CN113329752A

CN113329752A - 用白喉毒素-人白细胞介素-3缀合物与其它药剂组合治疗骨髓增生性肿瘤的组合治疗方法

Info

Publication number: CN113329752A
Application number: CN201980071179.0A
Authority: CN
Inventors: I·伯格斯坦
Original assignee: Stanlin Treatment Co
Current assignee: Stanlin Treatment Co; Stemline Therapeutics Inc
Priority date: 2018-10-31
Filing date: 2019-10-30
Publication date: 2021-08-31
Also published as: JP2022513403A; IL282679A; BR112021007945A2; CA3117678A1; BR122023024088A2; EP3873476A1; MX2021004895A; US20220001020A1; AU2019370284A1; SG11202103189VA; WO2020092505A1; KR20210133947A

Abstract

本发明提供了用于治疗或抑制有需要的受试者的骨髓增生性肿瘤(MPN)的方法，所述方法包括向所述受试者施用白喉毒素‑人白细胞介素‑3缀合物(DT‑IL3)和一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂。

Description

用白喉毒素-人白细胞介素-3缀合物与其它药剂组合治疗骨髓增生性肿瘤的组合治疗方法

相关申请的交叉引用

本国际申请要求于2018年10月31日提交的美国临时申请序列号62/753,145和于2019年4月11日提交的美国临时申请序列号62/832,558的优先权权益，所述美国临时申请中的每个美国临时申请的内容通过全文引用特此并入。

序列表

本申请与电子格式的序列表一同提交。序列表以创建于2019年10月21日的标题为“2019-10-21_01214-0017-00PCT_SEQ_List_ST25.txt”的文件的形式提供，所述文件大小为12,288字节。序列表的电子格式的信息通过引用其整体并入本文。

技术领域

本发明提供用于治疗或抑制有需要的受试者的骨髓增生性肿瘤(MPN)的方法。所述方法包括向所述受试者施用白喉毒素-人白细胞介素-3缀合物(DT-IL3)和一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂。

背景技术

骨髓增生性肿瘤(MPN)，也称为骨髓增生性疾病(MPD)，是以骨髓细胞过度产生为特征的血液系统疾病。MPN的特征还在于骨髓中一个或多个造血细胞系的克隆性扩增。在某些情况下，MPN患者的干细胞中可能存在基因突变，如Jak2蛋白突变。

MPN可能导致某些血细胞增多、血细胞异常和脾脏扩大(脾肿大)。MPN可能损伤骨髓并导致骨髓纤维化(bone marrow fibrosis)(骨髓纤维化(myelofibrosis)或MF)。由于MPN中血细胞计数发生变化，因此可能会产生贫血、疲劳和虚弱。如血栓形成等血栓出血并发症也是MPN的风险。MPN的进展可能导致罹患另外的病状，如急性髓性白血病。

本申请描述了用于用白喉毒素-人白细胞介素-3缀合物(DT-IL3)和一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂治疗MPN的改进方法。

发明内容

根据说明书，本申请描述了用DT-IL3和(a)一种或多种Jak抑制剂和/或(b)一种或多种低甲基化剂进行治疗的方法。

在一个实施例中，本申请提供了一种用于治疗或抑制有需要的受试者的骨髓增生性肿瘤(MPN)的方法，所述方法包括向所述受试者施用白喉毒素-人白细胞介素-3缀合物(DT-IL3)和a)一种或多种Jak抑制剂和/或b)一种或多种低甲基化剂。

在一些实施例中，所述DT-IL3以1p[μg/kg或更大、2μg/kg或更大或者4μg/kg或更大的剂量施用。在一些实施例中，所述DT-IL3以2μg/kg到20μg/kg或9μg/kg到20μg/kg的剂量施用。在一些实施例中，所述DT-IL3以4μg/kg到12μg/kg或9μg/kg到12μg/kg的剂量施用。在一些实施例中，所述DT-IL3以5、7、9或12μg/kg的剂量施用。在一些实施例中，所述DT-IL3的施用剂量为最大耐受剂量。

在一些实施例中，每周至少一次施用所述DT-IL3和所述一种或多种Jak抑制剂和/或低甲基化剂。在一些实施例中，每周至少两次施用所述DT-IL3和所述一种或多种Jak抑制剂和/或低甲基化剂。在一些实施例中，每周至少三次施用所述DT-IL3和一种或多种Jak抑制剂和/或低甲基化剂。

在一些实施例中，在一周或更长的时间段内施用所述DT-IL3和所述(a)一种或多种Jak抑制剂和/或所述(b)一种或多种低甲基化剂。在一些实施例中，在两周或更长的时间段内施用所述DT-IL3和所述(a)一种或多种Jak抑制剂和/或所述(b)一种或多种低甲基化剂。

在一些实施例中，至少连续3天施用所述DT-IL3和所述(a)一种或多种Jak抑制剂和/或所述(b)一种或多种低甲基化剂。

在一些实施例中，在多个治疗周期中施用所述DT-IL3和所述(a)一种或多种Jak抑制剂和/或所述(b)一种或多种低甲基化剂。在一些实施例中，治疗周期相隔至少1周、相隔至少2周、相隔至少3周、相隔至少4周、相隔至少5周或其组合。

在一些实施例中，所述DT-IL3在四个周期内每21天至少连续3天施用、随后在3个周期内每28天施用并且然后每42天施用。

在一些实施例中，每天至少一次或每天至少两次施用所述一种或多种Jak抑制剂。

在一些实施例中，在至少一个周期的至少前3天、至少前4天、至少前5天、至少前6天或至少前7天施用所述一种或多种低甲基化剂。

在一些实施例中，在施用DT-IL3四个21天周期之后，在28天周期的至少前3天、至少前4天、至少前5天、至少前6天或至少前7天施用所述一种或多种低甲基化剂，持续3个周期。

根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用所述DT-IL3和所述(a)一种或多种Jak抑制剂和/或所述(b)一种或多种低甲基化剂，直到获得疾病进展和/或不可接受的毒性为止。

在一些实施例中，向所述受试者施用包括所述DT-IL3和所述(a)一种或多种Jak抑制剂和/或所述(b)一种或多种低甲基化剂的药物组合物。

在一些实施例中，所述受试者为人。在一些实施例中，所述人具有不利的细胞遗传学。

在一些实施例中，所述DT-IL3是化学缀合物。

在一些实施例中，所述DT-IL3是重组表达蛋白。

在一些实施例中，所述DT-IL3表达为包括白喉毒素和人IL-3的催化结构域和易位结构域的单一多肽。在一些实施例中，表达为包括白喉毒素的所述催化结构域和易位结构域的单一多肽的所述DT-IL3包括氨基酸序列SEQ ID NO：3，和/或所述人IL-3包括氨基酸序列SEQ ID NO：1。

在一些实施例中，所述DT-IL3包括通过肽键与人IL-3连接的白喉毒素的氨基酸残基1到388。在一些实施例中，所述白喉毒素具有氨基酸序列SEQ ID NO：2，和/或人IL-3具有氨基酸序列SEQ ID NO：1。

在一些实施例中，抑制使MPN细胞增殖减少、MPN细胞数量稳定和/或MPN细胞数量减少。

在一些实施例中，抑制使脾脏和/或肝脏大小减小。

在一些实施例中，所述MPN为真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、骨髓纤维化、慢性髓单核细胞白血病、慢性中性粒细胞白血病、慢性嗜酸性粒细胞白血病、系统性肥大细胞增多症、症状性高嗜酸性粒细胞病症或引起过量红细胞、白细胞和/或血小板产生的其它骨髓病症。在一些实施例中，所述MPN是骨髓纤维化。在一些实施例中，所述骨髓纤维化是原发性骨髓纤维化、真性红细胞增多症后骨髓纤维化、原发性血小板增多症后骨髓纤维化、急变期原发性骨髓纤维化、急变期真性红细胞增多症后骨髓纤维化或急变期ET后骨髓纤维化。

在一些实施例中，所述MPN处于急变期。

在一些实施例中，所述MPN是急变期原发性骨髓纤维化、急变期真性红细胞增多症后骨髓纤维化或急变期ET后骨髓纤维化。

在一些实施例中，所述一种或多种Jak抑制剂包括鲁索替尼(ruxolitinib)。

在一些实施例中，所述一种或多种低甲基化剂包括阿扎胞苷(azacitidine)、地西他滨(decitabine)和/或SGI-110。

在一些实施例中，施用至少一种Jak抑制剂和至少一种低甲基化剂。

在一些实施例中，所述至少一种Jak抑制剂包括鲁索替尼，并且所述至少一种低甲基化剂包括地西他滨、阿扎胞苷和/或SGI-110。

在一些实施例中，所述受试者对利用一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂的预先治疗无反应。在一些实施例中，所述受试者对利用Jak抑制剂鲁索替尼的预先治疗无反应。在一些实施例中，所述受试者患有MF。

在一些实施例中，所述受试者不能耐受利用一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂的预先治疗的全剂量。在一些实施例中，所述受试者不能耐受利用Jak抑制剂鲁索替尼的预先治疗的全剂量。在一些实施例中，所述受试者患有MF。

在一些实施例中，所述受试者的血小板计数低或不适合利用鲁索替尼的治疗。在一些实施例中，所述受试者患有MF。

在一些实施例中，所述受试者先前对Jak抑制剂和/或低甲基化剂有应答。在一些实施例中，所述受试者患有MF。

在一些实施例中，所述受试者具有JAK2、MPL、ASXL1、TET2或CALR基因的突变。在一些实施例中，所述受试者具有JAK2V617F突变。

本文还提供了用于治疗或抑制有需要的受试者的骨髓增生性肿瘤(MPN)的药物组合物，所述药物组合物包括有效量的白喉毒素-人白细胞介素-3缀合物(DT-IL3)和一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂。在一些实施例中，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂。

本文还提供了用于治疗有需要的受试者的骨髓增生性肿瘤(MPN)的方法，所述方法包括：a)鉴定所述MPN，以及b)向所述有需要的受试者施用有效量的白喉毒素-人白细胞介素-3缀合物(DT-IL3)和一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂。

在一些实施例中，通过体检、血液测试、骨髓抽吸和活检、细胞遗传学分析、针对JAK2、MPL、ASXL1、TET2或CALR基因的突变的测试、动脉血氧饱和度和羧血红蛋白水平、中性粒细胞碱性磷酸酶水平、维生素B12或B12结合能力或血清尿酸盐来鉴定所述MPN。

在一些实施例中，通过针对JAK2V617F突变进行测试来鉴定所述MPN。

另外的目的和优点将在下面的描述中进行部分阐述，并且部分将通过描述而清楚，或者可以通过实践本公开进行了解。这些目的和优点将通过所附权利要求中特别指出的元素和组合来实现和获得。

应当理解的是，前述总体说明以及以下详细说明都仅仅是示例性和说明性的，并不限制权利要求。

并入本说明书中并且构成本说明书的一部分的附图展示一个(几个)实施例，并且与描述一起用于解释本文所述的原理。

附图说明

图1A-1E示出了通过流式细胞术评估的慢性髓单核细胞白血病(CMML)患者(N＝20)的母细胞(blast)和单核细胞上CD123的表达。淋巴细胞CD123表达用作对照。图1A示出了CMML母细胞、单核细胞和淋巴细胞上CD123的平均荧光强度。图1B示出了相对于淋巴细胞上CD123的平均荧光强度归一化的CMML母细胞和单核细胞上CD123的平均荧光强度。图1C和1D示出了不同CMML亚型(CMML-0、CMML-1和CMML-2)的母细胞(图1C)和单核细胞(图1D)上CD123的平均荧光强度。结果相对于淋巴细胞上CD123的平均荧光强度归一化。图1E示出了CMML亚型CMML-1和CMML-2中CD123阳性母细胞的百分比。总体而言，图1A-1E表明，相对于淋巴细胞，CD123在CMML患者的母细胞和单核细胞上高度表达。

图2A-2C示出了在体外用浓度增加的阿扎胞苷(AZA，图2A)、DT-IL-3(SL-401，图2B)或AZA和DT-IL3的组合(图2C)治疗后，CD123表达性K562细胞系的细胞活力测定的结果。当与单独的AZA相比时，AZA和DT-IL3显著降低了K562细胞活力。

图3A-3B示出了在体外用AZA、DT-IL3或AZA和DT-IL3(SL-401)的组合治疗后，来自CMML患者的外周血的新鲜单核细胞的细胞活力测定的结果。在图3A中，细胞暴露于浓度增加的AZA或AZA和DT-IL3的组合。在图3B中，细胞暴露于1μM AZA、4.8nM DT-IL3或1μM AZA和4.8nM DT-IL3的组合。总体而言，图3A-3B表明，当与单独的AZA相比时，AZA和DT-IL3显著降低了原代CMML单核细胞的细胞活力。

图4A-4D示出了使用来自CMML患者外周血的新鲜单核细胞进行的集落形成测定的结果。图4A-4D示出了单个患者的细胞的结果。在图4A-4C中，细胞暴露于单独的AZA(1、5或10μM)或1μM AZA和DT-IL-3(2.5或10nM)的组合。向1μM AZA中添加10nM的DT-IL3使集落形成显著减少。在图4D中，细胞暴露于单独的DT-IL3(2.5、10或20nM)或10nM DT-IL3和AZA(1或2.5μM)的组合。向DT-IL3中添加AZA使集落形成显著减少。总体而言，图4A-4D表明，当与单独的AZA或DT-IL3相比时，AZA和DT-IL3显著减少了CMML单核细胞的集落形成。

序列说明

表1提供了本文引用的某些序列的列表。

具体实施方式

I.治疗药物

本申请提供治疗骨髓增生性肿瘤(MPN)的方法，所述方法包括向受试者施用白喉毒素-人白细胞介素-3缀合物(DT-IL3)和(a)一种或多种Jak抑制剂和/或(b)一种或多种低甲基化剂。

在一些实施例中，同时或在同一天施用DT-IL3和(a)一种或多种Jak抑制剂和/或(b)一种或多种低甲基化剂。在一些实施例中，药物组合物包括DT-IL3和(a)一种或多种Jak抑制剂和/或(b)一种或多种低甲基化剂。

在一些实施例中，分开施用DT-IL3和(a)一种或多种Jak抑制剂和/或(b)一种或多种低甲基化剂。在一些实施例中，在不同的时间或不同的日期施用DT-IL3和(a)一种或多种Jak抑制剂和/或(b)一种或多种低甲基化剂。

A.白喉毒素-人白细胞介素-3缀合物(DT-IL3)

“DT-IL3”是指人白细胞介素-3(IL-3)和白喉毒素(DT)的缀合物。DT-IL-3缀合物在本技术领域中是已知的，并且本文设想了其根据本公开的方法的施用。例如，美国专利第7,763,242号；美国专利第8,470,307号；美国专利第9,181,317号；美国专利第9,631,006号和WO2008/030539中描述的DT-IL-3缀合物可以根据本发明所公开的方法使用。这些参考文献通过引用的方式以其针对DT-IL3的公开内容整体并入本文。还参见例如以下文献中的缀合物：Liu等人，《实验血液学(Exp.Hematol.)》32：277-281(2004)；Hogge等人，《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》12：1284-1291(2006)；Testa等人，《血液(Blood)》106：2527-2529(2005)；以及Klein等人，《生化与生理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)》288：1244-1249(2001)，所述文献也通过引用以其整体并入。

在某些实施例中，所述缀合物包括通过共价键与人IL-3融合的白喉毒素的催化结构域和易位结构域。在某些实施例中，白喉毒素通过肽连接体连接到缀合物的人IL-3部分。缀合物的连接体的长度可以是例如两个、三个、四个、五个、十个、多达十五个或十五个氨基酸。连接体的长度可以改变以提供缀合物的最佳结合。在一些实施例中，肽连接体的长度是两个到四个氨基酸。肽连接体可以是His-Met连接体。尽管无意受制于特定的作用机制，但是柔性肽连接体促进链配对并最小化可能的重折叠。连接体分子在本领域内众所周知，并在以下文献中已有描述：Denardo等人，1998，《临床癌症研究》4：2483-90；Peterson等人，1999，《生物缀合化学(Bioconjug.Chem.)》10：553；以及Zimmerman等人，1999，《核医学与生物学(Nucl.Med.Biol.)》26：943-50，所述文献各自通过引用以其整体并入。

在一些实施例中，本申请提供了包含本发明的DT-IL3以及药学上可接受的载体的药物组合物。根据本发明，缀合物可以包含通过本领域已知的任何连接体与IL-3的任何结构域连接的DT的任何结构域。在某些实施例中，缀合物为DT₃₈₈IL-3，其是N-末端蛋氨酸以及之后的通过His-Met氨基酸连接体融合到全长成熟的人IL-3的DT的氨基酸1-388的融合蛋白。

在一些实施例中，DT-IL3将选择性靶向介导到表达白细胞介素-3受体(IL-3受体)的细胞。在一些实施例中，DT-IL3靶向表达IL-3受体的MPN细胞。在一些实施例中，DT-IL3靶向肿瘤微环境中的促瘤细胞(如IL-3R+浆细胞样树突细胞)。

1.IL-3

白细胞介素-3(IL-3)是支持多潜能和定向骨髓和淋巴祖细胞的增殖和分化的细胞因子。参见例如Nitsche等人，《干细胞(Stem Cells)》21：236-244(2003)。IL-3也被称为造血生长因子、肥大细胞生长因子(MCGF)、多潜能集落刺激因子或P细胞刺激因子。

在一些实施例中，DT-IL3缀合物包含通过重组技术或通过化学(共价)键与白喉毒素(DT)或其部分、类似物或衍生物缀合的全长成熟的(缺乏信号肽)白细胞介素-3蛋白质(IL-3)或其结合到白细胞介素-3受体或其在细胞表面上表达的亚单位的部分、类似物或衍生物，所述毒素缺乏天然细胞结合结构域。

IL-3的片段、类似物和衍生物可以用于本发明，前提是当融合到缀合物的DT部分时，此类片段、类似物和衍生物维持结合IL-3受体或在细胞表面上表达的天然IL-3受体的亚单位的能力。所述片段、类似物和衍生物的结合动力学性质可以保持不变或仅变化不超过25％。IL-3多肽可以来自任何物种。在某些实施例中，IL-3为哺乳类动物IL-3，例如，IL-3多肽为人IL-3、其类似物、衍生物或片段。

在一些实施例中，IL-3为人IL-3。可以在GenBank数据库(参见例如登录号AAC08706)或UniProt#P08700中找到人IL-3的示例性氨基酸序列。人IL-3的示例性氨基酸序列为：

msrlpvllll qllvrpglqa pmtqttslkt swvncsnmid eiithlkqpp lplldfnnln

gedqdilmen nlrrpnleaf nravkslqna saiesilknl lpclplataa ptrhpihikd

gdwnefrrkl tfylktlena qaqqttlsla if[SEQ ID NO：1]。

在一些实施例中，IL-3与SEQ ID NO：1至少50％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

2.白喉毒素

白喉毒素(DT)是具有三个结构域的蛋白质：催化结构域(氨基酸26-112；下面SEQID NO：1中带下划线的序列)，所述催化结构域由富含精氨酸的二硫环连接到易位结构域(氨基酸225-404；SEQ ID NO：1中以斜体表示的序列)，其后为细胞结合结构域(氨基酸406-559)。从GenBank登录号AOU74567.1或UniProt#A0A142BWN1访问获得的DT的示例性氨基酸序列为：

MSRKLFASIL IGALLGIGAP PSAHAGADDV VDSSKSFVME NFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGN YDDDWKGFYS TDNKYDAAGY SVDNENPLSGKAGGVVKVTY PGLTKVLALK VDNAETIKKE LGLSLTEPLM EQVGTEEFIK RFGDGASRVV LSLPFAEGSS SVEYINNWEQAKALSVELEI NFETRGKRGQ DAMYEYMAQA CAGNRVRRSV GSSLSCINLD WDVIRDKTKT KIESLKEHGPIKNKMSESPN KTVSEEKAKQ YLEEFHQTAL EHPELSELKT VTGTNPVFAG ANYAAWAVNV AQVIDSETADNLEKTTAALS ILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIAL SSLMVAQAIPLVGELVDIGF AAYNFVESIINLFQVVHNSY NRPAYSPGHK TQPFLHDGYA VSWNTVEDSI IRTGFQGESG HDIKITAENT PLPIAGVLLPTIPGKLDVNK SKTHISVNGR KIRMRCRAID GDVTFCRPKS PVYVGNGVHA NLHVAFHRSS SEKIHSNEISSDSIGVLGYQ KTVDHTKVNS KLSLFFEIKS[SEQ ID NO：2]。

DT的片段、类似物和衍生物可以用于本申请中。在一些实施例中，DT由DT的催化结构域、易位结构域和细胞结合结构域组成。在一些实施例中，DT由DT的细胞结合结构域和催化结构域组成。在一些实施例中，DT由DT的细胞结合结构域和易位结构域组成。在一些实施例中，DT由DT的催化结构域和易位结构域组成。在一些实施例中，DT包括易位结构域、催化结构域或细胞结合结构域之一。

缀合到IL-3的DT片段是DT的催化结构域和易位结构域，由示例性SEQ ID NO：3表示：

GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KGFYSTDNKYDAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFIKRFGDGASRVVLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFETR GKRGQDAMYE YMAQACAGNR VRRSVGSSLSCINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPIKNKM SESPNKTVSE EKAKQYLEEF HQTALEHPEL SELKTVTGTNPVFAGANYAA WAVNVAQVID SETADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMVAQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHKTRP[SEQ ID NO：3]。

在一些实施例中，DT片段与SEQ ID NO：3至少50％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

3.用于产生DT-IL3缀合物的方法

本发明的DT-IL3缀合物可以通过标准重组DNA技术或蛋白质合成技术(例如，通过使用肽合成器)制成。例如，可以通过包含自动DNA合成器在内的常规技术来合成对本发明中的缀合物进行编码的核酸分子。可替代地，可以使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述锚定引物在两个连续的基因片段之间产生互补突出端，随后使其退火并再扩增以生成嵌合基因序列(参见例如《分子生物学实验指南(Current Protocols in MolecularBiology)》，Ausubel等人编，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)，1992)。

可以从本领域技术人员可获得的任何信息中(即，从GenBank、文献或通过常规克隆)获得编码本发明的缀合物(IL-3和白喉毒素序列)的核苷酸序列。编码缀合物的核苷酸序列可以插入到适当的表达载体中，即，含有所插入的蛋白质编码序列的转录和翻译所必需的元件的载体。在一些情况下，可以截断白喉毒素序列，以便去除特定的结构域，如靶向结构域。用于修饰或截断DNA的技术为分子生物学领域的技术人员所熟知。此外，IL-3和白喉毒素序列可以连接，其方式使得生成的DNA序列在翻译时所产生的多肽为本发明的化合物。在一些实施例中，将连接体序列引入到连接IL-3序列和白喉毒素序列的重组序列中。在本发明中可以利用多种宿主-载体系统来表达蛋白质编码序列。这些包含但不限于感染病毒(例如，痘苗病毒、腺病毒等)的哺乳动物细胞系统；感染病毒(例如，杆状病毒)的昆虫细胞系统；含有酵母载体的微生物，如酵母(如毕赤酵母(Pichia))；或用噬菌体、DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌(如大肠杆菌(E.coli))。载体的表达元件在其强度和特异性方面不同。根据所利用的宿主-载体系统，可以使用多个合适的转录和翻译元件中的任何一个。在一些实施例中，蛋白质在大肠杆菌中表达。在一些实施例中，蛋白质在毕赤酵母中表达。

可以通过本领域已知的任何启动子或增强子元件控制本发明的缀合物的表达。在一些实施例中，通过组成型启动子调节本发明的缀合物的表达。在另一实施例中，通过诱导型启动子调节表达。在另一实施例中，通过组织特异性启动子调节表达。

在一些实施例中，使用了载体，所述载体包括可操作地连接到缀合物编码核酸的启动子、一个或多个复制起点以及任选的一个或多个可选标记(例如，抗生素抗性基因)。

可以通过三种一般方法鉴定含有编码缀合物的插入基因的表达载体：(a)核酸杂交，(b)“标记”基因功能的存在或不存在，以及(c)插入序列的表达。在第一种方法中，可以使用包括与编码缀合物的插入基因同源的序列的探针，通过核酸杂交来检测表达载体中编码缀合物的基因的存在。在第二种方法中，可以基于是否存在由于在载体中插入了编码缀合物的核苷酸序列而引起的某些“标记”基因功能(例如，胸苷激酶活性、对抗生素的抗性、转化表型、杆状病毒中包涵体形成等)来鉴定和选择重组载体/宿主系统。例如，如果将编码缀合物的核苷酸序列插入载体的标记基因序列中，则可以通过缺少标记基因功能来鉴定含有编码缀合物插入物的基因的重组体。在第三种方法中，可以通过测定重组体表达的基因产物(例如，缀合物)来鉴定重组表达载体。此类测定可以基于例如体外测定系统中缀合物的物理或功能性质，例如与抗体或IL-3受体结合。

重组缀合物可以稳定表达以用于长期、高产量生产。例如，可以工程化稳定表达本发明缀合物的细胞系。可以用由适当的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)控制的DNA以及可选标记来转化宿主细胞而不使用含有病毒复制起点的表达载体来转化宿主细胞。在引入外来DNA后，可以使工程化的细胞在富集的培养基中生长1-2天，然后切换到选择性培养基。重组质粒中的可选标记赋予对选择的抗性，并且允许细胞将质粒稳定地整合到其染色体中并生长形成病灶，进而可以将所述病灶克隆并且扩展到细胞系中。此方法可以有利地用于工程化表达本发明缀合物的细胞系。

如上文所述，DT-IL3通常是使用含有经工程化以表达缀合物蛋白的核酸的细菌、昆虫或哺乳动物细胞重组产生的。

一旦通过重组表达或化学合成产生了本发明的缀合物，就可以通过本领域已知的用于纯化蛋白质的任何方法对其进行纯化，例如，通过色谱法(如，离子交换、亲和力(特别是蛋白A后对特异性抗原的亲和力)和分级柱色谱法)、离心、差别溶解或通过用于蛋白质纯化的任何其它标准技术。

B.Jak抑制剂

如本文所使用的，“Jak抑制剂”是抑制一种或多种Janus激酶(Jak)的药剂。Jak抑制剂可以是抑制一种或多种Jak的任何药剂，无论此药剂是否具有其它药理作用。Jak包含Jak1、Jak2、Jak3和TVk2。在一些实施例中，Jak抑制剂抑制Jak1或Jak2。在一些实施例中，Jak抑制剂是Jak2/Jak1抑制剂。在一些实施例中，Jak抑制剂还可以抑制其它激酶。

Jak介导对造血和免疫功能至关重要的某些细胞因子和生长因子的信号传导。在一些实施例中，抑制一种或多种Jak减少了脾肿大并降低循环细胞因子水平。

在一些实施例中，一种或多种Jak抑制剂包括鲁索替尼、甘多替尼(gandotinib)、莫洛替尼(momelotinib)、帕克替尼(pacritinib)、CHZ868、NS-018、SRC、托法替尼(tofacitinib)或伊他替尼(itacitinib)。在一些实施例中，根据本文提供的方法中的一些方法所使用的Jak抑制剂是鲁索替尼。

C.低甲基化剂

如本文所使用的，“低甲基化剂”是抑制DNA甲基化(即，向DNA核苷酸添加甲基)的任何药物。低甲基化剂可以是任何抑制DNA甲基化的药剂，无论此药剂是否具有其它药理作用。

在一些实施例中，低甲基化剂阻断DNA甲基转移酶的活性(即，所述化合物为DNA甲基转移酶抑制剂或DNMT抑制剂)。在一些实施例中，低甲基化剂降低DNA甲基化而不引起对DNA合成的实质性抑制。在一些实施例中，低甲基化剂恢复基因的正常功能。在一些实施例中，低甲基化剂引起快速分裂细胞死亡。

在一些实施例中，一种或多种低甲基化剂包括阿扎胞苷、地西他滨和/或SGI-110。

D.给药

本发明的药剂可以以任何临床相关剂量给药。所谓临床相关，是指药剂的剂量对受试者有影响。在一些实施例中，本文所公开的药剂的组合允许以比当作为单一药剂给药时所述药剂将产生效果的剂量低的剂量水平给药一种或多种药剂。例如，将DT-IL3与一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂一起使用的治疗提供临床相关效果，而当作为单一药剂给药时，相同剂量的Jak抑制剂或低甲基化剂则不会发现这种效果。

在一些实施例中，一种或多种药剂以最大耐受剂量给药。本文所使用的“最大耐受剂量”是指单个患者能够耐受的药剂的最高剂量。换言之，给定患者的副作用可以决定最大耐受剂量。副作用可能会限制施用比最大耐受剂量高的治疗剂量的能力。因此，给定患者的最大耐受剂量可能低于治疗处方信息中所指示的剂量或临床实践中常用的剂量。最大耐受剂量可能对患者的临床功效有限或没有临床功效。

1.DT-IL3的示例性剂量

在一些实施例中，所述DT-IL3以1μg/kg或更大、2μg/kg或更大或者4μg/kg或更大的剂量施用。在一些实施例中，DT-IL3以2μg/kg到20μg/kg或9μg/kg到20μg/kg的剂量施用。在一些实施例中，所述DT-IL3以4μg/kg到12μg/kg或9μg/kg到12μg/kg的剂量施用。在一些实施例中，所述DT-IL3以5μg/kg的剂量施用。在一些实施例中，所述DT-IL3以7μg/kg的剂量施用。在一些实施例中，所述DT-IL3以9μg/kg的剂量施用。在一些实施例中，所述DT-IL3以12μg/kg的剂量施用。

在一些实施例中，所述DT-IL3的施用剂量为最大耐受剂量。

2.Jak抑制剂的示例性剂量

在一些实施例中，一种或多种Jak抑制剂包括鲁索替尼。在一些实施例中，鲁索替尼的口服剂量为0.5mg、1mg、2.5mg、5mg、10mg、15mg、20mg或25mg。

在一些实施例中，甘多替尼的口服剂量为0.5mg、1mg、2.5mg、5mg、10mg、15mg、30mg、60mg、90mg或120mg。

在一些实施例中，莫洛替尼的口服剂量为0.5mg、1mg、2.5mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、300mg或400mg。

在一些实施例中，帕克替尼的口服剂量为0.5mg、1 mg、2.5mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、300mg或400mg。

在一些实施例中，CHZ868的口服剂量为0.5mg、1mg、2.5mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、300mg或400mg。

在一些实施例中，NS-018的口服剂量为0.5mg、1mg、2.5mg、5mg、10mg、15mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、300mg或400mg。

在一些实施例中，SRC的口服剂量为0.5mg、1mg、2.5mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、300mg或400mg。

在一些实施例中，托法替尼的口服剂量为0.5mg、1 mg、2.5mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg或30mg。

在一些实施例中，依他替尼的口服剂量为0.5mg、1mg、2.5mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、300mg或400mg。

在一些实施例中，Jak抑制剂的施用剂量为最大耐受剂量。

3.低甲基化剂的示例性剂量

在一些实施例中，阿扎胞苷

以75mg/m2或以下的剂量给药。在一些实施例中，阿扎胞苷以1mg/m2、2.5mg/m2、5mg/m2、10mg/m2、15mg/m2、20mg/m2、25mg/m2、37.5mg/m2、50mg/m2、75mg/m2或100mg/m2的剂量通过连续静脉输注或皮下注射给药。

在一些实施例中，地西他滨

以45毫克/平方米/天或以下的剂量给药。在一些实施例中，地西他滨

以1毫克/平方米/天、5毫克/平方米/天、10毫克/平方米/天、15毫克/平方米/天、20毫克/平方米/天、33毫克/平方米/天或45毫克/平方米/天的剂量给药。输注可以是每天一次连续静脉输注，也可以是一天多次连续静脉输注。

在一些实施例中，SGI-110(胍地西他滨(guadecitabine))以1mg/m2、3mg/m2、5mg/m2、10mg/m2、15mg/m2、20mg/m2、25mg/m2、30mg/m2或60mg/m2的剂量通过皮下注射给药。

在一些实施例中，低甲基化剂的施用剂量为最大耐受剂量。

在一些实施例中，在施用低甲基化剂之前，针对恶心和呕吐对受试者进行预先用药。

II.治疗方法

在一些实施例中，将DT-IL3与(a)一种或多种Jak抑制剂和/或(b)一种或多种低甲基化剂一起施用以治疗MPN。

在一些实施例中，治疗方法包括向受试者施用DT-IL3和一种或多种Jak抑制剂。

在一些实施例中，治疗方法包括向受试者施用DT-IL3和一种或多种低甲基化剂。

在一些实施例中，治疗方法包括向受试者施用DT-IL3、一种或多种Jak抑制剂以及一种或多种低甲基化剂。在一些实施例中，施用至少一种Jak抑制剂和至少一种低甲基化剂。在一些实施例中，所述至少一种Jak抑制剂包括鲁索替尼，并且所述至少一种低甲基化剂包括地西他滨、阿扎胞苷和/或SGI-110。

在一些实施例中，治疗方法包括向受试者施用DT-IL3和地西他滨。

在一些实施例中，治疗方法包括向受试者施用DT-IL3和阿扎胞苷。

在一些实施例中，治疗方法包括向受试者施用DT-IL3和SGI-110。

如本文所使用的，术语“受试者”和“患者”可互换使用。如本文所使用的，术语“受试者”是指动物。在一些实施例中，所述动物是哺乳动物，如非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如，猴和人)。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，受试者是非人类动物，如农场动物(例如马、猪或牛)或宠物(例如，狗或猫)。在一些实施例中，受试者是老年人。在一些实施例中，受试者是成人。在一些实施例中，受试者是人类儿童。在一些实施例中，受试者是人类小儿(即小于18岁的人类)。在一些实施例中，受试者是人类婴儿。

在一些实施例中，受试者具有不利的细胞遗传学。受试者基于生存结果被确定为具有有利或不利的细胞遗传学。不利的细胞遗传学是指与不利的结果相关的细胞遗传学风险概况。MF受试者的不利的细胞遗传学可以包含例如复杂核型(≥3个重排异常)或一项或两项异常，包含三体8、缺失7/7q、倒位17q、倒位3、缺失5/5q、缺失12p或11q23重排，并且有利的细胞遗传学包含所有其它情况，包含正常核型。

在一些实施例中，所述受试者对利用一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂的预先治疗无反应。如本文所使用的，如果患者未能获得对疗法的应答，从而确定所述疗法在治疗上无效，如：未达到临床终点，包含任何应答、延长应答持续时间、延长无病状态、生存期、无复发生存期、无进展生存期和总生存期，则受试者对预先治疗“无反应”。在一些实施例中，受试者对利用鲁索替尼的预先治疗无反应。在一些实施例中，对利用鲁索替尼的预先治疗无反应的受试者患有骨髓纤维化(MF)。

在一些实施例中，所述受试者不能耐受利用一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂的预先治疗的全剂量。如本文所使用的，“全剂量”是指处方信息中所指示的一种或多种剂量和/或临床实践中常用的剂量。在一些实施例中，给定患者的最大耐受剂量低于全剂量。换言之，受试者因副作用而不能耐受预先治疗的全剂量。在一些实施例中，受试者不能耐受利用鲁索替尼的预先治疗的全剂量。在一些实施例中，不能耐受利用鲁索替尼的预先治疗的全剂量的受试者患有MF。

在一些实施例中，所述受试者的血小板计数低或不适合利用鲁索替尼的治疗。在一些实施例中，血小板计数低或不适合利用鲁索替尼的治疗的受试者患有MF。在一些实施例中，血小板计数低以等于或低于5×10⁹/L、等于或低于10×10⁹/L、等于或低于20×10⁹/L、等于或低于30×10⁹/L、等于或低于40×10⁹/L或者等于或低于50×10⁹/L的血小板计数度量。在一些实施例中，由于肾损害或肝损害，患者可能不适合利用鲁索替尼的治疗。

在一些实施例中，所述受试者先前对Jak抑制剂和/或低甲基化剂有应答。在一些实施例中，先前对Jak抑制剂和/或低甲基化剂有应答的受试者患有MF。在一些实施例中，受试者先前对鲁索替尼有应答。先前对MF治疗失败的很多原因已得到表征，如骨髓抑制、耐药性和潜在恶性克隆的持续存在(参见Pettit和Odenike，《最新血液恶性肿瘤报告(CurrHematol Malig Rep.)》，12(6)：611-624(2017))。

A.骨髓增生性肿瘤

在一些实施例中，MPN为真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)、骨髓纤维化(MF)、慢性髓单核细胞白血病(CMML)、慢性中性粒细胞白血病、慢性嗜酸性粒细胞白血病、系统性肥大细胞增多症(SM)、症状性高嗜酸性粒细胞病症或引起过量红细胞、白细胞和/或血小板产生的其它骨髓病症。在一些实施例中，MPN为原发性嗜酸性粒细胞病症(PED)。

在一些实施例中，MPN为骨髓纤维化(MF)。MF的特征在于骨髓被瘢痕组织替代。由于骨髓瘢痕形成，所产生的血细胞数量可能不足，并且可能导致贫血、出血问题和感染风险。肝脏和脾脏可能会扩大，以试图产生另外的血细胞。

在一些实施例中，MF为原发性MF(PMF)、真性红细胞增多症后MF(PV后MF)、原发性血小板增多症后MF(ET后MF)、急变期原发性MF(PMF-BP)、急变期PV后MF，或急变期ET后MF。

在一些实施例中，所述MPN处于急变期。

在一些实施例中，MPN是PMF-BP、急变期PV后MF，或急变期ET后MF。

B.患有MPN的受试者的治疗和鉴定

在一些实施例中，用于治疗有需要的受试者的MPN的方法包括鉴定MPN并向有需要的受试者施用有效量的DT-IL3和一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂。

在一些实施例中，通过体检、血液测试、骨髓抽吸和活检、细胞遗传学分析、针对JAK2、MPL、ASXL1、TET2或CALR基因的突变的测试、动脉血氧饱和度和羧血红蛋白水平、中性粒细胞碱性磷酸酶水平、维生素B12或B12结合能力或血清尿酸盐来鉴定所述MPN。在一些实施例中，JAK2基因的突变是JAK2V617F突变。

在一些实施例中，患者具有JAK2、MPL、ASXL1、TET2或CALR基因的突变。在一些实施例中，患者具有JAK2V617F突变。

C.测量临床疗效的方法

在一些实施例中，抑制MPN使MPN细胞增殖减少、MPN细胞数量稳定和/或MPN细胞数量减少。如本文所使用的，“MPN细胞”是指引起MPN的任何异常骨髓细胞。

在一些实施例中，抑制MPN使脾脏和/或肝脏大小减小。在一些实施例中，在治疗之前和之后的不同时间点通过MRI或CT对脾脏大小进行测量。在一些实施例中，患有MPN的受试者具有异常大的脾脏(即脾肿大)或异常大的肝脏。在一些实施例中，通过体检将脾肿大定义为在肋缘下(BCM)≥5cm。

在一些实施例中，患有MPN的受试者没有异常大的脾脏或异常大的肝脏。在一些实施例中，患有MPN的受试者没有基线脾肿大(≤5cm BCM)。

在一些实施例中，脾脏大小的减小是脾脏大小减少至少25％、至少29％、至少33％、至少35％、至少40％或至少50％。在一些实施例中，脾脏大小的减小是患有基线脾肿大的受试者的脾脏大小减少≥33％。符合脾脏度量减小的参数的受试者是治疗“脾脏应答者”。

在一些实施例中，通过脾肿大的改善来测量临床功效。在一些实施例中，通过脾脏应答者的百分比来测量一组受试者中脾肿大的改善。

在一些实施例中，通过脾肿大的百分比变化来测量脾肿大的改善，所述脾肿大的百分比变化通过左肋缘下可触及的厘米数来测量。

在一些实施例中，所述受试者患有MF。MF的应答标准包含但不限于来自针对MF的国际工作组-MRT和ELN(International Working Group-MRT and ELN for MF)的下表2中的示例性应答标准。

表2

改编自Tefferi等人，《血液》122(6)：1395-98(2013)。在表2中，CR＝完全应答或缓解，PR＝部分应答或缓解，EMH＝髓外造血，LCM＝左肋缘，并且UNL＝正常上限。*基线和治疗后骨髓切片将通过中央审查过程进行一次性解释。CR分配不要求细胞遗传学和分子应答。

MF的分级依据欧洲分类法(Thiele等人，《血液学(Haematologica)》90：1128(2005))。

未成熟髓样细胞构成母细胞+早幼粒细胞+髓细胞+晚幼粒细胞+有核红细胞。在脾切除患者中，允许<5％的未成熟髓样细胞。§贫血应答、脾脏应答和进行性疾病的定义见上文。贫血严重程度的增加包括发生新的输血依赖性，或血红蛋白水平从预处理基线下降≥20g/L，持续至少12周。根据不良事件通用术语标准(Common Terminology Criteria for AdverseEvents，CTCAE)4.0版，血小板减少或中性粒细胞减少的严重程度增加被定义为血小板计数或绝对中性粒细胞计数较预处理基线下降2级。另外，对CI的分配需要≥25000×10(9)/L的最小血小板计数和≥0.5×10(9)/L的绝对中性粒细胞计数。||仅适用于基线血红蛋白＜100g/L的患者。对于在研究登记时不符合严格的输血依赖性标准但在前一个月内已接受输血的患者，应以输血前的血红蛋白水平作为基线。

研究登记前的输血依赖性被定义为在研究登记前的12周内，在不存在出血或治疗诱导的贫血的情况下，对于血红蛋白水平＜85g/L，输血至少6个单位的堆积红细胞(PRBC)。另外，最近的输血事件必须发生在研究登记前28天内。输血依赖性患者的应答需要在治疗阶段的任何连续“滚动”12周间隔期间没有任何PRBC输血，以血红蛋白水平≥85g/L为上限。#在脾切除术患者中，可触及的肝肿大用相同的测量策略代替。**脾脏或肝脏应答必须经过成像研究证实，其中需要通过MRI或CT评估脾脏体积减少≥35％。此外，通过MRI或CT，只要脾脏或肝脏的体积减少≥35％，则无论体检报告如何，均构成应答。

通过MPN-SAF TSS.17对症状进行评估。MPN-SAF TSS由患者自己评估，并且其包含疲劳、注意力集中、早饱、不活动、盗汗、瘙痒、骨痛、腹部不适、体重减轻和发烧。每项评分为0(不存在/极好)到10(可想象的最差/极差)。MPN-SAFTSS是所有个人评分(0-100分)的总和。症状应答要求MPN-SAF TSS降低≥50％。

脾肿大的进行性疾病分配需要证实MRI或计算机断层扫描显示脾脏体积较基线增加≥25％。体检和成像研究的基线值均指治疗前基线，而非治疗后的测量。

III.药剂施用

这些方法包括DT-IL3和一种或多种Jak抑制剂和/或低甲基化剂的多种施用方案。

在一些实施例中，每周至少一次施用DT-IL3。在一些实施例中，每周至少两次施用DT-IL3。在一些实施例中，每周至少三次施用DT-IL3。

在一些实施例中，每周至少一次施用一种或多种Jak抑制剂。在一些实施例中，每周至少两次施用一种或多种Jak抑制剂。在一些实施例中，每周至少三次施用一种或多种Jak抑制剂。在一些实施例中，每隔一天施用一种或多种Jak抑制剂。在一些实施例中，每天施用一种或多种Jak抑制剂。在一些实施例中，每天多于一次施用一种或多种Jak抑制剂。在一些实施例中，每天两次施用一种或多种Jak抑制剂。

在一些实施例中，每周至少一次施用一种或多种低甲基化剂。在一些实施例中，每周至少两次施用一种或多种低甲基化剂。在一些实施例中，每周至少三次施用一种或多种低甲基化剂。在一些实施例中，每天施用一种或多种低甲基化剂。在一些实施例中，每天两次施用一种或多种低甲基化剂。在一些实施例中，每天三次施用一种或多种低甲基化剂。在一些实施例中，每天施用一种或多种低甲基化剂持续一定时间段，然后在一定时间段内不施用所述一种或多种低甲基化剂。在一些实施例中，每天施用一种或多种低甲基化剂持续长达7天的时间段。

在一些实施例中，在一周或更长的时间段内施用所述DT-IL3和所述(a)一种或多种Jak抑制剂和/或所述(b)一种或多种低甲基化剂。在一些实施例中，在两周或更长的时间段内施用所述DT-IL3和所述(a)一种或多种Jak抑制剂和/或所述(b)一种或多种低甲基化剂。在一些实施例中，至少连续3天施用所述DT-IL3和所述(a)一种或多种Jak抑制剂和/或所述(b)一种或多种低甲基化剂。

A.治疗周期

在一些实施例中，在多个治疗周期中施用所述DT-IL3和所述(a)一种或多种Jak抑制剂和/或所述(b)一种或多种低甲基化剂。

如本文所使用的，“治疗周期”是指施用DT-IL3和(a)一种或多种Jak抑制剂和/或(b)一种或多种低甲基化剂的时间段。在一些实施例中，存在单个治疗周期。在一些实施例中，存在多个治疗周期。

在一些实施例中，当未施用DT-IL3和(a)一种或多种Jak抑制剂和/或(b)一种或多种低甲基化剂时，在多个治疗周期之间存在一定时间段。在一些实施例中，治疗周期相隔至少1周、相隔至少2周、相隔至少3周、相隔至少4周、相隔至少5周或其组合。

在一些实施例中，所述DT-IL3在四个周期内每21天至少连续3天施用、随后在3个周期内每28天施用并且然后每42天施用。在一些实施例中，与DT-IL3同时施用一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂。

在一些实施例中，每天至少一次或每天至少两次施用一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂。

在一些实施例中，在至少一个周期的至少前3天、至少前4天、至少前5天、至少6天或至少7天施用一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂。

在一些实施例中，在以28天为一个周期的3个周期的至少前3天、至少前4天、至少前5天、至少前6天或至少前7天施用一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂。在一些实施例中，DT-IL3与一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂同时施用。在一些实施例中，在施用DT-IL3四个21天周期之后施用一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂。

在一些实施例中，施用DT-IL3和(a)一种或多种Jak抑制剂和/或(b)一种或多种低甲基化剂，直到例如由治疗医生确定获得疾病进展和/或不可接受的毒性为止。

IV.药物组合物

在一些实施例中，用于治疗或抑制有需要的受试者的骨髓增生性肿瘤(MPN)的药物组合物包括有效量的DT-IL3和一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂。在一些实施例中，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂。

在一些实施例中，本发明提供一种药物组合物，其包括有效量的本发明的缀合物和药学上可接受的载体或媒剂。在一些实施例中，药物组合物包括有效量的本发明的缀合物和药学上可接受的载体或媒剂。所述药物组合物适合对动物和/或人类施用。

本发明的药物组合物可以呈允许向受试者施用所述组合物的任何形式。

用于制备所述药物组合物的材料在所用的数量下可以是无毒的。对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，药物组合物中的一种或多种活性成分的最佳剂量将取决于多种因素。相关因素包含但不限于受试者的类型(例如，人类)、受试者的整体健康水平、受试者所患癌症的类型、作为多药物方案的一部分的所述组合物的用途、本发明组合物的特定形式以及施用方式。

术语“载体”是指与本发明的组合物一起施用的稀释剂、佐剂或赋形剂。可以使用任何助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在一个实施例中，当施用给受试者时，本发明的组合物和药学上可接受的载体是无菌的。当静脉内施用本发明的组合物时，水可以是载体。盐溶液以及右旋糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。如有需要，本发明组合物还可以含有少量pH缓冲剂。

本发明的液体组合物，无论是溶液、悬浮液或其它类似形式，还均可以包含以下中的一种或多种：如注射用水、盐水溶液、生理盐水、林格氏(Ringer′s)溶液、等渗氯化钠等无菌稀释剂，如可以用作溶剂或悬浮培养基的合成甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、环糊精、丙二醇或其它溶剂等固定油；如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯等抗菌剂；如抗坏血酸或亚硫酸氢钠等抗氧化剂；如乙二胺四乙酸等螯合剂；如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐等缓冲剂；以及如氯化钠或右旋糖等用于调节张力的药剂。可以将肠胃外组合物封装在由玻璃、塑料或其它材料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。在一些实施例中，生理盐水是佐剂。可注射组合物可以是无菌的。

所述药物组合物包括有效量的本发明组合物，以便获得适当的剂量。通常，按药物组合物的重量计，此量是至少0.01％的本发明组合物。当旨在用于口服施用时，此量可以在药物组合物的0.1重量％与80重量％之间变化。按药物组合物的重量计，口服药物组合物可以包括介于4％与50％之间的本发明组合物。可以制备药物组合物，使得肠胃外剂量单位含有介于0.01重量％与2重量％之间的本发明组合物。

可以通过任何方便的途径(例如通过输注或快速浓注、通过上皮或皮肤粘膜内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收)施用药物组合物。施用可以是全身性的或局部的。各种递送系统是已知的，例如微粒、微胶囊、胶囊等，并且可以用于施用本发明组合物。施用方法可以包含但不限于口服施用和肠胃外施用；肠胃外施用包含但不限于皮内、肌肉内、腹腔内、静脉内、皮下；鼻内、硬膜外、舌下、鼻内、脑内、脑室内、鞘内、阴道内、经皮、经直肠、通过吸入，或对耳、鼻、眼或皮肤局部施用。施用方式由行医者自行决定，并且部分取决于医疗病状的部位(如癌症、癌性肿瘤或癌前病况的部位)。

在一些实施例中，本发明的组合物肠胃外施用。在一些实施例中，本发明的组合物静脉内施用。在另一实施例中，本发明的组合物通过连续输注施用。在特定实施例中，本发明的组合物通过持续15分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时或2小时的输注施用。

在一些实施例中，可能期望的是，向需要治疗的区域局部施用本发明的一种或多种组合物。这可以通过例如但不限于以下的方式实现：手术期间的局部输注；局部施加，例如与手术后的伤口敷料结合使用；通过注射；通过导管；通过栓剂；或通过植入物，所述植入物是多孔、非多孔或凝胶材料，包含膜(如硅橡胶膜)或纤维。在某些实施例中，本发明的一种或多种组合物可以腹腔内注射。

在又另一实施例中，本发明的组合物可以在受控释放系统中递送。

在一些实施例中，泵可以用于递送本发明的组合物(参见例如Sefton，《生物医学工程CRC评论参考(CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.)》1987，14，201；Buchwald等人，《外科学(Surgery)》1980，88：507；Saudek等人，《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》1989，321：574)。在一些实施例中，泵可以是但不限于类胰岛素泵。

本发明组合物可以采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、小丸剂、胶囊、含有液体的胶囊、粉剂、缓释调配物、栓剂、乳剂、气雾剂、喷雾剂、悬浮液的形式或任何其它适合使用的形式。E.W.Martin的《雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)》中描述了合适的药物载体的实例。

在一些实施例中，根据常规程序将本发明组合物调配为适于对动物、特别是人类静脉内施用的药物组合物。通常，用于静脉内施用的载体或媒剂为无菌等渗缓冲水溶液。必要时，所述组合物还可以包含增溶剂。用于静脉内施用的组合物可以任选地包括局部麻醉剂，如用于缓解注射部位疼痛的利多卡因。一般地，将成分分开或混合在一起以单位剂型提供，例如，作为在气密封容器中的干燥冻干粉或无水浓缩剂，所述气密封容器如指示活性剂的量的安瓿或小药囊。在通过输注施用本发明的组合物时，可以例如用含有无菌药用级水或盐水的输注瓶分配。当本发明的组合物通过注射施用时，可以提供无菌注射用水或盐水的安瓿以使得成分可以在施用之前混合。

本发明的组合物可以包括选自包含但不限于以下的另外的活性剂：另外的预防剂、另外的治疗剂、止吐剂、造血集落刺激因子、辅助疗法、疫苗或其它免疫刺激剂、基于抗体/抗体片段的药剂、抗抑制剂和镇痛剂。在一些实施例中，药物组合物包括医药上可接受的载体或媒剂。

药物组合物可以使用医药领域所熟知的方法制备。例如，可以通过将本发明组合物与水组合以形成溶液来制备旨在通过注射施用的组合物。可以添加表面活性剂以促进均匀溶液或悬浮液的形成。表面活性剂是可以与本发明组合物非共价相互作用以促进本发明组合物在水性递送系统中的溶解或均匀悬浮的复合物。

实例

实例1.DT-IL3和低甲基化剂的体外测试

使用人白血病细胞系以及来自CMML患者外周血的原代单核细胞进行临床前研究。为了在体外测定低甲基化剂(HMA)阿扎胞苷(AZA)和DT-IL3(SL-401)的活性浓度，将细胞暴露于浓度增加的AZA、DT-IL3或其组合，并进行细胞活力测定。在CD123表达性K562细胞系中，AZA和DT-IL3的IC50分别为772μM和4.8nM(图2A-2C)。图2A-2C表明，与单独的AZA相比，AZA和DT-IL3显著降低了K562细胞活力。

接下来使用暴露于浓度增加的AZA和DT-IL3的CMML患者外周血中的新鲜单核细胞在体外进行细胞活力测定。单一药剂AZA的IC50为1442μM，而AZA和DT-IL3(浓度为4.8nM)的组合的IC50为725μM(图3A)。与单独的1μM AZA相比，在此测定中向1μM AZA中添加4.8nMDT-IL3使细胞活力显著降低(图3B；p＜0.05)。

在使用来自CMML患者外周血的新鲜单核细胞进行的集落形成测试中，与单一药剂AZA相比，AZA和DT-IL3的组合显著减少了集落形成(图4A-4C，p＜0.05)。类似地，与单一药剂DT-IL3相比，向增加浓度的DT-IL3中添加AZA显著减少了集落形成(图4D，p＜0.05)。重要的是，在具有高风险基因型的患者样品中观察到了组合效应，包含具有NRAS/ASXL1/TET2的突变(图4C)和SRSF2/TET2/STAG2的突变(图4A)的那些。

目前CMML的治疗选项是有限的，并且CMML的治疗仍然是一个重要的未满足的医疗需求。尽管HMA疗法已被证实在CMML中具有功效，但其作用范围和持续时间往往有限。临床前数据(包含原发性CMML样品中的临床前数据)证明了HMA和DT-IL3的组合在CMML中的潜在治疗作用。参见图2A-2C、3A-3B和4A-4D。

实例2.从未接受过治疗的患者的临床试验

临床试验可以评估DT-IL3和一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂对从未接受过治疗的MPN患者的功效。“从未接受过治疗”的意思是这些患者以前没有接受过针对MPN的治疗。例如，这些患者没有接受过利用Jak抑制剂或低甲基化剂的预先治疗。

试验中的患者可能患有一系列不同类型的MPN。可替代地，试验中的所有患者可能患有骨髓纤维化。

基于体检、血液测试、骨髓抽吸和活检、细胞遗传学分析、针对JAK2、MPL、ASXL1、TET2或CALR基因的突变的测试、动脉血氧饱和度和羧血红蛋白水平、中性粒细胞碱性磷酸酶水平、维生素B12或B12结合能力或血清尿酸盐水平，患者可能被诊断为患有MPN。

试验可以具有自适应设计。换言之，试验可以允许在试验期间修改试验和/或程序。可替代地，试验可能设立了在整个试验期间维持的治疗组。

治疗组可以包含将DT-IL3与DT-IL3和一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂的组合进行比较。

治疗组可以包含将一种或多种Jak抑制剂与DT-IL3和一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂的组合进行比较。

治疗组可以包含将一种或多种低甲基化剂与DT-IL3和一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂的组合进行比较。

利用自适应设计，对用一种或多种低甲基化剂或一种或多种Jak抑制剂治疗失败的患者可以用DT-IL3和一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂的组合开始治疗。

可以通过MPN试验中所使用的标准措施如脾脏和/或肝脏大小的减小来对治疗的成功或失败进行评估。治疗期间还将对血液成分的变化、疾病复发和患者生存率进行评估。在治疗期间将测量毒性和不良事件。

可以使用本申请中描述的任何药剂剂量和治疗周期。DT-IL3可以是DT₃₈₈IL-3。Jak抑制剂可以是鲁索替尼。一种或多种低甲基化剂可以是阿扎胞苷、地西他滨和/或SGI-110。

申请人希望经治疗的患者能看到临床改善。

实例3.难治性患者的临床试验

临床试验可以评估DT-IL3和一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂在对预先治疗无反应或不能耐受预先治疗的全剂量的MPN患者中的功效。预先治疗可以是一种或多种低甲基化剂或一种或多种Jak抑制剂。鲁索替尼可以是预先治疗。

难治性患者的临床试验可能不包含患者对其无反应的预先治疗的治疗组。难治性患者的临床试验可以将DT-IL3和一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂的功效与患者先前未用其进行治疗的药剂的功效进行比较。例如，对鲁索替尼无反应的患者的试验可以包含低甲基化剂的治疗组和DT-IL3和一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂的治疗组。

除对患者的选择外，难治性患者的临床试验可以与从未接受过治疗的患者的临床试验具有相似或相同的参数。

申请人希望经治疗的患者能看到临床改善。

等效形式

前述书面说明书被认为足以使本领域的技术人员能够实践实施例。前述描述和实例详述了某些实施例并描述了发明人设想的最佳模式。然而，应当理解，无论前述内容可以在文本中看起来如何详尽，实施例都可以以许多方式实践并且应当根据所附权利要求以及其任何等同物来解释。

如本文所使用的，所有数值都假定为“约”。如本文所使用的，术语约是指数值，包含例如整数、分数和百分比，无论是否明确指出。术语约通常是指本领域的普通技术人员会认为等同于所列举的值(例如，具有相同的功能或结果)的数值范围(例如，所列举范围的+/-5-10％)。当如至少和约等术语在数值或范围列表之前时，这些术语修改列表中提供的所有值或范围。在一些情况下，术语约可以包含四舍五入为最接近的有效数字的数值。

序列表

<110> 斯坦林治疗公司

<120> 用白喉毒素-人白细胞介素-3缀合物与其它药剂组合治疗

骨髓增生性肿瘤的组合治疗方法

<130> 01214-0017-00PCT

<150> US 62/753,145

<151> 2018-10-31

<150> US 62/832,558

<151> 2019-04-11

<160> 3

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 152

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Ser Arg Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Val Arg Pro

1 5 10 15

Gly Leu Gln Ala Pro Met Thr Gln Thr Thr Ser Leu Lys Thr Ser Trp

20 25 30

Val Asn Cys Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys Gln

35 40 45

Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gln

50 55 60

Asp Ile Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala Phe

65 70 75 80

Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gln Asn Ala Ser Ala Ile Glu Ser Ile

85 90 95

Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr

100 105 110

Arg His Pro Ile His Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg

115 120 125

Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gln Ala Gln Gln

130 135 140

Thr Thr Leu Ser Leu Ala Ile Phe

145 150

<210> 2

<211> 560

<212> PRT

<213> 白喉杆菌

<400> 2

Met Ser Arg Lys Leu Phe Ala Ser Ile Leu Ile Gly Ala Leu Leu Gly

1 5 10 15

Ile Gly Ala Pro Pro Ser Ala His Ala Gly Ala Asp Asp Val Val Asp

20 25 30

Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr

35 40 45

Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys

50 55 60

Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser

65 70 75 80

Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn

85 90 95

Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly

100 105 110

Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys

115 120 125

Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly

130 135 140

Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val

145 150 155 160

Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn

165 170 175

Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe

180 185 190

Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala

195 200 205

Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu

210 215 220

Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr

225 230 235 240

Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser

245 250 255

Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu

260 265 270

Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu

275 280 285

Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala

290 295 300

Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp

305 310 315 320

Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly

325 330 335

Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu

340 345 350

Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala

355 360 365

Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn

370 375 380

Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr

385 390 395 400

Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His

405 410 415

Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg

420 425 430

Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu

435 440 445

Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly

450 455 460

Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg

465 470 475 480

Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys

485 490 495

Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu

500 505 510

His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile His Ser Asn Glu

515 520 525

Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp

530 535 540

His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser

545 550 555 560

<210> 3

<211> 388

<212> PRT

<213> 白喉杆菌

<400> 3

Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn

1 5 10 15

Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln

20 25 30

Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp

35 40 45

Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly

50 55 60

Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val

65 70 75 80

Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val

85 90 95

Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu

100 105 110

Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly

115 120 125

Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser

130 135 140

Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser

145 150 155 160

Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp

165 170 175

Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg

180 185 190

Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val

195 200 205

Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly

210 215 220

Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu

225 230 235 240

Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu

245 250 255

His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val

260 265 270

Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val

275 280 285

Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu

290 295 300

Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala

305 310 315 320

Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser

325 330 335

Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp

340 345 350

Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe

355 360 365

Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His

370 375 380

Lys Thr Arg Pro

385

Claims

1.一种用于治疗或抑制有需要的受试者的骨髓增生性肿瘤(MPN)的方法，所述方法包括向所述受试者施用白喉毒素-人白细胞介素-3缀合物(DT-IL3)以及

a.一种或多种Jak抑制剂和/或

b.一种或多种低甲基化剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述DT-IL3以1μg/kg或更大、2μg/kg或更大或者4μg/kg或更大的剂量施用。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述DT-IL3以2μg/kg到20μg/kg或9μg/kg到20μg/kg的剂量施用。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述DT-IL3以4μg/kg到12μg/kg或9μg/kg到12μg/kg的剂量施用。

5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述DT-IL3以5μg/kg的剂量施用。

6.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述DT-IL3以7μg/kg的剂量施用。

7.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述DT-IL3以9μg/kg的剂量施用。

8.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述DT-IL3以12μg/kg的剂量施用。

9.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述DT-IL3的施用剂量为最大耐受剂量。

10.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其中每周至少一次施用所述DT-IL3和所述一种或多种Jak抑制剂和/或低甲基化剂。

11.根据权利要求10所述的方法，其中每周至少两次施用所述DT-IL3和所述一种或多种Jak抑制剂和/或低甲基化剂。

12.根据权利要求11所述的方法，其中每周至少三次施用所述DT-IL3和所述一种或多种Jak抑制剂和/或低甲基化剂。

13.根据权利要求1到12中任一项所述的方法，其中在一周或更长的时间段内施用所述DT-IL3和所述(a)一种或多种Jak抑制剂和/或所述(b)一种或多种低甲基化剂。

14.根据权利要求13所述的方法，其中在两周或更长的时间段内施用所述DT-IL3和所述(a)一种或多种Jak抑制剂和/或所述(b)一种或多种低甲基化剂。

15.根据权利要求1到14中任一项所述的方法，其中至少连续3天施用所述DT-IL3和所述(a)一种或多种Jak抑制剂和/或所述(b)一种或多种低甲基化剂。

16.根据权利要求1到15中任一项所述的方法，其中在多个治疗周期中施用所述DT-IL3和所述(a)一种或多种Jak抑制剂和/或所述(b)一种或多种低甲基化剂。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述治疗周期相隔至少l周、相隔至少2周、相隔至少3周、相隔至少4周、相隔至少5周或其组合。

18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中所述DT-IL3在四个周期内每21天至少连续3天施用、随后在3个周期内每28天施用并且然后每42天施用。

19.根据权利要求16到18中任一项所述的方法，其中每天至少一次或每天至少两次施用所述一种或多种Jak抑制剂。

20.根据权利要求16到19中任一项所述的方法，其中在至少一个周期的至少前3天、至少前4天、至少前5天、至少前6天或至少前7天施用所述一种或多种低甲基化剂。

21.根据权利要求20所述的方法，其中在施用DT-IL3四个21天周期之后，在28天周期的至少前3天、至少前4天、至少前5天、至少前6天或至少前7天施用所述一种或多种低甲基化剂，持续3个周期。

22.根据权利要求1到21中任一项所述的方法，其中施用所述DT-IL3和所述(a)一种或多种Jak抑制剂和/或所述(b)一种或多种低甲基化剂，直到获得疾病进展和/或不可接受的毒性为止。

23.根据权利要求1到22中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用包括所述DT-IL3和所述(a)一种或多种Jak抑制剂和/或所述(b)一种或多种低甲基化剂的药物组合物。

24.根据权利要求1到23中任一项所述的方法，其中所述受试者为人。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述人具有不利的细胞遗传学。

26.根据权利要求1到25中任一项所述的方法，其中所述DT-IL3是化学缀合物。

27.根据权利要求1到26中任一项所述的方法，其中所述DT-IL3是重组表达蛋白。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述DT-IL3表达为包括白喉毒素和人IL-3的催化结构域和易位结构域的单一多肽。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述DT-IL3包括通过肽键与人IL-3连接的白喉毒素的氨基酸残基1到388。

30.根据权利要求1到29中任一项所述的方法，其中抑制使MPN细胞增殖减少、MPN细胞数量稳定和/或MPN细胞数量减少。

31.根据权利要求1到30中任一项所述的方法，其中抑制使脾脏和/或肝脏大小减小。

32.根据权利要求1到31中任一项所述的方法，其中所述MPN为真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、骨髓纤维化、慢性髓单核细胞白血病、慢性中性粒细胞白血病、慢性嗜酸性粒细胞白血病、系统性肥大细胞增多症、症状性高嗜酸性粒细胞病症或引起过量红细胞、白细胞和/或血小板产生的其它骨髓病症。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述MPN是骨髓纤维化(MF)。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述骨髓纤维化是原发性骨髓纤维化、真性红细胞增多症后骨髓纤维化、原发性血小板增多症后骨髓纤维化、急变期原发性骨髓纤维化、急变期真性红细胞增多症后骨髓纤维化或急变期ET后骨髓纤维化。

35.根据权利要求1到34中任一项所述的方法，其中所述MPN处于急变期。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述MPN是急变期原发性骨髓纤维化、急变期真性红细胞增多症后骨髓纤维化或急变期ET后骨髓纤维化。

37.根据权利要求1到36中任一项所述的方法，其中所述一种或多种Jak抑制剂包括鲁索替尼(ruxolitinib)。

38.根据权利要求1到37中任一项所述的方法，其中所述一种或多种低甲基化剂包括阿扎胞苷(azacitidine)、地西他滨(decitabine)和/或SGI-110。

39.根据权利要求1到38中任一项所述的方法，其中施用至少一种Jak抑制剂和至少一种低甲基化剂。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述至少一种Jak抑制剂包括鲁索替尼，并且所述至少一种低甲基化剂包括地西他滨、阿扎胞苷和/或SGI-110。

41.根据权利要求1到40中任一项所述的方法，其中所述受试者对利用一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂的预先治疗无反应。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述受试者对利用Jak抑制剂鲁索替尼的预先治疗无反应。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述受试者患有MF。

44.根据权利要求1到43中任一项所述的方法，其中所述受试者不能耐受利用一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂的预先治疗的全剂量。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述受试者不能耐受利用所述Jak抑制剂鲁索替尼的预先治疗的全剂量。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述受试者患有MF。

47.根据权利要求1到46中任一项所述的方法，其中所述受试者的血小板计数低或不适合利用鲁索替尼的治疗。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述受试者患有MF。

49.根据权利要求1到48中任一项所述的方法，其中所述受试者先前对Jak抑制剂和/或低甲基化剂有应答。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述受试者患有MF。

51.根据权利要求1到50中任一项所述的方法，其中所述受试者具有JAK2、MPL、ASXL1、TET2或CALR基因的突变。

52.根据权利要求1到51中任一项所述的方法，其中所述受试者具有JAK2V617F突变。

53.一种用于治疗或抑制有需要的受试者的骨髓增生性肿瘤(MPN)的药物组合物，所述药物组合物包括有效量的白喉毒素-人白细胞介素-3缀合物(DT-IL3)和一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂。

54.根据权利要求53所述的药物组合物，其中所述药物组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂。

55.一种用于治疗有需要的受试者的骨髓增生性肿瘤(MPN)的方法，所述方法包括：

a.鉴定所述MPN，以及

b.向所述有需要的受试者施用有效量的白喉毒素-人白细胞介素-3缀合物(DT-IL3)和一种或多种Jak抑制剂和/或一种或多种低甲基化剂。

56.根据权利要求55所述的方法，其中通过体检、血液测试、骨髓抽吸和活检、细胞遗传学分析、针对JAK2、MPL、ASXL1、TET2或CALR基因的突变的测试、动脉血氧饱和度和羧血红蛋白水平、中性粒细胞碱性磷酸酶水平、维生素B12或B12结合能力或血清尿酸盐来鉴定所述MPN。

57.根据权利要求56所述的方法，其中通过针对JAK2V617F突变进行测试来鉴定所述MPN。