KR20060015701A

KR20060015701A - 저-독성의 사람 인터페론-알파 유사체

Info

Publication number: KR20060015701A
Application number: KR1020067002021A
Authority: KR
Inventors: 하워드 엠. 존슨; 카롤 에이취 폰저; 로렐리 에이취. 빌라렛; 잭커라인 캄포스
Original assignee: 펩젠 코포레이션; 유니버시티 오브 플로리다
Priority date: 1997-10-20
Filing date: 1998-10-20
Publication date: 2006-02-17
Also published as: CN1240717C; EP1025124B1; CA2308116A1; CA2308116C; AU744774B2; KR100861007B1; AU9807298A; CN1276797A; JP2001520238A; JP2008247926A; TW593336B; DK1025124T3; KR20010031206A; EP1025124A1; US6204022B1; DE69839812D1; WO1999020653A1; ES2310931T3; ATE402957T1; KR100586625B1

Abstract

본 발명에서는 폴리펩티드 서열의 N-말단 부분에서 규정된 아미노산 치환을 수행함에 의해 인터페론-알파의 세포독성을 감소시키는 방법이 설명된다. 또한 본 발명에서는 낮은 세포독성을 나타내는 사람 인터페론-알파 유사체, 저-독성 인터페론-알파 유사체의 치료적 용도도 설명된다.

인터페론, 세포독성, 치환, 유사체

Description

저-독성의 사람 인터페론-알파 유사체{LOW-TOXICITY HUMAN INTERFERON-ALPHA ANALOG}

도 1 은 성숙한 HuIFNα, 성숙한 OvIFNτ, 및 IFNα-N0 부터 IFNα-N7 로 표시되는 8 개의 성숙한 HuIFNα 유사체의 처음 27 개의 N-말단 아미노산의 배열을 도시한다.

서열의 간단한 설명

SEQ ID NO:1 은 성숙한 사람 IFNα(mHuIFNα) 의 잔기 19 에서 27 사이의 아미노산 서열이다.

SEQ ID NO:2 는 성숙한 양의 인터페론-타우 (mOvIFNτ)의 잔기 19 에서 27 사이의 아미노산 서열이다.

SEQ ID NO:3 은 mHuIFNα의 잔기 11 에서 27 사이의 아미노산 서열이다.

SEQ ID NO:4 는 mOvIFNτ의 잔기 11 에서 27 사이의 아미노산 서열이다.

SEQ ID NO:5 는 mHuIFNα의 잔기 6 에서 27 사이의 아미노산 서열이다.

SEQ ID NO:6 은 mOvIFNτ의 잔기 6 에서 27 사이의 아미노산 서열이다.

SEQ ID NO:7 은 mHuIFNα의 잔기 1 에서 27 사이의 아미노산 서열이다.

SEQ ID NO:8 은 mOvIFNτ의 잔기 1 에서 27 사이의 아미노산 서열이다.

SEQ ID NO:9 는 성숙한 HuIFNα의 아미노산 서열이다 (IFNα-d; GenBank Accession No. J00210, PID g386796).

SEQ ID NO:10 은 성숙한 IFNα 유사체 IFNα-N0 의 아미노산 서열이다.

SEQ ID NO:11 은 성숙한 IFNα 유사체 IFNα-N1 의 아미노산 서열이다.

SEQ ID NO:12 는 성숙한 IFNα 유사체 IFNα-N2 의 아미노산 서열이다.

SEQ ID NO:13 은 성숙한 IFNα 유사체 IFNα-N3 의 아미노산 서열이다.

SEQ ID NO:14 는 성숙한 IFNα 유사체 IFNα-N4 의 아미노산 서열이다.

SEQ ID NO:15 는 성숙한 IFNα 유사체 IFNα-N5 의 아미노산 서열이다.

SEQ ID NO:16 은 성숙한 IFNα 유사체 IFNα-N6 의 아미노산 서열이다.

SEQ ID NO:17 은 성숙한 IFNα 유사체 IFNα-N7 의 아미노산 서열이다.

SEQ ID NO:18 은 성숙한 OvIFNτ의 아미노산 서열이다 (oTP-1; GenBank Accession No. Y00287; PID g1358).

SEQ ID NO:19 는 IFNα-N0 를 코딩하는 합성 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.

SEQ ID NO:20 은 링커 1 에 대한 뉴클레오티드 서열이다.

SEQ ID NO:21 은 링커 2 에 대한 뉴클레오티드 서열이다.

SEQ ID NO:22 는 단편 N1, 순방향 가닥에 대한 뉴클레오티드 서열이다.

SEQ ID NO:23 은 단편 N1, 역가닥에 대한 뉴클레오티드 서열이다.

SEQ ID NO:24 는 단편 N2, 순방향 가닥에 대한 뉴클레오티드 서열이다.

SEQ ID NO:25 는 단편 N2, 역가닥에 대한 뉴클레오티드 서열이다.

SEQ ID NO:26 은 단편 N3, 순방향 가닥에 대한 뉴클레오티드 서열이다.

SEQ ID NO:27 은 단편 N3, 역가닥에 대한 뉴클레오티드 서열이다.

SEQ ID NO:28 은 단편 N4, 순방향 가닥에 대한 뉴클레오티드 서열이다.

SEQ ID NO:29 는 단편 N4, 역가닥에 대한 뉴클레오티드 서열이다.

SEQ ID NO:30 은 단편 N5, 순방향 가닥에 대한 뉴클레오티드 서열이다.

SEQ ID NO:31 은 단편 N5, 역가닥에 대한 뉴클레오티드 서열이다.

SEQ ID NO:32 는 단편 N6, 순방향 가닥에 대한 뉴클레오티드 서열이다.

SEQ ID NO:33 은 단편 N6, 역가닥에 대한 뉴클레오티드 서열이다.

SEQ ID NO:34 는 단편 N7, 순방향 가닥에 대한 뉴클레오티드 서열이다.

SEQ ID NO:35 는 단편 N7, 역가닥에 대한 뉴클레오티드 서열이다.

본 발명은 사람 인터페론-알파의 독성을 감소시키는 방법, 저-독성의 사람 인터페론-알파 유사체, 및 이들 유사체의 치료적 용도에 관한 것이다.

참고문헌

인터페론 (IFN)은 두 가지의 뚜렷하게 구별되는 그룹: IFNα, IFNβ, 및 IFNω(IFNαⅡ 로도 알려져 있음)를 포함한 타입 I 인터페론; 및 IFNγ로 대표되는 타입 Ⅱ 인터페론으로 분류되어 왔다 (DeMaeyer, et al., 1988). 사람에게는 최소한 17 개의 IFNα 비-대립성 유전자, 최소한 2 개의 IFNβ 비-대립성 유전자, 및 하나의 IFNγ 유전자가 있는 것으로 추정된다.

IFNα' 는 다양한 유형의 세포 증식을 억제하는 것으로 알려져 있다. IFN α'들은 특히 모발상세포 백혈병과 같은 혈액학적 악성종양에 대하여 유용하다 (Quesada, et al., 1984). 나아가, 이들 단백질들은 또한 다발성 골수종, 만성 림프구성 백혈병, 저-등급 림프종, 카포시 육종, 만성 골수성 백혈병, 신장-세포 암종, 방광 종양 및 난소암에 대하여 활성을 나타냈다 (Bonnem, et al., 1984; Oldham, 1985). 특정 자가면역 및 염증성 질병의 병원학에서 인터페론과 인터페론 수용체의 역할에 대해서도 또한 연구되어 있다 (Benoit, et al., 1993).

IFNα' 는 또한 다양한 유형의 바이러스성 감염에 대해서도 유용하다 (Finter, et al., 1991). 알파 인터페론은 사람 유두종 바이러스 감염, B형 간염, 및 C형 간염 감염에 대해서도 활성을 나타냈다 (Finter, et al., 1991; Kashima, et al., 1988; Dusheiko, et al., 1986; Davis, et al., 1989).

그러나, 중요하게도, IFNα' 의 유용성은 그것들의 독성에 의하여 제한되어 왔다: 암 및 바이러스성 질병의 치료에 인터페론을 사용한 결과, 열, 오한, 식욕부진, 체중 손실, 및 피로감과 같은 심각한 부작용이 초래된다 (Pontzer, et al., 1991; Oldham, 1985). 이들 부작용은 때로 (i) 인터페론 용량이 치료의 효과를 제한할 수준으로까지 감소되어야 하거나, 또는 (ii) 환자의 치료를 중단할 필요를 유발하기까지 한다. 그러한 독성으로 인해 쇠약하게 하는 사람 및 동물 질병의 치료에 사용되는 이들 강력한 항바이러스성 및 항증식성 단백질의 유효성이 감소되었다.

발명의 개요

한 측면으로, 본 발명은 사람 IFNα (HuIFNα)의 독성을 감소시키는 방법을 포함한다. 이 방법은 성숙한 HuIFNα의 위치 19, 20, 22, 24, 및 27 에 있는 아미노산들중 하나 또는 그 이상의 아미노산을, 배양중에 사람 단핵 세포에 노출시켰을 때 폴리펩티드의 특이한 독성을 실질적으로 감소시키기에 효과적인 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다. 성숙한 HuIFNα의 아미노산 잔기 1 내지 27 의 대부분은 변화하지 않은 채로 유지된다.

한 구체예에서, 이 방법은 19, 20, 22, 및 27 에 있는 하나 또는 그 이상의 아미노산을 비보존된 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다. 다양한 구체예에서, 치환은, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 위치 19 에 있는 아미노산 대신 제 Ⅲ 부류에 속하는 아미노산, 특히 Asp 로 치환하는 것; 위치 20 에 있는 아미노산 대신 제 Ⅳ 부류에 속하는 아미노산, 특히 Arg 으로 치환하는 것; 위치 22 에 있는 아미노산 대신 제 Ⅲ 부류에 속하는 아미노산, 특히 Asn 으로 치환하는 것; 위치 27 에 있는 아미노산 대신 제 Ⅳ 부류에 속하는 아미노산, 특히 His 으로 치환하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 치환은 위치 24 에 있는 아미노산 대신 제 V 부류에 속하는 아미노산, 특히 Leu 으로 치환하는 것을 포함할 것이다.

다른 구체예에서, 이 방법은 성숙한 HuIFNα의 잔기 19 에서 27 사이에 있는 서열을 SEQ ID NO:2 로 표시되는 9-량체로 치환하는 것을 포함한다. 특히, 잔기 19 에서 27 사이에 있는 성숙한 HuIFNα의 서열은 SEQ ID NO:1 이다. 9-량체의 SEQ ID NO:2 는 성숙한 양의 인터페론-타우 (OvIFNτ)의 잔기 19 에서 27 에 상응하고, 위치 19, 20, 22, 24, 및 27 에서 성숙한 HuIFNα와 동일하지 않은 잔기를 함유하고 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 잔기 11 에서 27 사이에 있는 HuIFNα의 서열을 SEQ ID NO:4 로 표시되는 17-량체로 치환하는 것을 포함한다. 특히, 잔기 11 에서 27 사이에 있는 성숙한 HuIFNα의 서열은 SEQ ID NO:3 이다. 17-량체의 SEQ ID NO:4 는 성숙한 OvIFNτ의 잔기 11 에서 27 에 상응하고, 위치 11, 13, 14, 16, 19, 20, 22, 24, 및 27 에서 HuIFNα의 잔기와 동일하지 않은 잔기를 함유하고 있다. 다른 구체예에서, 방법은 잔기 6 에서 27 사이에 있는 HuIFNα의 서열을 SEQ ID NO:6 으로 표시되는 22-량체로 치환하는 것을 포함한다. 특히, 잔기 6 에서 27 사이에 있는 성숙한 HuIFNα의 서열은 SEQ ID NO:5 이다. 22-량체의 SEQ ID NO:6 은 성숙한 OvIFNτ의 잔기 6 에서 27 에 상응하며, 위치 6, 7, 8, 11, 13, 14, 16, 19, 20, 22, 24, 및 27 에서 HuIFNα의 잔기와 동일하지 않은 잔기를 함유하고 있다.

관련된 측면으로, 본 발명은 HuIFNα의 독성을 감소시키는 방법을 포함한다. 이 방법은 성숙한 HuIFNα의 위치 19, 20, 22, 24 및 27 에 있는 아미노산들중 하나 또는 그 이상의 아미노산을, 배양중의 단핵세포에서 폴리펩티드의 특이한 독성을 실질적으로 감소시키기에 효과적인 아미노산으로 치환하는 것을 포함하며, 이 때 잔기 28 에서 166 사이에 있는 성숙한 HuIFNα의 서열은 실질적으로 변화하지 않는다. 한 구체예에서, 상기 치환은 HuIFNα의 잔기 1 에서 27 사이에 있는 서열을 SEQ ID NO:8 로 규정되는 27-량체로 치환함으로써 이루어진다. 특히, 잔기 1 에서 27 사이에 있는 성숙한 HuIFNα의 서열은 SEQ ID NO:7 이다. 27-량체의 SEQ ID NO:8 은 성숙한 OvIFNτ의 잔기 1 에서 27 에 상응하며, 위치 2, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 13, 14, 16, 19, 20, 22, 24 및 27 에서 성숙한 HuIFNα의 잔기와 동일하지 않은 잔기를 함유하고 있다.

다른 측면으로, 본 발명은 사람의 치료에 사용하기 위한 저-독성의 사람 IFNα 유사체를 포함한다. 이 유사체는 아미노산 위치 19, 20, 22, 24 및 27 중 하나 또는 그 이상의 위치에 치환된 아미노산을 가지고 있는 성숙한 HuIFNα 단백질을 포함하며, 유사체의 아미노산 잔기 1 내지 27 의 대부분은 천연 HuIFNα의 잔기들이다. 유사체는 배양중의 단핵세포의 증가된 생육성에 의해 증명되는 바, 천연 사람 IFNα 와 관련하여 특이한 독성이 실질적으로 감소된 것을 특징으로 한다.

한 구체예에서, 유사체는 위치 19, 20, 22, 및 27 중 하나 또는 그 이상의 위치에서 보존되지 않은 아미노산 치환을 포함하고 있다. 다양한 구체예에서, 치환된 아미노산은, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 위치 19 에 있는 아미노산 대신 제 Ⅲ 부류의 아미노산, 특히 Asp; 위치 20 에 있는 아미노산 대신 제 Ⅳ 부류의 아미노산, 특히 Arg; 위치 22 에 있는 아미노산 대신 제 Ⅲ 부류의 아미노산, 특히 Asn; 및 위치 27 에 있는 아미노산 대신 제 Ⅳ 부류의 아미노산, 특히 His 일 수 있다. 다른 구체예에서, 치환된 아미노산은 위치 24 에 있는 아미노산 대신 제 Ⅴ 부류의 아미노산, 특히 Leu 일 것이다.

다른 구체예에서, 유사체는 잔기 19 에서 27 이 SEQ ID NO:2 의 9-량체로 치환된 성숙한 사람 IFNα를 포함한다. 다른 구체예에서, 유사체는 잔기 11 에서 27 이 SEQ ID NO:4 의 17-량체로 치환된 성숙한 사람 IFNα를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 유사체는 잔기 6 내지 27 이 SEQ ID NO:6 의 22-량체로 치환된 성숙한 사람 IFNα를 포함한다.

관련된 측면으로, 본 발명은 아미노산 위치 19, 20, 22, 24 및 27 중 하나 또는 그 이상의 위치에서 치환된 아미노산을 가지고 있는 성숙한 사람 IFNα 단백질을 포함하고 있으며, 성숙한 사람 IFNα 서열의 잔기 28 내지 166 사이의 서열은 실질적으로 변화되지 않은, 사람 치료에 사용하기 위한 저-독성의 사람 IFNα 유사체를 포함한다. 이 유사체는 배양중의 단핵세포의 증가된 생육성에 의해 증명되는 바, 천연의 성숙한 사람 IFNα에 관련하여 실질적으로 감소된 특이한 독성을 가지는 것을 특징으로 한다. 한 구체예에서, 유사체는 잔기 1 내지 27 이 SEQ ID NO:8 의 27-량체로 치환되어 있는 성숙한 사람 IFNα를 포함하고 있다.

본 발명은 또한 종양 세포 성장을 억제하는 방법을 포함한다. 이 방법에서, 종양 세포는 종양 세포의 성장을 억제하기에 효과적인 농도의 상술된 유형의 저-독성 IFNα 유사체와 접촉하게 된다. 저-독성의 IFNα 유사체는 어떠한 수용가능한 약리학적 제형의 일부분일 수 있다. 그것의 성장이 저-독성의 IFNα 유사체에 의하여 억제될 수 있는 종양 세포로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 암종 세포, 조혈 암세포, 백혈병 세포, 림프종 세포, 및 흑색종 세포가 있다. 한 구체예에서, 종양 세포는 스테로이드-민감성 종양 세포, 예컨대 유방 종양 세포이다.

본 발명의 또 다른 측면으로, 상술된 유형의 저-독성 IFNα 유사체가 바이러스 복제를 억제하는 방법에 사용된다. 이 방법에서, 바이러스에 감염된 세포들은 상기 세포내에서 바이러스 복제가 억제되기에 효과적인 농도의 저-독성 IFNα 화합물과 접촉된다. 저-독성 IFNα는 허용되는 약리학적 제형중 일부분일 수 있다. RNA 및 DNA 바이러스 두가지의 복제는 모두 저-독성 사람 IFNα에 의하여 억제될 수 있다. 그러한 RNA 바이러스의 실예로는 고양이 백혈병 바이러스, 양의 진행성 폐렴 바이러스, 양의 렌티바이러스, 말의 감염성 빈혈 바이러스, 소의 면역결핍성 바이러스, 비스나-마에디 (visna-maedi) 바이러스, 염소의 관절염 뇌염 바이러스, 사람 면역결핍성 바이러스 (HIV) 또는 C형 간염 바이러스 (HCV)가 있다. 예시적인 DNA 바이러스는 B형 간염 바이러스 (HBV)이다.

여전히 다른 측면으로, 본 발명은 자가면역 질병의 치료가 필요한 개체에게서 자가면역 질병을 치료하는 방법을 포함한다. 한 구체예에서, 자가면역 질병은 다발성 경화증이다. 이 방법은 개체에게, 상술된 유형의 저-독성 사람 IFNα 유사체를 약학적으로 효과적인 양으로 투여하는 것으로 이루어진다.

또 다른 측면으로, 본 발명은 만성 염증의 치료가 필요한 개체에서 만성 염증을 치료하는 방법을 포함한다. 한 구체예에서, 만성 염증은 궤양성 대장염으로부터 발생한다. 이 방법은 개체에게, 상술된 유형의 저-독성 사람 IFNα 유사체를 약학적으로 효과적인 양으로 투여하는 것으로 이루어진다.

또 다른 측면으로, 본 발명은 정맥내로 투여된 IFNα에 반응하는 어떠한 질병 상태를, 상술된 유형의 저-독성 사람 IFNα 유사체를 경구 투여함으로써 치료하는 방법을 포함한다. 경구적으로 투여되는 유사체는 바람직하게는 개체에 의해 섭취된다.

본 발명의 이들 및 다른 목적 및 특징들은 다음의 상세한 설명과 첨부되는 도면을 함께 판독할 때 보다 상세하게 이해될 것이다.

발명의 상세한 설명

I. 정의

인터페론-알파 (IFNα)는 SEQ ID NO:9 로서 표시된 성숙한 IFNα 단백질 서열에 대하여 70 % 이상, 또는 바람직하게는 약 80 % 이상, 또는 보다 바람직하게는 약 90 % 이상의 아미노산 동일성을 가지고 있는 인터페론 단백질의 어떠한 한 패밀리를 말한다. 아미노산 동일성은 예를 들면 디폴트 파라메터를 포함한 LALIGN 프로그램을 사용하여 측정될 수 있다. 이 프로그램은 서열 비교 프로그램의 FASTA 버전 1.7 슈트에서 발견된다 (Pearson and Lipman 1988; Pearson, 1990; program available from William R. Pearson, Department of Biological Chemistry, Box 440, Jordan Hall, Charlottesville, VA). 전형적으로, IFNα는 다음의 특징군중 최소한 한 가지의 특징을 가진다: (a) 항-바이러스 성질, (b) 항-세포 증식 성질, 및 (c) 핵산에 의해 또는 바이러스에 의해 유도가능함. 바람직한 IFNα는 사람으로부터 얻어지는 것들이다.

인터페론-타우 (IFNτ)는 SEQ ID NO:18 로서 표시된 성숙한 IFNτ 단백질에 대하여 70 % 이상, 또는 바람직하게는 약 80 % 이상, 또는 보다 바람직하게는 약 90 % 이상의 아미노산 동일성을 가지고 있는 인터페론 단백질의 어떠한 한 패밀리를 말한다. 전형적으로, IFNτ는 다음의 특징군중 최소한 한 가지의 특징을 가진다: (a) 배 발생/영양 외배엽에 의한 태아/태반 단계 중에 발현됨, (b) 항-황체 융해 성질, (c)항-바이러스 성질, 및 (d)항-세포 증식 성질. 바람직한 IFNτ'는 양 및 소의 IFNτ이다.

"성숙한 단백질" 은 리더 서열이 제거된 후의 IFN 단백질을 말한다. 성숙한 IFN 단백질 서열은 완전한 IFN 아미노산 서열의 잔기 Cys 24 에서 시작하여 성숙한 단백질 서열의 Cys 1 로 진행된다.

폴리뉴클레오티드 서열 또는 단편은 그것이 그것들이 유도되는 서열 또는 단편에 존재하는 것과 동일한 뉴클레오티드 서열을 함유할 때 다른 폴리뉴클레오티드 서열 또는 단편 "으로부터 유도"된다. 예를 들어, 박테리아 플라스미드는 만약 삽입물중의 폴리뉴클레오티드의 서열이 선택된 사람 유전자의 폴리뉴클레오티드의 서열과 동일하다면 선택된 사람 유전자"로부터 유도된" 삽입물을 함유한다.

유사하게, 폴리펩티드 서열 또는 단편은 그것이 그것들이 유도되는 서열 또는 단편에 존재하는 것과 동일한 아미노산 서열을 가지고 있을 때, 다른 폴리펩티드 또는 단편"으로부터 유도"된다.

두 개의 아미노산 서열과 관련하여 퍼센트 (%) 동일성은 서열들이 최적 상태로 배열되어 있고 "갭"을 나타내는 페널티가 없을 때 두 개의 서열 사이에서 동일한 잔기들의 % 를 말한다. 달리 표현하면, 만약 두 번째 서열과 최적으로 배열되기 위하여 첫 번째 서열안에 갭이 삽입되어야 한다면, % 동일성은 상응하는 아미노산 잔기와 짝을 이루는 잔기들만을 사용하여 계산된다 (즉, 계산은 첫 번째 서열의 "갭"에 있는 두 번째 서열의 잔기는 고려하지 않는다). 최적의 배열은 가장 높은 % 동일성 스코어를 제공하는 배열로서 규정된다. 그러한 배열은 "GENEWORKS" 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 대안으로, 배열은 1 의 ktup, 디폴트 파라메터 및 디폴트 PAM을 포함하는 국소 배열 프로그램 LALIGN 을 사용하여 수행될 수 있다.

"보존성 치환" 은 한 부류의 아미노산이 동일한 부류안에 있는 아미노산에 의하여 치환되는 것을 말하는데, 여기서 부류는 공통적인 물리화학적 아미노산 측쇄 성질 및 자연에서 발견되는 상동성 단백질에서의 높은 치환 빈도 (표준 Dayhoff 빈도 교환 매트릭스에 의해 측정되는 바)에 의하여 규정된다. 일반적으로 6 개 부류의 아미노산 측쇄가 상기에서 설명된 바와 같이 범주화되는데, 다음과 같다: 제 I 부류 (Cys); 제 Ⅱ 부류 (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); 제 Ⅲ 부류 (Asn, Asp, Gln, Glu); 제 Ⅳ 부류 (His, Arg, Lys); 제 Ⅴ 부류 (Ile, Leu, Val, Met); 및 제 Ⅵ 부류 (Phe, Tyr, Trp). 예를 들어, Asn, Gln, 또는 Glu 와 같은 제 Ⅲ 부류 의 다른 잔기에 대한 Asp 의 치환은 보존성 치환이다.

"비-보존성 치환" 은 한 부류의 아미노산을 다른 부류에 속해있는 아미노산으로 치환하는 것을 말한다: 예를 들면 제 Ⅱ 부류의 잔기 Ala 를 Asp, Asn, Glu 또는 Gln 과 같은 제 Ⅲ 부류의 잔기로 치환하는 것.

질병을 "치료"하는 것은 질병의 증상을 감소시키고 및/또는 질병의 심각성을 경감시키는데 효과적인 치료 물질을 투여하는 것을 말한다.

II. 저-독성 사람 IFNα 유사체

본 발명은 HuIFNα의 세포독성이 성숙한 HuIFNα의 아미노산 위치 19, 20, 22, 24, 및 27 중 하나 또는 그 이상의 위치에 아미노산 치환을 도입시킴으로써 상당히 감소될 수 있다는 발견을 토대로 한다.

도 1 은 성숙한 HuIFNα(SEQ ID NO:9) 및 성숙한 OvIFNτ(SEQ ID NO:18)의 처음 27 개의 N-말단 아미노산 잔기를 도시한다. 도면에서 동일하지 않은 잔기들 은 진하게 표시된다. OvIFNτ의 하위세트를 함유하고 있는 HuIFNα 유사체들은 하기 실시예 1 에서 설명되는 바와 같이 제조되었다. 각 HuIFNα 유사체의 위치 1 내지 27 이 도 1 에 도시되며, 치환이 일어난 곳은 진하게 표시된다. 각 유사체의 아미노산 28 내지 166 은 HuIFNα 잔기를 유지한다 (예컨대 SEQ ID NO:9 의 잔기 28 내지 166).

IFNα-N0 로부터 IFNα-N7 (SEQ ID NO:10 에서 SEQ ID NO:17) 로 표시되는 HuIFNα 유사체들은 하기 실시예 2 와 3 에서 설명되는 바와 같이 세포독성에 대하여 분석되었다. HuIFNα와 함께 인큐베이션된 간세포들은 생육성이 상당히 감소된 것으로 나타났다 (표 1, 실시예 2). 대조적으로, IFNα유사체 IFNα-N0 와 함께 인큐베이션된 세포들은 모출원에서 보고된 바와 같이 본질적으로 생육성이 전혀 감소되지 않은 것으로 나타났다.

IFNα-N1 부터 IFNα-N7 까지의 유사체가 실시예 3 에서 설명되는 바와 같이 세포독성에 대하여 분석되었다. 다양한 양의 OvIFNτ 또는 유사체 IFNα-N0 와 함께 인큐베이션된 말초혈 단핵 세포 (PBMC)는 7 일 동안 인큐베이션된 후에 본질적으로 생육성의 감소를 나타내지 않았다. 유사체 -N1 또는 -N3 과 함께 인큐베이션된 PBMC 는 생육성의 상당한 감소를 나타냈으며, 그 수준은 HuIFNα에 대해 관찰된 것과 유사하였다. 유사체 -N1 및 -N3 에서 위치 2, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 13 및 14 에서의 치환은 따라서 HuIFNα의 세포독성을 감소시키는 데에는 상대적으로 비효과적이다. IFNα-N4 와 함께 인큐베이션된 세포들은 HuIFNα 및 OvIFNτ와 함께 인큐베이션된 세포들의 생육성 수준 사이의 수준을 보유하였다. 그러므로 위치 16, 19 및 20 에서의 추가의 치환은 HuIFNα의 세포독성을 감소시키는 데에는 부분적으로 효과적이다.

IFNα 유사체 IFNα-N5, IFNα-N6 및 IFNα-N7 과 함께 인큐베이션된 PBMC 는 7 일동안의 인큐베이션 후에 본질적으로 어떠한 생육성의 손실도 보이지 않았다 (표 2). 이들 3 개의 유사체는 OvIFNτ의 낮은 세포독성을 보유하며, 나아가 HuIFNα의 감소된 세포독성에 기여하는 위치를 규정한다. 가장 놀랍게도, 유사체 IFNα-N7 이 위치 19, 20, 22, 24 및 27 에서의 단지 5 개의 치환만을 함유하고 있다. 낮은 세포독성을 나타내는 다른 유사체들, -N0, -N5, 및 -N6 은 이들 위치와 추가의 위치들에 치환을 포함하고 있다 (도 1). 이 시험에서 중간 수준의 세포독성을 나타낸 유사체 IFNα-4 는 위치 22, 24 및 27 에서 치환이 일어나지 않았다. 이들 데이터는 본 발명에 따라 이들 단백질의 세포독성에 잔기 위치 19, 20, 22, 24 및 27 이 중요한 역할을 한다는 것을 증명한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 위치 19, 20, 22, 24 및 27 중 하나 또는 그 이상의 위치에서 아미노산 치환이 일어났고, 나머지 아미노산의 대부분은 천연 HuIFNα 잔기인 HuIFNα 유사체를 예상한다. 이 유사체는 본원에 기술된 세포독성 분석에 의해 측정되는 바 감소된 독성과, 또한 천연 사람 IFNα와 관련된 치료 성질을 가지고 있다.

바람직한 치환은 하나 또는 그 이상의 다음을 포함한다: 성숙한 HuIFNα의 아미노산 19 는 성숙한 OvIFNτ의 Asp 19 로, 또는 동일한 부류의 잔기 Asn, Gln, 또는 Glu 로 치환될 수 있고; 성숙한 HuIFNα의 아미노산 20 은 성숙한 OvIFNτ의 Arg 20 으로, 또는 동일한 부류의 잔기 His 또는 Lys 으로 치환될 수 있으며; 성숙한 HuIFNα의 아미노산 22 는 성숙한 OvIFNτ의 Asn 22 로, 또는 동일한 부류의 잔기 Asp, Gln, 또는 Glu 로 치환될 수 있고; 성숙한 HuIFNα의 아미노산 24 는 성숙한 OvIFNτ의 Leu 24 로, 또는 동일한 부류의 잔기 Val 또는 Met 로 치환될 수 있으며; 성숙한 HuIFNα의 아미노산 27 은 OvIFNτ의 His 27 로, 또는 동일한 부류의 잔기 Arg 또는 Lys 으로 치환될 수 있다. 그러한 치환은 HuIFNα의 독성을 감소시키기에는 효과적이지만, 원하는 HuIFNα의 치료적 성질을 유의할만하게 변경시키지는 않는다.

일부의 저-독성 HuIFNα 유사체의 변경된 위치를 포함하는 다른 예시적인 서열로는 본원에서 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 및 SEQ ID NO:6 으로 표시되는 서열들이 있다. 가장 바람직한 구체예는 OvIFNτ와 동일하지 않은 위치에서 19 내지 27 영역에 치환이 일어난 HuIFNα 유사체이다. 예를 들면, 성숙한 사람 IFNα(SEQ ID NO:1)의 아미노산 19 내지 27 이 성숙한 OvIFNτ(SEQ ID NO:2)의 아미노산 19 내지 27 로 치환되면, 그 결과 성숙한 사람 IFNα의 위치 19, 20, 22, 24, 및 27 이 변경되는 한편 나머지 성숙한 사람 IFNα 서열은 변화되지 않은 채로 유지되는 구성물들이 있다. 이 실예는 유사체 IFNα-N7 (SEQ ID NO:17)에 상응한다.

비록 기재된 저-독성의 사람 IFNα 유사체가 "성숙한" 단백질이라 할지라도, 즉, 이들 단백질이 완전한 인터페론 서열의 잔기 Cys 24 (성숙한 단백질의 Cys 1 에 해당함)에서 시작한다 할지라도, 본 발명은 또한 리더 서열을 함유하는, 즉 개시 메티오닌에서 시작하는 IFNα 유사체를 포함한다는 것이 인정될 것이다. 그러 한 사람 IFNα 유사체에서 리더 서열은 사람 IFNα, 양의 IFNτ, 또는 타입 I 의 다른 인터페론으로부터 유도될 수 있다.

상기에서 지적된 바와 같이, 본 발명의 HuIFNα 유사체에 대하여 예상되는 상당한 장점은 천연 사람 IFNα와 관련하여 유사체의 감소된 독성이다. HuIFNα 유사체는 천연 사람 IFNα와 동일한 생물학적 활성을 가질 것이다.

III. 재조합 및 합성 조작

HuIFNα 유사체 HuIFNα-N0 를 암호화하는 합성 유전자의 제조는 하기 실시예 1A 에서 설명된다. 간단하게 설명하면, 처음 27 개의 N-말단 위치내에 모두 15 개의 OvIFNτ 치환을 함유하고 있는 성숙한 HuIFNα의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:10)이 Pichia pastoris에 대하여 최적화된 코돈 용법을 사용하여 역 번역되었다. 뉴클레오티드 서열은 구성물의 전 길이를 통하여 공간 배치된 5 개의 제한위치를 포함하도록 편집되었다. 합성 유전자 서열은 4 개의 뉴클레오티드 단편으로 나누어졌다. 각각 대략 150 염기쌍의 길이를 가지는 개별적인 단편들은 올리고뉴클레오티드의 순차적인 라이게이션에 의하여 제조되었다. 단편들은 순차적으로 박테리아 벡터에 클론되어 IFNα-N0 (SEQ ID NO:19)를 암호화하는 유전자가 생성되었다. 그런 다음 이 합성 유전자가 Pichia pastoris에서의 발현을 위해 pPICZ-α 벡터에 클론되었다. 유사체 IFNα-N1 부터 IFNα-N7 을 암호화하는 합성 유전자들도 또한 실시예 1A 에서 설명되는 바와 같이 올리고뉴클레오티드의 순차적인 라이게이션에 의하여 제조되었다.

피치아에서의 합성 유전자들의 발현 (실시예 1B)으로 재조합 HuIFNα 유사체 의 과잉생성이 가능해졌다. 재조합 HuIFNα 유사체들은 동일한 Pichia pastoris시스템을 사용하여 발현된 재조합 OvIFNτ의 항바이러스 활성과 유사한 항바이러스 활성을 나타냈다 (실시예 1C).

IV. 활용성

A. 항바이러스 성질

타입 I 인터페론들은 강력한 항바이러스 성질을 나타낸다. IFNα와 관련하여 IFNτ의 감소된 독성은 성숙한 단백질의 처음 27 개의 N- 말단 잔기내에 존재하는 비-보존된 아미노산들에 기인하는 것으로 여겨진다. 이들 아미노산 잔기들의 IFNα 의 N-말단 부분에 있는 상응하는 잔기들에 대한 치환으로 인해, 그 결과 생성되는 HuIFNα 유사체들의 감소된 세포독성이 부여되는 한편, 타입 I 인터페론들의 항바이러스 활성은 보유되는 것으로 여겨진다. 그러므로, 본 발명의 저-독성 HuIFNα 유사체를 포함하고 있는 제형들은 바이러스 복제를 억제하기 위하여 사용될 수 있다.

본 발명의 저-독성 HuIFNα 유사체들은 예컨대 어머니에게 있는 바이러스 (예컨대 HIV)의 발생단계에 있는 태아에로의 전달을 방지하기 위하여, 태아와 모체 사이의 면역 관계에 영향을 미치는 방법에 사용될 수 있다. 사람 인터페론 유사체들은 특히 잠재적인 항원성 반응이 동종 단백질을 사용하였을 때 더 적은 것으로 보이기 때문에, 사람의 치료에 특히 유용하다.

B. 항세포성 증식 성질

타입 I 인터페론들은 강력한 항세포성 증식 성질을 나타낸다. 본원에서 설 명되는 것과 같은 저-독성의 사람 IFNα 유사체들은 또한, 현재 공지되어 있는 다른 인터페론들과 관련된 부정적인 부작용없이 세포 성장을 억제하기 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 저-독성 IFNα 유사체를 포함하고 있는 제형들은 종양 성장을 억제하고, 예방하거나, 또는 둔화시키기 위하여 사용될 수 있다.

C. 면역 시스템 장애

본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 질병들에는 자가면역 질병, 염증성 질병, 증식성 질병 및 과잉증식성 질병 뿐만이 아니라, 면역학적으로 중재된 질병의 피부에 나타나는 징후가 포함된다. 특히, 본 발명의 방법은 면역 시스템 과민증과 관련된 질환들을 치료하는데 유익하다. 면역 시스템 과민증의 타입은 네가지이다. 타입 I, 또는 즉각적인/민감성 과민증은 알레르기 항원 (예컨대 꽃가루)에 대한 반응으로 일어나는 비만 세포 탈과립화에 기인한 것으로, 천식, 알레르기성 비염 (고초열), 담마진 (두드러기), 과민성 충격, 및 다른 알레르기성을 띄는 병이 여기에 포함된다. 타입 Ⅱ, 또는 자가면역 과민증은 신체의 자가 세포상에서 인지된 "항원"에 대해 특정된 항체에 기인하는 것이다. 타입 Ⅲ 과민증은 다양한 조직에 안착하여 추가의 면역 반응을 활성화시키는 항원/항체 면역 복합체의 형성에 기인하며, 혈청 병, 알레르기성 폐포염, 및 때로 추가 면역접종후에 형성되는 커다란 종기와 같은 질환의 원인이 된다. 타입 Ⅳ 과민증은 민감화된 T-세포로부터의 림포카인의 방출에 기인하며, 그 결과 염증성 반응이 유발된다. 실예로는 접촉성 피부염, 홍역의 발진, 및 특정 약물에 대한 "알레르기성" 반응이 있다.

일부의 개체에게서 어떤 메카니즘에 의하여 특정 질환이 과민증을 유발할 수 있는지에 대해서는 일반적으로 잘 알려져 있지 않지만, 그 메카니즘은 아마도 유전적 및 외인성 인자 둘다를 포함할 것이다. 예를 들어, 박테리아, 바이러스 또는 약물이, 이미 유전적으로 자가면역 장애에 걸리기 쉬운 개체에게서 자가면역 반응을 야기시키는데 중요한 역할을 담당할 것이다. 어떤 타입들의 과민증의 발생은 상호간에 관련이 있을 것으로 제시되었다. 예를 들어, 특정의 통상적인 알레르기를 가지고 있는 개체들은 자가면역 장애에 보다 더 쉽게 걸릴 수 있다고 제시되었다.

자가면역 장애는 기본적으로 특정 기관 또는 조직으로 한정되는 그룹과 전신에 영향을 주는 그룹으로 대략 나눌 수 있다. 기관-특이적 장애 (영향을 받는 기관)의 실예로는 다발성 경화증 (신경 돌기상의 미엘린 코팅), 타입 Ⅰ 당뇨병 (췌장), 하시모토스 갑상선염 (갑상선), 악성 빈혈 (위), 애디슨 질병 (부신), 중증 근무력증 (신경근육 결합부에 있는 아세틸콜린 수용체), 류마티스성 관절염 (관절 라이닝), 포도막염 (눈), 건선 (피부), 길라인-바레 신드롬 (Guillain-Barre Syndrome) (신경 세포) 및 그레이브 질병 (Grave's disease) (갑상선)이 있다. 전신성 자가면역 질병으로는 전신성 홍반성 낭창 및 피부근염이 있다.

과민증 장애의 다른 실예로는 천식, 습진, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 다른 습진성 피부염, 지루성 피부염, 비염, 태선 플라누스 (Lichen planus), 펨플루구스 (Pemplugus), 수포성 유천포창, 표피용해성 수포, 두드러기, 혈관부종, 혈관염, 홍반, 피부의 호산구 증가증, 부분적 탈모, 아테로마성 동맥경화증, 일차 담석증 및 신장 신드롬이 있다. 관련된 질병으로는 장의 염증, 예컨대 복강 질병, 항문 (직장)염, 호산구 증가성 위장염, 비만세포염, 염증성 장 질병, 크론스 질병 및 궤양성 대장염과, 발-관련 알레르기가 있다.

본 발명의 방법을 사용하여 특히 치료하기 쉬운 자가면역 질병에는 다발성 경화증, 타입 Ⅰ (인슐린 의존성) 당뇨병, 홍반성 낭창, 근 위축성 측삭 경화증, 크론스 질병, 류마티스성 관절염, 위장염, 천식, 포도막염, 알레르기 및 건선이 포함된다.

본 발명의 저-독성 HuIFNα 유사체를 함유하고 있는 의약은 치료적으로 치료하기 위하여 사용될 수 있고, 따라서 상기 논의된 바와 같은 자가면역 질병들의 증상을 경감시키기 위하여 사용될 수 있다.

D. 약학적 조성물

본 발명의 저-독성 사람 IFNα 유사체들은 약학적으로 유용한 조성물을 제조하는 공지된 방법에 따라 제형될 수 있다. 인터페론 또는 인터페론-유사 화합물들을 포함하고 있는 제형들은 이미 기술되어 있다 (예컨대 Martin, 1976). 일반적으로, 본 발명의 조성물은 유효량의 인터페론 유사체가 조성물의 효과적인 투여를 용이하게 하기 위하여 적당한 담체와 결합되는 방식으로 제형될 것이다.

이들 치료법에 사용된 조성물은 또한 다양한 형태일 수 있다. 이들은 예컨대 고체, 반-고체, 및 액체 투여 형태, 예컨대 정제, 환, 분말, 액체 용액 또는 현탁액, 리포솜, 좌제, 주사가능하고 용해되지 않는 용액이다. 바람직한 형태는 투여 및 치료 용도의 의도된 방식에 따라 좌우된다. 조성물은 또한 바람직하게는 당업자에게 공지되어 있는 약학적으로 허용되는 담체 및 보조제를 포함할 수 있다. 바람직하게도, 본 발명의 조성물은 단위 용량 형태이며, 통상적으로 환자에게 하루에 한 번 또는 여러번 투여될 것이다.

저-독성의 사람 IFNα 유사체 또는 관련된 폴리펩티드는 경구 섭취, 흡입, 비강내 분무, 복강내, 정맥내, 근육내, 병변내, 또는 피하 주사를 포함한, 모든 약학적으로 허용되는 단위용량 형태로 환자에게 투여될 수 있다. 특이하게, 다른 인터페론 화합물에 대해 사용된 조성물 및 방법들도 이들 유사체의 전달을 위하여 사용될 수 있다.

그러나 본 발명의 IFNα 유사체의 한 가지 기본적인 장점은 그것들의 매우 낮은 세포독성이다. 이 낮은 독성 때문에, 다른 인터페론 (예컨대 천연 사람 IFNα) 화합물에 대해 통상 사용될 수 있는 것보다 더 큰 농도로 인터페론 유사체를 투여하는 것이 가능하다. 그러므로, 본 발명의 저-독성 HuIFNα 유사체는 약 5×10⁴ 내지 20×10⁶ 유니트/일 내지 약 500×10⁶ 유니트/일 또는 그 이상의 비율로 투여될 수 있을 것으로 예상된다. 바람직한 구체예에서는, 투여량은 대략 20×10⁶ 유니트/일 이다. 전신 투여를 위해서는 더 많은 용량이 바람직하다. 물론 본 발명의 조성물 및 방법은 다른 치료법과 조화롭게 사용될 수 있는 것으로 이해되어져야 한다.

일단 환자의 상태가 개선되면, 필요에 따라 유지 용량이 투여된다. 계속해서, 투여의 용량 또는 빈도, 또는 두 가지가, 증상의 함수로서, 개선된 상태가 유지되는 수준으로 감소될 수 있다. 증상이 원하는 수준으로까지 경감되는 때에는, 치료는 중단되어야 한다. 그러나, 환자는 질병 증상의 어떠한 재발에 따라 장기간 기초로 일시적인 치료를 필요로 할 수도 있다.

본 발명의 IFNα 유사체들은, 이미 다른 인터페론들이 활성을 나타냈던 질병들을 포함하여, 다양한 암 및 바이러스 질병을 치료하기 위하여 표준 과정을 통하여 투여될 수 있다 (예컨대 Finter, et al., 1991; Dianzani, 1992; Francis, et al., 1992; 및 미국 특허 제 4,885,166 호 및 4,975,276 호 참조). 그러나, 상기에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 IFNα 유사체들은 독성 없이 이들 질병을 치료할 수 있는 능력을 포함하여 독특한 특징 및 장점들을 가지고 있다.

E. 피부 장애의 치료

피부 장애는 본 발명의 저-독성 인터페론 유사체를 사용하여 병변내적으로 치료될 수 있는데, 이 때 제형 및 용량은 투여 방법 및 치료될 병변의 크기 및 심각도에 따라 좌우될 것이다. 바람직한 방법은 피부내 및 피하 주사를 포함한다. 큰 병변내로의 다중 주사도 가능할 것이며, 한 환자의 피부에 있는 심각한 병변도 동시에 치료될 수 있다. 투여 일정은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 지속된 방출을 위해 디자인된 제형은 투여의 빈도를 감소시킬 수 있다.

F. 전신 치료

전신 치료는 본질적으로 모든 적용에 대해 동등하다. 다수의 정맥내, 피하 및/또는 근육내 투여가 가능하며, 치료를 위해 이식가능한 방법인 경우, 지속된 방출을 위해 디자인된 제형이 특히 유용하다. 환자는 또한 이식가능한 피하 간문 (portal), 저장기 또는 펌프를 사용하여 치료될 수 있다.

G. 국소 치료

본 발명의 저-독성 IFNα 유사체를 사용한 국소 치료는 특정 기관의 암 치료에 유용하다. 치료는 동맥내 관류에 의하여 이루어질 수 있다. 카테테르가 영향을 받은 기관에 치료를 지시하기 위하여 수술에 의해 또는 혈관 촬영술에 의해 이식될 수 있다. 만성 치료를 위해 카테테르에 연결된 피하 간문이 사용될 수 있으며, 또는 이식가능하고 보충가능한 펌프가 또한 사용될 수도 있다.

다음의 실시예들은 본 발명을 한정하는 의도가 아니라 설명하기 위한 것이다.

재료 및 방법

제한 엔도뉴클레아제, T4 DNA 리가아제, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제, Taq DNA 중합효소, 및 소의 장 포스파타아제를 뉴 잉글랜드 바이오랩스사 (New England Biolabs; Beverly, MA) 또는 프로메가 바이오테크사 (Promega Biotech; Madison, WI)로부터 구입하였다: 이들 시약은 제조자의 지시에 따라 사용하였다. 서열결정 반응을 위해서, "SEQUENASE DNA II" 서열결정 키트를 사용하였다 (United States Biochemical Corporation, Cleveland OH). 면역블롯팅 및 다른 시약들은 시그마 케미칼사 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)로부터 또는 피셔 사이언티픽사 (Fisher Scientific, Needham, MA)로부터 구입하였다. 니트로셀룰로오스 필터는 쉴라이허 및 슈엘사 (Schleicher & Schuell, Keene, NH)로부터 얻었다.

합성 올리고뉴클레오티드 링커와 프라이머들은 구매가능한 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성기 (예컨대 ABI 모델 380B-02 DNA 합성기, Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 제조하였다. 또는 다르게는, 통상적으로 디자인된 합성 올리고뉴클레오티드를 예를들면 신세틱 제네틱스사 (Synthetic Genetics, San Diego, CA)로부터 구입하였다. cDNA 합성 키트 및 무작위 프라이밍 표지화 키트는 뵈링거-만하임 바이오케미칼사 (Boehringer-Mannheim Biochemcal, BMB, Indianapolis, IN)로부터 얻었다.

폴리펩티드를 암호화하는 올리고뉴클레오티드 서열은 올리고뉴클레오티드 합성에 대한 표준 방법에 의하여 직접 합성하거나, 또는 큰 코팅 서열인 경우에는 코딩 서열에 상응하는 다중 올리고뉴클레오티드 단편의 탠뎀 배열을 포함하고 있는 일련의 클로닝 단계에 의하여 합성할 수 있다 (Yoshio, et al., 1989; Eaton, et al., 1988). 올리고뉴클레오티드 코딩 서열은 표준 재조합 과정에 의하여 발현될 수 있다 (Maniatis, et al., 1982; Ausubel et al., 1988). 또는 달리, 펩티드가 표준 시험관내 기법에 의하여 직접 합성될 수도 있다 (Applied Biosystems, Foster City CA).

재조합 사람 IFNα는 바이오소오스 인터내셔날 (Biosource International, Camarillo, CA)로부터 얻었다. 다른 언급이 없는 한, 단백질 농도는 바이신코니닉 산 (bicinchoninic acid) 분석 키트 (Pierce, Rockford, IL)를 사용하여 제조자의 지시를 따라 측정되었다.

본 연구에서 사용된 모든 조직 배양 배지, 혈청 및 IFN 은 Limulus amebocyte 용해물 (Associates of Cape Cod, Woods Hole, MA)을 사용한 분석에 의해 0.07 ng/ml 의 민감성 수준에서 측정되는 바, 내독소에 대하여 음성이었다.

< 실시예 >

실시예 1

HuIFNα 유사체의 클로닝 및 발현

A. HuIFNα 유사체를 암호화하는 합성 유전자의 제조

처음 27 개의 N-말단 위치내에 모두 15 개의 OvIFNτ 치환을 포함하고 있는 HuIFNα의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:10)을 Pichia pastoris에 대하여 최적화된 코돈 용법을 사용하여 역번역하였다. 뉴클레오티드 서열을 구성물의 전 길이를 통하여 5 개의 제한위치가 공간배치되도록 편집하였다. 합성 유전자 서열을 4 개의 뉴클레오티드 단편으로 나누었다. 각각이 약 150 염기쌍의 길이를 가지고 있는 개개의 단편들을 올리고뉴클레오티드의 순차적인 라이게이션에 의하여 구성하였다. 단편들을 G2 박테리아 벡터에 순차적으로 클로닝하여 IFNα-N0 를 암호화하는 유전자 (SEQ ID NO:19)를 생성하였다. 그런 다음 이 합성 유전자를 박테리아 벡터에서 잘라내어 Pichia pastoris에서의 발현을 위해 pPICZ-α 벡터 (Invitrogen, San Diego, CA)의 XhoI/NotI 부위에 라이게이션시켰다.

유사체 IFNα-N1 부터 IFNα-N7 을 암호화하는 합성 유전자들을 또한 올리고뉴클레오티드의 순차적인 라이게이션에 의하여 구성하였다. 상술된 pPICZ-α/IFNα-N0 구성물을 XbaI 과 BstEII 로 분해시킨 후, 어닐링된 올리고뉴클레오티드 링커 1 (SEQ ID NO:20)과 링커 2 (SEQ ID NO:21)를 이들 부위에 라이게이션시켜서 중간 벡터 구성물을 제조하였다. 이 단계로 하기 열거되는 뉴클레오티드 단편들에 의 하여 대체될, IFNα-N0의 N-말단 부분에 상응하는 뉴클레오티드 서열이 제거되었다. 중간 벡터 구성물을 XhoI 과 EcoRI 으로 분해시켰다. 그런 다음 올리고뉴클레오티드의 순차적인 라이게이션에 의하여 제조된 다음의 뉴클레오티드 단편들을 중간 구성물의 XhoI/EcoRI 부위에 라이게이션시켜서 pPICZ-α 벡터에 유사체 IFNα-N1 내지 IFNα-N7 을 제조하였다:

IFNα-N1 단편 N1 순방향 SEQ ID NO:22

단편 N1 역 SEQ ID NO:23

IFNα-N2 단편 N2 순방향 SEQ ID NO:24

단편 N2 역 SEQ ID NO:25

IFNα-N3 단편 N3 순방향 SEQ ID NO:26

단편 N3 역 SEQ ID NO:27

IFNα-N4 단편 N4 순방향 SEQ ID NO:28

단편 N4 역 SEQ ID NO:29

IFNα-N5 단편 N5 순방향 SEQ ID NO:30

단편 N5 역 SEQ ID NO:31

IFNα-N6 단편 N6 순방향 SEQ ID NO:32

단편 N6 역 SEQ ID NO:33

IFNα-N7 단편 N7 순방향 SEQ ID NO:34

단편 N7 역 SEQ ID NO:35

B. Pichia에서의 HuIFNα 유사체의 발현

재조합 인터페론 유사체의 발현을 위하여, 각각의 유전자의 코딩 서열을, 벡터상에 있는 XhoI 과 NotI 제한 엔도뉴클레아제 부위를 사용하여 pPICZ-α 발현 벡터 (Invitrogen, San Diego, CA)안에 삽입하였다. pPICZ-α 발현 벡터는 재조합 인터페론의 발현 및 정제를 용이하게 하기 위한 다양한 엘레먼트들을 제공한다. 예를 들어, 벡터는 메탄올-조절된 알코올 산화효소 (AOX) 프로모터를 함유하고 있는 발현 카세트를 포함하고 있다. 메탄올에서 성장된 효모 세포에서, 폴리A+RNA 의 대략 5 % 는 AOX1 유전자로부터 유래된 것이다. 또한, 벡터는 배양 배지안으로의 단백질의 분비를 지시하는 Saccharomyces cerevisiae α 인자 프레프로 펩티드로부터 얻어지는 분비 신호 서열을 함유하고 있다. 벡터는 또한 Sh ble 유전자 (Streptoalloteichus hindustanus ble 유전자)에 의해 코드된 제오신 (Zeocin) 항생물질을 사용하여 재조합 박테리아 및 효모 세포의 선택을 가능하게 한다.

HuIFNα 유사체를 암호화하는 재조합 플라스미드들을 대규모의 성장을 위하여 X-33 야생형 Pichia pastoris 세균주 안에 일렉트로포레이션시켰다. 재조합 효모 콜로니들을 인비트로겐사에 의한 프로토콜에 따라 성장시키고 유도하였다. 상층액을 수집하고, 0.8/0.2 mm 기공도의 아크로디스크 필터 (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI)를 사용하여 여과한 다음, Centriplus-10 농축기 (Amicon, Inc., Beverly, MA)를 사용하여 인산염 완충된 식염수 (PBS)로 완충액을 교환하였다. 이방법에 의해 얻어진 HuIFNα 유사체들은 동일한 Pichia pastoris시스템을 사용하여 발현된 재조합 OvIFNτ의 항바이러스 활성과 유사한 항바이러스 활성을 나타냈다.

C. 정량적인 항바이러스 분석

비색 분석을 사용하여 인터페론 단백질의 항바이러스 활성을 정량하였다. Madin Darby 소 신장 (MDBK) 세포를 10 % 의 소혈청 알부민 (FBS)과 항생물질이 첨가된 이글스 MEM 을 사용하여 96-웰 평면 바닥 플레이트에서 집밀도에 이를 때까지 성장시켰다. 배지를 제거하고 세포를 멸균된 PBS 로 한 번 세척하였다. 샘플을 희석 배지로서 2 % FBS 와 항생물질이 첨가된 이글스 MEM 배지를 사용하여 100 ㎕/웰로 연속적으로 10-배 에서 2-배의 희석액을 사용하여 삼중으로 첨가하였다. 인터페론 샘플을 첨가하고, 세포를 18 시간동안 37 ℃ 에서 인큐베이션하였다. 재조합 HuIFN-αA (Biosource Intl.)를 표준 인터페론 대조로서 사용하였다. 시험 웰에 수포성 구내염 바이러스 (VSV) 100 ㎕ 를 첨가하고 추가로 48 시간동안 37 ℃ 에서 인큐베이션하였다. 각 웰로부터 100 ㎕ 의 배지를 제거하고 100 ㎕ 의 0.2 % 중성 적색 용액 (Gibco-BRL)으로 교체한 다음, 1 시간동안 37 ℃ 에서 인큐베이션하였다. 모든 배지를 제거하고 세포를 부드럽게 PBS 로 두 번 세척한 후, 100 ㎕ 의 산 알코올 (50 % 에탄올, 1 % 아세트산)을 첨가하였다. 가용화된 염료의 A₅₅₀ 을 바이오-카이네틱스 판독기 (Bio-Kinetics Reader, Bio-Tek Instruments, Winooski, VT)를 사용하여 판독하였다. % 보호는 다음 식을 사용하여 계산하였다:

1 항바이러스 유니트 (U)는 50 % 보호로서 규정한다.

실시예 2: 간세포에서 IFNα 유사체의 시험관내 독성

*HuIFNα 및 IFNα 유사체 IFNα-N0 (SEQ ID NO:10, 도 1)의 시험관내 독성을 정상인의 간세포를 사용하여 비교하였다. 간세포를 클로네틱스 코포레이션 (Clonetics Corporation, San Diego, CA)으로부터 마트리겔-코팅된 96-웰 플레이트의 세포 집밀층으로서 받았다. 다음날, 웰의 배지를 0.1μM 의 인슐린, 0.1μM 의 덱사메타손, 50 ㎍/ml 의 겐타마이신, 및 50 ng/ml 의 암포테리신 B 가 첨가되어 있는 변형된 윌리암스 E 배지 (Clonetics Corp.) 100 ㎕ 로 교체하였다. 세포를 계속해서 2000 U/ml 내지 128,000 U/ml 의 HuIFNα 또는 IFNα-N0 로 처리하였다. 인큐베이션을 시작하고 4, 6, 또는 7 일후에 각 웰에 10 ㎕ 의 테트라졸리움 염 WST-1 (4-3-(4-요오도페닐)-2-(4-니트로페닐)-2H-5-테트라졸리올-1-3-벤젠 디술포네이트)(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) 을 첨가하였다. WST-1 은 미토콘드리아 호흡 사슬에 존재하는 숙시네이트-테트라졸리움 환원효소 시스템에 의해 포르마잔으로 절단되고 생육세포에서만 활성이다. 생육 세포의 백분율을 450 nm 에서의 흡광도에 의하여 측정하고 비-인터페론 처리 세포의 백분율로서 표시한다.

그 결과를 하기 표 1 에 나타낸다. 값들을 생육 세포의 % 대사 활성으로서 나타냈고, 100 % 는 배지만으로 처리된 세포의 생육성과 동일하다.

IFN 샘플과 함께 4, 6, 또는 7 일동안 인큐베이션한 후의 일차 정상인 간세포의 % 대사 활성

IFN 처리일 수	샘플	(유니트/ml)
IFN 처리일 수	샘플	1.28×10⁵	6.4×10⁴	3.2×10⁴	1.6×10⁴	8×10³	4×10³	2×10³
4	rHuIFN-α	70.9	74.4	92.1	72.0	71.3	77.5	91.4
4	IFNα-N0	114.6	130.9	142.4	122.3	112.0	93.5	111.3
6	rHuIFN-α	58.1	68.2	96.3	112.4	76.5	73.6	ND
6	IFNα-N0	118.3	96.2	114.6	129.9	138.6	110.7	ND
7	rHuIFN-α	35.0	47.1	71.4	66.0	82.0	83.0	ND
7	IFNα-N0	94.4	132.0	139.0	97.4	111.7	155.4	ND

ND = 실행하지 않음.

HuIFNα와 함께 인큐베이션된 간세포는 생육성이 상당히 감소된 것으로 나타났다. 대조적으로, IFNα 유사체 IFNα-N0 와 함께 인큐베이션된 세포들은 미처리된 세포와 비교하여 본질적으로 생육성이 손실되지 않은 것으로 나타났다.

실시예 3: 단핵 세포에서의 IFN α 유사체의 시험관내 독성

HuIFNα, OvIFNτ, 및 사람 IFNα 유사체 IFNα-N0 내지 IFNα-N7 (SEQ ID NO:10 에서 SEQ ID NO:17, 도 1)의 시험관내 독성을 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 사용하여 비교하였다. 전혈의 버피 코트 (buffy coat) 분획을 PBS 로 1:4 로 희석하여 Nycoprep 1.077 (Nycomed Pharma, Oslo, Norway) 위에 겹쳐놓았다. 600 × g 에서 20 분동안 20 ℃ 에서 원심분리한 후, 계면에 결합한 PBMC 를 피펫을 사용하여 제거하였다. 세포를 PBS 로 한 번 세척하고 96-웰 플레이트에 웰당 2 × 10⁵ 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 다음날, 세포를 2000 U/ml 내지 128,000 U/ml 의 IFNα, IFNτ, 또는 IFNα 유사체들로 처리하였다. 7 일동안 인큐베이션한 후, 각 웰에 테트라졸리움 염 WST-1 (Boehringer Mannheim)을 첨가하였다. 생육 세포의 백분율을 450 nm 에서의 흡광도에 의하여 측정하고, 비-인터페론 처리 세포의 백분율로서 표시하였다.

그 결과를 하기 표 2 에 나타낸다. 값들은 생육 세포의 % 대사 활성으로서 나타냈고, 100 % 는 배지만으로 처리된 세포의 생육성과 동일하다.

IFN 샘플과 함께 7 일동안 인큐베이션한 후의 사람 말초혈 단핵세포 (PBMC)의 % 대사 활성

샘플	유니트/ML
샘플	1.28×10⁵	6.4×10³	3.2×10⁴	1.6×10⁴	8×10³	4×10³	2×10³
rHuIFN-α	64.4	65.0	63.8	74.1	71.6	73.6	92.5
rOvIFN-τ	97.4	105.7	122.5	117.5	90.2	100.9	89.7
IFNα-N0	ND	124.6	138.9	101.7	103.5	103.0	105.7
IFNα-N1	60.0	56.1	60.4	69.3	65.6	ND	ND
IFNα-N3	53.8	64.1	59.0	73.5	63.7	66.6	71.7
IFNα-N4	82.5	80.9	80.5	76.1	89.8	71.1	73.4
IFNα-N5	139.1	118.0	99.2	110.2	82.2	96.8	120.0
IFNα-N6	ND	103.4	116.5	91.4	106.9	96.0	125.3
IFNα-N7	97.5	150.6	96.8	121.5	159.4	111.5	140.3

ND = 실행하지 않음.

HuIFNα과 함께 인큐베이션한 PBMC 는 생육성의 상당한 감소를 나타냈다. 대조적으로, OvIFNτ 또는 사람 IFNα 유사체 IFNα-N0, IFNα-N5, IFNα-N6, 및 IFNα-N7 과 함께 인큐베이션된 세포는 7 일동안 인큐베이션한 후에도 생육성의 손실을 나타내지 않았다. HuIFNα에 대해 관찰된 것과 유사한 생육성의 감소는 IFNα 유사체 IFNα-N1 및 IFNα-N3 과 함께 인큐베이션된 세포에서 관찰되었다. IFNα 유사체 IFNα-N4 와 함께 인큐베이션된 세포는 HuIFNα와 함께 인큐베이션된 세포보다 작은 생육성의 증가를 나타냈다.

본 발명이 특정 방법 및 구체예를 참조로 설명되었지만, 변형 및 수정이 본 발명으로부터 벗어남이 없이 이루어질 수 있음이 인정될 것이다.

<110> PEPGEN CORPORATION UNIVERSITY OF FLORIDA <120> LOW-TOXICITY HUMAN INTERFERON-ALPHA ANALOG <130> 1 <150> US 08/954,395 <151> 1997-10-20 <160> 36 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Ovis aries <400> 2 Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His 1 5 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asn Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro 1 5 10 15 Ser <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Ovis aries <400> 4 Ala Arg Glu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro 1 5 10 15 His <210> 5 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met 1 5 10 15 Ser Arg Ile Ser Pro Ser 20 <210> 6 <211> 22 <212> PRT <213> Ovis aries <400> 6 Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Arg Met 1 5 10 15 Asn Arg Leu Ser Pro His 20 <210> 7 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser 20 25 <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Ovis aries <400> 8 Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys 1 5 10 15 Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His 20 25 <210> 9 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe 35 40 45 Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp 65 70 75 80 Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110 Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140 Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160 Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 <210> 10 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mature HuIFN-alpha analog IFNa-NO <220> <221> CHAIN <222> (1)..(166) <400> 10 Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys 1 5 10 15 Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Met Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe 35 40 45 Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp 65 70 75 80 Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110 Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140 Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160 Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 <210> 11 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mature HuIFN-alpha analog IFNa-N1 <220> <221> CHAIN <222> (1)..(166) <400> 11 Cys Tyr Leu Ser Arg Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe 35 40 45 Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp 65 70 75 80 Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110 Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140 Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160 Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 <210> 12 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mature HuIFN-alpha analog IFNa-N2 <220> <221> CHAIN <222> (1)..(166) <400> 12 Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe 35 40 45 Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp 65 70 75 80 Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110 Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140 Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160 Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 <210> 13 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mature HuIFN-alpha analog IFNa-N3 <220> <221> CHAIN 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Phe 35 40 45 Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp 65 70 75 80 Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110 Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140 Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160 Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 <210> 17 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mature HuIFN-alpha analog IFNa-N7 <220> <221> CHAIN <222> (1)..(166) <400> 17 Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Met Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe 35 40 45 Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp 65 70 75 80 Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110 Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140 Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu 145 150 155 160 Arg Leu Arg Arg Lys Glu 165 <210> 18 <211> 172 <212> PRT <213> Ovis aries <400> 18 Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys 1 5 10 15 Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp 20 25 30 Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Asp Gln Leu 35 40 45 Gln Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ser 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr 65 70 75 80 Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu Gln Gln Gln Leu Asp His Leu 85 90 95 Asp Thr Cys Arg Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly 100 105 110 Asn Met Asp Pro Ile Val Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr 115 120 125 Asp Tyr Leu Gln Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val 130 135 140 Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gln Lys 145 150 155 160 Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro 165 170 <210> 19 <211> 527 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFNa-NO synthetic gene <220> <221> CDS <222> (18)..(518) <400> 19 ctaggctcga gaagaga tgt tac ttg tct aga aag ttg atg ttg gac gcc 50 Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala 1 5 10 aga gag aac ttg aag ttg ttg gat aga atg aac aga ctt tct cct cac 98 Arg Glu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His 15 20 25 tct tgt ctt atg gac aga cac gac ttc ggt ttc cca caa gaa gaa ttt 146 Ser Cys Leu Met Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe 30 35 40 gac ggt aac caa ttc caa aag gct cca gct atc tct gtc ttg cac gag 194 Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu 45 50 55 ttg atc caa caa att ttc aac ctt ttc act acc aag gac tcc tcc gct 242 Leu Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala 60 65 70 75 gct tgg gac gaa gat ttg ctt gac aag ttc tgt act gag ctt tac caa 290 Ala Trp Asp Glu Asp Leu Leu Asp Lys Phe Cys Thr Glu Leu Tyr Gln 80 85 90 caa ttg aac gac ttg gaa gcc tgt gtc atg caa gaa gag aga gtt gga 338 Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly 95 100 105 gag acc cct ttg atg aac gct gat tcc att ttg gct gtc aag aag tac 386 Glu Thr Pro Leu Met Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr 110 115 120 ttc aga aga att acc ttg tac ctt act gag aag aag tac tct cca tgt 434 Phe Arg Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys 125 130 135 gct tgg gag gtt gtt aga gct gaa att atg aga tcc ttg tct ttg tct 482 Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser 140 145 150 155 act aac ctt caa gaa aga ttg aga aga aag gag taa gc ggccgcg 527 Thr Asn Leu Gln Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu *** 160 165 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 1 <400> 20 ctagaaagtt gatggaattc gacg 24 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 2 <400> 21 gttaccgtcg aattccatca acttt 25 <210> 22 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment N1, forward strand <400> 22 tcgagaagag atgttacctt tctagaaccc actccttgga caacagaaga accttgatgt 60 tgctagccca aatgtccaga atctcccctt cctcttgtct tatggacaga cacgacttcg 120 gtttcccaca agaag 135 <210> 23 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment N1, reverse strand <400> 23 aattcttctt gtgggaaacc gaagtcgtgt ctgtccataa gacaagagga aggggagatt 60 ctggacattt gggctagcaa catcaaggtt cttctgttgt ccaaggagtg ggttctagaa 120 aggtaacatc tcttc 135 <210> 24 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment N2, forward strand <400> 24 tcgagaagag atgttacttg tctagaaagt tgatgttgga caacagaaga acccttatgc 60 tgctagctca aatgtccaga atctctccat cctcttgtct 100 <210> 25 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment N2, reverse strand <400> 25 cgaagtcgtg tctgtccata agacaagagg atggagagat tctggacatt tgagctagca 60 gcataagggt tcttctgttg tccaacatca actttctaga caagtaacat ctcttc 116 <210> 26 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment N3, forward strand <400> 26 tcgagaagag atgttacttg tctagaaagt tgatgttgga cgctagagag aacttgatgc 60 tgctagctca aatgtccaga atttcccctt cttcttgtct 100 <210> 27 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment N3, reverse strand <400> 27 cgaagtcgtg tctgtccata agacaagaag aaggggaaat tctggacatt tgagctagca 60 gcatcaagtt ctctctagcg tccaacatca actttctaga caagtaacat ctcttc 116 <210> 28 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment N4, forward strand <400> 28 tcgagaagag atgttacttg tctagaaagt tgatgcttga cgctagagaa aacttgaagc 60 ttttggacag aatgtccaga atttccccat cctcttgtct 100 <210> 29 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment N4, reverse strand <400> 29 cgaagtcgtg tctgtccata agacaagagg atggggaaat tctggacatt ctgtccaaaa 60 gcttcaagtt ttctctagcg tcaagcatca actttctaga caagtaacat ctcttc 116 <210> 30 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment N5, forward strand <400> 30 tcgagaagag atgtgacttg ccagaaaagc ttatgttgga cgccagagaa aacttgaaac 60 ttctagacag aatgaacaga ttgtctccac actcttgtct tatggacaga cacgacttcg 120 gtttcccaca agaag 135 <210> 31 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment N5, reverse strand <400> 31 aattcttctt gtgggaaacc gaagtcgtgt ctgtccataa gacaagagtg tggagacaat 60 ctgttcattc tgtctagaag tttcaagttt tctctggcgt ccaacataag cttttctggc 120 aagtcacatc tcttc 135 <210> 32 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment N6, forward strand <400> 32 tcgagaagag atgtgacttg cctgaaactc acagtctaga cgccagagag aacttgaagc 60 ttttggacag aatgaacaga ttgtctccac actcttgtct 100 <210> 33 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment N6, reverse strand <400> 33 cgaagtcgtg tctgtccata agacaagagt gtggagacaa tctgttcatt ctgtccaaaa 60 gcttcaagtt ctctctggcg tctagactgt gagtttcagg caagtcacat ctcttc 116 <210> 34 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment N7, forward strand <400> 34 tcgagaagag atgtgacttg ccagagaccc actcccttga caacagaaga actttgatgc 60 ttctagacag aatgaacaga ttgtccccac actcttgtct 100 <210> 35 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment N7, reverse strand <400> 35 cgaagtcgtg tctgtccata agacaagagt gtggggacaa tctgttcatt ctgtctagaa 60 gcatcaaagt tcttctgttg tcaagggagt gggtctctgg caagtcacat ctcttc 116

Claims

천연 사람 인터페론(IFN)-α 단백질의 폴리펩티드 유사체로서,

유사체 중의 아미노산 잔기 1-27은 위치 19, 20, 22, 24 및 27 중 하나 이상에서 천연 IFN-α 단백질과 상이하며, 단 유사체 중의 상기 서열은 아미노산 잔기 위치 22에 있는 Ser, Thr, Asn, Gln, 또는 Gly의 존재만에 의해서 천연 IFN-α 와 상이하지는 않은 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 유사체.
제 1 항에 있어서, 위치 19에 상응하는 아미노산 잔기는 Asn, Asp, Gln, 또는 Glu인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 유사체.
제 1 항에 있어서, 위치 19에 상응하는 아미노산 잔기는 Asp인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 유사체.
제 1 항에 있어서, 위치 20에 상응하는 아미노산 잔기는 His, Arg, 또는 Lys인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 유사체.
제 1 항에 있어서, 위치 20에 상응하는 아미노산 잔기는 Arg인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 유사체.
제 1 항에 있어서, 위치 22에 상응하는 아미노산 잔기는 Asn, Asp, Gln, 또는 Glu인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 유사체.
제 1 항에 있어서, 위치 22에 상응하는 아미노산 잔기는 Asn인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 유사체.
제 1 항에 있어서, 위치 27에 상응하는 아미노산 잔기는 His, Arg, 또는 Lys인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 유사체.
제 1 항에 있어서, 위치 27에 상응하는 아미노산 잔기는 His인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 유사체.
제 1 항에 있어서, 위치 24에 상응하는 아미노산 잔기는 Ile, Leu, Val, 또는 Met인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 유사체.
제 1 항에 있어서, 위치 24에 상응하는 아미노산 잔기는 Leu인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 유사체.
제 1 항에 있어서, 유사체 중의 잔기 28-166의 아미노산 서열은 천연 IFN-α 단백질의 잔기 28-166의 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 유사체.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드 유사체를 암호화하는 핵산 분자.
제 13 항에 따르는 핵산 분자를 재조합 발현 시스템 내에 위치시키는 단계; 핵산의 발현을 수행하여 유사체를 생산하는 단계; 및 유사체를 회수하는 단계를 포함하는, 사람 IFN-α 단백질의 폴리펩티드 유사체를 제조하는 방법.
하나 이상의 코돈에서 천연 사람 IFN-α 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 변형시켜 제 1 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드 유사체를 암호화하는 핵산 분자를 얻는 단계를 포함하는, 사람 IFN-α 단백질의 폴리펩티드 유사체를 암호화하는 핵산 분자를 제조하는 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드 유사체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 다발경화증, 건선, 포도막염, 류마티스관절염, 알레르기, 제 1 형 당뇨병, 홍반 루프스, 근육위축가쪽경화증, 크론(Crohn's)병, 천식 또는 구내염을 치료하기 위한 약리학적 조성물.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드 유사체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 종양성장을 저해, 예방 또는 둔화시키기 위한 약리학적 조성물.
제 16 항에 있어서, 경구 투여하기 위한 것을 특징으로 하는 약리학적 조성물.
제 17 항에 있어서, 경구 투여하기 위한 것을 특징으로 하는 약리학적 조성물.
제 16 항에 있어서, 주사로 투여하기 위한 것을 특징으로 하는 약리학적 조성물.
제 17 항에 있어서, 주사로 투여하기 위한 것을 특징으로 하는 약리학적 조성물
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드 유사체를 제공하는 것을 포함하는, 다발경화증, 건선, 포도막염, 류마티스관절염, 알레르기, 제 1 형 당뇨병, 홍반 루프스, 근육위축가쪽경화증, 크론(Crohn's)병, 천식 또는 구내염을 치료하기 위한 약리학적 조성물의 제조방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따르는 폴리펩티드 유사체를 제공하 는 것을 포함하는, 종양성장을 저해, 예방 또는 둔화시키기 위한 약리학적 조성물의 제조방법.
제 22 항에 있어서, 상기 약리학적 조성물은 경구투여 가능한 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항에 있어서, 상기 약리학적 조성물은 경구투여 가능한 것을 특징으로 하는 방법.