KR101998257B1 - Cfc 신드롬의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 TGF-β 신호전달경로 억제제 또는 BMP 신호전달경로 활성화제를 유효성분으로 함유하는 CFC 신드롬(cardiofaciocutaneous syndrome)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, SB-431542 또는 BMP4 단백질 처리시 CFC 신드롬 환자 유래의 유도만능줄기세포로부터 유도된 조골세포에서 ALP 활성 및 골미네랄 침착을 증가시킬 수 있음을 확인한 바 SB-431542를 포함하는 TGF-β 신호전달경로 억제제 또는 BMP4 단백질을 포함하는 BMP 신호전달경로 억제제는 CFC 신드롬을 예방 또는 치료하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

CFC 신드롬의 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING CARDIOFACIOCUTANEOUS SYNDROME}
본 발명은 TGF-β 신호전달경로 억제제 또는 BMP 신호전달경로 활성화제를 유효성분으로 함유하는 CFC 신드롬(cardiofaciocutaneous syndrome, 심장-얼굴-피부 증후군)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
CFC 신드롬(심장-얼굴-피부 증후군, cardiofaciocutaneous syndrome)은 주로 BRAF 유전자의 돌연변이에 의해 발생하는 희귀 상염색체 우성 유전질환이다. BRAF는 RAS/MAPK 신호전달체계에 속하는 인산화효소(kinase) 중 하나로, BRAF 유전자의 돌연변이로 인해 BRAF의 효소 활성이 지속적으로 증가하여 여러 증상이 나타나게 된다. 주요 증상으로는 심장기형, 특징적 얼굴형태, 피부이상 및 발달지연 및 정신지체 등이 있다(Niihori, Aoki et al. 2006, Rodriguez-Viciana, Tetsu et al. 2006). 특히 RAS-MAPK 신호 전달 경로에 변이가 있는 질환군에 속하는 누난 증후군, NF1, 코스텔로 증후군 등에서 관찰되는 골격계 관련 증상이 CFC 신드롬 환자에서도 나타나는데 구체적으로 골격계 발달이상 및 지연과 관련된 골 성장지연, 골밀도 저하, 척추 기형, 오목가슴 등이 보고되었다(Amoki, Niihori et al. 2008, Abe, Aoki et al. 2012).
CFC 신드롬의 유전자변이를 가진 마우스의 표현형 분석을 통해 척추뼈의 기형 및 골밀도 저하 등이 나타나는 것을 확인한 바 있으나, 인간에서 관찰되는 모든 골격계 증상을 대변하지 않으며 또한 발병 기전에 대한 연구는 상대적으로 매우 미흡한 실정이다(Inoue, Moriya et al. 2014, Moriya, Inoue et al. 2015). 또한 마우스와 사람의 종간의 본질적인 차이로 인해 CFC 환자로부터의 시료를 이용한 CFC 신드롬의 골격계 질환 메커니즘 연구 및 치료제 스크리닝이 요구된다.
줄기세포(stem cell)는 조직을 구성하는 각 세포로 분화되기 전단계의 세포로서, 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있을 수 있으며, 미분화 상태에서 무한 증식이 가능한 자가증식능 및 특정 분화 자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재적 가능성인 다분화능을 가진 세포를 말한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다. 인간배아줄기세포 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPS)를 포함하는 인간 다능성 줄기세포(Human pluripotent stem cells; hPSCs)는 다양한 특정 세포 종류로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있어 인체에서 직접 하기 힘든 초기 배발달기전 연구가 가능하다(Carvajal-Vergara, Sevilla et al. 2010). 배아줄기세포는 여성의 난자를 사용한다는 윤리적 문제와 환자의 몸 속에 이식하였을 때 면역거부반응이 일어날 수 있다는 한계가 존재하지만, 환자 체세포로부터 확립한 유도만능줄기세포를 이용하면, 상기의 문제를 해결함과 동시에 질환 환자세포의 유전적 결함을 그대로 가지고 있어 곧바로 질환 모델 세포로서 이용할 수 있다는 측면에서 큰 이점이 있다. 따라서 특정 질환 환자의 체세포로부터 유도만능줄기세포를 확립하고, 원하는 종류의 세포로 분화시켜 해당 질환 메커니즘 연구를 수행할 수 있으며 또한 그 세포를 이용하여, 약물후보물질을 대량 스크리닝하는 플랫폼을 구축함으로써, 실제 스크리닝에 활용하거나 약물 독성을 예측 및 평가하는데 활용 가능하다(Huebsch, Loskill et al. 2016, Sirenko, Hancock et al. 2016).
본 발명자들은 CFC 신드롬 환자의 섬유아세포로부터 유도만능줄기세포를 제조하고, 이를 이용하여 CFC 신드롬 환자에서 나타나는 골격계 관련 증상의 발병 기전을 탐색하였다. 그 결과 CFC 신드롬 환자로부터 유래한 유도만능줄기세포를 중간엽 줄기세포 단계를 거쳐 조골세포로 분화 유도시, 정상 대조군에 비해 조골세포로의 분화가 저해됨을 확인하였으며, 이에 p-SMAD2를 저해하는 화합물인 SB-431542를 처리하여 분화능을 개선시킬 수 있음을 확인하였다. 아울러 조골세포의 ALP(Alkaline Phosphatase) 효소활성을 측정하는 대용량 약물후보물질 스크리닝 플랫폼을 구축, 조골세포의 ALP 효소 활성을 증가시키는 화합물을 발굴할 수 있음을 확인함으로 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 SB-431542, LY2109761, LY2157299, LY-364937, SD-208 및 Ki26894으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 TGF-β 신호전달경로 억제제를 유효성분으로 함유하는 CFC 신드롬(cardiofaciocutaneous syndrome, 심장-얼굴-피부 증후군)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 BMP 신호전달경로 활성화제 BMP4(human bone morphogenic protein 4) 단백질을 유효성분으로 함유하는 CFC 신드롬(cardiofaciocutaneous syndrome, 심장-얼굴-피부 증후군)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SB-431542, LY2109761, LY2157299, LY-364937, SD-208 및 Ki26894으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 TGF-β 신호전달경로 억제제를 유효성분으로 함유하는 CFC 신드롬(cardiofaciocutaneous syndrome, 심장-얼굴-피부 증후군)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 SB-431542, LY2109761, LY2157299, LY-364937, SD-208 및 Ki26894으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 TGF-β 신호전달경로 억제제를 유효성분으로 함유하는 CFC 신드롬(cardiofaciocutaneous syndrome, 심장-얼굴-피부 증후군)의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 BMP 신호전달경로 활성화제 BMP4(human bone morphogenic protein 4) 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 CFC 신드롬(cardiofaciocutaneous syndrome, 심장-얼굴-피부 증후군)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 BMP 신호전달경로 활성화제 BMP4(human bone morphogenic protein 4) 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 CFC 신드롬(cardiofaciocutaneous syndrome, 심장-얼굴-피부 증후군)의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은
i) 시험관 내에서 CFC 신드롬 환자로부터 유래된 iPSC로부터 분화된 조골세포에 피검 화합물 또는 조성물을 처리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)의 조골세포에서 ALP 효소 활성 또는 골미네랄 침착정도를 분석하는 단계; 및
iii) 무처리 대조군과 비교하여 ALP 효소 활성 또는 골미네랄 침착정도를 증가시키는 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는, CFC 신드롬의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
SB-431542 또는 BMP4 처리시 CFC 신드롬 환자 유래의 유도만능줄기세포로부터 유도된 조골세포에서 ALP 활성 및 골미네랄 침착을 증가시킬 수 있으므로 CFC 신드롬을 예방 또는 치료제로 SB-431542를 포함하는 TGF-β 신호전달경로 억제제 또는 BMP4를 포함하는 BMP 신호전달경로 활성화제를 이용할 수 있다.
도 1은 CFC 신드롬 환자로부터 유래된 유도-만능 줄기 세포(CFC-iPSC)에서 분화된 배상체(embryonic body, EB)의 형태를 나타낸 도이다.
WT: 정상개체(wild-type)로부터 유래된 유도-만능 줄기 세포
CFC2 및 CFC7: 동일한 CFC 신드롬 환자로부터 유래된 두 개의 유도-만능 줄기 세포주
도 2는 CFC-iPSC에서 분화된 MSC(mesenchymal stem cell, 중간엽줄기세포)의 형태를 나타낸 도이다.
도 3은 CFC-iPSC에서 분화된 MSC(mesenchymal stem cell, 중간엽줄기세포)에서 양성표면마커 및 음성표면마커의 발현을 FACS(fluorescence activated cell sorter)로 분석한 도이다.
도 4는 CFC-iPSC에서 분화된 MSC(CFC-MSC)를 연골세포 및 지방세포로 분화시킨 후 각각 알시안 블루(alcian blue) 및 오일레드O(oil red O)으로 염색한 도이다.
도 5는 CFC-MSC에서 ERK 및 p-ERK의 발현을 확인한 도이다.
도 6은 CFC-MSC를 조골세포로 분화 유도 후 ALP의 활성을 측정한 도이다. (D#는 분화 후 경과한 날짜이다.)
도 7은 CFC-MSC를 조골세포로 분화 유도 후 칼슘 침착 정도를 알리자린 레드 에스 염색(alizarin red S 염색)을 통해 확인한 도이다.
도 8은 CFC-MSC를 조골세포로 분화 유도 후 조골세포의 마커 유전자인 ALP, RUNX2, BSP, OCN 및 OPN의 mRNA의 발현 수준을 실시간 PCR(real-time PCR)을 통해 확인한 도이다.
도 9는 CFC-MSC를 조골세포로 분화 유도 후 조골세포의 마커 단백질인 RUNX2 및 OPN 단백질의 발현 수준을 확인한 도이다.
도 10은 CFC-MSC를 조골세포로 분화 유도 후 ERK/p-ERK 및 SMAD2/p-SMAD2 단백질의 발현 수준을 확인한 도이다.
도 11은 WT-MSC(정상개체에서 유래한 iPSC로부터 분화된 MSC)를 조골세포로 분화 유도 후 PFGF 또는 액티빈 A(Activin A, ActA)를 처리하고 ERK/p-ERK 및 SMAD2/p-SMAD2 단백질의 발현 수준을 확인한 도이다.
도 12는 CFC-MSC를 조골세포로 분화 유도 후 SMAD1/p-SMAD1 단백질의 발현 수준을 확인한 도이다.
도 13은 CFC-MSC를 조골세포로 분화 유도 후 U0126, SB-431542 및 BMP4 단백질(재조합 인간유래단백질)을 처리하고 ALP의 활성을 측정한 도이다.
U: U0126, SB:SB-431542, B4:BMP4 단백질
도 14는 CFC-MSC를 조골세포로 분화 유도 후 U0126, SB-431542 및 BMP4 단백질(재조합 인간유래단백질)을 처리하고 골미네랄 침착 정도를 측정한 도이다.
U: U0126, SB:SB-431542, B4:BMP4 단백질
도 15는 CFC-MSC를 조골세포로 분화 유도 후 U0126, SB-431542 및 BMP4 단백질(재조합 인간유래단백질)을 처리하고 조골세포의 마커 유전자인 ALP, RUNX2, BSP, OCN 및 OPN의 mRNA의 발현 수준을 실시간 PCR(real-time PCR)을 통해 확인한 도이다.
U: U0126, SB:SB-431542, B4:BMP4 단백질
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 SB-431542, LY2109761, LY2157299, LY-364937, SD-208 및 Ki26894으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 TGF-β 신호전달경로 억제제를 유효성분으로 함유하는 CFC 신드롬(cardiofaciocutaneous syndrome, 심장-얼굴-피부 증후군)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
"TGF (Transforming growth factor) 베타 신호전달경로 억제제"는 TGF 베타에 의한 신호전달을 억제하는 물질을 의미한다. TGF 베타는 생체 내에서 세포의 증식, 분화, 세포사멸, 이동, 세포외기질(ECM)의 생산 혈관형성, 발생 등 다양한 생리적 과정을 조절하는 단백질이다.
상기 TGF 베타 신호전달경로 억제제는 SB-431542, LY2109761, LY2157299, LY364937, SD-208 또는 Ki26894일 수 있으나 TGF 신호전달을 억제시킬 수 있는 물질이라면 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서는 TGF 베타 신호전달경로 억제제로 SB431542를 이용하였으며 이는 하기 화학식 1의 구조를 가지고 있다.
Figure 112018013953419-pat00001
상기 LY2109761는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 상기 LY2157299는 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물, 상기 LY-364937는 하기 화학식 4로 표시되는 화합물, 상기 SD-208는 하기 화학식 5로 표시되는 화합물일 수 있다.
Figure 112018013953419-pat00002
Figure 112018013953419-pat00003
Figure 112018013953419-pat00004
Figure 112018013953419-pat00005
상기 TGF-β 신호전달경로 억제제는 CFC 신드롬 환자의 조골세포에서 p-SMAD2의 발현을 억제하는 것일 수 있다.
상기 TGF-β 신호전달경로 억제제는 CFC 신드롬 환자의 조골세포에서 ALP 효소 활성 또는 골미네랄 침착정도를 증가시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 BMP4(human bone morphogenic protein 4) 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 CFC 신드롬(cardiofaciocutaneous syndrome, 심장-얼굴-피부 증후군)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
"BMP (Bone morphogenic protein) 신호전달경로 활성화제"는 BMP에 의한 신호전달을 활성화하는 물질을 의미한다. BMP는 생체 내에서 골형성에 직접적으로 관여하는 단백질로, 조골세포 분화 및 성숙을 촉진, 조골세포 분화에 필수적인 역할을 한다.
상기 BMP 신호전달경로 활성화제는 BMP4 단백질일 수 있으나 BMP 신호전달을 활성화시킬 수 있는 물질이라면 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서는 BMP 신호전달경로 억제제인 BMP4 단백질을 이용하였으며 상기 BMP4 단백질은 서열번호 13으로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 BMP4 단백질은 BMP 신호전달경로 활성화시키는 활성을 가지는 단백질 야생형(wild type) 뿐만 아니라 야생형 단백질의 단편 서열이나 90% 이상의 아미노산 상동성을 가지고 BMP4 신호전달경로 활성화시키는 활성을 가지는 기능정 상동체를 포함할 수 있다. 여기서 상동성이란 야생형 단백질의 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 BMP4 단백질은 서열번호 13으로 정의되는 야생형 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
상기 BMP4 단백질은 BMP 신호전달경로를 활성화시키는 활성을 보유하는 한 이들의 아미노산 서열 변이체를 포함할 수 있다. 여기서 변이체란 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다.
상기 BMP4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 상기 BMP4 단백질을 코딩할 수 있고, BMP 신호전달경로를 활성화시키는 활성을 갖는 한, 본 발명의 범위에 포함된다.
상기 BMP4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 인체 또는 동물세포에서 발현되는 선형 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스성 발현벡터를 포함하는 벡터 또는 재조합 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 재조합 아데노 바이러스(adenovirus) 벡터, 재조합 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 벡터 또는 재조합 렌티바이러스(lentivirus) 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 벡터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 BMP4 단백질은 CFC 신드롬 환자의 조골세포에서 p-SMAD1의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
상기 BMP4 단백질은 CFC 신드롬 환자의 조골세포에서 ALP 효소 활성 또는 골미네랄 침착정도를 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예로서, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합한 것일 수 있다. 이때, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
본 발명의 조성물은 경구제제 또는 비경구제제로 제형화 될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 첨가될 수 있다. 한편, 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 여기에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등의 주사제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여될수 있으며, 비경구 투여는 피부 외용 또는 복강내 주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식중 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여된다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.
본 발명에 의한 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 SB-431542, LY2109761, LY2157299, LY-364937, SD-208 및 Ki26894으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 TGF-β 신호전달경로 억제제를 유효성분으로 함유하는 CFC 신드롬(cardiofaciocutaneous syndrome, 심장-얼굴-피부 증후군)의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 BMP4(human bone morphogenic protein 4) 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 CFC 신드롬(cardiofaciocutaneous syndrome, 심장-얼굴-피부 증후군)의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기에서 사용된 용어 "개선"은, 상기 CFC 신드롬이 의심되거나 발병한 개체의 증상을 호전시키거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
상기 건강기능식품에 첨가되는 유효성분인 TGF-β 신호전달경로 억제제 또는 BMP4 단백질의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있다. 일반적으로, 전체 건강기능식품 중량의 0.001 내지 0.01 중량부일 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품의 형태 및 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 건강기능식품의 형태는 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 또는 환 등일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 건강기능식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린 또는 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등 일 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린 또는 알코올 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 TGF-β 신호전달경로 억제제 또는 본 발명의 BMP4 단백질 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 CFC 신드롬 환자의 섬유아세포로부터 유도만능줄기세포를 제조하고, 이를 이용하여 CFC 신드롬 환자에서 나타나는 골격계 관련 증상의 발병 기전을 탐색하였다. 그 결과 CFC 신드롬 환자로부터 유래한 유도만능줄기세포를 중간엽 줄기세포 단계를 거쳐 조골세포로 분화 유도시, 정상 대조군에 비해 조골세포로의 분화가 저해되어 있으며(도 6 내지 도 10), 이에 p-SMAD2를 저해하는 화합물인 SB-431542를 처리 또는 p-SMAD1을 저해하는 단백질인 BMP4를 처리하여 분화능을 개선시킬 수 있음을 확인하였다(도 13 내지 도 15). 이에 SB-431542를 포함하는 TGF-β 신호전달경로 억제제 또는 BMP4 단백질을 포함하는 BMP 신호전달경로 활성화제는 CFC 신드롬의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, CFC 신드롬의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은
i) 시험관 내에서 CFC 신드롬 환자로부터 유래된 iPSC로부터 분화된 조골세포에 피검 화합물 또는 조성물을 처리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)의 조골세포에서 ALP 효소 활성 또는 골미네랄 침착 정도를 분석하는 단계; 및
iii) 무처리 대조군과 비교하여 ALP 효소 활성 또는 골미네랄 침착 정도를 증가시키는 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는, CFC 신드롬의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
i) 시험관 내에서 CFC 신드롬 환자로부터 유래된 iPSC로부터 분화된 조골세포에 피검 화합물 또는 조성물을 처리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)의 조골세포에서 ALP(Alkaline phosphatase), RUNX2(Runt-related transcription factor 2), BSP(Bone sialoprotein), OCN(Osteocalcin) 및 OPN(Osteopontin) 로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 조골세포 마커 유전자의 발현을 분석하는 단계; 및
iii) 무처리 대조군과 비교하여 ALP, RUNX2, BSP 또는 OCN 유전자의 발현을 감소시키거나 OPN 유전자의 발현을 증가시키는 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는, CFC 신드롬의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 단계 i)의 조골세포로의 분화는 자발적(spontaneous)인 분화 또는 분화유도 물질의 첨가로 인한 직접적(directed)인 분화 유도를 통해 분화될 수 있으며 중간엽줄기세포를 거쳐 분화되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 CFC 신드롬 환자의 섬유아세포로부터 유도만능줄기세포를 제조하고, 이를 이용하여 CFC 신드롬 환자에서 나타나는 골격계 관련 증상의 발병 기전을 탐색한 결과 CFC 신드롬 환자로부터 유래한 유도만능줄기세포를 중간엽 줄기세포 단계를 거쳐 조골세포로 분화 유도시, 비정상적인 마커 유전자 발현양상과 더불어 정상 대조군 조골세포에 비해 ALP 효소 활성 또는 골미네랄 침착 정도가 저하되어 있는 것을 확인한 바 CFC 신드롬 환자로부터 유래된 iPSC로부터 분화된 조골세포는 CFC 신드롬의 치료제 스크리닝 방법에 유용하게 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
< 실험예 1> CFC 신드롬 환자 유래 유도만능줄기세포(iPSC)로부터 중간엽줄기세포 (MSC) 유도
<1-1> CFC 환자의 임상적 증상 확인을 통한 선별
CFC 신드롬 환자에서 나타나는 골격계 관련 증상의 분자기전을 탐색하고, 향후 치료 약물 스크리닝을 위한 세포모델을 제조하기 위해 전형적인 CFC 신드롬의 증상을 모두 가지고 있으며, 골격계 관련 증상으로 성장지연, 골밀도 저하 등의 증상을 나타내는 CFC 환자를 선별하였다(표 1).
CFC 신드롬 환자의 임상 증상
전반적인 증상
성별
나이		 심장기형 (Cardiac
disorder)		 얼굴기형(Facial
malformation)		 목기형 (Neck anomaly) 피부이상 (Cutaneous anomaly) 작은키 (Short stature) 흉골이상 (Chest deformity) 정신지체 (Mental retardation)
남자

5.5
year		 있음 양안격리증(hypertelorism),
아래쪽에 위치한 귀(low-set ear), 눈구석주름 (epicanthal folds),
안검열 경사 (downslanting palpebral fissure), 대두증
(macrocephalic)		 짧은 목(short neck), 물갈퀴목 (webbed neck) 적은 모발
(sparse hair)		 해당 오목가슴
(pectus excavatum)		 있음
골격계 관련 증상
나이 키 몸무게 IGF1 IGFBP3
year cm SD score kg SD score ng/ml SD score ng/ml SD score
5.5 99.7 -2.8 17 -1.3 74 -0.8 1630 -9.3
6.5 107.6 -2.2 19 -1.2 157 -0.4 1854 -2.7
7.5 113 -2.2 21 -1.2 167 -0.5 2817 -1.8
8.5 121 -1.5 23 -1.2 404 1.9 2710 -2.0
9.5 126.4 -1.4 25.6 -1.1 325 0.7 2730 -2.8
골밀도
Age Spine AP(요추 전후방)
(L1-L4)		 대퇴골(Femur)
(목, Neck)		 대퇴골(Femur)
(전자, Troch)		 대퇴골(Femur)
(전체)
year g/cm2 SD score g/cm2 SD score g/cm2 SD score g/cm2 SD score
10.5 0.588 -1.6 0.698 -1.4 0.540 -1.5 0.646 -1.7
SD는 표준점수(standard score)로서 하기의 식으로 계산되며 음수일 경우 평균보다 낮다는 것을 나타내며, 절대값이 클수록 평균값과 차이가 크다는 것을 의미한다;
SD= (환자의 수치-전체 평균값)/표준편차.
소아에 있어서 골밀도의 경우 한국인 기준이 없으며, USA 기준으로 표준점수가 -1.0 ~ -2.5라면 골감소증으로 규정된다.
<1-2> CFC 환자로부터 체세포의 분리 및 iPSC 제조
병원의 임상연구 윤리 심의위원회의 심사를 통과한 후, 상기 실험예 <1-1>에서 선별된 CFC 환자와 법적 대리인의 동의를 얻어 국소 마취 후 펀치 생검법(punch biopsy method)으로 피부 조직 생검을 수행하여 CFC 환자로부터 진피(dermal) 조직을 수득하였다. 수득한 진피 조직에서 섬유아세포를 분리하여 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS; GIBCO 사, 미국), 0.05 ㎎/㎖ 아스코르브산(ascorbic acid), 0.3 ㎎/㎖ L-글루타민(L-glutamin; GIBCO 사, 미국), 3.7 ㎎/㎖ 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate, NaHCO3) 및 100 U/㎖ 페니실린(penicillin; GIBCO 사, 미국)을 포함하는 둘베코 변이된 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle`s medium, DMEM; GIBCO 사, 미국)에서 배양하였다. 배양 후, 세포 상층액 100 ㎕을 조직 배양 플레이트(tissue culture plate)에 접종한 후, 5% 이산화탄소 조건의 37℃에서 3 시간 동안 유지한 다음, 배양 배지를 2 ㎖ 첨가한 후 1주일 간 세포 배양하여 섬유아세포를 수득하였다. 이후 당업계에 잘 공지되어 있는 다분화능 마커(pluripotent marker)인 OCT4, SOX2, KLF4 및 C-MYC를 이용한 이소성 발현(ectopic expression) 방법(Takahashi, K et al, Cell 131(5): 861-872, 2007)을 이용하여 상기 CFC 환자의 섬유아세포(fibroblast)로부터 iPSC(CFC-iPSC)를 제조하였다.
<1-3> CFC- iPSC의 MSC(Mesenchymal Stem Cell)로의 분화 유도
CFC 신드롬 환자에서 나타나는 골격계 관련 결함이 조골세포의 기능과 관련성이 있는지 확인하고자 하였다. 이에 CFC-iPSC를 조골세포로 분화시켜 관련기전을 탐색하고자 먼저 조골세포로의 분화과정의 중간단계인 CFC-iPSC의 MSC(Mesenchymal Stem Cell)로의 분화가 정상적으로 일어나는지 조사하였다.
기존 논문(Mahmood, Harkness et al. 2010)의 프로토콜을 참고하여 정상 개체(WT, wild type) 유래 iPSC(대조군)와 CFC 신드롬환자 유래 iPSC를 in vitro 상에서 약 30일간 분화를 유도하였다. 구체적으로, CFC-iPSC의 콜로니(colony)를 Mickle Laboratory Engineering Co. 사의 조직 절단기(tissue chopper)를 이용하여 4~9 등분(조각 당 약 0.5 mm × 0.5 mm 크기)하고, 10 mg/ml 디스페이즈(dispase)를 37°C에서 4분간 처리하여 조각을 세포배양접시로부터 분리하였다. 분리한 세포 조각들을 페트리접시(petri dish)로 옮기고 10% 혈청 대체물(serum replacement, SR), 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin), 1% 비필수 아미노산(non-essential amino acids)을 포함하는 둘베코 변이된 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle`s medium, DMEM/F12)인 배상체 분화 배지(embryoid body differentiation media, EB media)에서 1일간 배양하였다. 세포조각이 둥글게 뭉친 배상체(embryoid body, EB)가 만들어진 것을 확인한 후 EB들을 10 μM SB-431542 (SB) 를 포함하는 EB media에서 8일간 추가 배양하였다. 이후, EB들을 피브로넥틴(fibronectin)을 코팅한 배양접시로 옮기고, 1% B27 보충물 (B27 supplement), 1% 인슐린-트렌스페린-셀레늄 액체 배지 보충물(insulin-transferrin-selenium liquid media supplement), 1% 화학적으로 합성된 지질농축물(chemically defined lipid concentrate), 1 μM SB를 포함하는 DMEM/F12 배지에서 4일간 배양(배양접시 바닥에 붙은 상태)하고, 이후 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 α-minimum essential medium (α-MEM) 배지인 MSC 배양배지에서 18일간 추가적으로 배양하엿다. phosphate-buffered saline(PBS)로 1회 세척 후 0.25% 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)를 37°C에서 2분간 처리하여 세포를 배양접시에서 분리한 후 새 배양접시로 옮기고 MSC 배양배지에서 70~80% 정도로 세포가 자라면 계대배양을 하며 실험에 사용하거나 냉동보관하였다. 동일한 방법으로 WT-iPSC 또한 WT-MSC로 분화를 유도하였다.
그 결과 iPSC로부터 MSC로 유도하는 과정의 중간 단계인 배상체의 형태(도 1)와 최종 분화한 MSC의 특징적인 형태(도 2)가 정상개체와 CFC 신드롬 환자유래 세포에서 유의미한 차이를 보이지 않는 것을 확인하였다.
<1-4> CFC- iPSC로부터 분화된 MSC의 표면 마커 발현
상기 실험예 <1-3>의 CFC-iPSC로부터 분화된 MSC가 정상개체의 iPSC로부터 유래된 MSC와 동일한 특징을 나타내는지를 표면마커분석을 통해 조사하였다.
구체적으로 FACS 분석을 위해서, 상기 실험예 <1-3>에서 분화된 MSC를 PBS로 1회 세척 후 아큐테이즈(accutase)를 37°C에서 5분간 처리하여 배양접시로부터 분리하였다. 0.5% FBS 가 포함된 PBS인 FACS 버퍼를 사용하여 1회 세척 후 4°C에서 300 ×g로 5분간 원심분리한 후 상층액은 버리고 가라앉은 세포를 FACS 버퍼로 재부유시키고 40 μm pore size의 세포여과기(cell strainer)를 이용하여 필터링하였다. 필터한 세포를 FACS 버퍼로 2회 재세척 후 4°C에서 × 300 g로 5분간 원심분리하였다. FACS 버퍼로 재부유한 세포에, 양성 표면마커인 CD44, CD73, CD90, CD105와 음성 표면마커인 CD34, CD45, HLA-DR 항체를 각각 넣고 빛을 차단한 4°C에서 20분간 반응시켰다. 사용한 항체의 정보는 [표 2]와 같다. 항체와 반응시킨 세포를 FACS 버퍼로 2회 세척 후 10% 포르말린 용액을 상온에서 10분간 처리하여 고정한다. 고정한 샘플을 BD Biosciences 사의 FACS Calibur flow cytometer 기계를 이용하여 최소 5,000개 이상의 셀의 표면마커를 리딩하였다. 각 샘플당 표면마커의 발현량은 FlowJo 프로그램을 이용하여 분석하였다.
FACS에 사용한 항체 정보
항체 종 형광 농도 회사 카탈로그 번호
CD73 mouse PE 1:100 eBioscience 12-0739-42
CD90 mouse APC 1:100 eBioscience 17-0909-42
CD105 mouse APC 1:100 eBioscience 17-1057-42
CD34 mouse APC 1:100 eBioscience 17-0349-42
CD45 mouse FITC 1:100 eBioscience 11-9459-42
HLA-DR mouse APC 1:100 R&D systems FAB4869A
PE-isotype mouse PE 1:100 eBioscience 12-4714-42
APC-isotype mouse APC 1:100 eBioscience 17-4714-42
FITC-isotype mouse FITC 1:100 eBioscience 11-4714-42
그 결과, 양성 표면마커인 CD44, CD73, CD90, CD105을 95% 이상 발현하였고, 음성 표면마커인 CD34, CD45, HLA-DR은 발현하지 않음을 확인하였다(도 3). 이 결과는 CFC 환자 유래 iPSC로부터 분화된 MSC가 정상적인 MSC의 표현형을 나타낸다는 것을 의미한다.
<1-5> CFC- iPSC부터 분화된 MSC의 p- ERK 발현
상기 실험예 <1-3>의 CFC-iPSC로부터 분화된 MSC 또한 CFC 신드롬 환자에서 나타나는 ERK 신호전달체계의 활성화 특징을 나타내는지를 웨스턴블롯법에 의한 p-ERK 발현 분석을 통해 조사하였다.
실험예 <1-3>에서 분화된 MSC 세포를 PBS 로 1회 세척 후 스크래퍼(scraper)를 이용하여 수득하였다. 인산가수분해효소 저해혼합물인 10 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 1 mM Na2P2O4를 추가한 Pro-Prep Protein Extraction Solution(iNtRON Biotechnology)에 수득한 세포를 재현탁한 후 얼음 위에서 1 초 동안 3 내지 5회의 초음파로 파쇄하고 원심 분리(4℃, 16,100×g, 5 min)하여 세포의 단백질을 포함하는 상층액을 수득하였다. 단백질을 브레드-포드 분석(brad-ford assay)으로 정량한 후, 각각의 세포로부터 수득한 상층액을 25% 글리세롤(glycerol), 2% 도데실 황산 나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS), 14.4 mM β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol) 및 0.1% 브로모페놀 블루(bromophenol blue)를 포함하는 60 mM 트리스-염산 완충용액(Tris-HCl buffer; pH 6.8)에 희석하여 3 분간 가열하였다. 가열한 단백질은 100 kDa 이하 및 이상의 분자량을 나타내는 단백질을 효과적으로 분리하기 위하여 10% 및 6% SDS-PAGE gel에서 각각 분리하고, 니트로셀룰로오즈 막(nitrocellulose membrane)으로 이동시킨 후 4% 스킴 밀크(4% skim milk in TBST, TBST; 20mM Tris [pH 7.5], 145mM NaCl, 0.05% Tween-20)) 또는 5% 소혈청알부민(5% bovine serum albumin in TBST)으로 블로킹을 수행하였다. 상기 막에 1차 항체로 토끼 유래 항-ERK1/2 항체(Cell signaling Technologies, #9120)와 토끼 유래 항-p-ERK1/2 항체(Cell signaling Technologies, #4370)를 각각 1:2000으로 희석하여 4℃에서 밤새 처리하였다. 다음 날 TBST로 3회 세척하고, 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)가 결합된 염소(goat) 유래 항-토끼 IgG (H+L) 2차 항체(Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate; Thermo scientific 사)를 4% 스킴밀크를 포함하는 TBST와 함께 막에 1:5000으로 희석하여 상온에서 한 시간 처리하였다. 막을 TBST로 3회 세척 후, enhanced chemiluminescence(ECL) 용액을 처리하여 단백질 밴드를 확인하였다. 단백질 밴드의 정량은 Image J 프로그램을 이용하였으며, 각 단백질은 GAPDH를 대조군으로 사용하여 발현량을 보정하였다.
그 결과, WT-MSC 보다 CFC-MSC 에서 p-ERK의 단백질량이 높게 나타났으며, 이는 CFC 신드롬 환자에서 나타나는 BRAF 돌연변이로 인한 ERK 신호전달체계의 활성화가 분화한 MSC에서도 유지되고 있으므로, CFC-MSC를 CFC 신드롬 연구를 위한 질환세포 모델로 활용할 수 있음을 의미한다.
< 실험예 2> CFC 신드롬 환자 유래 유도만능줄기세포(CFC-iPSC)로부터 분화된 중간엽줄기세포(CFC-MSC)의 분화능 검증
<2-1> CFC- iPSC로부터 분화된 MSC의 연골세포 및 지방세포로의 분화
상기 실험예 <1-3>의 CFC-iPSC로부터 분화된 MSC가 MSC의 특징과 더불어 분화능력을 유지하고 있는지를 연골세포 및 지방세포로의 분화를 유도하여 확인하였다.
연골세포로의 분화를 위해, MSC를 0.25% trypsin-EDTA를 37°C에서 2분간 처리하여 배양접시로부터 분리한 후, 1×105 개 세포를 10㎕ 연골세포분화 배지(STEMPRO Chondrogenesis Differentiation Medium, Invitrogen 사)에 섞어 코팅되지 않은 둥근 바닥 96 well 플레이트에 넣고 37°C에서 1시간 배양 후 같은 배지를 100㎕ 추가로 넣어주고 계속 배양하였다. 1~2일이 지나면 세포가 뭉친 구 형태가 관찰되는데 3일마다 연골세포분화 배지를 갈아주며 21일간 부유 배양하였다. 21일째 세포를 10% 포르말린 용액을 10분간 처리하여 고정한 후, 2% 아가로스 겔에 넣어 굳혔다. 겔을 얇게 섹션하여 3% 아세트산을 3분간 처리하고 알시안블루(alcian blue) 염색용액을 상온에서 30분간 처리하고 연골세포로의 분화정도를 확인하였다. 지방세포로의 분화를 위해, MSC를 0.25% trypsin-EDTA를 37°C에서 2분간 처리하여 배양접시로부터 분리한 후, 2.5 × 104 개/cm2 의 밀도로 4-well 배양접시에 깔고 MSC 배양배지에서 4일간 37°C로 세포가 가득 찰 때까지 배양하였다. 4일 후 배지를 지방세포분화 배지(STEMPRO Adipogenesis Differentiation Medium, Invitrogen 사)로 교환하고 3일마다 배지를 갈아주며 21일간 배양하였다. 21일째 세포를 10% 포르말린 용액을 10분간 처리하여 고정한 후, oil red O 용액을 60°C에서 15분간 처리하고 지방세포로의 분화정도를 확인하였다.
그 결과 정상개체와 CFC 신드롬 개체 유래 MSC 모두 연골세포 또는 지방세포로 정상적으로 분화함을 확인하였다.
<2-2> CFC- iPSC로부터 분화된 MSC의 조골세포로의 분화
CFC 신드롬 환자에서 나타나는 골격계 관련 결함이 조골세포의 기능과 관련성이 있는지 확인하기 위하여 상기 실험예 <1-3>의 CFC-iPSC로부터 분화된 MSC를 조골세포로 분화를 유도하였다.
조골세포 분화를 위해, MSC를 0.25% trypsin-EDTA를 37°C에서 2분간 처리하여 배양접시로부터 분리한 후, 2×104 개/cm2 의 밀도로 4-well 배양접시에 깔고 3일간 37°C에서 MSC 배양배지에서 세포가 가득 찰 때까지 배양하였다. 3일 후 배지를 조골세포분화 배지(STEMPRO Osteogenesis Differentiation Medium, Invitrogen 사)로 교환하고 3일마다 배지를 갈아주며 배양하면서 7일 간격으로 백혈구 ALP 키트(Leucocyte Alkaline Phosphatase Kit, Sigma-Aldrich 사)를 이용, 제조사의 프로토콜에 따라 골미네랄의 주요 성분인 수산화인회석(hydroxyapatite)를 형성하는데 필수적인 효소로서 조골세포 분화 지표인 ALP의 활성을 확인하였다. 구체적으로, 수득한 세포를 PBS로 1회 세척하여 아세톤, 37% 포름알데하이드, 시트르산염 용액(citrate solution)을 포함하는 고정용액에 상온에서 30초간 배양한 후 증류수로 다시 2회 세척하고 질산나트륨(sodium nitrate), FRV-alkaline 용액, Naphthol As-BI alkaline solution를 증류수에 섞은 용액으로 1시간동안 염색하여 푸른색으로 변하는 정도를 관찰하였다. 아울러 MSC를 조골세포로 분화하는 과정에서 7일 간격으로 alizarin red S 염색을 수행, 골미네랄 침착능을 조사하였다. PBS로 1회 세척한 수득한 세포를 포르말린 용액에 상온에서 10분간 고정시키고 증류수로 3회 세척 후 alizarin red S 용액에서 상온에서 20분간 염색하였다. 증류수로 2회 세척하고 칼슘 양이온의 침착량을 붉게 변한 정도로 비교하였다.
그 결과 WT-MSC에 비해 CFC-MSC의 ALP 활성이 분화초기에 낮게 나타나며, 4주 이상 되어야 ALP 활성이 정상과 유사한 정도로 나타나는 분화 지연 현상이 나타나는 것을 확인하였다(도 6). 또한 CFC 신드롬 유래 조골세포에서 WT 유래 조골세포보다 칼슘 침착 능력이 저하되어 있음을 관찰할 수 있었다(도 7). 상기 결과는 CFC 신드롬 환자에서 유래한 MSC는 조골세포로의 분화 및 성숙에 장애가 있거나 시간적 지연이 있음을 의미한다.
< 실험예 3> CFC- MSC의 조골세포로의 분화 및 성숙 장애의 분자기전 탐색
<3-1> CFC- MSC의 조골세포로의 분화시 마커 유전자 발현량 비교
CFC-MSC의 조골세포로의 비정상적인 분화 원인을 규명하기 위하여 조골세포로 분화시키는 동안 조골세포 분화 관련 마커 유전자들인 ALP, RUNX2, BSP, OCN 및 OPN의 mRNA 발현 수준을 실시간-PCR(real-time PCR)을 통해 확인하였다.
상기 실험예 <2-2>에 기재된 방법으로 WT-MSC 및 CFC-MSC를 조골세포로 분화시킨 후 7일째에 세포를 수득하였다. 수득된 세포를 트리졸(TRIzol; Invitrogen, 미국)에 현탁하고 제조사의 프로토콜에 따라 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA 1 ㎍을 주형으로 Oligo dT 프라이머 및 M-MLV 역전사 합성효소(M-MLV reverse transcriptase; Enzynomics 사)를 사용하여 제 1가닥 cDNA(first-strand cDNA)를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 하기 [표 4]에 기재된 각 유전자에 대한 프라이머 세트를 이용, CFX-Connect 실시간 검출 시스템(CFX-Connect real-time detection system, Bio-Rad 사)으로 실시간 PCR(real-time PCR)을 수행하여, CFC-MSC로부터 분화된 조골세포(CFC-조골세포)에서 각 유전자의 상대적인 발현량을 확인하였다. 발현 수준을 보정하기 위한 대조군으로 GAPDH 유전자를 이용하였으며, 각 유전자의 △Ct 값은 GAPDH 및 각각의 유전자의 Ct값의 차이로 계산하였다. WT-MSC로부터 분화된 조골세포(WT-조골세포)에서의 각 유전자의 발현량을 확인하고, 이를 CFC-조골세포의 유전자의 발현량과 각각 비교하여 2-( SΔCt - CΔCt ) (S△Ct: CFC-iPS에서 각 유전자의 △Ct 값; 및 C△Ct: WT-iPS에서 각 유전자의 △Ct 값)로 계산되는 발현 배수(fold change)로 나타내었다.

실시간 PCR을 위해 사용한 프라이머 및 그 서열
유전자 프라이머명 서열 (5’to 3’ 서열번호
GAPDH GAPDH_F GAAGGTGAAGGTCGGAGTC 1
GAPDH_R GAAGATGGTGATGGGATTTC 2
RUNX2 RUNX2_F TAGGCGCATTTCAGATGATG 3
RUNX2_R GACTGGCGGGGTGTAAGTAA 4
OPN OPN_F ACAGCCAGGACTCCATTGAC 5
OPN_R ACACTATCACCTCGGCCATC 6
OCN OCN_F GGCAGCGAGGTAGTGAAGAG 7
OCN_R AGCAGAGCGACACCCTAGAC 8
ALP ALP_F GTACGAGCTGAACAGGAACA 9
ALP_R CTTGGCTTTTCCTTCATGGT 10
BSP BSP_F CTCAGCATTTTGGGAATGGC 11
BSP_R GTCACTACTGCCCTGAACTG 12
그 결과, WT-조골세포에 비해 CFC-조골세포에서 ALP, RUNX2, BSP 및 OCN 유전자의 발현이 전반적으로 낮음을 확인하였다. 이에 반해, OPN 유전자만 CFC-조골세포에서 특이적으로 WT-조골세포보다 높게 발현되는 것을 확인하였다(도 8).
<3-2> CFC- MSC의 조골세포로의 분화시 마커 단백질 발현량 비교
CFC-MSC의 조골세포로의 비정상적인 분화 원인을 규명하기 위하여 조골세포로 분화시키는 동안 조골세포 분화 관련 마커 유전자들인 RUNX2 및 OPN 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다.
상기 실험예 <2-2>에 기재된 방법으로 WT-MSC 및 CFC-MSC를 조골세포로 분화시킨 후 7일째에 세포를 수득하고 상기 실험예 <1-5>에 기재된 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다. 1차 항체로 토끼 유래 항-RUNX2 항체(Cell signaling Technologies, #12556)와 마우스유래 항-OPN 항체(Abcam, ab69498)를 각각 1:1000으로 희석하여 처리하였다. 마우스유래 항-OPN 항체에 대한 2차 항체로는 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)가 결합된 염소(goat) 유래 항-마우스 IgG (H+L) 2차 항체(Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate; Santa Cruz 사)를 사용하였다.
그 결과 상기 실험예 <3-1>의 결과와 동일하게 RUNX2 단백질 발현은 감소, OPN 단백질 발현은 증가되어 있음을 확인하였다(도 9). RUNX2의 발현 감소는 다른 분화 관련 유전자들의 발현을 전반적으로 저해시켜 조골세포로의 분화를 억제할 수 있다고 알려져 있는 바 CFC 신드롬 조골세포도 이러한 원인으로 인해 비정상적인 분화 및 성숙을 보이는 것으로 예상된다.
<3-3> CFC- MSC의 조골세포로의 분화시 신호전달분자 p- ERK 및 p- SMAD2의 발현 확인
CFC-MSC의 조골세포로의 비정상적인 분화와 관련, ERK 신호전달경로와 transforming growth factor-beta(TGF-beta) 신호전달경로의 활성화 수준을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. TGF-beta 신호전달체계는 p-SMAD2의 발현 수준으로 그 활성을 확인할 수 있으며, 과활성화된 경우 조골세포의 성숙을 방해하는 것으로 알려져 있다(Erlebacher and Derynck 1996, Maeda, Hayashi et al. 2004).
상기 실험예 <2-2>에 기재된 방법으로 WT-MSC 및 CFC-MSC를 조골세포로 분화시킨 후 7일째에 세포를 수득하고 상기 실험예 <1-5>에 기재된 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다. 1차 항체로 토끼 유래 항-ERK1/2 항체(Cell signaling Technologies, #9120) 및 토끼 유래 항-p-ERK1/2 항체(Cell signaling Technologies, #4370)는 각각 1:1000으로, 토끼 유래 항-SMAD2/3 항체(Cell signaling Technologies, #3102) 및 토끼 유래 항-p-SMAD2 항체(Cell signaling Technologies, #3108)는 각각 1:500으로 희석하여 처리하였다.
그 결과 WT-MSC로부터 분화된 조골세포와 비교하여 CFC-MSC로부터 분화된 조골세포에서 p-ERK와 p-SMAD2의 수준이 유의미하게 증가되어 있음을 확인하였다(도 10).
<3-4> MSC의 조골세포로의 분화시 ERK 신호전달경로 및 transforming growth factor-beta( TGF -beta) 신호전달경로의 상호 관계 규명
CFC-MSC로부터 분화된 조골세포에서 활성화된 ERK 신호전달경로와 TGF-beta 신호전달경로간의 크로스톡(crosstalk)을 조사하기 위하여 정상 조골세포에서 각각의 신호전달체계를 인위적으로 활성화시킬 수 있는 PDGF(platelet-derived growth factor) 또는 액티빈 A(50ng/ml)을 처리하고 웨스턴 블롯을 수행하였다.
구체적으로 상기 실험예 <2-2>에 기재된 방법으로 WT-MSC를 조골세포로 분화를 유도하고 1일 째에 10ng/ml의 농도로 PDGF를 처리하거나 50ng/ml의 농도로 액티빈 A를 각각 처리하였다. 7일째에 세포를 수득하여 상기 실험예 <1-5>에 기재된 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다.
그 결과 ERK와 TGF-beta 신호전달경로는 둘중 하나가 활성화되면 상대방의 활성 또한 증가시키는 양성 피드백 현상을 나타내는 것을 관찰하였다(도 11). 이 결과는 CFC 신드롬 조골세포에서 나타나는 TGF-beta 신호전달체계의 비정상적인 증가가 BRAF 돌연변이에 의한 ERK 신호전달체계의 활성화에 의해 발생할 수 있다는 것을 제시한다.
<3-5> MSC의 조골세포로의 분화시 pSMAD1의 발현 확인
BMP (Bone morphogenic protein) 신호전달경로는 조골세포 분화 및 성숙을 촉진, 조골세포 분화에 필수적인 역할을 하는 것으로 보고되었다(Phimphilai, Zhoa et al. 2006). 이에 CFC-MSC로부터 분화된 조골세포에서 상기 BMP 신호전달경로의 변화여부를 그 주요지표인 p-SMAD1의 발현을 측정함으로써 조사하였다.
상기 실험예 <2-2>에 기재된 방법으로 WT-MSC 및 CFC-MSC를 조골세포로 분화시킨 후 7일째에 세포를 수득하고 상기 실험예 <1-5>에 기재된 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다. 1차 항체로 토끼 유래 항-p-SMAD1/5/9 항체(Cell signaling Technologies, #13820), 토끼 유래 항-SMAD1 항체(Cell signaling Technologies, #9743)를 각각 1:500으로 희석하여 사용하였다.
- CFC-조골세포에서 p-SMAD1의 수준, 즉 BMP 신호전달체계의 활성이 WT-조골세포에 비해 유의미하게 낮음을 western blot을 통해 관찰하였다(그림 12).
그 결과 WT-MSC로부터 분화된 조골세포와 비교하여 CFC-MSC로부터 분화된 조골세포에서 p-SMAD1의 발현, 즉 BMP 신호전달경로가 유의미하게 저해되어 있음을 확인하였다(도 12). 이는 상기 실험예 <2-2>에서 확인한 CFC-MSC의 조골세포로의 분화능 저해와 일맥상통하는 결과이다.
< 실험예 4> ERK 신호전달경로, TGF -beta 신호전달경로 및 BMP 신호전달경로 조절을 통한 CFC 신드롬 환자의 치료 효과 확인
<4-1> ERK 신호전달경로, TGF -beta 신호전달경로 및 BMP 신호전달경로 조절을 통한 CFC-조골세포의 ALP 효소활성 및 골미네랄 침착량 증가 확인
ERK 신호전달경로, TGF-beta 신호전달경로 또는 BMP 신호전달경로 조절 물질을 처리하여 CFC-조골세포의 저하된 ALP 효소 활성 및 골미네랄 침착정도를 개선시킬 수 있는지 조사하였다.
상기 실험예 <2-2>에 기재된 방법으로 CFC-MSC를 조골세포로 분화를 유도하고 1일 째에 ERK 신호전달경로 저해제인 U0126(Cell Signaling Technology사) 5μM, TGF-beta 신호전달경로 저해제인 SB-431542 (SB, Cayman Chemical사) 5μM 또는 BMP 신호전달경로 활성화제인 재조합 단백질 BMP4(human bone morphogenic protein 4, R&D systems 사)를 50 ng/ml의 농도로 24시간동안 처리하였다. 분화 유도 7일째에 ALP 효소 활성을, 14일째에 alizarin red S 염색을 상기 실험예 <2-2>에 기재된 방법으로 수행하였다. 또한 21일째에 von Kossa 염색을 수행하였다. 구체적으로 세포를 PBS로 1회 세척하고 포르말린 용액으로 상온에서 10분간 고정시킨 다음 증류수로 3회 세척하였다. 이후 5% 질산은(silver nitrate) 용액으로 자외선 아래에서 1시간(상온) 배양하였다. 증류수로 최종적으로 2회 세척 후 검게 변한 정도로 칼슘 침착량을 평가하였다.
그 결과 ERK 신호전달경로 또는 TGF-beta 신호전달경로를 억제시키거나 BMP 신호전달경로를 활성화시키는 경우 CFC-MSC로부터 분화한 조골세포의 ALP 효소 활성을 증가시키고(도 13), 골미네랄 침착 또한 증가시킬 수 있음을(도 14) 확인, 즉 CFC-MSC의 조골세포로의 비정상적이었던 분화결함을 정상적으로 회복시킬 수 있음을 확인하였다.
<4-2> ERK 신호전달경로, TGF -beta 신호전달경로 및 BMP 신호전달경로 조절을 통한 CFC-조골세포의 마커 유전자 발현 회복 확인
상기 실험예 <4-1>에서 확인한 것과 유사하게, ERK 신호전달경로, TGF-beta 신호전달경로 또는 BMP 신호전달경로 조절 물질을 처리하여 실험예 <3-1>에서 확인한 바와 같이 CFC-조골세포에서 저하된 분화관련 마커 유전자의 발현을 정상적으로 회복시킬 수 있는지 조사하였다.
상기 실험예 <2-2>에 기재된 방법으로 CFC-MSC를 조골세포로 분화를 유도하고 1일째에 24시간 동안 ERK 신호전달경로 저해제인 U0126(Cell Signaling Technology사) 5μM, TGF-beta 신호전달경로 저해제인 SB-431542 (SB, Cayman Chemical사) 5μM 또는 BMP 신호전달경로 활성화제인 재조합 단백질 BMP4(human bone morphogenic protein 4, R&D systems 사)를 50 ng/ml의 농도로 처리하였다. 분화 유도 7일째에 세포를 수득한 후 <3-1>에 기재된 것과 같이 실시간 PCR을 통해 ALP, RUNX2, OCN, OPN 및 BSP 유전자의 발현을 조사하였다.
그 결과 CFC-조골세포에서 변화되었던 유전자 발현이 정상적인 방향으로 회복되는 것이 관찰되었다(도 15). 이러한 결과는 ERK 신호전달경로, TGF-beta 신호전달경로 또는 BMP 신호전달경로의 조절을 통해 CFC-조골세포의 결함을 회복시킬 수 있음을 보여주며, CFC 신드롬 환자의 치료를 위한 새로운 분자생물학적 타겟 및 후보 물질을 제시하는 의의가 있다.
< 실험예 5> CFC- MSC 및 이로부터 분화된 조골세포를 이용한 약물 스크리닝 플랫폼 구축
ALP는 조골세포 분화 및 골미네랄 형성에 매우 중요하며 필수적인 역할을 하는 효소이다. CFC-조골세포는 WT-조골세포에 비해 저하된 ALP 효소 활성을 나타내므로 CFC-조골세포에서 ALP의 효소 활성을 회복시킬 수 있는 화합물을 발견하면 CFC 신드롬 환자의 골형성 이상 및 골밀도 저하 증상에 적용이 가능할 것으로 예상된다. 이에 이러한 약물을 대량으로 스크리닝할 수 있는 플랫폼을 구축하였다.
<5-1> CFC- iPSC로부터 유래한 CFC- MSC의 조골세포로의 효율적인 대량 유도/화합물 처리조건 확립
배양된 MSC를 PBS로 1회 세척하고 0.25% trypsin-EDTA를 37°C에서 2분간 처리하여 배양접시에서 분리한 후, 조골세포 배양배지에 재현탁하여 384 well 플레이트(black, optically clear bottom, tissue culture treated, sterile, greiner 사)에 5×103 개/40㎕/well의 농도로 분주하였다. 세포를 균일하게 분주하는 것은 Labsystems MultiDrop 384 (BECKMAN COULTER 사) 기계를 사용하였다. 24시간 후 스크리닝에 사용할 화합물 및 양성 대조군, 음성 대조군을 원하는 농도로 각 well에 처리한 후 배지를 교환하지 않고 6일간 추가로 배양하였다. 화합물을 일정 농도로 희석하고 384 well 플레이트에 추가하는 과정은 Biomek FXp Laboratory Automation Workstation (BEXKMAN COULTER 사)를 이용하였다.
<5-2> 상기 분화된 조골세포의 대량 배양 조건에서 ALP 효소 활성의 안정적 정량 분석 조건 확립
상기 <5-1>의 화합물 처리 상태로 분화된 세포를 7일째에 PBS(85㎕/well)로 1회 세척한 후 1-Step PNPP 용액(30㎕/well, Thermo scientific 사)을 상온에서 20분간 처리하였다. 2N NaOH(15㎕/well)를 추가하여 반응을 정지시키고, 405nm 파장에서 흡광도를 측정하여 ALP 효소 활성을 비교하였다. 분석시 384 well 플레이트에 용액을 처리하는 것은 Labsystems MultiDrop 384 (BECKMAN COULTER 사) 기계를 활용하였다. WT-MSC로부터 분화된 조골세포를 정상 대조군으로 사용하였고, CFC-조골세포에 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 처리한 것을 음성 대조군, CFC-조골세포에 5μM SB-431542를 처리한 군을 양성 대조군으로 사용하였다. 가장자리 효과(Edge effect)를 줄이기 위해, 384 well 플레이트의 가장자리는 비우거나 증류수로 채우고, 해당 well은 기본값(basal level)으로 세팅하여 흡광도 값을 보정하였다.
<110> Korea Advanced Institute Of Science And Technology <120> COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING CARDIOFACIOCUTANEOUS SYNDROME <130> 2017P-11-047 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Forward primer <400> 1 gaaggtgaag gtcggagtc 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Reverse primer <400> 2 gaagatggtg atgggatttc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RUNX2 Forward primer <400> 3 taggcgcatt tcagatgatg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RUNX2 Reverse primer <400> 4 gactggcggg gtgtaagtaa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPN Forward primer <400> 5 acagccagga ctccattgac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPN Reverse primer <400> 6 acactatcac ctcggccatc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCN Forward primer <400> 7 ggcagcgagg tagtgaagag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCN Reverse primer <400> 8 agcagagcga caccctagac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALP Forward primer <400> 9 gtacgagctg aacaggaaca 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALP Reverse primer <400> 10 cttggctttt ccttcatggt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSP Forward primer <400> 11 ctcagcattt tgggaatggc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSP Reverse primer <400> 12 gtcactactg ccctgaactg 20 <210> 13 <211> 408 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Ile Pro Gly Asn Arg Met Leu Met Val Val Leu Leu Cys Gln Val 1 5 10 15 Leu Leu Gly Gly Ala Ser His Ala Ser Leu Ile Pro Glu Thr Gly Lys 20 25 30 Lys Lys Val Ala Glu Ile Gln Gly His Ala Gly Gly Arg Arg Ser Gly 35 40 45 Gln Ser His Glu Leu Leu Arg Asp Phe Glu Ala Thr Leu Leu Gln Met 50 55 60 Phe Gly Leu Arg Arg Arg Pro Gln Pro Ser Lys Ser Ala Val Ile Pro 65 70 75 80 Asp Tyr Met Arg Asp Leu Tyr Arg Leu Gln Ser Gly Glu Glu Glu Glu 85 90 95 Glu Gln Ile His Ser Thr Gly Leu Glu Tyr Pro Glu Arg Pro Ala Ser 100 105 110 Arg Ala Asn Thr Val Arg Ser Phe His His Glu Glu His Leu Glu Asn 115 120 125 Ile Pro Gly Thr Ser Glu Asn Ser Ala Phe Arg Phe Leu Phe Asn Leu 130 135 140 Ser Ser Ile Pro Glu Asn Glu Val Ile Ser Ser Ala Glu Leu Arg Leu 145 150 155 160 Phe Arg Glu Gln Val Asp Gln Gly Pro Asp Trp Glu Arg Gly Phe His 165 170 175 Arg Ile Asn Ile Tyr Glu Val Met Lys Pro Pro Ala Glu Val Val Pro 180 185 190 Gly His Leu Ile Thr Arg Leu Leu Asp Thr Arg Leu Val His His Asn 195 200 205 Val Thr Arg Trp Glu Thr Phe Asp Val Ser Pro Ala Val Leu Arg Trp 210 215 220 Thr Arg Glu Lys Gln Pro Asn Tyr Gly Leu Ala Ile Glu Val Thr His 225 230 235 240 Leu His Gln Thr Arg Thr His Gln Gly Gln His Val Arg Ile Ser Arg 245 250 255 Ser Leu Pro Gln Gly Ser Gly Asn Trp Ala Gln Leu Arg Pro Leu Leu 260 265 270 Val Thr Phe Gly His Asp Gly Arg Gly His Ala Leu Thr Arg Arg Arg 275 280 285 Arg Ala Lys Arg Ser Pro Lys His His Ser Gln Arg Ala Arg Lys Lys 290 295 300 Asn Lys Asn Cys Arg Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val 305 310 315 320 Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr Gln Ala Phe Tyr 325 330 335 Cys His Gly Asp Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr 340 345 350 Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Ser Ile 355 360 365 Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu 370 375 380 Tyr Leu Asp Glu Tyr Asp Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Glu Met 385 390 395 400 Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg 405

Claims (10)

  1. SB-431542, LY2109761, LY2157299, LY-364937, SD-208 및 Ki26894으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 TGF-β 신호전달경로 억제제를 유효성분으로 함유하는 CFC 신드롬(cardiofaciocutaneous syndrome, 심장-얼굴-피부 증후군)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 TGF-β 신호전달경로 억제제는 CFC 신드롬 환자의 조골세포에서 p-SMAD2의 발현을 억제하는 것인 CFC 신드롬의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 TGF-β 신호전달경로 억제제는 CFC 신드롬 환자의 조골세포에서 ALP 효소 활성 또는 골미네랄 침착정도를 증가시키는 것인 CFC 신드롬의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. SB-431542, LY2109761, LY2157299, LY-364937, SD-208 및 Ki26894으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 TGF-β 신호전달경로 억제제를 유효성분으로 함유하는 CFC 신드롬(cardiofaciocutaneous syndrome, 심장-얼굴-피부 증후군)의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  5. BMP4(human bone morphogenic protein 4) 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 CFC 신드롬(cardiofaciocutaneous syndrome, 심장-얼굴-피부 증후군)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 BMP4 단백질은 서열번호 13으로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 것인 CFC 신드롬(cardiofaciocutaneous syndrome, 심장-얼굴-피부 증후군)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 BMP4 단백질은 CFC 신드롬 환자의 조골세포에서 p-SMAD1의 발현을 증가시키는 것인 CFC 신드롬의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 BMP4 단백질은 CFC 신드롬 환자의 조골세포에서 ALP 효소 활성 또는 골미네랄 침착정도를 증가시키는 것인 CFC 신드롬의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. BMP4(human bone morphogenic protein 4) 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 CFC 신드롬(cardiofaciocutaneous syndrome, 심장-얼굴-피부 증후군)의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  10. i) 시험관 내에서 CFC 신드롬 환자로부터 유래된 iPSC로부터 분화된 조골세포에 피검 화합물 또는 조성물을 처리하는 단계;
    ii) 상기 단계 i)의 조골세포에서 ALP 효소 활성 또는 골미네랄 침착 정도를 분석하는 단계; 및
    iii) 무처리 대조군과 비교하여 ALP 효소 활성 또는 골미네랄 침착 정도를 증가시키는 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는, CFC 신드롬의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
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