ES2310931T3 - Analogos de interferon alfa humano de baja toxicidad. - Google Patents
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Abstract
Un análogo polipeptídico de un polipéptido interferón (IFN)-alfa humano nativo maduro para uso en terapia de seres humanos, en el que el análogo comprende el polipéptido interferón humano maduro, y la secuencia de aminoácidos en el análogo difiere en una o más de las posiciones 19, 20, 22, 24 y 27, a condición de que la mayoría de restos de aminoácido en las posiciones 1-27 sean del polipéptido IFN-alfa humano nativo y, cuando dicha una o más posiciones 19, 20, 22, 24 y 27 está sustituida, la posición 19 sea Asn, Asp, Gln o Glu, la posición 20 sea His, Arg o Lys, la posición 22 sea Asn, Asp, Gln o Glu, la posición 24 sea Leu o la posición 27 sea His, Arg o Lys; y en el que el análogo es capaz de exhibir una menor toxicidad respecto al IFN-alfa maduro en un ensayo que comprende: (a) incubar una primera muestra de PBMC durante 7 días en un medio de cultivo que comprende de 2.000 a 128.000 unidades antivíricas/ml del análogo; (b) incubar una segunda muestra de 2 x 10 5 células/pocillo de PBMC durante 7 días en un medio de cultivo que tiene una concentración igual, en unidades antivíricas/ml, del IFN-alfa maduro; y (c) comparar el porcentaje de células viables restantes en la primera muestra con el de la segunda muestra, con lo que un porcentaje mayor de células viables indica la toxicidad relativamente menor del análogo en el medio de cultivo.
Description
Análogos de interferón alfa humano de baja
toxicidad.
La presente invención se refiere a análogos de
interferón alfa humano de baja toxicidad, a los correspondientes
ácidos nucleicos, a los procedimientos para prepararlos y a las
composiciones farmacéuticas y a los usos terapéuticos de estos
análogos.
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Zoon, K. C., y col., Methods
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Los interferones (IFN) se han clasificado en dos
grupos distintos: interferones de tipo I, que incluyen IFN\alpha,
IFN\beta e IFN\omega (también conocido como IFN\alphaII); e
interferones de tipo II, representados por IFN\gamma (revisado
por DeMaeyer, y col., 1988). En seres humanos, se estima que hay al
menos 17 genes IFN\alpha no alélicos, al menos 2 genes INF\beta
no alélicos y un solo gen IFN\gamma.
Se ha demostrado que los IFN\alpha inhiben
diversos tipos de proliferación celular. Los IFN\alpha son
especialmente útiles frente a malignidades hematológicas tales como
tricoleucemia (Quesada y col., 1984), Además, estas proteínas han
mostrado también actividad frente a mieloma múltiple, leucemia
linfocítica crónica, linfoma de escasa malignidad, sarcoma de
Kaposi, leucemia mielógena crónica, carcinoma de células renales,
tumores de vejiga urinaria y cánceres de ovario (Bonnem, y col.,
1984; Oldham, 1985). Se ha investigado también el papel de
interferones y receptores de interferón en la patogénesis de ciertas
enfermedades autoinmunes e inflamatorias (Benoit, y col,
1993).
1993).
Los IFN son también útiles contra diversos tipos
de infecciones víricas (Finter y col., 1991). Los interferones alfa
han mostrado actividad contra infección por papilomavirus humano,
infecciones por hepatitis B y hepatitis C (Finter, y col., 1991;
Kashima, y col., 1983; Dusheiko, y col., 1986; Davis, y col.,
1989).
Sin embargo, la utilidad de los IFN\alpha ha
estado significativamente limitada por su toxicidad: el uso de
interferones en el tratamiento del cáncer y la enfermedad vírica da
como resultado efectos secundarios graves, tales como fiebre,
escalofríos, anorexia, pérdida de peso y fatiga (Pontzer, y col.,
1991; Oldham, 1985). Estos efectos secundarios requieren a menudo
(i) reducir la dosificación de interferón a niveles que limitan la
eficacia del tratamiento, o (ii) la retirada del tratamiento al
paciente. Dicha toxicidad ha reducido la utilidad de estas potentes
proteínas antivíricas y antiproliferativas en el tratamiento de
enfermedades debilitantes humanas y animales.
En un aspecto, la invención está dirigida a un
análogo polipeptídico de un polipéptido
(IFN)-\alpha interferón humano nativo humano para
uso en terapia para seres humanos, en el que el análogo comprende el
polipéptido interferón \alpha humano maduro, y la secuencia de
aminoácidos en el análogo difiere en una o más de las posiciones
19, 20, 22, 24 y 27, a condición de que la mayoría de restos de
aminoácido en las posiciones 1-27 sean del
polipéptido IFN-\alpha humano nativo y, cuando
dicha una o más posiciones 19, 20, 22, 24 y 27 está sustituida, la
posición 19 sea Asn, Asp, Gln o Glu, la posición 20 sea His, Arg o
Lys, la posición 22 sea Asn, Asp, Gln o Glu, la posición 24 sea Leu
o la posición 27 sea His, Arg o Lys; y
en el que el análogo es capaz de exhibir una
menor toxicidad respecto al IFN-\alpha maduro en
un ensayo que comprende:
(a) incubar una primera muestra de PBMC durante
7 días en un medio de cultivo que comprende 2.000 a 128.000
unidades antivíricas/ml del análogo;
(b) incubar una segunda muestra de 2 x 10^{5}
células/pocillo de PBMC durante 7 días en un medio de cultivo que
tiene una concentración igual, en unidades antivíricas/ml, al
IFN-\alpha maduro; y
(c) comparar el porcentaje de células viables
restantes en la primera muestra con el de la segunda muestra, con
lo que un porcentaje mayor de células viables indica la toxicidad
relativamente menor del análogo en el medio de cultivo.
En otra realización, el procedimiento comprende
sustituir la secuencia de HuIFN\alpha maduro entre los restos
19-27 por 9 unidades definidas por la SEQ ID NO: 2.
En particular, la secuencia de HuIFN\alpha maduro entre los
restos 19-27 es la SEC Nº ID 1. La SEC Nº ID de 9
unidades corresponde a los restos 19-27 del
interferón tau ovino maduro (OvIFN\tau) y contiene restos no
idénticos al HuIFN\alpha maduro en las posiciones 19, 20, 22, 24
y 27.
El análogo de IFN\alpha humano de baja
toxicidad es para uso en terapia para seres humanos. Este análogo
comprende una proteína de HuIFNa madura que tiene, en una o más de
las posiciones aminoacídicas 19, 20, 22, 24 y 27, un aminoácido
sustituido, y la mayoría de los restos de aminoácido
1-27 en el análogo son restos de HuIFN\alpha
nativos. El análogo se caracteriza por tener una toxicidad
específica sustancialmente reducida respecto a IFN\alpha humano
nativo, como se evidencia por un aumento en la viabilidad de células
mononucleares en cultivo.
En una realización, el análogo contiene una
sustitución aminoacídica como se define a continuación en una o más
de las posiciones 19, 20, 22 y 27. En diversas realizaciones, el
aminoácido sustituido incluye: Asn, Asp, Gln o Glu, en particular
Asp, para el aminoácido en posición 19; His, Arg o Lys, en
particular Arg, para el aminoácido en posición 20; Asn, Asp, Gln o
Glu, en particular Asn, para el aminoácido en posición 22; His, Arg
o Lys, particularmente His, para el aminoácido en posición 27, y Leu
para el aminoácido en posición 24.
En un aspecto relacionado, la invención incluye
un análogo de IFN\alpha humano de baja toxicidad para uso en
terapia para seres humanos, que comprende una proteína IFN\alpha
humana madura que tiene en una o más de las posiciones
aminoacídicas 19, 20, 22, 24 y 27 un aminoácido sustituido como se
define anteriormente, quedando la secuencia de IFN\alpha humano
maduro entre los restos 28-166 sustancialmente sin
cambios. El análogo se caracteriza por una toxicidad específica
sustancialmente reducida respecto al IFN\alpha humano maduro
nativo como se evidencia por un aumento en la viabilidad de células
mononucleares en cultivo.
Se describe adicionalmente un procedimiento de
inhibición del crecimiento de células tumorales. En el procedimiento
se ponen en contacto las células tumorales con un análogo de
IFN\alpha de baja toxicidad del tipo descrito anteriormente a una
concentración eficaz para inhibir el crecimiento de células
tumorales. El análogo de IFN\alpha de baja toxicidad puede ser
parte de cualquier formulación farmacológica aceptable. Las células
tumorales cuyo crecimiento puede inhibirse por un análogo de
IFN\alpha de baja toxicidad incluyen, pero sin limitación,
células de carcinoma, células cancerosas hematopoyéticas, células de
leucemia, células de linfoma y células de melanoma. En una
realización, las células tumorales son células tumorales sensibles a
esteroides, por ejemplo, células de tumor mamario.
En otro aspecto adicional de la presente
invención se usa un análogo de IFN\alpha de baja toxicidad del
tipo descrito anteriormente en un procedimiento de inhibición de la
replicación vírica. En este procedimiento se ponen en contacto
células infectadas con un virus con el compuesto de IFN\alpha de
baja toxicidad a una concentración eficaz para inhibir la
replicación vírica en dichas células. El IFN\alpha de baja
toxicidad puede ser parte de cualquier formulación farmacológica
aceptable. Puede inhibirse la replicación de virus tanto de ARN
como de ADN mediante el IFN\alpha humano de baja toxicidad. Los
virus de ARN ilustrativos incluyen virus de leucemia felina, virus
de neumonía ovina progresiva, lentivirus ovino, virus de anemia
infecciosa equina, virus de inmunodeficiencia bovina, virus
Visna-maedi, virus de
encefalitis-artritis caprina, virus de
inmunodeficiencia (VIH) o virus de hepatitis C (HCV) humanos. Es un
virus de ADN ilustrativo el virus de hepatitis B (HBV).
En otro aspecto más, la invención incluye un
procedimiento de tratamiento de cualquier afección patológica que
sea sensible al IFN\alpha administrado por vía intravenosa
mediante la administración oral de un análogo de IFN\alpha humano
de baja toxicidad del tipo descrito anteriormente. Preferiblemente,
el sujeto ingiere el análogo administrado por vía oral.
Estos y otros objetos y rasgos de la invención
se apreciarán más completamente cuando se lea la siguiente
descripción detallada junto con los dibujos adjuntos.
La Figura 1 muestra el alineamiento de los
primeros 27 aminoácidos N-terminales de
HuIFN\alpha maduro, OvIFN\tau maduro y ocho análogos de
HuIFN\alpha maduro designados IFN\alpha-N0 a
IFN\alpha-N7.
La SEQ ID NO: 1 es la secuencia aminoacídica de
un IFN\alpha humano maduro (mHuIFN\alpha) entre los restos
19-27.
La SEQ ID NO: 2 es la secuencia aminoacídica de
un interferón-tau ovino maduro (mOvIFN\tau) entre
los restos 19-27.
La SEQ ID NO: 3 es la secuencia aminoacídica de
un mHuIFN\alpha entre los restos 11-27.
La SEQ ID NO: 4 es la secuencia aminoacídica de
un mOvIFN\tau entre los restos 11-27.
La SEQ ID NO: 5 es la secuencia aminoacídica de
un mHuIFN\alpha entre los restos 6-27.
La SEQ ID NO: 6 es la secuencia aminoacídica de
un mOvIFN\tau entre los restos 6-27.
La SEQ ID NO: 7 es la secuencia aminoacídica de
un mHuIFN\alpha entre los restos 1-27.
La SEQ ID NO: 8 es la secuencia aminoacídica de
un mOvIFN\tau entre los restos 1-27.
La SEQ ID NO: 9 es la secuencia aminoacídica de
un HuIFN\alpha maduro (IFN\alpha-d; nº de acceso
a GenBank J00210, PID g386796).
La SEQ ID NO: 10 es la secuencia aminoacídica
del análogo de IFN\alpha maduro
IFN\alpha-N0.
La SEQ ID NO: 11 es la secuencia aminoacídica
del análogo de IFN\alpha maduro
IFN\alpha-N1.
La SEQ ID NO: 12 es la secuencia aminoacídica
del análogo de IFN\alpha maduro
IFN\alpha-N2.
La SEQ ID NO: 13 es la secuencia aminoacídica
del análogo de IFN\alpha maduro
IFN\alpha-N3.
La SEQ ID NO: 14 es la secuencia aminoacídica
del análogo de IFN\alpha maduro
IFN\alpha-N4.
La SEQ ID NO: 15 es la secuencia aminoacídica
del análogo de IFN\alpha maduro
IFN\alpha-N5.
La SEQ ID NO: 16 es la secuencia aminoacídica
del análogo de IFN\alpha maduro
IFN\alpha-N6.
La SEQ ID NO: 17 es la secuencia aminoacídica
del análogo de IFN\alpha maduro
IFN\alpha-N7.
La SEQ ID NO: 18 es la secuencia aminoacídica de
un OvIFN\tau maduro (oTP-1; Nº de acceso a GenBank
Y002876, PID g1358).
La SEQ ID NO: 19 es la secuencia nucleotídica de
un gen sintético que codifica IFN\alpha-10.
La SEQ ID NO: 20 es la secuencia nucleotídica
del conector 1.
La SEQ ID NO: 21 es la secuencia nucleotídica
del conector 2.
La SEQ ID NO: 22 es la secuencia nucleotídica
del fragmento N1, cadena directa.
La SEQ ID NO: 23 es la secuencia nucleotídica
del fragmento N1, cadena inversa.
La SEQ ID NO: 24 es la secuencia nucleotídica
del fragmento N2, cadena directa.
La SEQ ID NO: 25 es la secuencia nucleotídica
del fragmento N2, cadena inversa.
La SEQ ID NO: 26 es la secuencia nucleotídica
del fragmento N3, cadena directa.
La SEQ ID NO: 27 es la secuencia nucleotídica
del fragmento N3, cadena inversa.
La SEQ ID NO: 28 es la secuencia nucleotídica
del fragmento N4, cadena directa.
La SEQ ID NO: 29 es la secuencia nucleotídica
del fragmento N4, cadena inversa.
La SEQ ID NO: 30 es la secuencia nucleotídica
del fragmento N5, cadena directa.
La SEQ ID NO: 31 es la secuencia nucleotídica
del fragmento N5, cadena inversa.
La SEQ ID NO: 32 es la secuencia nucleotídica
del fragmento N6, cadena directa.
La SEQ ID NO: 33 es la secuencia nucleotídica
del fragmento N6, cadena inversa.
La SEQ ID NO: 34 es la secuencia nucleotídica
del fragmento N7, cadena directa.
La SEQ ID NO: 35 es la secuencia nucleotídica
del fragmento N7, cadena inversa.
\vskip1.000000\baselineskip
Interferón alfa (IFN\alpha) designa uno
cualquiera de una familia de proteínas interferón que tiene más de
un 70%, o preferiblemente más de aproximadamente un 80%, o más
preferiblemente más de aproximadamente un 90% de identidad
aminoacídica con la secuencia de proteína IFN\alpha madura
presentada como SEQ ID NO: 9. La identidad aminoacídica puede
determinarse usando, por ejemplo, el programa LALIGN con parámetros
por defecto. Este programa se encuentra en el paquete FASTA versión
1.7 de programas de comparación de secuencia (Pearson y Lipman,
1988; Pearson, 1990; programa disponible en William R. Pearson,
Department of Biological Chemistry, Box. 440, Jordan Hall,
Charlottesville, VA). Típicamente, el IFN\alpha tiene al menos una
característica del siguiente grupo de características: (a)
propiedades antivíricas, (b) propiedades de proliferación
anticelular, y (c) inducible por ácidos nucleicos o por virus. Los
IFN\alpha preferidos proceden de seres humanos.
Interferón tau (IFN\tau) designa uno
cualquiera de una familia de proteínas interferón que tiene más de
un 70%, o preferiblemente más de aproximadamente un 80%, o más
preferiblemente más de aproximadamente un 90% de identidad
aminoacídica con la secuencia de IFN\tau maduro presentada como
SEQ ID NO: 18. Típicamente, el IFN\tau tiene al menos una
característica del siguiente grupo de características: (a) expresado
durante las etapas embriónicas/fetales por trofectoderma/placenta,
(b) propiedades antiluteolíticas, (c) propiedades antivíricas y (d)
propiedades anti-proliferación celular. Los
IFN\tau preferidos son IFN\tau ovino y bovino.
"Proteína madura" designa la
proteína IFN después de la eliminación de la secuencia líder. La
secuencia de proteína IFN madura empieza con el resto Cys24 de la
secuencia aminoacídica de IFN completa, que se corresponde con el
Cys1 de la secuencia de proteína madura.
Una secuencia o fragmento polinucleotídico
"deriva de" otra secuencia o fragmento polinucleotídico
cuando contiene la misma secuencia de nucleótidos que está presente
en la secuencia o fragmento del que deriva. Por ejemplo, un
plásmido bacteriano contiene un inserto "derivado de" un gen
humano seleccionado si la secuencia de los polinucleótidos en el
inserto es la misma que la secuencia de los polinucleótidos en el
gen humano seleccionado.
De forma similar, una secuencia o fragmento
polipeptídico "deriva de" otra secuencia o fragmento
polipeptídico cuando contiene la misma secuencia de aminoácidos que
está presente en la secuencia o fragmento del que deriva.
Identidad porcentual (%), con respecto a dos
secuencias aminoacídicas, designa el % de restos que son idénticos
en las dos secuencias cuando las secuencias se alinean óptimamente y
no se asigna penalización a los "huecos". En otras palabras,
si necesita insertarse un hueco en una primera secuencia para
alinearla óptimamente con una segunda secuencia, se calcula el % de
identidad usando sólo los restos que están emparejados con el
correspondiente resto aminoacídico (concretamente, el cálculo no
considera los restos en la segunda secuencia que estén en el
"hueco" de la primera secuencia). Se define el alineamiento
óptimo como el alineamiento que da la mayor puntuación porcentual
de identidad. Dichos alineamientos pueden realizarse usando el
programa "GENEWORKS". Como alternativa, los alineamientos
pueden realizarse usando el programa de alineamiento local LALIGN
con un ktup de 1, parámetros por defecto y PAM por defecto.
Una "sustitución conservativa"
designa la sustitución de un aminoácido de una clase por un
aminoácido de la misma clase, en la que una clase se define por las
propiedades fisicoquímicas comunes de la cadena lateral
aminoacídica y las altas frecuencias de sustitución en proteínas
homólogas encontradas en la naturaleza (como se determina por una
matriz de intercambio de frecuencia Dayhoff estándar). Las seis
clases generales de cadenas laterales aminoacídicas, clasificadas
como se describe anteriormente incluyen: clase I (Cys); clase II
(Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); clase III (Asn, Asp, Gln, Glu); clase IV
(His, Arg, Lys); clase V (Ile, Leu, Val, Met) y clase VI (Phe, Tyr,
Trp). Por ejemplo, la sustitución de un Asp por otro resto de clase
III tal como Asn, Gln o Glu es una sustitución conservativa.
Una "sustitución no conservativa"
designa la sustitución de un aminoácido de una clase por un
aminoácido de otra clase; por ejemplo, la sustitución de una Ala,
un resto de clase II, por un resto de clase III tal como Asp, Asn,
Glu o Gln.
Tratar una enfermedad designa administrar
una sustancia terapéutica eficaz para reducir los síntomas de la
enfermedad y/o reducir la gravedad de la enfermedad.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención está basada en el
descubrimiento de que la citotoxicidad de HuIFN\alpha puede
reducirse significativamente introduciendo sustituciones
aminoacídicas en una o más de las posiciones aminoacídicas 19, 20,
22, 24 y 27 de HuIFN\alpha maduro.
La Figura 1 muestra los primeros 27 restos de
aminoácido N-terminales de un HuIFN\alpha maduro
(SEQ ID NO: 9) y un OvIFN\tau maduro (SEQ ID NO: 18), en los que
los restos no idénticos se muestran en negrita. Se prepararon los
análogos de HuIFN\alpha que contienen subconjuntos de
sustituciones de OvIFN\tau como se describe en el ejemplo 1. Las
posiciones 1-27 de cada análogo de HuIFN\alpha se
muestran en la Figura 1 con las sustituciones mostradas en negrita.
Los aminoácidos 28-166 de cada análogo
\hbox{siguen siendo restos de HuIFN \alpha (por ejemplo,
restos 28-166 de SEQ ID NO: 9).}
Se ensayó la citotoxicidad de los análogos de
HuIFN\alpha designados de IFN\alpha-N0 a
IFN\alpha-N7 (SEQ ID NO: 10 a SEQ ID NO: 17) como
se describe en los ejemplos 2 y 3. Los hepatocitos incubados con
HuIFN\alpha mostraron reducciones significativas de viabilidad
(Tabla 1, ejemplo 2). En contraposición, las células incubadas con
el análogo de IFN\alpha IFN\alpha-N0 no
mostraron esencialmente pérdida de viabilidad, como se reseña en la
solicitud original.
Se ensayó la citotoxicidad de los análogos
IFN\alpha-N1 a IFN\alpha-N7 como
se describe en el ejemplo 3. Las células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) incubadas con cantidades variables de OvIFN\tau
o el análogo IFN\alpha-N0 no mostraron
esencialmente pérdida de viabilidad después de 7 días de incubación.
Las PBMC incubadas con los análogos N1 o N3 mostraron reducciones
significativas de viabilidad, con niveles similares a los
observados para HuIFN\alpha. Las sustituciones en los análogos N1
y N3 en las posiciones 2, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 13 y 14 son por lo
tanto relativamente ineficaces en la reducción de la citotoxicidad
de HuIFN\alpha. Las células incubadas con
IFN\alpha-N4 retenían un nivel de viabilidad entre
el de células incubadas con HuIFN\alpha y con OvIFN\tau. Las
sustituciones adicionales en las posiciones 16, 19 y 20 son por lo
tanto parcialmente eficaces en la reducción de la toxicidad de
HuIFN\alpha.
Las PBMC incubadas con los análogos de
IFN\alpha IFN\alpha-N5,
IFN\alpha-N6 e IFN\alpha-N7 no
mostraron esencialmente pérdida de viabilidad después de 7 días de
incubación (Tabla 2). Estos tres análogos conservan la baja
toxicidad de OvIFN\tau y definen adicionalmente las posiciones
responsables de la citotoxicidad reducida de HuIFN\alpha. Más
notablemente, el análogo IFN\alpha-N7 contiene
sólo 5 sustituciones, en las posiciones 19, 20, 22, 24 y 27. Los
otros análogos que exhiben baja citotoxicidad, N0, N5 y N6,
contienen sustituciones en estas posiciones y en posiciones
adicionales (Figura 1). El análogo IFN\alpha-4,
que muestra un nivel intermedio de citotoxicidad en este ensayo,
carece de sustituciones en las posiciones 22, 24 y 27. Los datos
demuestran que las posiciones de los restos 19, 20, 22, 24 y 27
desempeñan un papel significativo en la citotoxicidad de estas
proteínas, según la invención.
Más específicamente, la presente invención
contempla un análogo de HuIFN\alpha que contiene una o más
sustituciones aminoacídicas en las posiciones 19, 20, 22, 24 y 27,
siendo la mayoría de los aminoácidos restantes restos nativos de
HuIFN\alpha. El análogo posee una toxicidad reducida medida por
los ensayos de citotoxicidad descritos en la presente memoria,
junto con propiedades terapéuticas asociadas a IFN\alpha humano
nativo.
Las sustituciones preferidas incluyen una o más
de las siguientes: el aminoácido 19 de HuIFN\alpha maduro puede
sustituirse por Asp19 de OvIFN\tau maduro, o por un resto de la
misma clase Asn, Gln o Glu; el aminoácido 20 de HuIFN\alpha
maduro puede sustituirse por Arg20 de OvIFN\tau maduro o por un
resto de la misma clase His o Lys; el aminoácido 22 de
HuIFN\alpha maduro puede sustituirse por Asn22 de OvIFN\tau
maduro o por un resto de la misma clase Asp, Gln o Glu; el
aminoácido 24 de HuIFN\alpha maduro puede sustituirse por Leu24
de OvIFN\tau maduro; y el aminoácido 27 de HuIFN\alpha maduro
puede sustituirse por His27 de OvIFN\tau o por un resto de la
misma clase Arg o Lys. Dichas sustituciones son eficaces para
reducir la toxicidad de HuIFN\alpha, pero no alteran
significativamente las propiedades terapéuticas de HuIFN\alpha
deseables.
Otras secuencias ilustrativas que comprenden las
posiciones alteradas de algunos análogos de HuIFN\alpha de baja
toxicidad incluyen las secuencias presentadas en la presente memoria
como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6. Las realizaciones
más preferidas son análogos de HuIFN\alpha sustituidos en la
región 19-27 en posiciones que no son idénticas en
OvIFN\tau. Por ejemplo, los constructos en los que los aminoácidos
19-27 de IFN\alpha maduro humano (SEQ ID NO: 1)
se sustituyen por los aminoácidos 19-27 de
OvIFN\tau maduro (SEQ ID NO: 2), dan como resultado la alteración
de las posiciones 19, 20, 22, 24 y 27 en IFN\alpha humano maduro,
mientras que la secuencia de IFN\alpha humano maduro permanece sin
cambios. Este ejemplo corresponde al análogo
IFN\alpha-N7 (SEQ ID NO: 17).
Como se observa anteriormente, una considerable
ventaja contemplada para los análogos de HuIFN\alpha de la
presente invención es la toxicidad reducida de los análogos respecto
a IFN\alpha humano nativo. Los análogos de HuIFN\alpha pueden
tener la misma actividad biológica que el IFN\alpha humano
nativo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe la construcción de un gen sintético
que codifica el análogo de HuIFN\alpha
IFN\alpha-N0 en el ejemplo 1A. Brevemente, se
retrotradujo la secuencia aminoacídica de HuIFN\alpha maduro que
contenía las 15 sustituciones de OvIFN\tau en las primeras 27
posiciones N-terminales (SEQ ID NO: 10) con uso de
codón optimizado para Pichia pastoris. Se editó la secuencia
nucleotídica para incluir cinco sitios de restricción espaciados a
lo largo del constructo. Se dividió la secuencia génica sintética en
cuatro fragmentos nucleotídicos. Se construyeron los fragmentos
individuales, cada uno de aproximadamente 150 pares de bases de
longitud, mediante ligamientos secuenciales de oligonucleótidos. Se
clonaron secuencialmente los fragmentos en un vector bacteriano,
proporcionando el gen que codifica IFN\alpha-N0
(SEQ ID NO: 19). Se clonó después el gen sintético en el vector
pPICZ-\alpha para expresión en Pichia
pastoris. Se construyeron también los genes sintéticos que
codifican los análogos IFN\alpha-N1 a
IFN\alpha-N7 mediante ligamientos secuenciales de
oligonucleótidos como se describe en el ejemplo 1A.
La expresión de los genes sintéticos en
Pichia (ejemplo 1B) permitió la sobreproducción de análogos
de HuIFN\alpha recombinantes. Los análogos de HuIFN\alpha
recombinantes exhibían una actividad antivírica (ejemplo 1C)
similar a la actividad antivírica de OvIFN\tau recombinante
expresado usando el mismo sistema de Pichia pastoris.
\vskip1.000000\baselineskip
Los interferones de tipo I exhiben potentes
propiedades antivíricas. La toxicidad reducida de IFN\tau con
respecto a IFN\alpha parece ser atribuible a aminoácidos no
conservados presentes en los primeros 27 aminoácidos
N-terminales de la proteína madura. Las
sustituciones de estos restos de aminoácido por los correspondientes
restos en la porción N-terminal de IFN\alpha
parece conferir una citotoxicidad reducida a los análogos de
HuIFN\alpha resultantes, mientras que se retiene la actividad
antivírica de interferones de tipo I. Por tanto, pueden usarse
formulaciones que comprenden análogos de HuIFN\alpha de baja
toxicidad de la presente invención para inhibir la replicación
vírica.
Los análogos de HuIFN\alpha de baja toxicidad
de la presente invención pueden emplearse en procedimientos para
afectar a la relación inmunitaria entre feto y madre, por ejemplo,
en la prevención de la transmisión de virus maternos (por ejemplo,
VIH) al feto en desarrollo. Los análogos de interferón humano son
particularmente útiles para el tratamiento de seres humanos, puesto
que son menos probables respuestas antigénicas usando una proteína
homóloga.
\vskip1.000000\baselineskip
Los interferones de tipo I exhiben una potente
actividad antiproliferación celular. Los análogos de IFN\alpha
humano de baja toxicidad tales como se describen en la presente
memoria pueden usarse también para inhibir el crecimiento celular
sin los efectos secundarios negativos asociados a otros interferones
que se conocen en la actualidad. Las formulaciones que comprenden
los análogos de IFN\alpha de baja toxicidad de la presente
invención pueden usarse para inhibir, prevenir o retardar el
crecimiento tumoral.
\vskip1.000000\baselineskip
Las enfermedades que pueden tratarse usando
procedimientos de la presente invención incluyen enfermedades
autoinmunes, inflamatorias, proliferativas e hiperproliferativas,
así como manifestaciones cutáneas de enfermedades mediadas
inmunológicamente. En particular, los procedimientos de la presente
invención son ventajosos para tratar afecciones relativas a la
hipersensibilidad del sistema inmunitario. Hay cuatro tipos de
hipersensibilidad del sistema inmunitario. La hipersensibilidad de
tipo I, o inmediata/anafiláctica, se debe a la desgranulación de
los mastocitos en respuesta a un alérgeno (por ejemplo, polen), e
incluye asma, rinitis alérgica (fiebre del heno), urticaria
(erupciones), choque anafiláctico y otras enfermedades de naturaleza
alérgica. La hipersensibilidad de tipo II, o autoinmune, se debe a
anticuerpos que están dirigidos contra "antígenos" percibidos
en las propias células del cuerpo. La hipersensibilidad de tipo III
se debe a la formación de complejos inmunitarios antígeno/anticuerpo
que se alojan en diversos tejidos y activan respuestas inmunitarias
adicionales, y es responsable de afecciones tales como enfermedad
del suero, alveolitis alérgica y las grandes hinchazones que a veces
se forman después de vacunaciones de recuerdo. La hipersensibilidad
de tipo IV se debe a la liberación de linfocinas de células T
sensibilizadas, que da como resultado una reacción inflamatoria. Los
ejemplos incluyen dermatitis de contacto, el exantema del sarampión
y reacciones "alérgicas" a ciertos medicamentos.
Los mecanismos mediante los que ciertas
afecciones pueden dar como resultado hipersensibilidad en algunos
individuos no son generalmente bien entendidos, pero pueden implicar
factores tanto genéticos como extrínsecos. Por ejemplo, las
bacterias, virus o medicamentos pueden desempeñar un papel
desencadenando una respuesta autoinmune en un individuo que ya
tiene una predisposición genética al trastorno autoinmune. Se ha
sugerido que la incidencia de algunos tipos de hipersensibilidad
puede correlacionarse con otros. Por ejemplo, se ha propuesto que
los individuos con ciertas alergias comunes son más sensibles a
trastornos autoinmunes.
Los trastornos autoinmunes pueden agruparse
ampliamente en aquellos limitados principalmente a órganos o tejidos
específicos y aquellos que afectan a todo el cuerpo. Los ejemplos
de trastornos específicos de un órgano (con el órgano afectado)
incluyen esclerosis múltiple (recubrimiento de mielina en procesos
nerviosos), diabetes mellitus de tipo I (páncreas), tiroiditis de
Hashimoto (glándula tiroidea), anemia perniciosa (estómago),
enfermedad de Addison (glándulas suprarrenales), miastenia grave
(receptores de acetilcolina en la unión neuromuscular), artritis
reumatoide (revestimiento de articulación), uveitis (ojo), psoriasis
(piel), síndrome de Guillain-Barré (células
nerviosas) y enfermedad de Grave (tiroides). Las enfermedades
autoinmunes
\hbox{sistémicas incluyen lupus sistémico
eritematoso y dermatomiositis.}
Otros ejemplos de trastornos de
hipersensibilidad incluyen asma, eccema, dermatitis atópica,
dermatitis de contacto, otras dermatitis eccematosas, dermatitis
seborreica, rinitis, liquen plano, pénfigo, penfigoide ampolloso,
epidermólisis ampollosa, urticaria, angioedemas, vasculitis,
eritemas, eosinofilias cutáneas, alopecia areata, aterosclerosis,
cirrosis biliar primaria y síndrome nefrótico. Las enfermedades
relacionadas incluyen inflamaciones intestinales tales como
enfermedad celíaca, proctitis, gastroenteritis por eosinofilia,
mastocitosis, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de
Crohn y colitis ulcerosa, así como alergias relacionadas con el
alimento.
Las enfermedades autoinmunes particularmente
susceptibles de tratamiento usando los procedimientos de la presente
invención incluyen esclerosis múltiple, diabetes mellitus de tipo I
(insulinodependiente), lupus eritematoso, esclerosis lateral
amiotrófica, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, estomatitis,
asma, uveitis, alergias y psoriasis.
Los medicamentos que contienen análogos de
HuIFN\alpha de baja toxicidad de la presente invención pueden
usarse para tratar terapéuticamente, y aliviar de esta manera
síntomas de enfermedades autoinmunes tales como las discutidas
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los análogos de IFN\alpha humano de baja
toxicidad de la presente invención pueden formularse según
procedimientos conocidos para preparar composiciones útiles
farmacéuticamente. Se han descrito anteriormente formulaciones que
comprenden interferones o compuestos similares a interferón (por
ejemplo, Martin, 1976). En general, las composiciones de la
invención en cuestión se formularán de tal modo que se combine una
cantidad eficaz de análogo de interferón con un vehículo adecuado
para facilitar una administración eficaz de la composición.
Las composiciones usadas en estas terapias
pueden estar también en una variedad de formas. Éstas incluyen, por
ejemplo, formas de dosificación sólidas, semisólidas y líquidas,
tales como comprimidos, píldoras, polvos, disoluciones o
suspensiones líquidas, liposomas, supositorios, disoluciones
inyectables e infusibles. La forma preferida depende del modo de
administración y la aplicación terapéutica pretendidos. Las
composiciones incluyen también preferiblemente vehículos y
coadyuvantes farmacéuticamente aceptables convencionales que son
conocidos por los expertos en la técnica. Preferiblemente, las
composiciones de la invención están en forma de una dosis unitaria
y se administrarán habitualmente al paciente una o más veces al
día.
Los análogos de IFN\alpha humano de baja
toxicidad o polipéptidos relacionados pueden administrarse a un
paciente en cualquier forma de dosificación farmacéuticamente
aceptable, incluyendo toma oral, inhalación, pulverización
intranasal, inyección intraperitoneal, intravenosa, intramuscular,
intralesional o subcutánea. Específicamente, las composiciones y
procedimientos usados para otros compuestos de interferón pueden
usarse para el suministro de estos análogos.
Sin embargo, una ventaja principal de los
análogos de IFN\alpha de la invención en cuestión es su
citotoxicidad extremadamente baja. Debido a esta baja toxicidad, es
posible administrar los análogos de interferón a concentraciones
mayores que las que pueden utilizarse generalmente con otros
compuestos de interferón (por ejemplo, IFN\alpha nativo humano).
Por tanto, se contempla que los análogos de HuIFN\alpha de baja
toxicidad de la presente invención puedan administrarse en
cantidades de aproximadamente 5 x 10^{4} a 20 x 10^{6}
unidades/día a aproximadamente 500 x 10^{6} unidades/día o más.
En una realización preferida, la dosificación es de aproximadamente
20 x 10^{6} unidades/día. Se prefieren dosis altas para
administración sistémica. Por supuesto, debe entenderse que las
composiciones y procedimientos de esta invención pueden usarse en
combinación con otras terapias.
Una vez se ha producido la mejora de la afección
de un paciente, se administra una dosis de mantenimiento si es
necesario. Posteriormente, puede reducirse la dosificación o la
frecuencia de administración, o ambas, en función de los síntomas,
a un nivel al que se retenga la condición mejorada. Cuando se han
aliviado los síntomas al nivel deseado, el tratamiento debe cesar.
Sin embargo, los pacientes pueden requerir tratamiento intermitente
a largo plazo tras cualquier recurrencia de los síntomas de la
enfermedad.
Los análogos de IFN\alpha de la invención en
cuestión pueden administrarse mediante procedimientos estándar para
tratar una variedad de cánceres y enfermedades víricas, incluyendo
aquellos para los que otros interferones han mostrado anteriormente
actividad. Véanse, por ejemplo, Finter y col., 1991; Dianzani, 1992;
Francis, y col., 1992 y las patentes de EE.UU. nº 4.885.166 y
4.975.276. Sin embargo, como se discute anteriormente, los análogos
de IFN\alpha de la invención en cuestión tienen rasgos y ventajas
únicas, incluyendo su capacidad de tratar estas afecciones sin
toxicidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Pueden tratarse trastornos de la piel por vía
intralesional usando análogos de interferón de baja toxicidad de la
presente invención, en los que la formulación y dosis dependerán del
procedimiento de administración y del tamaño y gravedad de la
lesión a tratar. Los procedimientos preferidos incluyen inyección
intradérmica y subcutánea. Pueden ser posibles múltiples
inyecciones en lesiones grandes, y pueden tratarse a la vez varias
lesiones de la piel de un solo paciente. Un experto en la técnica
puede determinar el calendario de administración. Las formulaciones
diseñadas para liberación sostenida pueden reducir la frecuencia de
administración.
\vskip1.000000\baselineskip
El tratamiento sistémico es esencialmente
equivalente para todas las aplicaciones. Son posibles dosis
intravenosas, subcutáneas y/o intramusculares múltiples, y en el
caso de procedimientos con implantes de tratamiento, son
particularmente útiles las formulaciones diseñadas para liberación
sostenida. También pueden tratarse los pacientes usando portales,
depósitos o bombas subcutáneos implantables.
\vskip1.000000\baselineskip
El tratamiento regional con análogos de
IFN\alpha de baja toxicidad de la presente invención es útil para
el tratamiento de cánceres en órganos específicos. El tratamiento
puede conseguirse mediante infusión intraarterial. Puede
implantarse un catéter quirúrgica o angiográficamente para el
tratamiento directo del órgano afectado. Puede usarse un portal
subcutáneo, conectado con el catéter, para tratamiento crónico, o
puede emplearse también una bomba implantable rellenable.
Los siguientes ejemplos ilustran, pero no
pretenden limitar en modo alguno, la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Las endonucleasas de restricción, ADN ligasa T4,
polinucleótido cinasa T4, ADN polimerasa Taq y fosfatasa intestinal
bovina se adquirieron en New England Biolabs (Beverly, MA) o Promega
Biotech (Madison, WI): estos reactivos se usaron según las
instrucciones del fabricante. Para las reacciones de secuenciación
se usó un kit secuenciador "SEQUENASE DNA II" (United States
Biochemical Corporation, Cleveland, OH). Los reactivos de
inmunotransferencia y otros fueron de Sigma Chemical Co. (St. Louis,
MO) o de Fischer Scientific (Needham, MA). Los filtros de
nitrocelulosa se obtienen de Schleicher and Schuell (Keen, NH).
Se prepararon los conectores y cebadores
oligonucleotídicos sintéticos usando sintetizadores
oligonucleotídicos automatizados comercialmente disponibles (por
ejemplo, un sintetizador de ADN ABI modelo 380B-02
(Applied Biosystems, Foster City, CA)). Como alternativa, pueden
adquirirse oligonucleótidos sintéticos diseñados a medida, por
ejemplo, en Synthetic Genetics (San Diego, CA). Se obtuvieron los
kit de síntesis de ADNc y marcaje de cebado aleatorio en
Boehringer-Mannheim Biochemical (BMB, Indianápolis,
IN).
Las secuencias oligonucleotídicas que codifican
polipéptidos pueden sintetizarse directamente mediante
procedimientos estándar o síntesis de oligonucleótidos o, en el
caso de grandes secuencias de codificación, sintetizarse mediante
una serie de etapas de clonación que implican una matriz en serie de
fragmentos oligonucleotídicos múltiples correspondientes a la
secuencia de codificación (Yoshio, y col., 1989; Eaton, y col.,
1988). Las secuencias de codificación de oligonucleótidos pueden
expresarse mediante procedimientos recombinantes estándar (Maniatis
y col., 1982; Ausubel y col., 1988). Como alternativa, los péptidos
pueden sintetizarse directamente mediante técnicas in vitro
estándar (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Se obtuvo IFN\alpha-A humano
recombinante de Biosource International (Camarillo, CA). A menos que
se indique otra cosa, se determinó la concentración de proteína con
el kit de ensayo de ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, IL)
según las instrucciones del fabricante.
Todos los medios de cultivo de tejido, sueros e
IFN usados en este estudio resultaron negativos para la endotoxina,
como se determina mediante ensayo con lisado de amebocito
Limulus (Associates of Cape Cod, Woods Hole, MA) a un nivel
de sensibilidad de 0,07 ng/ml.
\newpage
\global\parskip0.930000\baselineskip
Ejemplo
1
Se realizó una traducción inversa de la
secuencia aminoacídica de HuIFN\alpha que contiene las 15
sustituciones de OvIFN\tau en las primeras 27 posiciones
N-terminales (SEQ ID NO: 10) usando el codón
optimizado para Pichia pastoris. Se editó la secuencia
nucleotídica para incluir cinco sitios de restricción espaciados a
lo largo del constructo. Se dividió la secuencia del gen sintético
en cuatro fragmentos nucleotídicos. Se construyeron los fragmentos
individuales, cada uno de aproximadamente 150 pares de bases de
longitud, mediante ligamientos secuenciales de oligonucleótidos. Se
clonaron secuencialmente los fragmentos en el vector bacteriano G2,
proporcionando el gen que codifica IFN\alpha-N0
(SEQ ID NO: 19). Se cortó después el gen sintético del vector
bacteriano y se ligó en los sitios XhoI/NotI del
vector pPICZ-\alpha (Invitrogen, San Diego, CA),
para expresión en Pichia pastoris.
Se construyeron también los genes sintéticos que
codifican los análogos IFN\alpha-N1 a
IFN\alpha-N7 mediante ligamientos secuenciales de
oligonucleótidos. Se digirió el constructo
pPICZ-\alpha/IFN\alpha-N0
descrito anteriormente con XbaI y BstII y se ligaron
los oligonucleótidos asociados conector 1 (SEQ ID NO: 20) y
conector 2 (SEQ ID NO: 21) en estos sitios, produciendo un
constructo de vector intermedio. Esta etapa eliminó la secuencia
nucleotídica correspondiente a la sección N-terminal
de IFN\alpha-N0, reemplazada por los fragmentos
nucleotídicos enumerados a continuación. Se digirió el constructo de
vector intermedio con XhoI y EcoRI. Se ligaron
después los siguientes fragmentos nucleotídicos, preparados mediante
ligamiento secuencial de oligonucleótidos, en los sitios
XhoI/EcoRI del constructo intermedio, produciendo los
análogos IFN\alpha-N1 a
IFN\alpha-N7 en el vector
pPICZ-\alpha.
| IFN\alpha-N1 | Fragmento N1 de codificación | SEQ ID NO: 22 |
| Fragmento N1 inverso | SEQ ID NO: 23 |
| IFN\alpha-N2 | Fragmento N2 de codificación | SEQ ID NO: 24 |
| Fragmento N1 inverso | SEQ ID NO: 25 |
| IFN\alpha-N3 | Fragmento N3 de codificación | SEQ ID NO: 26 |
| Fragmento N3 inverso | SEQ ID NO: 27 |
| IFN\alpha-N4 | Fragmento N4 de codificación | SEQ ID NO: 28 |
| Fragmento N4 inverso | SEQ ID NO: 29 |
| IFN\alpha-N5 | Fragmento N5 de codificación | SEQ ID NO: 30 |
| Fragmento N5 inverso | SEQ ID NO: 31 |
| IFN\alpha-N6 | Fragmento N6 de codificación | SEQ ID NO: 32 |
| Fragmento N6 inverso | SEQ ID NO: 33 |
| IFN\alpha-N7 | Fragmento N7 de codificación | SEQ ID NO: 34 |
| Fragmento N7 inverso | SEQ ID NO: 35 |
\vskip1.000000\baselineskip
Para expresar los análogos de interferón
recombinante las secuencias de codificación de cada gen se
insertaron en el vector de expresión pPICZ-\alpha
(Invitrogen, San Diego, CA) usando los sitios de las endonucleasas
de restricción XhoI y NotI en el vector. El vector de
expresión pPICZ-\alpha proporciona una variedad
de elementos para facilitar la expresión y purificación de los
interferones recombinantes. Por ejemplo, el vector incluye un
módulo de expresión que contiene el promotor de alcohol oxidasa
regulado por metanol (AOX). En células de levadura cultivadas en
metanol, aproximadamente un 5% del poliA+ARN es del gen AOX1.
Además, el vector contiene también el prepropéptido el factor
\alpha secuencia señal de secreción de Saccharomyces
cerevisiae que dirige la secreción de la proteína al medio de
cultivo. El vector proporciona también la selección de bacterias y
células de levadura recombinantes usando el antibiótico zeocina
codificado por el gen Sh ble (gen ble de Streptoalloteichus
hindustanus).
Se sometieron a electroporación los plásmidos
recombinantes que codifican análogos de HuIFN\alpha en la cepa de
tipo salvaje X-33 de Pichia pastoris para
crecimiento a gran escala. Se cultivaron las colonias de levadura
recombinante y se indujeron según los protocolos proporcionados por
Invitrogen. Se recogieron los sobrenadantes y se filtraron usando
un filtro Acrodisc de tamaño de poro 0,8/0,2 mm (Gelman Sciences,
Ann Arbor, MI) y se intercambió el tampón por disolución salina
tamponada con fosfato (PBS) usando concentradores
Centriplus-10 (Amicon, Inc., Beverly, MA). Los
análogos de HuIFN\alpha recombinantes obtenidos mediante este
procedimiento exhibían una actividad antivírica similar a la
actividad antivírica de OvIFN\tau recombinante expresado usando
el mismo sistema de Pichia pastoris.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se usó un ensayo colorimétrico para cuantificar
la actividad antivírica de las proteínas interferón. Se cultivaron
células de riñón bovino Madin Darby (MDBK) hasta confluencia en
placas de fondo plano de 96 pocillos usando MEM de Eagle
suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% y antibióticos. Se
eliminó el medio y se lavaron las células una vez con PBS estéril.
Se añadieron muestras por triplicado usando diluciones en serie de
10 veces y 2 veces a 100 \mul/pocillo usando como medio de
dilución MEM de Eagle suplementado con FBS al 2% y antibióticos. Se
añadieron muestras de interferón, y las células se incubaron durante
18 horas a 37ºC. Se usó HuIFN\alpha-A
recombinante (Biosource Int.) como patrón de control del interferón.
Se añadieron 100 \mul de virus de la estomatitis vesicular (VSV)
a los pocillos de ensayo y se incubaron durante 48 horas más a
37ºC. Se eliminaron 100 \mul de medio de cada pocillo y se
reemplazaron por 100 \mul de disolución de rojo neutro al 0,2%
(Gibco-BRL), y se incubaron durante 1 hora a 37ºC.
Se eliminó todo el medio y las células se lavaron suavemente dos
veces con PBS antes de la adición de 100 \mul de
ácido-alcohol (50% de etanol, 1% de ácido acético).
Se leyó la A_{550} del tinte solubilizado con un
Bio-Kinetics Reader (Bio-Tek
Instruments, Winooski, VT). Se calculó la protección porcentual
usando la siguiente fórmula:
Protección\
porcentual = 100 \times \frac{AVG(A_{550}\ de\ pocillo\ de\
ensayo) - AVG (A_{550}\ de\ pocillo\ de\ control\ de\ virus)}{AVG
(A_{550}\ de\ pocillos\ de\ control\ de\ célula\ no\
tratada)}
Se define 1 unidad antivírica (U) como un 50% de
protección.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se compararon la toxicidad in vitro de
HuIFN\alpha y del análogo de IFN\alpha
IFN\alpha-N0 (SEQ ID NO: 10; Figura 1) usando
hepatocitos humanos normales. Se recibieron los hepatocitos como una
capa confluente de células en placas de 96 pocillos recubiertas con
Matrigel de Clonetics Corporation (San Diego, CA). El día siguiente
se reemplazó el medio de los pocillos por 100 \mul de medio E de
Williams modificado (Clonetics Corp.) suplementado con insulina 0,1
\muM, dexametasona 0,1 \muM, gentamicina 50 \mug/ml y
anfotericina B 50 ng/ml. Se trataron posteriormente las células con
de 2.000 U/ml a 128.000 U/ml de HuIFN\alpha o
IFN\alpha-N0. Después de 4, 6 ó 7 días de
incubación, se añadieron 10 \mul de la sal de tetrazolio
WST-1 (1,3-bencenodisulfonato de
4-[3-(4-yodofenil)-2-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio])
(Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) a cada pocillo. Se escindió
el WST-1 a formazano mediante el sistema succinato
de tetrazolio, que está presente en la cadena respiratoria
mitocondrial y es activo sólo en células viables. Se midió el
porcentaje de células viables mediante la absorbancia a 450 nm y se
expresó como el porcentaje de células no tratadas con
interferón.
Se muestran los resultados en la Tabla 1. Se
presentan los valores como actividad metabólica porcentual de
células viables en las que 100% es igual a la viabilidad de células
tratadas con medio solo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los hepatocitos incubados con HuIFN\alpha
mostraron reducciones significativas de viabilidad. En
contraposición, las células incubadas con el análogo de IFN\alpha
IFN\alpha-N0 no mostraron esencialmente pérdida de
viabilidad en comparación con células no tratadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se compararon la toxicidad in vitro de
HuIFN\alpha, OvIFN\tau y análogos de IFN\alpha humano
IFN\alpha-N0 a IFN\alpha-N7
(SEQ ID NO: 10 a SEQ ID NO: 17, figura 1) usando células
mononucleares de sangre periférica (PBMC). Se diluyó 1:4 con PBS la
fracción de capa leucocítica de sangre completa y se recubrió sobre
Nycoprep 1.077 (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega). Después de
centrifugar a 600 x g durante 20 minutos a 20ºC, las PBMC que
formaban una banda en la interfase se eliminaron usando una pipeta.
Se lavaron las células una vez con PBS y se sembraron a una
concentración de 2 x 10^{5} células/pocillo en una placa de 96
pocillos. Se trataron las células el día siguiente con 2.000 U/ml a
128.000 U/ml de IFN\alpha, IFN\tau o análogos de IFN\alpha.
Después de 7 días de incubación, se añadió la sal de tetrazolio
WST-1 (Boehringer Mannheim) a cada pocillo. Se
midió el porcentaje de células viables mediante absorbancia a 450 nm
y se expresó como el porcentaje de células no tratadas con
interferón.
Se muestran los resultados en la Tabla 2. Se
presentan los valores como actividad metabólica porcentual de
células viables en las que 100% es igual a la viabilidad de las
células tratadas con medio solo.
\vskip1.000000\baselineskip
Las PMBC incubadas con HuIFN\alpha mostraron
una reducción significativa de viabilidad. En contraposición, las
células incubadas con OvIFN\tau o con los análogos de IFN\alpha
humano IFN\alpha-N0,
IFN\alpha-N5, IFN\alpha-N6 e
IFN\alpha-N7 no mostraron esencialmente pérdida de
viabilidad después de 7 días de incubación. Se observaron
reducciones de la viabilidad similares a las observadas para
HuIFN\alpha en células incubadas con los análogos de IFN\alpha
IFN\alpha-N1 e IFN\alpha-N3. Las
células incubadas con el análogo de IFN\alpha
IFN\alpha-N4 mostraron un pequeño aumento de la
viabilidad frente a células incubadas con HuIFN\alpha.
Aunque se ha descrito la invención con
referencia a procedimientos y realizaciones específicos, se
apreciará que pueden hacerse diversas modificaciones y cambios sin
apartarse de la invención.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Pepgen Corporation
\hskip1cmUniversity of Florida
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Análogo de interferón alfa humano de
baja toxicidad
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<130> 5600-0301.41
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<140> por asignar
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<141>
20-10-1998
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 08/954.395
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
20-10-1997
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 08/631.328
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
12-4-1996
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows, versión
3.0
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<210> 1
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 1
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\hskip0,8cm
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<210> 2
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Ovis aries
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<400> 2
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\hskip0,9cm
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<210> 3
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Ovis aries
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<210> 5
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<211> 22
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<210> 6
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<212> PRT
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<213> Ovis aries
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<212> PRT
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<211> 27
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<212> PRT
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<213> Ovis aries
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<210> 9
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<211> 166
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 9
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> CADENA
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<222> (1)...(166)
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<223> análogo de
HuIFN-alfa maduro IFNa-N0
\newpage
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<400> 10
\hskip0,8cm
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<210> 11
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<211> 166
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> CADENA
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<222> (1)...(166)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de
HuIFN-alfa maduro IFNa-N1
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<400> 11
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
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<211> 166
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(166)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de
HuIFN-alfa maduro IFNa-N2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(166)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de
HuIFN-alfa maduro IFNa-N3
\newpage
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<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(166)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de
HuIFN-alfa maduro IFNa-N4
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 15
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<211> 166
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(166)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de
HuIFN-alfa maduro IFNa-N5
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<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(166)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de
HuIFN-alfa maduro IFNa-N6
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CADENA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(166)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> análogo de
HuIFN-alfa maduro IFNa-N7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Ovis aries
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<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 527
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)...(518)
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<223> gen sintético de
IFN\alpha-N0
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Conector 1
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<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Conector 2
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<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 135
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Fragmento N1, cadena directa
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<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 135
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento N1, cadena inversa
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<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento N2, cadena directa
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<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento N2, cadena inversa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Fragmento N3, cadena directa
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<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento N3, cadena inversa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento N4, cadena directa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 29
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<211> 116
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento N4, cadena inversa
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<400> 29
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\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 135
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento N5, cadena directa
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 135
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento N5, cadena inversa
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 31
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\hskip0,8cm
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<210> 32
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<211> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento N6, cadena directa
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 32
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\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento N6, cadena inversa
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 35
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\hskip0,8cm
Claims (14)
1. Un análogo polipeptídico de un polipéptido
interferón (IFN)-\alpha humano nativo maduro para
uso en terapia de seres humanos, en el que el análogo comprende el
polipéptido interferón \alpha humano maduro, y la secuencia de
aminoácidos en el análogo difiere en una o más de las posiciones 19,
20, 22, 24 y 27, a condición de que la mayoría de restos de
aminoácido en las posiciones 1-27 sean del
polipéptido IFN-\alpha humano nativo y, cuando
dicha una o más posiciones 19, 20, 22, 24 y 27 está sustituida, la
posición 19 sea Asn, Asp, Gln o Glu, la posición 20 sea His, Arg o
Lys, la posición 22 sea Asn, Asp, Gln o Glu, la posición 24 sea Leu
o la posición 27 sea His, Arg o Lys; y
en el que el análogo es capaz de exhibir una
menor toxicidad respecto al IFN-\alpha maduro en
un ensayo que comprende:
(a) incubar una primera muestra de PBMC durante
7 días en un medio de cultivo que comprende de 2.000 a 128.000
unidades antivíricas/ml del análogo;
(b) incubar una segunda muestra de 2 x 10^{5}
células/pocillo de PBMC durante 7 días en un medio de cultivo que
tiene una concentración igual, en unidades antivíricas/ml, del
IFN-\alpha maduro; y
(c) comparar el porcentaje de células viables
restantes en la primera muestra con el de la segunda muestra, con
lo que un porcentaje mayor de células viables indica la toxicidad
relativamente menor del análogo en el medio de cultivo.
2. Un análogo polipeptídico según la
reivindicación 1, en el que el resto aminoacídico en la posición 19
es Asp.
3. Un análogo polipeptídico según la
reivindicación 1, en el que el resto aminoacídico en la posición 20
es Arg.
4. Un análogo polipeptídico según la
reivindicación 1, en el que el resto aminoacídico en la posición 22
es Asn.
5. Un análogo polipeptídico según la
reivindicación 1, en el que el resto aminoacídico en la posición 27
es His.
6. Una molécula de ácido nucleico que codifica
un análogo polipeptídico según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-5.
7. Un procedimiento para preparar un análogo
polipeptídico de un polipéptido IFN-\alpha humano
que comprende: colocar una molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 6 en un sistema de expresión recombinante; efectuar
la expresión del ácido nucleico para producir el análogo; y
recuperar el análogo.
8. Un procedimiento para preparar una molécula
de ácido nucleico que codifica un análogo polipeptídico de un
polipéptido IFN-\alpha humano que comprende:
modificar una molécula de ácido nucleico que codifica un
polipéptido IFN-\alpha humano maduro en uno o más
codones, proporcionando una molécula de ácido nucleico según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
9. Una composición farmacéutica que comprende un
análogo de IFN-\alpha según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-5 y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
10. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 9 para administración oral a un sujeto que tiene una
afección patológica sensible a IFN-\alpha.
11. Una composición para inhibir la replicación
vírica en células infectadas con un virus, que comprende un análogo
de IFN-\alpha según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-5.
12. Una composición para inhibir el crecimiento
de células tumorales, que comprende un análogo de
IFN-\alpha según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-5.
13. Uso de un análogo de
IFN-\alpha según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-5 para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de una infección vírica sensible a
IFN-\alpha.
14. Uso de un análogo de
IFN-\alpha según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-5 para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de un tumor sensible a
IFN-\alpha.
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