 아미노산으로 이루어진다. 그리고, 그것의 아미노산 서열은 계통수적(系統樹的)으로 떨어진 종 사이에서도 전장에 걸쳐 30% 이상의 상동성이 있다. 예를 들면, 인간의 코필린에는 근형 코필린과 비근형 코필린이 존재하지만, 이들의 상동성은 76.5%인 것이 알려져있다. 따라서, 본 발명에서 특별히 한정되지 않고 "코필린"이라고 하는 경우에는 SEQ ID NO: 1로 나타내어지는 아미노산 서열을 가지는 코필린뿐 아니라 그 동족 화합물도 포함된다.

본 발명에서 코필린의 동족 화합물이라고 하는 경우에는 SEQ ID NO: 1로 나타내어지는 코필린의 아미노산 서열에서 하나 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 것; SEQ ID NO: 1로 나타내어지는 코필린의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열과 상보적인 염기 서열과의 사이에서, 엄격한 조건 하에서 잡종 형성 가능한(hybridizable) 염기 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 가지는 것; 코필린의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 1)과의 사이에서 최소한 30%, 바람직하게는 최소한 50%, 보다 바람직하게는 최소한 60%, 가장 바람직하게는 최소한 70%의 아미노산 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 것으로서, 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는 것이 포함된다. 본 발명에서 코필린의 동족 화합물이라고 하는 경우에는 또한, SEQ ID N0: 2로 나타내어지는 코필린의 염기 서열과 상보적인 염기 서열과의 사이에서, 엄격한 조건 하에서 잡종 형성 가능한 염기 서열에 의해 코딩되는 것; SEQ ID NO: 2로 나타내어지는 코필린의 염기 서열과의 사이에서 최소한 30%, 바람직하게는 최소한 50%, 보다 바람직하게는 최소한 60%, 가장 바람직하게는 최소한 70%의 염기 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함하는 DNA에 의해 코딩되는 것으로서, 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는 것도 포함된다.

여기에서, "하나 또는 복수 개"란, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼10개, 가장 바람직하게는 1∼5개를 말한다. 또, 단백질의 경우, "결실", "치환", 및 "부가"는 코필린(SEQ ID NO: 1)과 동일하게 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 갖도록 발생되는 것을 말한다. 예를 들면, 아미노산의 "치환"의 경우에는 동일한 성질을 가지는 아미노산끼리의 치환, 예를 들면 특정 소수성 아미노산으로부터 다른 소수성 아미노산으로의 치환, 특정 친수성 아미노산으로부터 다른 친수성 아미노산으로의 치환, 특정 산성 아미노산으로부터 다른 산성 아미노산으로의 치환, 또는 특정 염기성 아미노산으로부터다른 염기성 아미노산으로의 치환 등의 치환이 포함된다.

본 발명에서, 엄격한 조건이란, 목적의 염기 서열이 코필린(SEQ ID NO: 1)을 코딩하는 염기 서열(예를 들면, SEQ ID NO: 2) 또는 이것과 축중(縮重)의 관계에 있는 염기 서열과의 사이에서, 특이적으로 잡종 형성 가능한 조건을 말한다. 잡종 형성 조건은 온도, 이온 농도 등의 조건을 고려하여 결정되지만, 일반적으로는 온도가 높을수록, 또한 이온 농도가 낮을수록 엄격한 정도가 높아지는 것으로 알려져 있다. 이러한 엄격한 조건의 설정은 당업자이면, 예로서, Sambrook 및 Russel[Molecular C1oning: A Laboratory Manua1, 3rd edition(2001)]에 기재된 바에 따라 행할 수 있다. 이들 엄격한 조건의 구체적인 예로서는, 6×SSC, 5×Denhardt's, 0.1% SDS, 25℃ 내지 68℃ 등의 잡종 형성 조건을 사용하는 것이 고려된다. 이 경우, 잡종 형성의 온도로서는 보다 바람직하게 45℃ 내지 68℃(포름아미드 없음) 또는 25℃ 내지 50℃(50% 포름아미드)를 들 수 있다.

본 발명에서 아미노산 또는 염기 서열의 서열 상동성은 시각적 검사 및 수학적 계산에 의해 결정할 수도 있다. 이와는 달리, 2개의 단백질 서열의 서열 상동성은 Needleman 및 Wunsch(J. Mol. Bio1., 48:443-453, 1970)의 알고리즘에 기초하여, 그리고 위스콘신 대학 유전학 컴퓨터 그룹(UWGCG)으로부터 입수 가능한 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정할 수도 있다. GAP 프로그램의 바람직한 디폴트 파라미터(default parameter)에는: (1) HeniKoff 및 Henikoff(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919, 1992)에 기재된 바와 같은 스코어링 매트릭스, blosum62; (2) 12 갭 가중(gap weight); (3) 4 갭 길이가중(gap length weight); 및 (4) 말단 갭에 대한 페널티(penalty) 없음이 포함된다.

본 발명에서 아미노산 또는 염기 서열의 서열 상동성 분석에는 당업자가 이용하는, 서열 비교의 다른 프로그램도 또한 사용할 수도 있다. 예를 들면 Altschu1 등(Nuc1. Acids. Res. 25., p. 3389-3402, 1997)에 기재되어 있는 BLAST 프로그램을 이용하여 서열 정보와 비교하여 결정할 수 있다. 구체적으로는, 염기 서열 분석의 경우, Nucleotide BLAST(BLASTN) 프로그램에서 Query 염기 서열을 입력하여, GenBank, EMBL, DDBJ 등의 염기 서열 데이터 베이스와 대조할 수 있다. 또, 아미노산 서열 분석의 경우, Protein BLAST(BLASTP) 프로그램에서 Query 아미노산 서열을 입력하여, GenBank CDS, PDB, SwissProt, PIR 등의 아미노산 서열 데이터 베이스와 대조 체크할 수 있다. 상기 프로그램은 인터넷 상에서 National Center for Biotechnology Information(NCBI), 또는 DNA Data Bank of Japan(DDBJ)의 웹사이트로부터 이용하는 것이 가능하다. BLAST 프로그램에 의한 상동성 검색의 각종 조건(파라미터)은 상기 사이트에 자세히 기재되어 있고, 일부의 설정을 적절하게 변경하는 것이 가능하지만, 검색은 통상 디폴트 값을 이용하여 행한다. 당업자가 이용하는 서열 비교의 다른 프로그램도 또한 사용할 수 있다.

이러한 코필린 및 그 동족 화합물은 천연의 것을 사용하는 외에, 본 발명의 기술 분야에서 기지의 유전자 공학적 방법에 의해 제조할 수 있는 것, 예를 들면 부위 특이적 변이생성(Site Directed Mutagenesis), 변이원(變異原) 처리나 PCR 증폭 미스를 이용한 랜덤 변이생성(Random Mutagenesis), 카세트 도입변이생성(Cassette Mutagenesis) 등에 의해 제조되는 것을 이용할 수 있다. 즉, 변이는 자연적으로 발생된 것일 수도 있고, 유전자 공학적 방법에 의해서 실시된 것일 수도 있다. 예를 들면, 코필린에 관해서는 아미노산 서열(SEQ ID N0: 1) 및 유전자 서열(SEQ ID NO: 2)은 이미 알려진 것이므로, 이들 서열에 기초하여, 확립되어 있는 유전자 공학적 방법에 의해 생산할 수도 있다. 여기에서, 유전자 공학적 방법으로는 예를 들면, Sambrook 및 Russel[Molecular C1oning: A Laboratory Manual, 3rd edition (2001)]에 기재되어 있는 방법을 사용할 수 있다. 당업자는 관용된 방법에 의해 용이하게 이러한 변이 단백질을 제작할 수 있다.

코필린은 생물종에 따라 몇 개의 다른 명칭으로 불리우고, 통상 이들은 코필린 패밀리로 총칭된다. 본 발명에서는 이들 코필린 패밀리에 속하는 여러 가지 생물종 유래의 것을 포함해서 코필린이라 총칭한다. 따라서, 코필린에는 인간 비근형 코필린이나 인간 근형 코필린 등을 포함하는 코필린으로 명명되고 있는 것뿐 아니라, 예를 들면, 돼지의 데스트린(destrin), 닭의 액틴 탈중합 인자(ADF), 섬게(urchin) 알의 디팩틴(depactin), 효모의 Abp1, Acanthamoeba의 액토포린(actophorin) 등 및 이들의 동족 화합물이 포함된다.

코필린의 활성을 갖는 물질의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제로서의 활성의 종 특이성은 마우스 유래의 코필린이 인간 세포에 대하여 효과를 발휘하는 등, 엄밀한 종 특이성은 갖고 있지 않다. 따라서, 본 발명의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제의 유효 성분으로는 코필린뿐 아니라, 코필린과 동일한 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는 한, 특정한 종 유래일 필요는 없고, 예를 들면 소, 돼지, 새, 염소, 양 등의 동물로부터 유래할 수도 있다. 그러나, 인간에게 사용하는 경우에는 인간 유래인 것, 즉 인간 유래 코필린 또는 상기 코필린의 인간 유래의 동족 화합물을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 한 특징에서는 또한, 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제에는 코필린 또는 그 동족 화합물 이외에, 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화를 촉진하는 작용을 가지는 여러 가지의 사이토카인을 1종 이상, 보조적 유효 성분으로서 함유시킬 수도 있다.

본 발명에서 보조적 유효 성분으로서 추가할 수 있는 사이토카인의 예로서는 인터로이킨(IL)-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-11, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 에리스로포이에틴(EPO), 줄기 세포 인자(SCF), flk-2/flt-3 리간드, 트롬보포이에틴(TPO), 염기성 섬유아세포 증식 인자(bFGF), 산성 섬유아세포 증식 인자(aFGF), 인슐린형 증식 인자, 상피 증식 인자(EGF), 간세포 증식 인자(HGF),트랜스포밍 성장 인자-α(TGF-α), 프로테아제 넥신 I, 프로테아제 넥신 II, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 콜린 작동성 분화 인자(CDF), 백혈구 유주 저지 인자(LIF) 등이 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또, IL-6/가용성 IL-6 수용체 복합체 또는 Hyper IL-6(IL-6와 가용성 IL-6 수용체와의 융합 단백질)을 함유시킬 수도 있다. 본 발명에서 추가할 수 있는 사이토카인으로는 줄기 세포 인자(SCF), flk-2/flt-3 리간드, 트롬보포이에틴(TPO) 또는 이들 중 임의의 조합이바람직하다.

이들 사이토카인을 보조적 유효 성분으로서 함유시키면, 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제로서의 코필린의 효과는 상승적(相乘的)으로 증가한다. 이들 첨가량은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 인간 코필린을 100으로 한 경우에 각각 0.0001∼200000 중량% 첨가할 수 있다. 이들 보조적 유효 성분의 첨가량은 전술한 값에 한정되는 것이 아니고, 증상, 환자의 연령 등에 의하여 적절하게 결정할 수 있다. 이들 사이토카인은 반드시 코필린과 동시에 동일 제형으로서 투여하지 않아도 되고, 예를 들면, 코필린을 투여한 후에 사이토카인을 투여할 수도 있다.

본 발명의 한 특징에서는 전술한 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제에 대하여, 코필린 이외의 HPP-CFC 활성을 가지는 물질을 추가의 보조적 유효 성분으로서 첨가하여 사용할 수도 있다. 추가의 보조적 유효 성분으로서의 코필린 이외의 HPP-CFC 활성을 가지는 물질이란, HPP-CFC 유래 콜로니의 형성을 촉진함으로써, 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 작용을 가지는 물질로서, 코필린 이외의 물질을 말한다. 코필린과 이들 추가의 보조적 유효 성분을 동시에 투여함으로써, 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진작용을 상승적으로 항진(亢進)시킬 수 있다. 이러한 물질에는 SCF, flk2/flt-3 리간드, TP0, IL-6/가용성 IL-6 수용체 또는 Hyper IL-6(IL-6과 가용성 IL-6 수용체와의 융합 단백질) 등이 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 코필린을 유효 성분으로 하는 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제는 체 내에 투여되었을 때의 그 기능에 따라, 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화가 충분하지 않기 때문에 생기는 질환, 보다 구체적으로는 범조혈 세포 감소 및/또는 조혈 기능 저하를 수반하는 질환, 또는 조혈 세포 감소 또는 조혈 기능 장애를 수반하는 질환의 치료 및/또는 조혈 세포 감소 또는 조혈 기능 장애를 수반하는 치료법의 개선에 유효하다. 상기 예로서는 Fanconi 증후군, 재생 불량성 빈혈, 악성 림프종 또는 급성 백혈병 등의 암, 만성 간장애, 신부전, 수술 시 또는 보존혈의 대량 수혈환자, 중증 감염증, 골수 장애성 혈소판 감소증, 특발성 혈소판 감소성 자반병(ITP), STE, 뱀에 물림(poisonous snake bite), 용혈성 요독증성 증후군, 비장 기능 항진증, 출혈, Barnard-Soulier 증후군, Glanzmann's 혈소판 무력증, 요독증, 항혈소판 항체, 골수 증식성 질환 등이 있다.

본 발명의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제의 투여는 한정되는 것은 아니지만, 일반적으로 비경구적으로 행하여지고, 예를 들면 정맥 내, 복강 내, 근육 내 등의 경로로 투여할 수 있다. 본 발명에서는 정맥 내 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제의 치료 또는 개선약으로서의 사용량은 그 사용 방법, 사용 목적 등에 따라 다르지만, 예를 들면, 인간 코필린의 단백질량으로서, 주사 투여하여 사용할 경우에는 예를 들면, 하루에 약 0.002 ㎍/kg∼20 mg/kg을 투여하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 하루에 약 0.2 ㎍/kg∼2 mg/kg이다.

본 발명의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제는 액체 또는 고체로서 조제할 수 있다.

본 발명의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제를 액체로서 조제하는 경우에는 코필린을 수성 용제(예를 들면, 증류수), 수용성 용제(예를 들면, 생리식염수, 링겔 액), 유성 용제(예를 들면, 참기름, 올리브유) 등의 용제에 용해하여, 관용적 방법에 의해 조제할 수 있다. 또 원하는 바에 따라 용해 보조제(예를 들면, 살리실산나트륨, 아세트산나트륨), 완충제(예를 들면, 구연산나트륨, 글리신), 등장화제(예를 들면, 포도당, 전화당), 안정제(예를 들면, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜), 보존제(예를 들면, 염화벤즈알코늄, 페놀), 무통화제(예를 들면, 벤질알코올, 염산프로카인) 등의 첨가제를 가할 수도 있다. 또, 상기 수용액에서의 pH는 약 3∼8, 더욱 바람직하게는 약 5∼7로 조정된다. 상기 pH 범위로 조정하기 위해서는 예를 들면 묽은 산(예를 들면, 희염산)이나 묽은 알칼리(예를 들면, 묽은 수산화나트륨, 묽은 탄산수소나트륨) 등을 첨가함으로써 행할 수 있다.

본 발명의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제를 제제화할 때, 코필린을 함유하는 액제에, 안정제로서 인간 혈청 알부민(HSA)을 배합하면, 용액 상태에서 pH 3∼8를 나타내도록 조정할 수 있다. 이와 같이 하면, 보존중 및 동결이나 동결 건조 조작에서의 코필린의 활성 저하가 적고, 또한 동결품에서는 그의 재용해 시 용해 상태가 투명하기 때문에 바람직하다. HSA로서는 어떠한 것이라도 좋지만, 본 조성물을 임상 응용하기 위해서는 비경구 투여에 이용할 정도의 품질을 갖는 것이 바람직하다. 예를 들면, 건강한 사람의 혈장을 원료로 하여 Cohn의 에탄올 분획 제6법에 의해서 분획 정제한 것이 이용된다. 또, 안정제로서, 아세틸트립토판나트륨이나, 카푸린산나트륨을 포함할 수도 있다. HSA는 각 성분을 수용액으로 한 경우에, 수용액 1 ㎖당 약 0.1 mg∼약 50 mg, 특히, 약 0.5 mg∼약 20 mg 함유시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제를 제제화할 때, 코필린을 함유하는 액제에, 상기 HSA에 추가하여, 예를 들면, 글리신, 글루탐산, 아스파라긴산, 알라닌, 프롤린 등의 아미노산, 특히 모노아미노 지방산 아미노산, 또는 환형 아미노산, 포도당, 맨노스(mannose) 등의 단당류, 솔비톨, 만니톨 등의 당 알코올류, 및 이들의 생리학적으로 허용되는 염, 및 이들의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물 중 1종 또는 2종 이상을 배합할 수도 있다. 상기 배합제는 예를 들면, 코필린을 수용액으로 한 경우에, 수용액 1 ㎖당, 단당류 또는 당 알코올류의 경우는 약 10∼100 mg, 아미노산의 경우는 약 5∼50 mg 배합하는 것이 바람직하다. 상기의 제제화 공정에서, 수용액을 용액 상태로 pH 약 3∼8, 바람직하게는 pH 약 5∼7을 나타내도록 조정한다. 글루탐산 등의 산성 아미노산을 배합하는 경우는 상기 물질을 상기 소정량 가함으로써, 소정의 pH로 조정할 수 있다. 또는, 원하는 바에 따라, 또는 상기 산성 아미노산을 배합하지않을 경우는 염산, 인산 등의 미네랄산, 또는 숙신산, 주석산, 구연산 등의 완충제를 사용하여 소정의 pH로 조정할 수 있다.

또, 본 발명의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제를 고체로서 조제하는 경우는, 예를 들면, 코필린을 동결함으로써 또는 동결 건조함으로써 조제할 수 있다. 특히, 취급이나 저장의 안정성 면에서 동결 건조하는 것이 바람직하다. 본 발명의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제를 동결함으로써 조제하기 위해서는 수용액으로서 조제한 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제를 원료로서 이용하고, 이것을 통상 약 -80℃∼-20℃에서 동결함으로써 제조할 수 있다. 상기 동결 조성물은 약 -80℃∼25℃, 바람직하게는 약 -80℃∼15℃, 더욱 바람직하게는 약 -80℃∼-10℃에서 보관된다. 본 발명의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제를 동결 건조함으로써 조제하기 위해서는, 예를 들면, 상기 동결 조성물을 통상의 방법에 의해 감압 건조하거나, 또는 상기 수용액 또는 상기 동결 조성물의 융해에 의해 얻어지는 수용액을, 원하는 바에 따라 소분하여, 전술한 바와 같이 동결한 후, 통상의 방법에 의해 감압 건조함으로써 제조할 수 있다.

본 발명에서는 경우에 따라, 고체(예를 들면, 분말상)의 코필린에 희석제(예를 들면, 증류수, 생리식염수, 포도당), 부형제[예를 들면, 카르복시메틸 셀룰로스(CMC), 알긴산나트륨], 보존제(예를 들면, 염화벤즈알코늄, 페놀), 무통화제(포도당, 벤질알코올, 염산프로카인) 등을 혼합할 수 있다.

전술한 고체의 제제를 동결 건조함으로써 조제할 경우에는 또한 그것을 이용하여 액제를 조제하기 때문에, 사용 시 적당한 용제에 용해하여 사용할 수 있다.보다 구체적으로는 전술한 고체의 제제를, 증류수 또는 생리식염수 등을 이용하여 용해하여 액제로 만들어 사용한다. 또, 원하는 바에 따라 상기의 단당류, 당 알코올류, 아미노산 등을 함유하는, pH 조정된 용해액으로 용해한 후에 사용할 수도 있다.

본 발명의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제를 액제로서 또는 동결에 의해 제조하는 경우는, 예를 들면, 코필린을 함유하는 수용액을 여과 등에 의하여 멸균하는 것이 바람직하다. 액제로서 제조하는 경우에는 이 수용액을 사용할 수 있고, 동결에 의해 제조하는 경우에는 이 수용액을 동결할 수 있다.

본 발명의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제를 동결 건조에 의해 제조하는 경우는, 예를 들면, 코필린을 함유하는 수용액을 여과 등에 의하여 멸균하거나, 이 수용액을 여과 등에 의하여 멸균한 후, 무균 조작에 의해 바이알병 등에 나누어 소분한 후 상기 동결 건조 처리를 하는 것이 바람직하다. 이 경우, 용기의 공간부를 진공으로 하거나, 질소 가스 치환함으로써, 상기 조성물의 안정성을 높일 수 있다. 또한, 아미노산이나 단당류 또는 당 알코올류를 함유하는 수용액으로, 동결 건조품을 용해하는 경우에는 그 수용액은 제균 여과하고, 무균 조작에 의해 앰플 등에 나누어 소분한 후, 통상의 방법에 의해 증기 멸균한 것을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 코필린을 유효 성분으로 하는 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제는 전술한 바와 같은 약리학적 효과를 발휘하는결과, 본 발명의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제는 또한 재생 의료에서 사용될 수도 있다.

본 발명의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제를 재생 의료에 있어서 사용하는 경우에는 본 발명의 증식 및/또는 분화 촉진제를 전술한 바와 같이 생체 내에 투여하거나, 또는 생체 외에서 배양액 중에 첨가한다. 본 발명의 증식 및/또는 분화 촉진제를 생체 외에서 사용하는 경우에는, 예를 들면, 이하의 방법에 따라 행할 수 있지만, 이외에도 상기 기술 분야에서 이미 알려진 방법을 이용하여 행할 수 있다. 먼저, 피험체로부터 상기 기술 분야에서 알려진 방법을 사용하여 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포를 채취하고, 이어서 이것을 본 발명의 증식 및/또는 분화 촉진제를 포함하는 배양액 속에서 배양하여 증식시킴으로써 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화를 촉진하고, 그 후 증식 및/또는 분화시킨 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포를 다시 피험체내에 이입(移入)한다.

본 발명의 증식 및/또는 분화 촉진제를 생체 외에서 사용하는 경우에는 배양액 중에서의 코필린 농도로서 1 ng/㎖∼100 ㎍/㎖, 바람직하게는 2.5 ng/㎖∼50 ㎍/㎖, 보다 바람직하게는 25 ng/㎖∼10 ㎍/㎖, 가장 바람직하게는 250 ng/㎖∼2.5 ㎍/㎖가 되도록, 본 발명의 증식 및/또는 분화 촉진제를 배양액 중에 첨가한다. 본 발명의 증식 및/또는 분화 촉진제 중에는 경우에 따라, 전술한 바와 같이 사이토카인을 추가로 첨가할 수 있다. 본 발명에서 추가하여 첨가하는 사이토카인으로는 줄기 세포 인자(SCF), flk-2/flt-3 리간드, 트롬보포이에틴(TPO) 또는 이들 중임의의 조합이 바람직하다.

[발명의 실시예]

(1) 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는 물질의 측정법

조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식의 측정법으로서, 세포계보 마커(Lineage marker)를 발현한 세포를 제거한 마우스 골수 세포와 샘플을 액체 배양한 후, 그 배양액 중에 존재하는 고증식능 콜로니 형성 세포(High Proliferative Potential Co1ony Forming Cell; HH-CFC)의 수를 측정하는 방법을 이용한다. HPP-CFC를 지표로 한 분석계는 조혈 줄기 세포의 연구에 널리 이용되고 있다. 예를 들면, 조혈 줄기 세포에 작용하는 줄기 세포 인자(SCF; Stem Cell Factor)는 HPP-CFC을 지표로 하여 정제된다.

(2) 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는 물질의 정제

조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는 물질의 정제는, 예를 들면, S6 세포의 무단백질 배양 상청(60O L) 및 세포를 출발 원료로 하여, 분자량 10000인 UF 막에 의해 분리하는 한외여과 농축(18 L) 후, 50% 황산암모늄 상청, 페닐-세파로오스(Amersham Pharmacia Biotech K.K.), 헤파린-세파로오스(Amersham Pharmacia Biotech K.K.), 킬레이트-세파로오스(Amersham Pharmacia Biotech K.K.), MonoS(Amersham Pharmacia Biotech K.K.), 겔 여과 등의 각 칼럼 크로마토그래피를 순차 조합함으로써 행할 수 있다. 단백질은 A280 nm, Lowry법에 의한 정량, SDS-PAGE에 의해 확인한다.

(3) 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는 물질의 구조 결정

조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는 물질의 구조 결정에는 단백질의 한정 분해로 생기는 복수의 펩티드 단편의 분자량 값, 및 그의 충돌 해리에 의해서 생기는 분자량 값에 의해서 단백질/핵산 서열 데이터 베이스를 검색하여, 원래의 단백질을 동정하는 방법을 이용한다. 이 방법은 질량 분석계나 질량 분석법의 발전에 따라 단백질이나 펩티드로부터, 그 분자량을 높은 정밀도로 측정할 수 있게 된 것, 게놈 프로젝트 등에 의해 대량의 단백질/핵산 서열 데이터가 축적된 것, 대량의 데이터를 고속으로 처리하는 컴퓨터 기술이 발전된 것을 기술적인 배경으로 하며, 1O ng 정도 이상의 미량의 시료를 간단한 조작으로 처리함으로써, 미지의 단백질을 신속하고도 확실하게 동정할 수 있는 이점를 가진다.

(4) HPP-CFC 활성의 측정 방법

HPP-CFC 활성의 측정은 조혈 줄기 세포를 특이적으로 취득할 목적으로 마우스에 항암제인 5-플루오로우라실을 투여한 마우스로부터 얻은 골수 세포로부터, 추가로 T 세포, B 세포, 과립구 및 대식세포의 마커 항원을 발현하고 있는 세포를 제거한 조혈 줄기 세포 분획에, 샘플 및 사이토카인을 첨가하여 액체 배양하고, 그 배양액의 일부를 콜로니 분석에 제공함으로써 형성되는 거대한 HPP-CFC 콜로니수를측정함으로써 행한다.

본 명세서에 있어서, 염기, 아미노산 등을 약호로 표시하는 경우, IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature에 의한 약호 또는 상기 분야에서의 관용 약호에 따른다.

명세서의 이하에 실시예를 기재한다. 이 실시예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 한정하는 것을 목적으로 하는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는 물질의 정제, 동정

(1) 인간 S6 세포의 조제

인간 S6 세포를 750 ㎠의 배양 면적을 가지는 롤러 보틀(Corning, 430851)에서 배양했다. 즉, 롤러 보틀당 1×10⁸세포를 심고, 10% 소 태아 혈청(FBS, Hyclone사)을 포함하는 F-12 배지(Flow Laboratories) 500 ㎖를 사용하여, 37℃, 0.5 rpm으로 72시간 배양했다. 72시간 배양 후, 배양 상청을 원심 조작에 의해 제거하여, 인산 완충화 염류 용액(Phosphate buffered saline: PBS, 日水製藥)으로 3회 세정했다. 세정 후, 원심 조작으로 상청을 제거한 세포 펠릿을 -20℃에서 동결보존했다.

(2) 마우스 골수 세포에 의한 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는 물질의 측정

조혈 줄기 세포를 특이적으로 취득할 목적으로 마우스에 항암제인 5-플루오로우라실(KYOWA HAKK0 KOGYO Co., Ltd)를 투여한 마우스로부터 얻은 골수 세포로부터, 추가로 T 세포, B 세포, 과립구 및 대식세포의 마커 항원을 발현하고 있는 세포를 제거한 조혈 줄기 세포에, 샘플 및 사이토카인을 첨가하여 액체 배양하고, 그 배양액의 일부를 콜로니 분석에 제공함으로써 형성되는 거대한 HPP-CFC 콜로니수를 측정함으로써, 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는 물질의 활성을 측정했다. 이하, 이 측정법을 HPP-CFC 활성 측정법이라 칭한다.

구체적으로는, 마우스 BDFI(암컷, 10∼15주령, 일본 찰스 리버로부터 구입)에 5-플루오로우라실(150 mg/kg, i.v.)(KYOWA HAKKO KOGYO Co., Ltd)를 투여하여, 2일 후에 대퇴골로부터 골수 세포를 채취했다. 채취한 골수 세포를 래트 항마우스 CD4 항체(CALTAG), CD8 항체(CALTAG), B220 항체(CEDERLANE), Gr-1 항체(CEDERLANE), Mac-1 항체(CALTAG)로 표지했다. 이들 래트 항체는 전부 IgG를 사용했다. 다음에 염소 항 래트 IgG 항체 표지 다이나 비즈(Dyna Beads)(DYNAL)를 반응시킨 후, 마그넷을 이용하여 다이나 비즈와 결합한 세포를 제거함으로써, 계보 마커(Lineage marker) 음성인 골수 세포(Lin^-BMCs)를 얻었다. Lin^-BMCs를 10% FCS(Invitrogen)첨가 αMEM 배지(Invitrogen)로 2.5×1O⁴cells/㎖가 되도록 조제했다. 이 세포 부유액에 마우스 IL-3(최종 농도 1O ng/㎖)(INTERGEN)를 첨가 후, 이세포 부유액을 24웰 플레이트(Corning)의 각 웰에 1 ㎖씩 가했다. 이어, 각 웰에 샘플을 첨가 후, 37℃, 5% CO₂의 조건 하에 CO₂인큐베이터 내에서 배양했다. 배양 6일째 및 10일째에, 각 웰 중의 배양액을 교반한 후, 그 중의 200 ㎕를 채취했다. 15 ㎖의 원심관 튜브에, 상기 채취한 배양액 200 ㎕와 FCS 1.5 ㎖(최종 농도 30%), BSA 0.5 ㎖(최종 농도 1%)(ICN), 2-ME 50 ㎕(최종 농도 1×10^-4M)(Wako Pure Chemical lndustries, Ltd.), αMEM으로 제작한 2.5% 메틸 셀룰로스 2 ㎖(최종 농도 1%)(Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.), 각 조혈 인자 50 ㎕[마우스 IL-3(INTERGEN), SCF(PeproTech), 인간 IL-6(PeproTech), G-CSF(CHUGAI PHARMACEUTICAL C0., LTD.), M-CSF(가부시키가이샤 미도리쥬지): 모두 최종 농도 10 ng/㎖], αMEM 0.5 ㎖를 혼화하여 전량이 5 ㎖로 되도록 했다. 그 후, 20분간 정치하여 거품을 빼고, 그 중 1 ㎖를 4매의 35 mm 부유 세포 배양용 접시(Corning)에 옮겼다. 9 cm 샬레에 2개의 35 mm 접시를 넣고, 추가로 증류수를 넣은 덮개 없는 35 mm 접시 1개를 넣어, 37℃, 5% CO₂의 조건 하에 CO₂인큐베이터 내에서 14일간 배양했다. 직경 2 mm 이상의 콜로니를 HPP-CFC로서 그 수를 측정했다.

(3) 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는 물질의 정제

PBS로 세정하여 동결 보존한 습윤 중량 269 g의 S6 세포에 20mM Tris/HC1 버퍼(pH 7.0)를 가하고, 4℃에서, Potter-Elvehjem형 테플론(등록상표) 호모지나이저(IWAKI GLASS C0., LTD.)로 파쇄했다. 세포 잔사를 원심분리(8000rpm, 20분)로써 제거한 상청에 대해 50% 포화가 되도록 황산암모늄(유안)을 첨가했다. 그의 상청을 2M 유안/20mM Tris/HC1 버퍼(pH 7.0)로 평형화한 페닐-세파로오스(Amersham Pharmacia Biotech K.K.)에 투입하고 충분히 세정한 후, 유안 농도를 1.5M, 1M, 0.5M, 0M으로 단계적으로 내림으로써 각 결합 분획을 용출했다. 본 인자, 즉 본 명세서에서 전술한 S6 인자는 주로 1M 유안/20mM Tris/HC1 버퍼(pH 7.0) 분획에 용출되어 있는 것을 상기 (2)에 기재된 HPP-CFC 활성 측정법과 동일한 방법에 의해 확인했다.

페닐-세파로오스로 얻어진 활성 분획을 0.6M NaC1/20mM Tris/HC1 버퍼(pH 7.0)에 대하여 충분히 투석한 후, 이 버퍼로 평형화한 헤파린-세파로오스 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech K.K.)에 투입하고 세정 후, 2M NaC1/20mM Tris/HCl 버퍼(pH 7.0)로 각 결합 분획을 용출했다. 이 헤파린 용출 분획을 20mM Tris/HCl 버퍼(pH 7.0)로 4배 희석하고, 0.5M NaC1/20mM Tris/HC1 버퍼(pH 7.0)로 평형화한 구리(Cu) 킬레이트-세파로오스 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech K.K.)에 흡착시키고, 0.5M 및 0.3M NaCl/20mM 인산나트륨 버퍼(pH 6.8)의 2단계로 세정함으로써 버퍼 치환을 행했다.

결합 분획은 0.lM 이미다졸/0.3M NaCl/20mM 인산나트륨 버퍼(pH 6.8)에 의해 용출시키고, 그대로 0.4M NaC1/20mM 인산나트륨 버퍼(pH 6.8)로 평형화한 MonoS 이온 교환 칼럼에 걸어 유속 0.7 ㎖/분으로 0.4∼2M의 NaC1 그레디언트 용출을 행하고, 용출액에는 최종 농도 0.1%가 되도록 계면활성제 CHAPS를 첨가하여 보존했다. HPR-CFC 활성은 분획 47∼50에서 확인되었지만, 이들 분획 중에는 목적으로 하는S6 인자와 함께, 염기성 FGF가 공존하는 것이 ELlSA로 확인되었다. 여기서 MonoS 활성 분획을 전반(前半) 분획(분획 47, 48)과 후반 분획(분획 49, 50)의 2 분획으로 나눠, 헤파린 칼럼에서의 그레디언트 크로마토그래피에 의해 염기성 FGF와의 분리를 시도했다. 0.4M NaC1/20mM 인산나트륨 버퍼(pH 6.8)/0.1% CHAPS로 평형화한 헤파린-세파로오스 칼럼에 건 다음, 유속 0.7 ㎖/분으로 0.4∼4M의 NaC1 그레디언트 용출을 행했다.

MonoS 활성 전반 분획으로부터는 분획 30∼32에서 활성이 확인되었지만, 여기에는 염기성 FGF가 존재하는 것이 ELISA로 확인되어, 본 활성은 염기성 FGF 유래인 것이 밝혀졌다.

한편, MonoS 후반 분획은 분획 30∼32(염기성 FGF 분획) 이외에, ELISA로 염기성 FGF가 검출되지 않는 분획 22, 23에서 HPP-CFC 활성이 확인되었다. 활성 분획 부근의 각 분획에 대해, 도즈 분석(dose assay) 및 염기성 FGF l ng/㎖ 첨가한 계에서의 분석을 행했다. 활성은 분획 22, 23에서 용량 의존적으로 확인되고, 액체 배양 6일째보다 10일째 쪽이 높은 HPP-CFC 콜로니 형성 촉진 활성을 나타내었다. 또, 염기성 FGF 첨가 분석계에서도 분획 22, 23에서 염기성 FGF 단독의 총활성(full activity)을 넘는 HPP-CFC 활성이 확인되었다.

또한, 활성을 재확인하기 위해서 헤파린 칼럼에서 그레디언트 구배를 바꾸고 크로마토그래피를 다시 행했다. 0.3M NaC1/20mM 인산나트륨 버퍼(pH 6.8)/0.1% CHAPS로 평형화한 헤파린-세파로오스 칼럼에 건 후, 0.3∼2M의 NaC1과 그레디언트 구배를 완만히 하여 용출을 행했다. HPP-CFC 활성은 분획 25∼27에서 확인되어,이 분획 중에는 염기성 FGF가 존재하지 않는 것을 ELISA법으로 확인했다. 활성 분획인 분획 26에서 용량 의존적으로 활성이 확인되고, 염기성 FGF 첨가 분석계에서도 염기성 FGF 단독에서의 완전한 활성을 넘는 HPP-CFC 활성이 확인되었다. 또, 활성 분획 중에는 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동 분석(겔 농도: 0∼20% 그레디언트)에 의해 20 kDa의 밴드가 확인되었다.

이상의 각 스텝에 의해, SDS-폴리아크릴아미드 전기영동 분석에서 20 kDa의 밴드를 나타내는 분획이 S6 세포 l20 L에서 약 0.4 ㎖ 얻어지고, 이 분획은 HPP-CFC 활성이 확인된 것이기 때문에, 본 분획에서 관찰된 20 kDa 밴드는 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는 물질인 것이 명백해졌다.

(4) 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는 물질의 성질

본 발명에서의 인자는 하기의 성질을 가진다.

1. 분자량: 약 20 kDa(SDS-PAGE)

SDS-폴리아크릴아미드 전기영동 분석에서 20 kDa 부근에 하나의 밴드로서 검출되고, 환원, 비환원 조건에 의한 이동도의 차이는 없다. 따라서 분자간 디설파이드 결합을 갖지 않는다.

2. 등전점: 8.1±0.5

AFB Multiphor II(Amersham Pharmacia Biotech K.K.)를 사용한 2차원 전기영동 분석에서, 상기 범위에 스폿으로서 검출된다.

(5) 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는 물질의 구조 결정

본 인자에 관해 이하의 순서에 따라 구조 결정을 시도했다.

MS 및 MS/MS 측정을 위한 샘플 조제

본 인자로 판단된 20 kDa 밴드를 포함하는 정제 분획을, 12.5% 아크릴아미드 겔에 의해 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동 분석 후, 0.1% CBB/40% MeOH/1% Ac0H로 염색했다. 20 kDa 밴드를 검출 후, 그 밴드를 잘라 내고, 40% MeOH/1% AcOH로 탈색했다. 탈색한 겔을 10mM DTT/10OmM NH₄HCO₃pH 8.7 중에서 침투하여, 56℃, 1시간 배양 후, 55mM 요오도아세트아미드를 첨가하여, 암실에서 45분간 배양함으로써, 본 인자의 환원 알킬화를 행했다. 과잉의 환원제나 알킬화제를 겔로부터 제거 후, 150ng 트립신(Promega)/5mM CaC1₂/50mM NH₄HCO₃을 첨가하여, 겔 내 트립신 소화를 37℃, 18시간 행했다. 반응 종료 후, 펩티드 단편 혼합물을 추출하여, 스피드 백(SPEED BACK)(Savant)으로 건조시켰다. 0.05% TFA로 용해한 펩티드 단편 혼합물을 0.05% TFA로 평형화한 PorosR2(Perseptive Co., Ltd.)에 제공하고, 50% MeOH/0.2% FA로 용출시킴으로써 탈염했다. 탈염된 펩티드 단편 혼합물을 질량 분석(MS) 및 탠덤 질량분석(MS/MS) 측정을 위한 샘플(조제된 펩티드 단편 화합물)로 이용했다. 음성 대조로서, 샘플 버퍼만으로 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동 분석을 행한 레인 중 20 kDa 밴드가 검출되는 것으로 생각되는 부위를 잘라 내고, 본 인자의 경우와 같이 조제했다. 기술한 이외의 상세한 조작은 Wilm 등의 방법에 따라서 행했다(Wilm, M., Shevchenko, A., Houthaeve, T., Breit, S., Schweigerer, L., Fotsis, T. 및 Mann, M. Nature 379, 466-469, 1996).

MS 및 MS/MS 분석에 의한 구조 결정

본 인자의 구조 결정에는 4중극(quadrupole) 직교 가속 비행시간형 질량분석계인 Q-TOF(Micromass Inc.사)를 이용하여, MS 및 MS/MS 측정을 조작 지시서에 따라서 행했다. 우선 조제된 펩티드 단편 혼합물과 음성 대조에 대해, 각각 MS에 의해 mz 100∼1500의 범위를 측정했다. 펩티드의 지표가 되는 다가(多價) 분자 이온에 대해 양자로 비교하고, 조제된 펩티드 단편 혼합물에서 유의적으로 검출된 2가 분자 이온을 3개 확인했다(표 1).

표 1: MS 및 MS/MS 분석으로 얻어진 주된 이온

분자 이온 번호: 1

분자 이온: 583.82(2가)

분자 이온 번호: 2

분자 이온: 669.39(2가)

프로덕트 이온(y ion): 712.43, 827.45, 990.51, 1103.60, 1174.66

프로덕트이온(i ion): 86.08, 136.07

분자 이온 번호: 3

분자 이온: 670.9(2가)

다음에 이들 3개의 2가 분자 이온을 개별적으로 선택하여, MS/MS를 측정했다. 그 결과, 얻어진 주된 프로덕트 이온의 정보를 기초로, 인터넷 상에 공개되어있는 데이터 베이스 검색 프로그램 중 하나인 ProteinProspector(http://prospector.ucsf.edu/mshome3.2.htm)를 이용하여 검색한 바, 저분자량 액틴 조절 단백질로서 잘 알려진 인간 비근형 코필린(AC: P23528, pI 8.22, 166aa)이 히트(hit)했다. 본 인자는 인간 비근형 코필린과 분자량, 등전점 등의 거동이 유사하다.

그러나, 이러한 분석만으로, 본 인자가 인간 비근형 코필린이라고 하는 것을 확정하는 것은 곤란하다. 따라서, 표 1에 기술한 정보와 인간 비근형 코필린의 정합성(整合性)을 보다 엄밀하게 조사하기 위해서, 얻어진 정보로부터 추측되는 펩티드(표 2)를 합성하여 충돌 해리 스펙트럼을 측정함으로써 검증했다. 그 결과, 얻어진 정보 모두가 표 1에 기재된 정보와 합치했다. 특기할 점으로서, 얻어진 정보에는 표 2 기재의 N 말단이나 C 말단을 포함하는 펩티드에 관한 정보가 포함되어 있고, 본 인자의 N 말단과 C 말단이 인간 비근형 코필린과 동일한 것을 특정할 수 있었다. 이상의 결과로부터, 본 인자는 번역 시작의 메티오닌이 제거되어, 그것에 계속되는 알라닌이 아세틸화되고, 그것에 계속되는 세린이 인산화되지 않는(액틴 조절이라는 관점에서는 활성형의) 인간 비근형 코필린이라고 동정되었다(도 1).

표 2: 데이터 베이스 검색으로 추측된 부분 아미노산 서열

분자 이온 번호: 1의 정보에 의해 추측된 N 말단을 포함하는 펩티드

(AcetN)ASGVAVSDGVIK + Na 부가

분자 이온 번호: 2의 정보에 의해 추측된 펩티드

YALYDATYETK

분자 이온 번호: 3의 정보에 의해 추측된 C 말단을 포함하는 펩티드

LGGSAVISLEGKPL

실시예 2: 코필린의 조제

(1) 인간 S6 세포주 유래의 cDNA 라이브러리의 제작

무혈청 배지 F12(Invitrogen)를 넣은 롤러 보틀에서 4일간 배양한 S6 세포(1.2×10⁸세포)로부터, FastTrack mRNA Isolation Kit(Invitrogen사)를 이용하여, 37 ㎍㎖의 S6 세포-polyA RNA를 조제했다. 그 5 ㎍의 S6 세포-po1yA RNA로부터, TimeSaver cDNA Synthesis Kit(Amersham Pharmacia Biotech K.K.)와 Directional C1oning Toolbox(Amersham Pharmacia Biotech K.K.)를 이용하여, EcoRI(Takara Shuzo Co., Ltd.) 제한효소 부위와 NotI(Takara Shuzo Co., Ltd.) 제한효소 부위를 양측에 가진 cDNA를 조제했다.

다음에, cDNA를 λ 파지 클로닝 벡터 λExCell NotI/EcoRI/CIP(Amersham Pharmacia Biotech K.K.)에 삽입하여, GigaPack III Gold Packaging Extract(Stratagene)를 이용하여, 시험관 내 패키징을 행했다. 대장균 NM522(Stratagene)을 숙주로 하여 플라크수를 한천 배지 상에서 헤아려 역가를 측정하였더니 1.37×10⁶pfu였다. 또한, 대장균 NM522을 숙주로 하여, 라이브러리 증폭을 행하고, 6.9×1O¹⁰pfu/㎖의 S6 세포 cDNA 라이브러리를 얻었다. S6 세포 cDNA 라이브러리의 평균 삽입 사이즈는 1.0 kb였다.

(2) PCR 에 의한 인간 비근형 코필린 cDNA의 전장(全長) 클로닝

태반 유래 인간 비근형 코필린의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열(AC: DO0682, 501 bp)을 기초로 각각 올리고머 SKO13(도 2의 1∼26에 대응, 프라이머 SKO13: SEQ ID NO: 3) 및 SKO14(도 2의 476∼501에 대응, 프라이머 SK014: SEQ ID N0: 4)를 합성했다:

프라이머 SKO13 5'-ATGGCCTCCGGTGTGGCTGTCTCTGA-3'(SEQ ID NO: 3);

프라이머 SKO14 5'-TCACAAAGGCTTGCCCTCCAGGGAGA-3'(SEQ ID NO: 4).

인간 비근형 코필린 cDNA는 상기 S6 세포 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, 프라이머 SK013(SEQ ID N0: 3) 및 프라이머 SK014(SEQ lD N0: 4)를 프라이머로 하고, Advantage 2 polymerase(CLONTECH사)를 이용하여, PCR에 의해 증폭했다. 이 증폭 산물을 Zero Blunt TOPO PCR C1oning Kit(인비트로젠사)를 이용하여, pCR-Blunt II-TOP0 벡터에 서브클로닝하여, 약 500 염기쌍의 DNA 단편을 가지는 양성(陽性) 클론을 얻었다. 양성 클론에 대해, BigDye Terminater Cycle Kit(Applied Biosystems사)를 이용하여, ABl RRlSM 310(Applied Biosystems사)에 의해 염기 서열 분석을 행한 결과, 501 염기쌍의 비근형 코필린 cDNA 전장의 취득을 확인했다. 또, 태반 유래 인간 비근형 코필린 cDNA의 염기 서열과 비교하여, S6 세포 유래의 것은 2염기에서 상이했지만, 모두 아미노산의 변이를 수반하지 않았다(도 3).

(3) 인간 비근형 코필린 cDNA의 발현 벡터의 제작

비근형 코필린 cDNA 클론과 pKDEMSS 벡터(Kitano K, Fukuda Y, Nagahira K, Nasu T, Izumi R, Kawashima K, Nakanish T; Immuno1. Lett. 47, 215-222, 1995) 유래 pDE 벡터를, EcoRI로 소화 후, 알칼리인산 가수분해 효소(Takara Shuzo Co.,Ltd.)에 의해 탈인산화했다. 그 후, 비근형 코필린 cDNA를 포함하는 EcoRI 단편과 pDE 벡터 DNA 단편을 아가로오스겔 전기영동 후, DNA를 포함하는 겔을 잘라 내어, CONCERT Rapid Gel Extraction System(Invitrogen)에 의해 정제했다. DNA Ligation Kit(Takara Shuzo Co., Ltd.)를 이용하여, 비근형 코필린 cDNA 단편을 pDE 벡터 DNA 단편에 삽입하고, 대장균 JM109(Toyobo Co., Ltd.)를 형질전환함으로써 인간 비근형 코필린 cDNA의 발현 벡터를 조제했다. 또, 발현 벡터에 삽입된 인간 비근형 코필린 cDNA가 발현용 프로모터에 대하여 순방향인 것을 제한효소에 의해 확인했다.

(4) 인간 비근형 코필린의 C0S-1 세포에서의 발현

재조합형 인간 비근형 코필린을 이하의 순서에 의해 발현시키고, 그 발현을 확인했다.

인간 비근형 코필린의 COS-1 세포에서의 발현

인간 비근형 코필린 cDNA 발현 벡터를 이용하여, 인간 비근형 코필린을 동물세포로 발현시키고, 발현된 단백질에 HPP-CFC 활성이 있는지 여부를 검토했다. 발현용 동물 세포로서 COS-1 세포(理化學硏究所에서 구입)를 이용하여, 리포펙틴법에 의해 인간 비근형 코필린 cDNA 발현 벡터를 트렌스펙션했다. 즉, 직경 10 cm의 배양용 디쉬(Corning, 430167)에 C0S-1 세포를 I×10⁶세포 심었다. 배지는 10% 소 태아 혈청을 포함하는 Dulbecco의 최소 필수 배지(DMEM, NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.)를 이용했다. 다음 날, Opti-MEM I 배지(Invitrogen) 5 ㎖로 세포를 l회 세정한 후, 5 ㎖의 Opti-MEM I 배지를 가하고, 37℃에서 2시간 배양했다. 2시간 배양 후, 디쉬 1매당 실시예 2(3)에서 제작한 발현 플러스미드 1 ㎖ 및 리포펙틴(Invitrogen) 10 ㎖의 혼합액을 가하고, 또한 37℃에서 5시간 배양했다. 배양 후, 0pti-MEM 배지를 5 ㎖ 가하고, 합계 10 ㎖로 만들어, 5% C0₂존재 하, 37℃에서 72시간 배양했다. 72시간 배양 후, 원심 조작에 의해 배양 상청을 회수했다. 음성 대조로서, 인간 비근형 코필린을 삽입하지 않은 원래의 발현 벡터를 이용하여 동일하게 조제했다.

분비형의 재조합형 인간 비근형 코필린의 검출

배양 상청에 대해 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동 분석한 바, 인간 비근형 코필린 cDNA 발현 벡터를 트렌스펙션한 배양 상청에는 재조합형 인간 비근형 코필린이라고 생각되는 20 kDa의 밴드가 유의적으로 확인되었다. 이 20 kDa의 밴드는 웨스턴 블롯 분석으로, 래빗 항인간 비근형 코필린 펩티드(13∼22) 폴리클로날 항체(Cytoskeleton사)와 특이적으로 반응했다. 따라서, 재조합형 인간 비근형 코필린이 분비되는 것이 확인되었다. 웨스턴 블롯 분석 및 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동 분석에 의해, 분비형의 재조합형 인간 비근형 코필린의 발현량은 1 ㎖당 2.5 ㎖인 것을 확인했다.

분비형의 천연형 인간 비근형 코필린의 검출

인간 비근형 코필린을 삽입하지 않은 발현 벡터(pDE 벡터)를 트렌스펙션한 배양 상청을 10% 트리클로로아세트산에 의해 침전 후, 100배량 이용하여, 동일하게웨스턴 블롯 분석한 경우, 천연형 인간 비근형 코필린이 미약한 밴드를 검출했다. 이상의 결과로부터, 종래 세포 내에만 존재하고 있다고 생각되었던 비근형 코필린이 분비형으로서도 소량이지만 존재하는 것이 밝혀졌다.

실시예 3: 재조합형 인간 비근형 코필린의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는 물질로서의 활성 확인

COS-I 세포에서 발현된 분비형의 재조합형 인간 비근형 코필린이, 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는 물질인지 여부를 평가하기 위해, 배양 상청에 대해, HPP-CFC 검정/정량을 행했다.

마우스 BDFI(암컷, 10∼I5주령, 일본 찰스 리버로부터 구입)에 항암제인 5-플루오로우라실을 (150 mg/kg, i.v.)(KYOWA HAKK0 K0GY0 Co., Ltd.)를 투여한 후, 2일 후의 마우스의 대퇴골로부터 골수 세포를 채취했다. 채취한 골수 세포를 래트 항마우스 CD4 항체(CALTAG), CD8 항체(CALTAG), B220 항체(CEDERLANE), Gr-1 항체(CEDERLANE), Mac-1 항체(CALTAG)로 표지했다. 이들 래트 항체는 전부 IgG를 사용했다. 다음에 염소 항래트 IgG 항체 표지 다이나 비즈(DYNAL)를 반응시킨 후, 마그넷을 이용하여 다이나 비즈와 결합한 세포를 제거함으로써, 계보 마커(Lineage marker) 음성인 골수 세포(Lin^-BMCs)를 얻었다. 이것을, 조혈 줄기 세포 분획으로서 HPP-CPC 분석에 이용했다.

얻어진 조혈 줄기 세포 분획을, 10% FCS 첨가 αMEM 배지에서 2.5×10⁴세포/㎖로 조제했다. 이 세포 부유액에 마우스 IL-3(최종 농도 10 ng/㎖)을 첨가후, 24웰 배양 플레이트(Corning)의 각각의 웰 중에 1 ㎖ 씩 파종하고, 또한 각 웰에 샘플인 실시예 2에서 조제한 배양 상청 또는 사이토카인을 첨가하여 액체 배양하고, 그 배양액의 일부를 콜로니 분석에 제공하여 형성되는 거대한 HPP-CFC 콜로니수를 측정함으로써 HPP-CFC 활성의 측정을 행한다.

도 4에서, Cofilin 1, 2, 3, 4는 각각, 10배로 농축한 코필린 배양 상청을 ×1, ×10, ×100, ×1000배로 희석한 것을 나타낸다. 따라서, 실시예 2에서 분비형의 재조합형 인간 비근형 코필린의 발현량이 1 ㎖당 2.5 ㎍인 것으로부터, αMEM 배지에 대하여 1/10량의 배양 상청을 첨가한 배양액 속에서는 재조합형 인간 코필린 농도로서 Cofilin 1은 2500 ng/㎖, Cofilin 2는 250 ng/㎖, Cofilin 3은 25 ng/㎖, Cofilin 4는 2.5 ng/㎖이 포함된다. C1, C2는 배양 상청 샘플과 동량의 PBS를 첨가한 웰이다. SCF1, 5, 10은 각각, 배양액 중에 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 1O ng/㎖의 SCF가 포함되는 것을 나타낸다. 데이터는 액체 배양 6일째와 10일째의 각 웰의 배양액 200 ㎕ 중의 HPP-CFC 콜로니수를 나타낸다. Input은 배양 전의 세포 부유액 200 ㎕ 중의 HPP-CFC 콜로니수를 나타낸다.

재조합형 인간 비근형 코필린은 음성 대조에 비하여, 액체 배양 6일째보다 10일째에서 활성 상승 경향을 나타내는 본 인자 특유의 HPP-CFC 활성을, 유의적으로 농도 의존적으로 나타냈다(도 4). 활성이 확인된 농도는 코필린으로서 약 25 ng/㎖(도면에서 Cofilin 3으로 표기)이고, SCF 1 ng/㎖(도면에서 SCF 1으로 표기)와 동등했다. 음성 대조의 배양 상청에 분비형의 천연형 인간 비근형 코필린이 확인됨으로써, HPP-CFC 활성에 약간 관여하고 있음이 시사되었다(도 4).

이상의 과정을 거쳐서, 본 발명자들은 저분자량 액틴 조절 단백질로서 잘 알려진 인간 비근형 코필린이, 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는 물질로서 작용하는 것을 발견했다.

실시예 4: 재조합형 인간 비근형 코필린의 인간 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포(CD34 양성 세포)의 증식 촉진 활성의 검토

재조합형 인간 비근형 코필린이, 인간 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 촉진 활성을 가지는지 여부를, 실시예 2에서 조제한 재조합형 인간 비근형 코필린 함유 COS-1 세포 배양 상청을 인간 조혈 줄기 세포 배양중에 첨가함으로써 검토했다.

인간 제대혈에 실리카겔 현탁액을 10%(V/V)가 되도록 가하고 완만하게 교반하고 37℃에서 약 1시간 정치했다. 비중 1.077의 lymphoprep(NYCOMED사)에 넣어 합친 후, 1600 rpm에서 30분간의 비중 원심에 의해 단핵구(單核球) 분획을 얻었다. 이어서, Direct CD34 Progenitor Cel1 Isolation Kit 및 Auto-MACS(Miltenyi Biotec사)를 이용하여 CD34 양성 세포를 취득했다. 이렇게 하여 얻어진 CD34 양성 세포를, 20% FCS(CCT사) 및 1% BSA(SIGMA사) 첨가 αMEM(GIBCO사) 배지에서 1×10⁴cells/㎖로 조제하여, 12웰 배양 플레이트(Falcon사)에 웰당 1 ㎖씩 가했다.

이와 같이 조제한 배양 플레이트 중에, SCF + FL군에 대해서는 인간 SCF(100 ng/㎖, R&D사) 및 인간 Flt-3 리간드(FMS-like tyrosine kinase 3 Ligand, FL)(100 ng/㎖, R&D사)를, SCF + FL + 코필린군에 대해서는 인간 SCF(100 ng/㎖, R&D사) 및인간 FL(100 ng/㎖, R&D사) 및 실시예 2에서 조제한 재조합형 인간 비근형 코필린 함유 COS-1 세포 배양 상청을 10배 농축하여 그 100 ㎕를 첨가하고, 그 후, CO₂인큐베이터에서 37℃에서 배양했다. PBS군(대조군)에는 전술한 SCF, FL, 또는 코필린 대신 동량의 PBS만을 첨가했다. 배양 3일, 5일, 7일, 9일, 12일 및 14일째에, 혈구 계산판을 이용하여 현미경 하에서 세포수를 측정했다. 결과를 배양 개시 시의 초기 세포수에 대한 증식 배율로 표시하고, 그것을 도 5에 나타내었다.

그 결과, 인간 비근형 코필린은 SCF + FL과의 공존에 의해, 인간 제대혈 유래 CD34 양성 세포를 시간이 지남에 따라 증식시키고, SCF + FL만을 첨가한 경우에 비해 현저한 증식 활성을 나타내는 것이 밝혀졌다. 구체적으로는 배양 14일째의 시점에서 초기 세포수의 약 90배까지 증식했다(도 5).

실시예 5: 재조합형 인간 비근형 코필린의 인간 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및 분화 촉진 활성의 검토

재조합형 인간 비근형 코필린이 인간 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는지 여부를, 실시예 2에서 조제한 재조합형 인간 비근형 코필린 함유 COS-1 세포 배양 상청을 이용하여, 각종 콜로니 형성능을 지표로 하여 검토했다.

먼저, 인간 제대혈 유래 CD34 양성 세포를 실시예 4에 기재한 바와 같이 2.5×10⁴cells/㎖로 조제하고, 12웰 배양 플레이트에 웰당 1 ㎖씩 가했다. 실시예 2에서 조제한 재조합형 인간 비근형 코필린 함유 COS-1 세포 배양 상청을 10배 농축하고 그 중 100 ㎕, 인간 SCF(100 ng/㎖), 인간 FL(100 ng/㎖) 및/또는 인간 TPO(100 ng/㎖, R&D사)를 여러 가지 조합으로 첨가하여 7일간 배양 후, 세포수를 측정했다. 세포수의 측정은 혈구 계산판을 이용하여 현미경 하에서 행했다. 결과를 배양 개시 시의 초기 세포수에 대한 증식 배율로 표시하고, 그것을 도 6a에 나타내었다. 여기에서, "T/C"군은 인간 TP0(100 ng/㎖, R&D사) 및 전술한 코필린 함유 배양 상청을 함유하는 조건; "S/F/C"군은 인간 SCF(100 ng/㎖), 인간 FL(100 ng/㎖) 및 전술한 코필린 함유 배양 상청을 함유하는 조건; "S/F/T"군은 인간 SCF(1O0 ng/㎖), 인간 FL(1O0 ng/㎖) 및 인간 TPO(100 ng/㎖, R&D사)를 함유하는 조건; "S/F"군은 인간 SCF(100 ng/㎖) 및 인간 FL(100 ng/㎖)을 함유하는 조건; "C"군은 전술한 코필린 함유 배양 상청을 함유하는 조건; "T"군은 인간 TPO(100 ng/㎖, R & D 사)를 함유하는 조건을 기초로 각각 배양한 것을 나타낸다. "PBS"군은 PBS 만을 첨가한 조건을 기초로 배양한 것을 나타낸다.

그 결과, 인간 비근형 코필린은 SCF 및 FL과의 공존(즉 S/F/C군)에 의해, 인간 제대혈 유래 CD34 양성 세포를 현저하게 증식시키고, S/F군의 경우의 약 6배, S/F/T군의 경우의 약 2배의 증식 활성을 나타내고, 배양 7일째에서는 "Input"(배양 전의 세포 현탁액 200 ㎕ 중의 콜로니수)의 약 58배까지 증식했다(도 6a).

이어, 전술한 (1)에서 7일간 배양한 인간 제대혈 유래 CD34 양성 세포 현탁액의 일부(100 ㎕)를 채취하여, 메틸 셀룰로스법에 의한 콜로니 형성 분석에 제공했다.

메틸 셀룰로스법에 의한 콜로니 형성 분석은 이하와 같이 행한다. 즉,αMEM을 기초 배지로 하고, 2.2% 메틸셀룰로스(信越化學), 30% FCS, 1% BSA, 5×10^-5M 2ME(和光純藥), SCF(100 ng/㎖), IL-3(20 ng/㎖), TPO(1O ng/㎖ R&D사), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF; 10 ng/㎖, 中外製藥), 에리스로포이에틴(EPO; 2 U/㎖, 麒麟麥酒))을 첨가한 반고형 배지 속에서 37℃, 5% CO₂의 조건 하에 2주간 배양하여 각종 콜로니를 형성시켰다.

각종 콜로니 중, 과립구·대식세포계 전구 세포(Colony-forming unit Granulocyte, Macrophage, CFU-GM) 콜로니, 적아세포계 전구 세포인 적아세포 버스트 형성 세포(Burst-forming unit erythroid, BFU-E) 콜로니 및 골수계 다능성 줄기 세포(Co1ony-forming unit mixed, CFU-Mix) 콜로니의 동정 및 콜로니수의 측정을 도립(倒立) 현미경 하에서 시각적 관찰에 따라 행했다. 작은 세포가 조밀하게 모인 과립구 집괴(集塊)와, 보다 큰 세포에 의한 굵은 대식세포 집괴로 이루어지는 세포 집괴를 CFU-GM으로 하고, 또한 헤모글로빈 합성에 의해 적색을 나타낸 세포로 이루어지는 큰 집괴를 BFU-E로 하여 판별했다. 판별 곤란한 집괴나 전형적인 콜로니의 형태을 이루고 있지 않은 집괴에 관해서는 사이토스핀 표본(cytospun sample)을 제작한 후, Giemsa 염색에 의해 판정했다. 그리고, CFU-GM은 50개 이상의 세포 집괴를, BFU-E는 500개 이상의 세포 집괴를 각각 콜로니로서 계측하여, BFU-E와 다른 계통의 세포 50개 이상을 포함하는 콜로니를 CFU-Mix 콜로니로서 계측했다. 결과를 배양 개시 시의 초기 세포수에 대한 증식 배율로 표시하고, CFU-GM 콜로니, BFU-E 콜로니 및 CFU-Mix 콜로니에 대한 결과를 각각 도 6b∼6d에 나타내었다.

인간 비근형 코필린과 SCF 및 FL과의 공존에 의해(즉 S/F/C군) 인간 제대혈 유래 CD34 양성 세포를 증식시킨 후에 콜로니 형성 분석에 제공한 바, CFU-GM, BFU-E 및 CFU-Mix의 콜로니수가 "Input"(배양 전의 세포 현탁액 200 ㎕ 중의 콜로니수)의 각각 약 4배, 약 6배 및 약 8배까지 증폭되었다(도 6b, 6c, 6d). 특히, BFU-E 및 CFU-Mix에 관해서는 다른 어느 사이토카인의 조합보다도 현저하게 콜로니수를 증폭시켰다.

실시예 6: 재조합형 인간 비근형 코필린의 인간 거핵구계 전구 세포의 증식 및 분화 촉진 활성의 검토

재조합형 인간 비근형 코필린이, 인간 거핵구계 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는지 여부를, 실시예 2에서 조제한 재조합형 인간 비근형 코필린 함유 COS-1 세포 배양 상청을 이용하여, 거핵구 전구 세포(Co1ony-forming unit megakaryocyte, CFU-Mk)의 콜로니 형성능을 지표로 하여 검토했다.

먼저, 실시예 4에 기재한 바와 같이 인간 제대혈 유래 CD34 양성 세포를 2.5×10⁴cells/㎖로 조제하여, 12웰 배양 플레이트에 웰당 1 ㎖씩 가했다. 실시예 2에서 조제한 재조합형 인간 비근형 코필린 함유 COS-1 세포 배양 상청을 10배 농축하고, 그 중 10O ㎕, 인간 SCF(1O0 ng/㎖), 인간 FL(100 ng/㎖) 및 인간 TPO(100 ng/㎖, R&D사)를, 실시예 5에 기재한 조합, 즉 T/C군, S/F/C군, S/F/T군, S/F군, C군, 및 T군의 조건으로 첨가하여, 7일간 배양했다. "PBS"군은 PBS만을 첨가한 조건을 기초로 배양한 것을 나타낸다.

이어서, 7일간 배양한 인간 제대혈 유래 CD34 양성 세포의 현탁액의 일부를 채취하여 MegaCult-C(Stem Cell Techno1ogies사)를 이용하여, CFU-Mk 콜로니를 형성시키고, 거핵구의 동정 및 콜로니수를 측정을 했다. 즉, 세포 현탁액의 일부(100 ng)를 콜라겐 겔(IL-3, IL-6 및 TPO 함유)에 가하고 교반 후, 배양용 슬라이드 챔버에 옮겨 12∼14일간 배양하여 CFU-Mk 콜로니를 형성시켰다. 슬라이드 상의 세포를 메탄올/아세톤 용액으로 고정한 후, 항 GP(Glycoprotein) IIb/IIIa(인간 거핵구의 마커) 항체에 의한 면역 염색 및 에번스 블루(Evans Blue)에 의한 세포핵 염색으로 거핵구를 검출했다. 본 실시예에서는 현미경 하에서 관찰했을 때에, 20개 이상의 거핵구로 이루어지는 세포 집괴를 CFU-Mk 콜로니로서 계측했다. 결과를 배양 개시 시의 초기 세포수에 대한 증식 배율로 표시하고, 그것을 도 7에 나타내었다.

인간 비근형 코필린은 SCF 및 FL의 공존에 의해 인간 제대혈 유래 CD34 양성 세포를 증식시키고, 이어서 콜로니 형성 분석에 제공한 바, CFU-Mk의 콜로니수를 "Input"(배양 전의 세포 현탁액 200 ㎕중의 콜로니수)의 약 4배까지 증폭시켰다(도 7). 또한, 다른 사이토카인의 조합에서의 증폭은 대략 Input과 동일한 정도였다.

실시예 7: 재조합형 인간 비근형 코필린의 인간 거핵구세포 돌기(Proplatelet) 형성 활성의 검토

재조합형 인간 비근형 코필린이, 인간 거핵구세포 돌기(Proplatelet) 형성 활성을 가지는지 여부를, 실시예 2에서 조제한 재조합형 인간 비근형 코필린 함유 COS-1 세포 배양 상청을 이용하여, 형태학적으로 검토했다.

인간 제대혈 유래 CD34 양성 세포를, 1% BSA, GIBC0 서플리먼트(인슐린 10 ㎍/㎖, 트랜스페린 5.5 ㎍/㎖, 에탄올아민 2 mg/㎖, 아(亞)셀렌산 6.7 mg/㎖) 첨가 αMEM에서 5×10⁴cel1s/㎖로 조제 후, 12웰 배양 플레이트의 각 웰에 1 ㎖씩 가했다. 이어서, 실시예 2에서 조제한 재조합형 인간 비근형 코필린 함유 COS-1 세포 배양 상청을 10배 농축하여, 그 10O ㎕ 또는 인간 TPO(100 ng/㎖)을 단독 또는 조합으로 첨가하여, 5% CO₂, 37℃의 조건으로 배양했다. 배양 7일째에 각 웰의 배지와 상기 조성의 배지를 1 ㎖씩 첨가하여 배양을 계속했다. 그 후, 경시적으로 현미경 하에서 관찰하여 거핵구세포 돌기 형성의 유무를 확인했다.

인간 비근형 코필린은 TP0와의 공존에 의해 인간 제대혈 유래 CD34 양성 세포를 거핵구로 현저하게 분화 증식시켜(도 8), 배양 2주간 전후에서는 성숙 거핵구의 일부에 혈소판 방출의 전단계를 반영하는 것으로 생각되는 세포 돌기가 확인되었다(도 9). 그러나, 인간 비근형 코필린의 단독 첨가 또는 TPO의 단독 첨가에서는 세포 돌기의 형성은 전혀 인지되지 않았다.

본 발명은 코필린을 유효 성분으로 하는 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제를 제공함으로써, 폭넓은 세트의 혈액 세포의 증식 및/또는 분화를 촉진할 수 있는 효과를 가진다. 이러한 효과에 의해, 상기 촉진제는 범조혈 세포 감소증 및/또는 조혈 기능 저하를 수반하는 질환의 치료약으로서 유용하며, 또 재생 의료의 분야에서 효율적으로 혈액계 세포의 재생을 도모할수 있게 된다.

<110> DAIICHI SUNTORY PHARMA CO., LTD. DAIICHI SUNTORY BIOMEDICAL RESEARCH LTD. <120> AGENTS PROMOTING THE PROLIFERATION AND/OR DIFFERENTIATION OF HEMATOPOIETIC STEM CELLS AND/OR HEMATOPOIETIC PRECUSOR CELLS <130> YCT-785 <150> JP 2001-400330 <151> December 28, 2001 <160> 4 <200> 1 <211> 166 <212> PRT <213> Human <223> Amino acid sequence of human Cofilin. <400> 1 Met Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Asp Gly Val Ile Lys Val Phe Asn 5 10 15 Asp Met Lys Val Arg Lys Ser Ser Thr Pro Glu Glu Val Lys Lys Arg 20 25 30 Lys Lys Ala Val Leu Phe Cys Leu Ser Glu Asp Lys Lys Asn Ile Ile 35 40 45 Leu Glu Glu Gly Lys Glu Ile Leu Val Gly Asp Val Gly Gln Thr Val 50 55 60 Asp Asp Pro Tyr Ala Thr Phe Val Lys Met Leu Pro Asp Lys Asp Cys 65 70 75 80 Arg Tyr Ala Leu Tyr Asp Ala Thr Tyr Glu Thr Lys Glu Ser Lys Lys 85 90 95 Glu Asp Leu Val Phe Ile Phe Trp Ala Pro Glu Ser Ala Pro Leu Lys 100 105 110 Ser Lys Met Ile Tyr Ala Ser Ser Lys Asp Ala Ile Lys Lys Lys Leu 115 120 125 Thr Gly Ile Lys His Glu Leu Gln Ala Asn Cys Tyr Glu Glu Val Lys 130 135 140 Asp Arg Cys Thr Leu Ala Glu Lys Leu Gly Gly Ser Ala Val Ile Ser 145 150 155 160 Leu Glu Gly Lys Pro Leu 165 <200> 2 <211> 501 <212> DNA <213> Human <223> Nucleotide sequence of human Cofilin. <400> 2 atggcctccg gtgtggctgt ctctgatggt gtcatcaagg tgttcaacga catgaaggtg 60 cgtaagtctt caacgccaga ggaggtgaag aagcgcaaga aggcggtgct cttctgcctg 120 agtgaggaca agaagaacat catcctggag gagggcaagg agatcctggt gggcgatgtg 180 ggccagactg tcgacgatcc ctacgccacc tttgtcaaga tgctgccaga taaggactgc 240 cgctatgccc tctatgatgc aacctatgag accaaggaga gcaagaagga ggatctggtg 300 tttatcttct gggcccccga gtctgcgccc cttaagagca aaatgattta tgccagctcc 360 aaggacgcca tcaagaagaa gctgacaggg atcaagcatg aattgcaagc aaactgctac 420 gaggaggtca aggaccgctg caccctggca gagaagctgg ggggcagtgc ggtcatctcc 480 ctggagggca agcctttgtg a 501 <200> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> Primer sequence for amplifying human Cofilin gene. <400> 3 atggcctccg gtgtggctgt ctctga 25 <200> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <223> Primer sequence for amplifying human Cofilin gene. <400> 4 tctccctgga gggcaagcct ttgtga 26

Claims

코필린(cofilin)을 유효 성분으로 하는 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구(前驅) 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제.
제1항에 있어서,

상기 코필린이 SEQ ID NO: 1로 표기되는 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:1로 표기되는 코필린의 아미노산 서열에서 하나 또는 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 서열을 가지며, 또한 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제.
제1항에 있어서,

상기 코필린이 SEQ ID N0: 1로 표기되는 아미노산 서열, 또는 SEQ ID N0: 1로 표기되는 코필린의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열과 상보적인 염기 서열과의 사이에서, 엄격한 조건 하에 있어서 잡종 형성하는(hybridizable) 염기 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 가지며, 또한 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제.
제1항에 있어서,

상기 코필린이 SEQ ID NO: 1로 표기되는 아미노산 서열, 또는 코필린의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 1)과의 사이에서 최소한 30%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, 또한 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제.
제1항에 있어서,

상기 코필린이 SEQ ID N0: 2로 표기되는 염기 서열, 또는 SEQ ID N0: 2로 표기되는 코필린의 염기 서열과 상보적인 염기 서열과의 사이에서, 엄격한 조건 하에서 잡종 형성 가능한 염기 서열에 의해 코딩되며, 또한 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제.
제1항에 있어서,

상기 코필린이 SEQ ID N0: 2로 표기되는 염기 서열, 또는 SEQ ID N0: 2로 표기되는 코필린의 염기 서열과의 사이에서 최소한 30%의 염기 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함하는 DNA에 의해 코딩되며, 또한 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진 활성을 가지는 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 코필린이 유전자 재조합의 방법에 의해 생산되는 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 코필린이 당쇄(糖鎖)를 가지는 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,

또 다른 사이토카인(cytokine)을 추가로 함유하여 이루어지는 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제.
제9항에 있어서,

상기 사이토카인이 인터로이킨-1(IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-l1, 과립구(顆粒球) 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 에리스로포이에틴(EPO), 염기성 섬유아세포 증식 인자(BFGF), 산성 섬유아세포 증식 인자(aFGF), 인슐린형 증식 인자(IGF), 상피 증식 인자(EGF), 간세포 증식 인자(HGF), 트랜스포밍(transforming) 성장 인자-α(TGF-α), 프로테아제넥신(protease nexin) I, 프로테아제 넥신 II, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 콜린 작동성 분화 인자 또는 백혈구 유주 저지 인자(LIF), 줄기 세포 인자(SCF), flk-2/flt-3 리간드(FL), 트롬보포이에틴(TPO), IL-6/가용성 IL-6 수용체 복합체 또는 Hyper IL-6(IL-6과 가용성 IL-6 수용체와의 융합 단백질)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 또는 복수의 조합인 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제.
제9항에 있어서,

상기 다른 사이토카인이 IL-3인 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제.
제9항에 있어서,

상기 또 다른 사이토카인이 줄기 세포 인자(SCF), flk-2/flt-3 리간드(FL) 또는 이들의 조합인 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,

조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화가 충분하지 않기 때문에 생기는 질환의 치료를 위한 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,

범조혈(汎造血) 세포 감소 및/또는 조혈 기능 저하를 수반하는 질환의 치료를 위한 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,

재생 의료에 이용할 수 있는 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제 중 최소한 1종을 투여하는 것을 포함하는 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화를 촉진하는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제 중 최소한 1종을 투여하는 것을 포함하는 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화가 충분하지 않기 때문에 생기는 질환을 치료하는 방법.
제17항에 있어서,

조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화가 충분하지 않기 때문에 생기는 상기 질환이 범조혈 세포 감소 및/또는 조혈 기능 저하를 수반하는 질환인 치료 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제 중 최소한 1종을 이용하여 조혈 줄기 세포를 생체 외에서 증식시키는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포의 증식 및/또는 분화 촉진제 중 최소한 1종을 이용하여 조혈 줄기 세포를 생체 외에서 증식시키는 것에 의한 재생 의료 방법.