JP2001520238A

JP2001520238A - 低毒性のヒトインターフェロン−αアナログ

Info

Publication number: JP2001520238A
Application number: JP2000516991A
Authority: JP
Inventors: ハワードエム．ジョンソン，; キャロルエイチ．ポンザー，; ロアリーエイチ．ビラレテ，; ジャクリーンキャンポス，
Original assignee: University of Florida
Current assignee: University of Florida
Priority date: 1997-10-20
Filing date: 1998-10-20
Publication date: 2001-10-30
Also published as: CN1240717C; EP1025124B1; KR20060015701A; CA2308116A1; CA2308116C; AU744774B2; KR100861007B1; AU9807298A; CN1276797A; JP2008247926A; TW593336B; DK1025124T3; KR20010031206A; EP1025124A1; US6204022B1; DE69839812D1; WO1999020653A1; ES2310931T3; ATE402957T1; KR100586625B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ポリペプチド配列のＮ末端部位における規定されたアミノ酸置換を作製することにより、インターフェロンαの細胞毒性を減少する方法を記載する。低細胞毒性を有するヒトインターフェロンαアナログ、およびこの低毒性のインターフェロンαアナログの治療適用も、記載される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明はヒトインターフェロンαの毒性を減少する方法、低毒性のヒトインタ
ーフェロンαアナログ、およびこれらアナログの治療的使用に関するものである
。

【０００２】（参考文献）

【０００３】

【数１】（発明の背景）インターフェロン（ＩＦＮ）は２つの異なる群に分類されており：Ｉ型インタ
ーフェロンとしては、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、およびＩＦＮω（ＩＦＮαＩＩとし
ても公知である）が挙げられ、ＩＩ型インターフェロンは、ＩＦＮγ（ＤｅＭａ
ｅｙｅｒらによる総説、１９８８）に代表されている。ヒトでは、少なくとも１
７個のＩＦＮαの非対立遺伝子、少なくとも２個のＩＦＮβの非対立遺伝子、お
よび１個のＩＦＮγ遺伝子があると推定されている。

【０００４】ＩＦＮαは様々な型の細胞増殖を阻害することが示された。ＩＦＮαは、ヘア
リーセル白血病のような血液学的な悪性疾患に対して特に有効である（Ｑｕｅｓ
ａｄａら、１９８４）。さらに、これらのタンパクは多発性骨髄腫、慢性リンパ
性白血病、軽度リンパ腫、カポージ肉腫、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、膀胱腫
瘍、および卵巣癌に対しても活性が示された（Ｂｏｎｎｅｍら、１９８４、Ｏｌ
ｄｈａｍ、１９８５）。特定の自己免疫および炎症性疾患の病因におけるインタ
ーフェロンとインターフェロンレセプターの役割も研究されてきた（Ｂｅｎｏｉ
ｔら、１９９３）。

【０００５】ＩＦＮαはまた、様々なタイプのウィルス感染に対して有用である（Ｆｉｎｔ
ｅｒら、１９９１）。αインターフェロンはヒト乳頭腫ウイルス感染、Ｂ型肝炎
およびＣ型肝炎の感染に対しても活性を示した（Ｆｉｎｔｅｒら、１９９１；Ｋ
ａｓｈｉｍａら、１９８８；Ｄｕｓｈｅｉｋｏら、１９８６；Ｄａｖｉｓら、１
９８９）。

【０００６】しかし、意味深いことに、ＩＦＮαの有用性はそれらの毒性によって制限され
てきた。癌、およびウイルス疾患の治療におけるインターフェロンの使用は結果
的に発熱、悪寒、食欲不振、体重減少、および疲労のような深刻な副作用をもた
らしている（Ｐｏｎｔｚｅｒら、１９９１；Ｏｌｄｈａｍ、１９８５）。このよ
うな副作用はしばしば（ｉ）インターフェロン投薬量を処置の効果を制限するレ
ベルに減少する、または（ｉｉ）患者の治療からの解放を必要とする。そのよう
な毒性は、消耗性のヒトおよび動物の疾患の治療において、これらの強力な抗ウ
ィルスおよび抗増殖性タンパクの有効性を減少させてきた。

【０００７】（発明の要旨）１つの局面において、本発明はヒトＩＦＮα（ＨｕＩＦＮα）の毒性を減少す
るための方法を包含する。この方法は、成熟ＨｕＩＦＮαの１９、２０、２２、
２４、および２７番目のアミノ酸の１つ以上を、培養物中のヒト単核細胞に曝し
た場合にそのポリペプチドペプチドの特異的な毒性を実質的に減少するのに効果
的なアミノ酸と置換することを包含する。成熟ＨｕＩＦＮαの１〜２７番目のア
ミノ酸残基の大部分は不変のままである。

【０００８】ある実施態様において、この方法は、１９、２０、２２、および２７番目のア
ミノ酸の１つ以上を非保存的アミノ酸と置換することを包含する。様々な実施態
様において、この置換には、１９番目のアミノ酸の、クラスＩＩＩアミノ酸（特
にＡｓｐ）での置換；２０番目のアミノ酸の、クラスＩＶアミノ酸（特にＡｒｇ
）での置換；２２番目のアミノ酸の、クラスＩＩＩアミノ酸（特にＡｓｎ）での
置換；および２７番目のアミノ酸の、クラスＩＶアミノ酸（特にＨｉｓ）での置
換が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施態様において、この置換と
しては、２４番目のアミノ酸の、クラスＶアミノ酸（特にＬｅｕ）での置換が挙
げられる。

【０００９】別の実施態様において、この方法は、成熟ＨｕＩＦＮαの１９〜２７番目の残
基間の配列を、配列番号２に規定される９マーで置換することを包含する。特に
、成熟ＨｕＩＦＮαの１９〜２７番目の残基間の配列は配列番号１である。９マ
ーの配列番号２は、成熟ヒツジインターフェロン−τ（ＯｖＩＦＮτ）の１９〜
２７番目の残基に対応し、そして成熟ＨｕＩＦＮαとは１９、２０、２２、２４
、および２７番目の位置で、同一でない残基を含む。別の実施態様において、こ
の方法は、ＨｕＩＦＮαの１１〜２７番目の残基間の配列を、配列番号４に規定
される１７マーで置換することを包含する。特に、成熟ＨｕＬＦＮαの１１〜２
７番目の残基間の配列は配列番号３である。１７マーの配列番号４は成熟ＯｖＩ
ＦＮτの１１〜２７番目の残基に対応し、そしてＨｕＩＦＮαとは１１、１３、
１４、１６、１９，２０，２２，２４、および２７番目の位置で、同一でない残
基を含む。別の実施態様において、この方法は、ＨｕＩＦＮαの６〜２７番目の
残基間の配列を、配列番号６に規定される２２マーと置換することを包含する。
特に、成熟ＨｕＩＦＮαの６〜２７番目の残基間の配列は配列番号５である。２
２マーの配列番号６は成熟ＯｖＩＦＮτの６〜２７番目の残基に対応し、そして
ＨｕＩＦＮαとは６，７，８、１１、１３、１４、１６、１９，２０，２２，２
４、および２７番目の位置で、同一でない残基を含む。

【００１０】関連した局面において、本発明はＨｕＩＦＮαの毒性を減少させるための方法
を包含する。この方法は成熟ＨｕＩＦＮαの１９、２０、２２、２４、および２
７番目のアミノ酸の１つ以上を、培養物中の単核細胞内のポリペプチドの特異的
な毒性を実質的に減少するのに効果的なアミノ酸で置換することを包含し、ここ
で、成熟ＨｕＩＦＮαの２８〜１６６番目の残基間の配列は実質的に不変である
。ある実施様態において、この置換はＨｕＩＦＮαの１〜２７番目の残基間の配
列を、配列番号８で規定される２７マーで置換することにより達成される。特に
、成熟ＨｕＩＦＮαの１〜２７番目の残基間の配列は配列番号７である。２７マ
ーの配列番号８は成熟ＯｖＩＦＮτの１〜２７番目の残基に対応し、そして、成
熟ＨｕＩＦＮαとは、２、４、５、６、７、８、１１、１３、１４、１６、１９
、２０、２２、２４、および２７番目の位置で、同一でない残基を含む。

【００１１】別の局面において、本発明はヒト治療における使用のための低毒性のヒトＩＦ
Ｎαアナログを包含する。このアナログは成熟ＨｕＩＦＮαタンパクを包含し、
このタンパクは、アミノ酸１９、２０、２２、２４、および２７番目の１以上の
位置での、置換されたアミノ酸を有しており、そしてこのアナログにおける１〜
２７番目のアミノ酸残基の大部分は天然ＨｕＩＦＮα残基である。このアナログ
は、培養物中における単核細胞の増加された生存能力によって証明されたように
、天然ヒトＩＦＮαと比較して、実質的に減少された比毒性を有しているとして
特徴づけられる。

【００１２】ある実施態様において、このアナログは１９、２０、２２、および２７番目の
１以上の位置での、非保存的アミノ酸置換を含む。様々な実施態様において、こ
の置換されたアミノ酸には、１９番目のアミノ酸に対する、クラスＩＩＩアミノ
酸（特にＡｓｐ）；２０番目のアミノ酸に対する、クラスＩＶアミノ酸（特にＡ
ｒｇ）；２２番目のアミノ酸に対する、クラスＩＩＩアミノ酸（特にＡｓｎ）；
および２７番目のアミノ酸に対する、クラスＩＶアミノ酸（特にＨｉｓ）が挙げ
られるが、これらに限定されない。別の実施態様において、この置換されたアミ
ノ酸としては、２４番目のアミノ酸に対する、クラスＶアミノ酸（特にＬｅｕ）
が挙げられる。

【００１３】別の実施態様において、このアナログは、１９〜２７番目の残基間を配列番号
２の９マーで置換された、成熟ヒトＩＦＮαを包含する。別の実施態様では、こ
のアナログは、１１〜２７番目の残基間を配列番号４の１７マーで置換された、
成熟ヒトＩＦＮαを包含する。別の実施態様では、このアナログは、６〜２７番
目の残基間を配列番号６の２２マーで置換された成熟ヒトＩＦＮαを包含する。

【００１４】関連した局面において、本発明はヒト治療における使用のための低毒性のヒト
ＩＦＮαアナログを包含し、このアナログは、アミノ酸１９、２０、２２、２４
、および２７番目での１以上の位置で、置換されたアミノ酸を有する成熟ヒトＩ
ＦＮαタンパクであって、その成熟ヒトＩＦＮα配列の２８〜１６６番目の残基
間は実質的に不変である、成熟ヒトＩＦＮαタンパクを包含する。このアナログ
は、培養物中における単核細胞の増加された生存能力によって証明されるような
、天然成熟ヒトＩＦＮαと比較して、実質的に減少された比毒性により特徴づけ
られる。ある実施態様では、このアナログは、１〜２７番目の残基間を配列番号
８の２７マーで置換された成熟ヒトＩＦＮαを包含する。

【００１５】本発明はさらに、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を包含する。この方法におい
て、腫瘍細胞に、腫瘍細胞の増殖を阻害する有効濃度の、上記タイプの低毒性の
ＩＦＮαアナログを接触させる。その低毒性のＩＦＮαアナログは任意の受容可
能な薬学的処方物の一部であり得る。低毒性のＩＦＮαアナログによりその増殖
が阻害され得る腫瘍細胞としては、癌細胞、造血癌性細胞、白血病性細胞、リン
パ腫細胞および黒色腫細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施態
様において、腫瘍細胞としては、ステロイド感受性腫瘍細胞（例えば、乳腫瘍細
胞）が挙げられる。

【００１６】本発明のさらに別の局面において、上記タイプの低毒性のＩＦＮαアナログは
、ウイルスの複製の阻害の方法において使用される。この方法において、ウイル
ス感染した細胞に、その細胞内でのウイルスの複製を阻害する有効濃度の、低毒
性のＩＦＮαアナログを接触させる。その低毒性のＩＦＮαは任意の受容可能な
薬学的処方物の一部であり得る。ＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスの両方の
複製は、低毒性のヒトＩＦＮαにより阻害され得る。例示的なＲＮＡウイルスと
しては、ネコ白血病ウイルス、メンヨウの進行性肺炎ウイルス、ヒツジレンチウ
イルス、ウマ伝染病貧血ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ビスナ−マエディウ
イルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、あるいは
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が挙げられる。例示的なＤＮＡウイルスとはＢ型肝
炎ウイルス（ＨＢＶ）である。

【００１７】さらに別の局面において、本発明は、自己免疫疾患の処置が必要とされる被験
体における、その処置の方法を包含する。ある実施態様においては、自己免疫疾
患は多発性硬化症である。その方法は、薬学的有効量の上記タイプの低毒性のヒ
トＩＦＮαアナログを、被験体に投与する工程を包含する。

【００１８】別の局面において、本発明は、慢性炎症の処置が必要とされる被験体における
、その処置の方法を包含する。ある実施態様においては、慢性炎症は潰瘍性大腸
炎から生じる。その方法は、薬学的有効量の上記タイプの低毒性のヒトＩＦＮα
アナログを、被験体に投与する工程を包含する。

【００１９】さらに別の局面において、本発明は上記タイプの低毒性のヒトＩＦＮαアナロ
グの経口投与による、静脈投与されるＩＦＮαに応答性の任意の疾患状態の処置
の方法を包含する。経口投与されるアナログは、好ましくは被験体により経口摂
取される。

【００２０】本発明のこれらの、および他の目的ならびに特徴は、以下の本発明の詳細な記
述が、添付される図と共に読まれる場合にさらに十分に評価される。

【００２１】（配列の簡単な説明）配列番号１は、成熟ヒトＩＦＮα（ｍＨｕＩＦＮα）の１９〜２７番目の残基
間のアミノ酸配列である。

【００２２】配列番号２は、成熟ヒツジインターフェロン−τの（ｍＯｖＩＦＮτ）１９〜
２７番目の残基間のアミノ酸配列である。

【００２３】配列番号３は、ｍＨｕＩＦＮαの１１〜２７番目の残基間のアミノ酸配列であ
る。

【００２４】配列番号４は、ｍＯｖＩＦＮτの１１〜２７番目の残基間のアミノ酸配列であ
る。

【００２５】配列番号５は、ｍＨｕＩＦＮαの６〜２７番目の残基間のアミノ酸配列である
。

【００２６】配列番号６は、ｍＯｖＩＦＮτの６〜２７番目の残基間のアミノ酸配列である
。

【００２７】配列番号７は、ｍＨｕＩＦＮαの１〜２７番目の残基間のアミノ酸配列である
。

【００２８】配列番号８は、ｍＯｖＩＦＮτの１〜２７番目の残基間のアミノ酸配列である
。

【００２９】配列番号９は、成熟ＨｕＩＦＮα（ＩＦＮα−ｄ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ
００２１０，ＰＩＤｇ３８６７９６）のアミノ酸配列である。

【００３０】配列番号１０は、成熟ＩＦＮαアナログＩＦＮα−Ｎ０のアミノ酸配列である
。

【００３１】配列番号１１は、成熟ＩＦＮαアナログＩＦＮα−Ｎ１のアミノ酸配列である
。

【００３２】配列番号１２は、成熟ＩＦＮαアナログＩＦＮα−Ｎ２のアミノ酸配列である
。

【００３３】配列番号１３は、成熟ＩＦＮαアナログＩＦＮα−Ｎ３のアミノ酸配列である
。

【００３４】配列番号１４は、成熟ＩＦＮαアナログＩＦＮα−Ｎ４のアミノ酸配列である
。

【００３５】配列番号１５は、成熟ＩＦＮαアナログＩＦＮα−Ｎ５のアミノ酸配列である
。

【００３６】配列番号１６は、成熟ＩＦＮαアナログＩＦＮα−Ｎ６のアミノ酸配列である
。

【００３７】配列番号１７は、成熟ＩＦＮαアナログＩＦＮα−Ｎ７のアミノ酸配列である
。

【００３８】配列番号１８は、成熟ＯｖＩＦＮτ（ｏＴＰ−１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｙ
００２８７，ＰＩＤｇ１３５８）のアミノ酸配列である。

【００３９】配列番号１９は、ＩＦＮα−Ｎ０をコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列
である。

【００４０】配列番号２０は、リンカー１に対するヌクレオチド配列である。

【００４１】配列番号２１は、リンカー２に対するヌクレオチド配列である。

【００４２】配列番号２２は、断片Ｎ１，正方向鎖に対するヌクレオチド配列である。

【００４３】配列番号２３は、断片Ｎ１，逆方向鎖に対するヌクレオチド配列である。

【００４４】配列番号２４は、断片Ｎ２，正方向鎖に対するヌクレオチド配列である。

【００４５】配列番号２５は、断片Ｎ２，逆方向鎖に対するヌクレオチド配列である。

【００４６】配列番号２６は、断片Ｎ３，正方向鎖に対するヌクレオチド配列である。

【００４７】配列番号２７は、断片Ｎ３，逆方向鎖に対するヌクレオチド配列である。

【００４８】配列番号２８は、断片Ｎ４，正方向鎖に対するヌクレオチド配列である。

【００４９】配列番号２９は、断片Ｎ４，逆方向鎖に対するヌクレオチド配列である。

【００５０】配列番号３０は、断片Ｎ５，正方向鎖に対するヌクレオチド配列である。

【００５１】配列番号３１は、断片Ｎ５，逆方向鎖に対するヌクレオチド配列である。

【００５２】配列番号３２は、断片Ｎ６，正方向鎖に対するヌクレオチド配列である。

【００５３】配列番号３３は、断片Ｎ６，逆方向鎖に対するヌクレオチド配列である。

【００５４】配列番号３４は、断片Ｎ７，正方向鎖に対するヌクレオチド配列である。

【００５５】配列番号３５は、断片Ｎ７，逆方向鎖に対するヌクレオチド配列である。

【００５６】（発明の詳細な説明）（Ｉ定義）インターフェロン−α（ＩＦＮα）とは、配列番号９で表される成熟ＩＦＮα
タンパク質配列と７０％を超える、もしくは、好ましくは約８０％を超える、あ
るいは、さらに好ましくは約９０％を超えるアミノ酸の同一性を有する、インタ
ーフェロンタンパクのファミリーの任意の１つをいう。アミノ酸配列の同一性は
、例えば、デフォルトパラメーターをもちいてＬＡＬＩＧＮプログラムを使用し
て決定され得る。このプログラムは配列比較プログラムのＦＡＳＴＡｖｅｒｓ
ｉｏｎ１．７ｓｕｉｔｅ（ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ１９８
８；Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０；ＷｉｌｌｉａｍＲ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｄｅｐ
ａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｏｘ４
４０，ＪｏｒｄａｎＨａｌｌ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡから利
用可能なプログラム）の中に見られる。代表的に、ＩＦＮαは以下の特徴の群か
らの少なくとも１つの特徴を有している；（ａ）抗ウイルス特性、（ｂ）抗細胞
増殖特性、および（ｃ）核酸によるか、またはウイルスによる誘導性。好ましい
ＩＦＮαはヒト由来である。

【００５７】インターフェロン−τ（ＩＦＮτ）とは、配列番号１８で表される成熟ＩＦＮ
τ配列と７０％を超える、または、好ましくは約８０％を超える、または、より
好ましくは約９０％を超えるアミノ酸の同一性を有するインターフェロンタンパ
クのファミリーの任意の１つをいう。代表的に、ＩＦＮτは以下の特徴の群から
の少なくとも１つの特徴を有している；（ａ）胚／胎児期間の栄養外胚葉／胎盤
による発現、（ｂ）抗黄体消退化特性、（ｃ）抗ウイルス特性、および（ｄ）抗
細胞増殖特性。好ましいＩＦＮτは、ヒツジおよびウシＩＦＮτである。

【００５８】「成熟タンパク」とは、リーダー配列の除去後のＩＦＮタンパクをいう。成熟
ＩＦＮタンパク配列は、成熟タンパク配列のＣｙｓ１に対応する、完全ＩＦＮア
ミノ酸配列のＣｙｓ２４残基より始まる。

【００５９】あるポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド断片は、それが由来する配
列または断片中に存在しているものと同じヌクレオチドの配列を、そのポリヌク
レオチド配列またはポリヌクレオチド断片が含む場合に、それは別のポリヌクレ
オチド配列またはポリヌクレオチド断片に「由来する」。例えば、細菌のプラス
ミドは、そのインサート中のポリヌクレオチド配列が、ある選択されたヒト遺伝
子中のポリヌクレオチド配列と同じである場合は、その選択されたヒト遺伝子に
「由来する」インサートを保持する。

【００６０】同様に、あるポリペプチド配列またはポリペプチド断片は、それが由来する配
列または断片中に存在する配列と同じアミノ酸の配列を、そのポリペプチド配列
またはポリペプチド断片が保持している場合に、それは別のポリペプチド配列ま
たはポリペプチド断片に「由来する」。

【００６１】２つのアミノ酸配列に関して、同一パーセント（％）とは、それら配列が最適
に整列化され「ギャップ」に対してペナルティーを割り当てない場合での、その
２つの配列における同一残基のパーセント（％）をいう。つまり、第一配列を第
二配列と共に最適に整列化するために、ギャップを第一配列中に挿入する必要が
ある場合は、同一パーセント（％）は対応するアミノ酸残基とペアとなる残基の
みを用いて計算される（すなわち、その計算は、第一配列の「ギャップ」中に存
在する、第二配列中の残基を考慮しない）。最適整列化は、最も高い同一パーセ
ント（％）のスコアーを与える整列化として定義される。そのような整列化は、
「ＧＥＮＥＷＯＲＫＳ」プログラムを用いて実行され得る。あるいは、整列化は
１のｋｔｕｐ、デフォルトパラメーター、およびデフォルトＰＡＭを有するロー
カルアライメントプログラムＬＡＬＩＧＮを用いて実行され得る。

【００６２】「保存的置換」とは、あるクラスのアミノ酸の、同クラスのアミノ酸での置換
をいい、ここで、クラスとは、共通の物理化学的なアミノ酸側鎖の特性、および
（標準Ｄａｙｈｏｆｆ交換頻度マトリックスにより決定されるような）天然に見
られる相同タンパクにおける高い置換頻度によって規定される。上記のように分
類された、アミノ酸側鎖の６つ一般的のクラスとしては、クラスＩ（Ｃｙｓ）；
クラスＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）；クラスＩＩＩ（Ａｓ
ｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ）；クラスＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；クラ
スＶ（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）；およびクラスＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ
、Ｔｒｐ）が挙げられる。例えば、Ａｓｐの、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、あるいはＧｌｕ
のようなクラスＩＩＩの別の残基での置換は、保存的置換である。

【００６３】「非保存的置換」とは、あるクラスのアミノ酸の、別のクラス由来のアミノ酸
での置換をいう（例えば、クラスＩＩ残基であるＡｌａの、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇ
ｌｕ、またはＧｌｎのようなクラスＩＩＩ残基での置換）。

【００６４】疾患の「処置」とは、疾患の症状および／または疾患の重篤度を減少するのに
効果的な治療物質を投与することをいう。

【００６５】（ＩＩ．低毒性のヒトＩＦＮαアナログ）本発明は、成熟ＨｕＩＦＮαにおける１９、２０、２２、２４、および２７番
目のアミノ酸位置の１以上にアミノ酸置換を導入するより、ＨｕＩＦＮαの細胞
毒性を有意的に減少させ得ることの知見に基づいている。

【００６６】図１は、成熟ＨｕＩＦＮαの最初の２７Ｎ末端アミノ酸残基（配列番号９）、
および成熟ＯｖＩＦＮτの最初の２７Ｎ末端アミノ酸残基（配列番号１８）を示
しており、ここで、非同一残基は太字で示されている。ＯｖＩＦＮτ置換のサブ
セットを含むＨｕＩＦＮαアナログは、実施例１において記載されているように
調製された。各ＨｕＩＦＮαアナログの１〜２７番目の位置は、図１に示され、
その置換は太字で示されている。各アナログの２８〜１６６番目のアミノ酸は、
ＨｕＩＦＮα残基のままである（例えば、配列番号９の２８〜１６６番目の残基
）。

【００６７】ＩＦＮα−Ｎ０〜ＩＦＮα−Ｎ７（配列番号１０〜配列番号１７）と称するＨ
ｕＩＦＮαアナログに対して、実施例２および実施例３に記載される細胞毒性の
アッセイを行った。ＨｕＩＦＮαと共にインキュベートされた肝細胞は、生存度
において有意的な低下が示された（表１、実施例２）。対照的に、ＩＦＮαアナ
ログＩＦＮα−Ｎ０と共にインキュベートした細胞は、親出願に報告されたよう
に、本質的に生存度の減少を示さなかった。

【００６８】ＩＦＮα−Ｎ１からＩＦＮα−Ｎ７までのアナログに対して、実施例３に記載
される細胞毒性のアッセイを行った。様々な量のＯｖＩＦＮτ、または様々な量
のＩＦＮα−Ｎ０と共にインキュベートした末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、７
日間のインキュベート後、本質的に生存度の減少は示さなかった。アナログ−Ｎ
１あるいはアナログ−Ｎ３と共にインキュベートしたＰＢＭＣは、ＨｕＩＦＮα
に対して観察されたのと同様のレベルで、生存度の有意的な低下を示した。従っ
て、アナログ−Ｎ１およびアナログ−Ｎ３における、２、４、５、６、７、８、
１１、１３、および１４番目の位置での置換は、ＨｕＩＦＮαの細胞毒性の減少
には、比較的、効果がないものである。ＩＦＮα−Ｎ４と共にインキュベートし
た細胞は、ＨｕＩＦＮαと共にインキュベートした細胞の生存度およびＯｖＩＦ
Ｎτと共にインキュベートした細胞の生存度との間のレベルでの生存度を保持し
ていた。従って、１６、１９、および２０番目の位置での、さらなる置換は、Ｈ
ｕＩＦＮαの毒性の減少に部分的に効果的である。

【００６９】ＩＦＮαアナログＩＦＮα−Ｎ５、ＩＦＮα−Ｎ６、およびＩＦＮα−Ｎ７と
インキュベートしたＰＢＭＣは、７日間のインキュベート後、本質的に生存度の
低下を示さなかった（表２）。これら３アナログはＯｖＩＦＮαの低い細胞毒性
を保持し、そしてさらに、ＨｕＩＦＮα細胞毒性の減少の原因となる位置を規定
する。最も際立ったことに、アナログＩＦＮα−Ｎ７は、１９、２０、２２、２
４、および２７番目の位置での、５つのみの置換を有している。他の低細胞毒性
を示したアナログ、−Ｎ０、−Ｎ５および−Ｎ６は、これらの位置および、さら
なる位置においての置換を有している（図１）。アナログＩＦＮα−４は、本試
験において中程度の細胞毒性のレベルを示すが、位置２２、２４、および２７で
の置換を欠いている。本発明に従って、本データは、１９、２０、２２、２４、
および２７番目の残基が、これらのタンパクの細胞毒性において顕著な役割を果
たしていることを実証している。

【００７０】より具体的には、本発明は、１９、２０、２２、２４、および２７番目の位置
での１以上のアミノ酸置換を含有しているＨｕＩＦＮαアナログで、その残りの
アミノ酸の大部分が天然ＨｕＩＦＮα残基である、ＨｕＩＦＮαアナログを意図
している。このアナログは、天然ヒトＩＦＮαと関連する治療特性とともに、本
明細書に記載されている細胞毒性アッセイによって測定されたような減少された
毒性を有している。

【００７１】好ましい置換としては、以下の１つ以上が挙げられる：成熟ＨｕＩＦＮαの１
９番アミノ酸は、成熟ＯｖＩＦＮτのＡｓｐ１９、あるいは同クラスの残基であ
るＡｓｎ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕで置換され得る；成熟ＨｕＩＦＮαの２０番ア
ミノ酸は、成熟ＯｖＩＦＮτのＡｒｇ２０、あるいは同クラスの残基であるＨｉ
ｓまたはＬｙｓと置換され得る；成熟ＨｕＩＦＮαの２２番アミノ酸は、成熟Ｏ
ｖＩＦＮτのＡｓｎ２２、あるいは同クラスの残基であるＡｓｐ、Ｇｌｎ、また
はＧｌｕと置換され得る；成熟ＨｕＩＦＮαの２４番アミノ酸は、成熟ＯｖＩＦ
ＮτのＬｅｕ２４、あるいは同クラスの残基であるＶａｌまたはＭｅｔと置換さ
れ得る；および、成熟ＨｕＩＦＮαの２７番アミノ酸は、ＯｖＩＦＮτのＨｉｓ
２７、あるいは同クラスの残基であるＡｒｇまたはＬｙｓと置換され得る。この
ような置換は、ＨｕＩＦＮαの毒性を減少するのに効果的であるが、望ましいＨ
ｕＩＦＮαの治療特性を有意には変えない。

【００７２】いくつかの低毒性のＨｕＩＦＮαアナログの変化された位置を包囲する、他の
例示的配列としては、配列番号２、配列番号４、および配列番号６として本明細
書に記載される配列が挙げられる。最も好ましい実施態様は、ＯｖＩＦＮτにお
いて非同一である位置における、１９〜２７番目の領域において置換されたＨｕ
ＩＦＮαアナログである。例えば、成熟ヒトＩＦＮαの１９〜２７番目のアミノ
酸（配列番号１）が、成熟ＯｖＩＦＮτの１９〜２７番目のアミノ酸（配列番号
２）で置換される構築物は、結果として、成熟ヒトＩＦＮαの１９、２０、２２
、２４、および２７番目の位置での変化を生じるが、残りの成熟ヒトＩＦＮα配
列は、不変のままである。この例はアナログＩＦＮα−Ｎ７（配列番号１７）と
対応する。

【００７３】記載された低毒性のヒトＩＦＮαアナログは「成熟」タンパクである、すなわ
ち、それらは（成熟タンパクのＣｙｓ１に対応する）完全なインターフェロン配
列のＣｙｓ２４残基から始まるが、本発明はまたリーダー配列を含むＩＦＮαア
ナログ（すなわち、開始メチオニンから始まる）を包含することは、理解され得
る。そのようなヒトＩＦＮαにおけるリーダー配列はヒトＩＦＮα、ヒツジＩＦ
Ｎτ、または別のＩ型インターフェロンに由来し得る。

【００７４】先に指摘されたように、本発明のＨｕＩＦＮαアナログに対して意図される重
要な利点とは、天然ヒトＩＦＮαと比較した、アナログの減少された毒性である
。このＨｕＩＦＮαアナログは天然ヒトＩＦＮαと同じ生物学的活性を有し得る
。

【００７５】（ＩＩＩ組換え操作および合成操作）ＨｕＩＦＮαアナログＩＦＮα−Ｎ０をコードする合成遺伝子の構築は、実施
例１Ａに記載されている。手短には、最初の２７Ｎ末端の位置における１５全て
のＯｖＩＦＮτでの置換を含んでいる成熟ＨｕＩＦＮαのアミノ酸配列（配列番
号１０）は、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓに対して最適化されたコドン使用
頻度で、復帰（ｂａｃｋ）翻訳された。そのヌクレオチド配列は、その構築物の
全長にわたり、間隔を置いて配置された５つの制限部位を含むよう編集された。
その合成遺伝子配列は４つのヌクレオチド断片に分けられた。個々の断片は（各
、長さ約１５０塩基対）は、オリゴヌクレオチドの連続的ライゲーションにより
構築された。その断片は細菌のベクターの中に連続的にクローン化され、ＩＦＮ
α−Ｎ０（配列番号１９）をコードする遺伝子を生じた。合成遺伝子は次にＰｉ
ｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓにおける発現のためのｐＰＩＣＺ−αベクターの中
にクローン化された。アナログＩＦＮα−Ｎ１からＩＦＮα−Ｎ７をコードする
合成遺伝子はまた、実施例１Ａにおいて記載されるようなオリゴヌクレオチドの
連続的ライゲーションによって構築された。

【００７６】Ｐｉｃｈｉａにおける合成遺伝子の発現（実施例１Ｂ）は、組換えＨｕＩＦＮ
αアナログの大量発現をもたらした。組換えＨｕＩＦＮαアナログは、同じＰｉ
ｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ系を用いて発現された、組換えＯｖＩＦＮτの抗ウ
イルス活性と類似の抗ウイルス活性（実施例１Ｃ）を示した。

【００７７】（ＩＶ．有用性）（Ａ．抗ウイルス特性）Ｉ型インターフェロンは強力な抗ウイルス特性を示す。ＩＦＮαと比較して、
ＩＦＮτの減少された毒性は、成熟タンパクの最初の２７Ｎ末端残基内に存在す
る非保存的アミノ酸に起因すると思われる。これらのアミノ酸残基での、ＩＦＮ
αのＮ末端部分のその対応する残基についての置換は、結果として生じたＨｕＩ
ＦＮαアナログの細胞毒性を減少するようであるが、Ｉ型インターフェロンの抗
ウイルス活性を保持するようである。従って、本発明の低毒性のＨｕＩＦＮαア
ナログを含有する処方物は、ウイルスの複製を阻害するために使用され得る。

【００７８】本発明の低毒性のＨｕＩＦＮαアナログは、胎児と母体間の免疫関係に影響を
及ぼす方法において（例えば、母方のウイルス（例えば、ＨＩＶ）の成長中の胎
児への伝染を防ぐことにおいて、）必要とされ得る。同種のタンパク質を用いる
と強力な抗原の応答は、あまりないようなので、これらのヒトインターフェロン
アナログは、特にヒト治療のために有効である。

【００７９】（Ｂ．抗細胞増殖特性）Ｉ型インターフェロンは強力な抗細胞増殖活性を示す。本明細書に記載される
ような低毒性のヒトＩＦＮαアナログはまた、近年公知である、他のインターフ
ェロンと関連するネガティブな副作用なしで、細胞増殖を阻害するために使用さ
れ得る。本発明の低毒性のＩＦＮαアナログを包含する処方物は、腫瘍増殖を阻
害するか、防ぐか、あるいは遅らせるために使用され得る。

【００８０】（Ｃ．免疫系障害）本発明の方法を使用して処置され得る疾患としては、自己免疫性、炎症性、増
殖性、および過剰の増殖性疾患、ならびに免疫学的に媒介された疾患の皮膚での
発症が挙げられる。特に、本発明の方法は、免疫系の過敏症に関係する状態を処
置するために有利である。免疫系の過敏症には４つの型がある。Ｉ型、あるいは
即時型の／アナフィラキシー性の過敏症は、アレルゲン（例えば、花粉）に対す
る応答におけるマスト細胞の脱顆粒によるものであり、そして、そのような過敏
症としては、喘息、アレルギー性鼻炎（枯草熱）、じんま疹（発疹）、アナフィ
ラキシーショック、および他のアレルギー性の疾患が挙げられる。ＩＩ型、ある
いは自己免疫性の過敏症は、身体自身の細胞上で認識された「抗原」に対して向
けられた抗体に起因するものである。ＩＩＩ型過敏症は、様々な組織中に留まり
、そしてさらなる免疫応答を活性化する抗原／抗体免疫複合体の形成に起因する
ものであり、そして、ＩＩＩ型過敏症は、血清病、アレルギー性肺胞炎、および
ブースターワクチン接種後に時折形成される大きい腫脹のような状態の原因とな
る。ＩＶ型過敏症は、炎症反応を生じる感作Ｔ細胞からのリンフォカインの放出
に起因するものである。例としては、接触皮膚炎、はしかの発疹、および特定の
薬物に対する「アレルギー」反応が挙げられる。

【００８１】いくらかの個体において、特定の状態から結果として過敏症になり得る機構は
、一般的にはよく理解されていないが、遺伝的および外因性要因の両方を含み得
る。例えば、細菌、ウイルス、あるいは薬物は、すでに自己免疫障害に対する遺
伝的素因を有している個体における、自己免疫応答を誘発する役割を果たし得る
。いくつかの型の過敏症の発生数は、他の過敏症と相関し得ると示唆されてきた
。例えば、特定の通常のアレルギーを有する個体は、自己免疫疾患に対してより
感受性であることが提唱されている。

【００８２】自己免疫障害は、特定の器官あるいは特定の組織に主に制限されるもの、およ
び体全体が罹患するものとに大まかに分類され得る。器官特異的障害の例（罹患
する器官と共に）としては、多発性硬化症（神経突起上のミエリンコーティング
）、Ｉ型糖尿病（膵臓）、橋本甲状腺炎（甲状腺）、悪性貧血（胃）、アジソン
病（副腎）、重症筋無力症（神経筋接合部のアセチルコリンレセプター）、慢性
関節リウマチ（関節内層（ｊｏｉｎｔｌｉｎｉｎｇ））、ブドウ膜炎（眼）、
乾癬（皮膚）、ギヤン−バレー症候群（神経細胞）、およびグレーブス病（甲状
腺）が挙げられる。全身性自己免疫疾患としては、全身性エリテマトーデスおよ
び皮膚筋炎が挙げられる。

【００８３】過敏症障害の他の例としては、喘息、湿疹、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎
、他の湿疹性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、鼻炎、扁平苔癬、天疱瘡（ｐｅｍｐｌｕｇ
ｕｓ）、水疱性類天疱瘡、表皮水疱症、ウルティカリス（ｕｒｉｔｃａｒｉｓ）
、血管性水腫、脈管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｄｅｓ）、紅斑、皮膚性好酸球増加
症、円形脱毛症、アテローム性動脈硬化症、原発性胆汁性肝硬変、およびネフロ
ーゼ症候群が挙げられる。関連する疾患としては、セリアック病（ｃｅｒｉａｃ
ｄｉｓｅａｓｅ）、直腸炎、好酸球性胃腸炎、肥満細胞症、炎症性腸疾患、ク
ローン病、および潰瘍性大腸炎のような腸炎ならびに食物関連のアレルギーが挙
げられる。

【００８４】本発明の方法を使用する処置を特に受け入れられる自己免疫疾患としては、多
発性硬化症、Ｉ型（インシュリン依存性の）糖尿病、エリテマトーデス、筋萎縮
性側索硬化症、クローン病、慢性間接リウマチ、口内炎、喘息、ブドウ膜炎、ア
レルギー、および乾癬が挙げられる。

【００８５】本発明の低毒性のＨｕＩＦＮαアナログを含有する医薬は、治療的処置に使用
され得、そしてそれによって、先に議論されたような自己免疫障害の症状を緩和
し得る。

【００８６】（Ｄ．薬学的組成物）本発明の低毒性のヒトＩＦＮαアナログは、薬学的に有用な組成物を調製する
ための、公知の方法に従って処方され得る。インターフェロンおよびインターフ
ェロン様化合物を含有する処方物は、以前に記載されている（例えば、Ｍａｒｔ
ｉｎ、１９７６）。一般に、本発明の組成物は、有効量のインターフェロンアナ
ログが、組成物の効果的な投与を容易にするために適切なキャリア−と組み合わ
せ得るよう処方される。

【００８７】これらの治療において使用される組成物もまた、様々な形態で存在し得る。こ
れらには、例えば、錠剤、丸剤、粉末、溶液あるいは懸濁液、リポソーム、坐剤
、注射剤、および不融性溶液のような、固体の、半固体の、および液体の投薬形
態が挙げられる。好ましい形態は、投与、および治療的適用の意図される形態に
依存する。その組成物はまた、好ましくは当業者に公知である、従来の薬学的に
受容可能なキャリアーおよびアジュバンドを含有する。好ましくは、その本発明
の組成物は１ユニットの投与量の形態で存在しており、そして通常一日あたり一
回以上、患者に投与される。

【００８８】低毒性のヒトＩＦＮαアナログ、または関連したポリペプチドは、経口摂取、
吸入、鼻腔内噴霧、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射、病変内注射、あるい
は皮下注射を含む、任意の薬学的に受容可能な投薬形態で、患者に投与され得る
。特に、他のインターフェロン化合物に対して使用される組成物および方法は、
これらアナログの送達に使用され得る。

【００８９】しかし、本発明のＩＦＮαアナログの一つの重要の利点は、それらの極度に低
い細胞毒性である。この低毒性のために、他のインターフェロン（例えば、天然
ヒトＩＦＮα）化合物について一般に利用され得る濃度よりさらに高い濃度で、
そのインターフェロンアナログを投与することが可能である。従って、本発明の
低毒性のＨｕＩＦＮαアナログは約５×１０⁴ユニット／日から２０×１０⁶ユニ
ット／日までから、約５００×１０⁶ユニット／日以上の速度で投与され得ることが意図される。好ましい実施態様では、その投与量は約２０×１０⁶ユニット／日である。高い投与量は全身投与にとって好ましい。もちろん、この発明の組
成物および方法は、他の治療との併用においても使用され得ることは理解される
べきである。

【００９０】一旦、患者の状態が改善されると、必要な場合に維持量が投与される。その後
、症状の関数としての、投与量または投与頻度、あるいは両者は、改善された状
態が保持されるレベルまで減少され得る。症状が望ましいレベルに緩和された場
合は、処置は終止するべきである。しかし、患者は、任意の疾患症状の再発に際
して長期的な体制の、間欠性の処置を必要とし得る。

【００９１】本発明のＩＦＮαアナログは、他のインターフェロンが以前に活性を示した疾
患を含む、様々な癌およびウイルス性疾患を処置するために、標準手順によって
投与され得る（例えば、Ｆｉｎｔｅｒら、１９９１；Ｄｉａｎｚａｎｉ、１９９
２；Ｆｒａｎｃｉｓら、１９９２、および米国特許第４，８８５，１６６号およ
び米国特許第４，９７５，２７６号を参照のこと）。しかし、先に議論されたよ
うに、本発明のＩＦＮαアナログは、毒性なしでこれらの状態を処置するそれら
の能力を含めた、独特の特徴および利点を有している。

【００９２】（Ｅ．皮膚障害の処置）皮膚の障害は、病変内局的に本発明の低毒性のインターフェロンアナログを用
いて処置され得、ここで、処方物および投与量は、投与方法、ならびに処置され
るべき病変のサイズおよび重篤度に依存する。好ましい方法としては、皮内およ
び皮下注射が挙げられる。大きい病変内への複数の注射は可能とされ得、そして
一人の患者のいくつかの皮膚上の病変は、一度に処置され得る。投与のスケジュ
ールは、当業者により決定され得る。持続的に放出されるようデザインされた処
方物は投与頻度を減少させ得る。

【００９３】（Ｆ．全身処置）全身処置は、実質的に全ての適用と等価である。複数の静脈内、皮下、および
／または筋肉内投与は可能であり、そして処置のための移植可能な方法の場合、
持続的に放出されるようデザインされた処方物は、特に有用である。患者はまた
、移植可能な皮下の入口、リザーバー、またはポンプを用いて処置され得る。

【００９４】（Ｇ．局所的処置）本発明の低毒性のＩＦＮαアナログを用いた局所的処置は、特定の器官におけ
る癌の処置に有用である。処置は動脈内注入により達成され得る。カテーテルは
罹患した器官を直接的処置するために外科的に、あるいは血管造影的に移植され
得る。カテーテルを連結された皮下の入口は、慢性的な処置に使用され得るか、
あるいは移植可能な、補充可能なポンプもまた使用され得る。

【００９５】以下の実施例は本発明を説明するが、決して本発明の制限を意図するものでは
ない。

【００９６】（材料および方法）制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、および仔ウシ腸フォスファターゼはＮｅｗ
ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）またはＰｒｏｍｅｇ
ａＢｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）より購入した：これらの試薬は製
品説明書に従って使用した。シークエンシング反応のために、「ＳＥＱＵＥＮＡ
ＳＥＤＮＡＩＩ」シークエンシングキットを使用した（ＵｎｉｔｅｄＳｔ
ａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃｌｅｖｅｌａ
ｎｄＯＨ）。免疫ブロット試薬および他の試薬は、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃ
ａｌＣｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ（Ｎｅｅｄｈａｍ、ＭＡ）より購入した。ニトロセルロースフィルターは
ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ（Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）より入手
した。

【００９７】合成オリゴヌクレオチドリンカーおよびプライマーは、市販の自動オリゴヌク
レオチドシンセサイザー（例えば、ＡＢＩｍｏｄｅｌ３８０Ｂ−０２ＤＮ
Ａｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓ
ｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ））を使用して調製した。あるいは、カスタム設計され
た合成オリゴヌクレオチドは、例えば、ＳｙｎｔｈｅｔｉｃＧｅｎｅｔｉｃｓ
（ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）より購入され得る。ＣＤＮＡ合成キットおよびラ
ンダムプライミングラベリングキットは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（ＢＭＢ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）よ
り入手した。

【００９８】ポリペプチドをコードしているオリゴヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチ
ド合成の標準的な方法によって直接的に合成され得るか、あるいはコードする配
列が大きい場合には、コード配列に対応する、複数のオリゴヌクレオチド断片の
直列の並びを含む一連のクローニング工程により合成され得るか（Ｙｏｓｈｉｏ
ら、１９８９；Ｅａｔｏｎら、１９８８）のいずれか一方で合成され得る。オリ
ゴヌクレオチドのコード配列は、標準的な組換え手順により発現され得る（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓら、１９８２；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８８）。あるいは、ペプチ
ドは標準的なｉｎｖｉｔｒｏ技術（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、
ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙＣＡ）より直接的に合成され得る。

【００９９】組換えヒトＩＦＮαＡは、ＢｉｏｓｏｕｒｃｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）より入手した。他に示されない限り、タンパク濃
度はビシンコニニン（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ）酸アッセイキット（Ｐｉｅ
ｒｃｅ、ＲｏｃｋｆｏｒｄＩＬ）を製品説明書に従って用い、決定した。

【０１００】本研究で使用した、全ての組織培養培地、血清、およびＩＦＮは内毒素に対し
て陰性であり、その内毒素は０．０７ｎｇ／ｍｌの感度レベルでのリムルスアメ
ーバ様細胞ライセート（ＣａｐｅＣｏｄ、ＷｏｏｄｓＨｏｌｅ、ＭＡの共同
研究者）を用いたアッセイにより決定した。

【０１０１】（実施例１）（ＨｕＩＦＮαアナログのクローニングおよび発現）（Ａ．ＨｕＩＦＮαアナログをコードする合成遺伝子の構築）最初の２７Ｎ末端の位置に１５全てのＯｖＩＦＮτ置換を含むＨｕＩＦＮαの
アミノ酸配列（配列番号１０）を、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓに最適化さ
れたコドン使用頻度で復帰（ｂａｃｋ）翻訳された。そのヌクレオチド配列は、
その構築物の全長にわたり間隔を置いて配置された、５つの制限部位を含むよう
に編集された。その合成遺伝子配列は４つのヌクレオチド断片に分けられた。個
々の断片は（各、長さ約１５０塩基対）は、オリゴヌクレオチドの連続的ライゲ
ーションにより構築された。それら断片はＧ２細菌ベクターの中に連続的にクロ
ーン化され、ＩＦＮα−Ｎ０（配列番号１９）コードする遺伝子を生じた。さら
に合成遺伝子は細菌ベクターから切り出され、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ
における発現用のｐＰＩＣＺ−αベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳａｎＤ
ｉｅｇｏＣＡ）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ部位中にライゲーションした。

【０１０２】ＩＦＮα−Ｎ１からＩＦＮα−Ｎ７のアナログをコードしている合成遺伝子も
また、オリゴヌクレオチドの連続的ライゲーションにより構築した。上記のｐＰ
ＩＣＺ−α／ＩＦＮα−Ｎ０構築物をＸｂａＩおよびＢｓｔＥＩＩを用いて消化
し、そしてアニールされたオリゴヌクレオチドリンカー１（配列番号２０）およ
びリンカー２（配列番号２１）を、これらの部位中にライゲーションし、中間体
ベクター構築物を作成した。この工程で、ＩＦＮα−Ｎ０のＮ末端部分に対応す
るヌクレオチド配列を除去し、以下に列挙されるヌクレオチド断片により置換し
た。中間体ベクター構築部をＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化した。連続
的ライゲーションによって調製した、以下に示すヌクレオチド断片は、次にその
中間体構築物のＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位中にライゲーションし、ｐＰＩＣＺ−
αベクター中にＩＦＮα−Ｎ１からＩＦＮα−Ｎ７までの各アナログを作成した
。

【０１０３】ＩＦＮα−Ｎ１断片Ｎ１正方向配列番号２２断片Ｎ１逆方向配列番号２３ＩＦＮα−Ｎ２断片Ｎ２正方向配列番号２４断片Ｎ２逆方向配列番号２５ＩＦＮα−Ｎ３断片Ｎ３正方向配列番号２６断片Ｎ３逆方向配列番号２７ＩＦＮα−Ｎ４断片Ｎ４正方向配列番号２８断片Ｎ４逆方向配列番号２９ＩＦＮα−Ｎ５断片Ｎ５正方向配列番号３０断片Ｎ５逆方向配列番号３１ＩＦＮα−Ｎ６断片Ｎ６正方向配列番号３２断片Ｎ６逆方向配列番号３３ＩＦＮα−Ｎ７断片Ｎ７正方向配列番号３４断片Ｎ７逆方向配列番号３５（Ｂ．ＰｉｃｈｉａにおけるＨｕＩＦＮαアナログの発現）組換えインターフェロンアナログの発現のために、各遺伝子のコード配列を、
ｐＰＩＣＺ−α発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃ
Ａ）のＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を使用してそのベク
ター内に挿入した。ｐＰＩＣＺ−α発現ベクターは組換えインターフェロンの発
現および精製を容易にする様々な要素を提供する。例えば、そのベクターは、メ
タノール調節性アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）プロモーターを含有する発現
カセットを含んでいる。メタノールで増殖させた酵母細胞内において、およそ５
％のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡはＡＯＸ１遺伝子由来である。さらに、そのベクター
はまた、培養培地中へのタンパクの分泌を指示する、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのαファクターのプレプロペプチド由来の分泌シグナ
ル配列を含有する。また、そのベクターによって、Ｓｈｂｌｅ遺伝子（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓｂｌｅ遺伝子）に
よりコードされるゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）抗生物質を用いて、組換え細菌細胞
および組換え酵母細胞の選択を提供する。

【０１０４】ＨｕＩＦＮαアナログをコードしている組換えプラスミドを、大量増殖用のＰ
ｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ野生株Ｘ−３３にエレクトロポレーションした。
組換え酵母のコロニーを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより提供されたプロトコール
に従って、増殖および誘導した。上清を回収し、そして０．８／０．２ｍｍポア
サイズのアクロディスクフィルター（ａｃｒｏｄｉｓｃｆｉｌｔｅｒ）（Ｇｅ
ｌｍａｎＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＡｎｎＡｒｂｏｒ、ＭＩ）を使用して濾過し、
そしてセントリプラス−１０コンセントレータ（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｂｅ
ｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用して、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でバッファ
ー交換した。この方法によって得られた組換えＨｕＩＦＮαアナログは、同じＰ
ｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ系を使用して発現された、組換えＯｖＩＦＮτの
抗ウイルス活性と同様の抗ウイルス活性を示した。

【０１０５】（Ｃ．定量的抗ウイルスアッセイ）比色アッセイを使用して、インターフェロンタンパクの抗ウイルス活性を定量
化した。ＭａｄｉｎＤａｒｂｙウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞を、１０％ウシ胎児
血清（ＦＢＳ）および抗生物質を補充したイーグルＭＥＭを使用して、９６ウェ
ルの平底プレート中でコンフルエントになるまで増殖した。培地を除去し、そし
て細胞を滅菌ＰＢＳで一度洗浄した。希釈培地として２％ＦＢＳおよび抗生物質
を補充したイーグルＭＥＭを使用して連続的な１０倍および２倍希釈を使用し、
サンプルを、１００μｌ／ウェルになるよう、三連で添加した。インターフェロ
ンサンプルを添加して、そして細胞を３７℃で、１８時間インキュベートした。
標準なインターフェロンのコントロールとしては、組換えＨｕＩＦＮ−αＡ（Ｂ
ｉｏｓｏｕｒｃｅＩｎｔｌ．）使用した。１００μｌの水疱性口内炎ウイルス
（ＶＳＶ）をテストウェルに添加して、３７℃で、そしてさらに４８時間インキ
ュベートした。１００μｌの培地を各ウェルから除去して、そして１００μｌの
０．２％ニュートラルレッド溶液（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）と交換し、そして３７
℃で、１時間インキュベートした。全ての培地を除去し、そして細胞を１００μ
ｇの酸アルコール（５０％エタノール、１％酢酸）の添加前にＰＢＳで２回穏や
かに洗浄した。可溶化された色素のＡ₅₅₀を、Ｂｉｏ−ＫｉｎｅｔｉｃｓＲｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−ＴｅｋＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＷｉｎｏｏｓｋｉＶＴ
）により読取った。保護率は次の式を用いて計算された。

【０１０６】

【数２】１抗ウイルスユニット（Ｕ）を５０％保護として定義する。

【０１０７】（実施例２）（肝細胞におけるＩＦＮαアナログのインビトロ毒性）ＨｕＩＦＮαおよびＩＦＮαアナログＩＦＮα−Ｎ０（配列番号１０；図１）
のインビトロの毒性を、正常のヒト肝細胞を用いて比較した。肝細胞を、Ｃｌｏ
ｎｅｔｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）から、マ
トリゲル被覆の９６ウェルプレート中の細胞のコンフルエントな層として受け取
った。次の日、ウェル中の培地を、０．１μＭのインシュリン、０．１μＭのデ
キサメサゾン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、および５０ｎｇ／ｍｌのアン
ホテリシンＢを補充した、１００μｌの改変ウィリアムＥ培地（Ｃｌｏｎｅｔｉ
ｃｓＣｏｒｐ．）と交換した。細胞を引き続き、２，０００Ｕ／ｍｌ〜１２８
，０００Ｕ／ｍｌのＨｕＩＦＮα、またはＩＦＮα−Ｎ０で処置した。インキュ
ベートの４、６、または７日後に、１０μｌのテトラゾリウム塩ＷＳＴ−１（４
−３−（４−ヨードフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−５−テト
ラゾリオール−１−３−ベンゼンジスルホネート）（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭ
ａｎｎｈｅｉｍ，ＩｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓＩＮ）を各ウェルに添加した。Ｗ
ＳＴ−１は、ミトコンドリアの呼吸鎖に存在し、そして生存可能な細胞内でのみ
活性である、コハク酸テトラゾリウムレダクターゼ系により切断され、ホルマザ
ンを生じる。生存可能な細胞のパーセントは、４５０ｎｍの吸収により測定され
、そしてインターフェロン非処理の細胞のパーセントとして表された。

【０１０８】その結果を表１に示す。値は、培地のみで処理された細胞の生存能力と等しい
ものを１００％とした生存可能な細胞の代謝活性のパーセントとして示される。

【０１０９】

【表１】ＮＤ：行なわず。

【０１１０】ＨｕＩＦＮαと共にインキュベートした肝細胞は、生存能力において有意的な
低下を示した。対照的に、ＩＦＮαアナログＩＦＮα−Ｎ０と共にインキュベー
トした細胞は、非処理の細胞と比較して、本質的に生存能力の減少は示さなかっ
た。

【０１１１】（実施例３）（単核細胞におけるＩＦＮαアナログのインビトロ毒性）ＨｕＩＦＮα、ＯｖＩＦＮτ、およびＩＦＮα−Ｎ０からＩＦＮα−Ｎ７（配
列番号１０から配列番号１７；図１）までのヒトＩＦＮαアナログのインビトロ
での毒性を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて比較した。全血液のバフィコ
ート画分をＰＢＳで１：４に希釈し、そしてＮｙｃｏｐｒｅｐ１．０７７（Ｎ
ｙｃｏｍｅｄＰｈａｒｍａ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）上にオーバーレイした
。６００×ｇで、２０℃、２０分間遠心分離後、界面にバンドを形成しているＰ
ＢＣＭをピペットを用いて取り除いた。細胞をＰＢＳで一度洗浄し、そして９６
ウェルプレートに２×１０⁵細胞／ウェルの濃度でプレートした。次の日、細胞を２，０００Ｕ／ｍｌから１２８，０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮα、ＩＦＮτまたは
ＩＦＮαアナログで処置した。７日間のインキュベート後、テトラゾリウム塩Ｗ
ＳＴ−１（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を各ウェルに添加した。
生存可能な細胞の割合を、４５０ｎｍの吸収により測定し、インターフェロン非
処理の細胞の割合として表した。

【０１１２】その結果を、表２に示した。値は、培地のみで処理された細胞の生存能力と等
しいものを１００％とした生存可能な細胞の代謝活性のパーセントとして示され
る。

【０１１３】

【表２】ＮＤ：行なわず。

【０１１４】ＨｕＩＦＮαと共にインキュベートしたＰＢＭＣは、生存能力において有意的
な低下を示した。対照的に、ＯｖＩＦＮτと共に、またはヒトＩＦＮαアナログ
であるＩＦＮα−Ｎ０、ＩＦＮα−Ｎ５、ＩＦＮα−Ｎ６、およびＩＦＮα−Ｎ
７と共にインキュベートした細胞は、７日間のインキュベート後、本質的に生存
能力の減少を示さなかった。ＨｕＩＦＮαに対して観察されたものと同様の生存
能力の低下は、ＩＦＮαアナログであるＩＦＮα−Ｎ１およびＩＦＮα−Ｎ３と
共にインキュベートされた細胞において観察された。ＩＦＮαアナログであるＩ
ＦＮα−Ｎ４と共にインキュベートされた細胞は、ＨｕＩＦＮαと共にインキュ
ベートされた細胞より、生存能力においてわずかな増加を示した。

【０１１５】本発明は、特定の方法および実施態様を参照して共に記述されたが、本発明か
ら逸脱することなく、様々な修正および変更がされ得ることが理解される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、成熟ＨｕＩＦＮα、成熟ＯｖＩＦＮτ、およびＩＦＮα−Ｎ０からＩ
ＦＮα−Ｎ７に表される８つの成熟ＨｕＩＦＮαアナログの最初の２７Ｎ末端ア
ミノ酸のアライメントを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 37/06 Ａ６１Ｋ 37/66 Ｆ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ポンザー，キャロルエイチ. アメリカ合衆国メリーランド 20905, シルバースプリングス，ピッピングロックドライブ 215 (72)発明者ビラレテ，ロアリーエイチ. アメリカ合衆国カリフォルニア 94501, アラメダ，ショアラインドライブ 2485 (72)発明者キャンポス，ジャクリーンアメリカ合衆国カリフォルニア 94565, ピッツバーグ，オリンダサークル 14 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 BA44 DA22 MA52 MA66 NA07 ZB072 ZB112 4H045 AA10 AA20 AA30 DA16 EA22 EA28 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトＩＦＮαの毒性を減少させるための方法であって、成熟
ヒトＩＦＮα配列の２２番目のアミノ酸ならびに、１９番目、２０番目、２４番
目、および２７番目のアミノ酸のうち１以上のアミノ酸を、培養物中の単核細胞
内のＩＦＮαの特異的な毒性を実質的に減少させるために効果的なアミノ酸での
置換する工程であって、ここで、１〜２７番目のアミノ酸の大部分は天然ヒトＩ
ＦＮαアミノ酸である工程、を包含する方法。
【請求項２】請求項１に記載の方法であって、ここで、前記置換する工程
は、前記の成熟ヒトＩＦＮα配列の１９番目、２０番目、２２番目、および２７
番目のアミノ酸のうち、１以上のアミノ酸を非保存的アミノ酸で置換する工程を
包含する、方法。
【請求項３】請求項１に記載の方法であって、ここで、前記置換する工程
が、以下の置換工程、（ａ）１９番目のアミノ酸をクラスＩＩＩのアミノ酸で置換する工程；（ｂ）２０番目のアミノ酸をクラスＩＶのアミノ酸で置換する工程；（ｃ）２２番目のアミノ酸をクラスＩＩＩのアミノ酸で置換する工程；（ｄ）２４番目のアミノ酸をクラスＶのアミノ酸で置換する工程；および、（ｅ）２７番目のアミノ酸をクラスＩＶのアミノ酸で置換する工程、のうちの１つ以上を包含する、方法。
【請求項４】請求項１に記載の方法であって、ここで前記置換する工程が
、以下の置換工程、（ａ）１９番目のアミノ酸をＡｓｐで置換する工程；（ｂ）２０番目のアミノ酸をＡｒｇで置換する工程；（ｃ）２２番目のアミノ酸をＡｓｎで置換する工程；（ｄ）２４番目のアミノ酸をＬｅｕで置換する工程；および、（ｅ）２７番目のアミノ酸をＨｉｓで置換する工程、のうちの１つ以上を包含する、方法。
【請求項５】請求項１に記載の方法であって、ここで、前記置換する工程
が、以下の置換工程、（ａ）成熟ヒトＩＦＮα配列の１９〜２７番目の位置を、配列番号２に規定され
る９マーにより置換する工程；（ｂ）成熟ヒトＩＦＮα配列の１１〜２７番目の位置を、配列番号４に規定され
る１７マーにより置換する工程；（ｃ）成熟ヒトＩＦＮα配列の６〜２７番目の位置を、配列番号６に規定される
２２マーにより置換する工程；からなる群から選択される置換工程により達成される、方法。
【請求項６】請求項１に記載の方法であって、ここで、成熟ヒトＩＦＮα
配列の２８〜１６６番目の位置は実質的に不変である、方法。
【請求項７】ヒト治療で使用される低毒性のヒトＩＦＮαアナログであっ
て、請求項１に記載の方法に従って前記アミノ酸を置換する工程により調製され
た、１以上の置換されたアミノ酸を有する成熟ヒトＩＦＮαを包含する、低毒性
のヒトＩＦＮαアナログ。
【請求項８】請求項７に記載のアナログであって、ここで、前記置換され
たアミノ酸が１９番目、２０番目、２２番目および、２７番目の１以上の位置に
おいて非保存的アミノ酸である、アナログ。
【請求項９】請求項７に記載のアナログであって、ここで、前記置換する
工程が、以下の置換工程、（ａ）１９番目のアミノ酸をクラスＩＩＩのアミノ酸で置換する工程；（ｂ）２０番目のアミノ酸をクラスＩＶのアミノ酸で置換する工程；（ｃ）２２番目のアミノ酸をクラスＩＩＩのアミノ酸で置換する工程；（ｄ）２４番目のアミノ酸をクラスＶのアミノ酸で置換する工程；および、（ｅ）２７番目のアミノ酸をクラスＩＶのアミノ酸で置換する工程、のうちの１つ以上を包含する、アナログ。
【請求項１０】請求項７に記載のアナログであって、ここで、前記置換す
る工程が、以下の置換工程、（ａ）１９番目のアミノ酸をＡｓｐで置換する工程；（ｂ）２０番目のアミノ酸をＡｒｇで置換する工程；（ｃ）２２番目のアミノ酸をＡｓｎで置換する工程；（ｄ）２４番目のアミノ酸をＬｅｕで置換する工程；および、（ｅ）２７番目のアミノ酸をＨｉｓで置換する工程、のうちの１つ以上を包含する、アナログ。
【請求項１１】請求項７に記載のアナログであって、ここで、前記置換す
る工程が、以下の置換工程、（ａ）成熟ヒトＩＦＮα配列の１９〜２７番目の位置を、配列番号２に規定され
る９マーにより置換する工程；（ｂ）成熟ヒトＩＦＮα配列の１１〜２７番目の位置を、配列番号４に規定され
る１７マーにより置換する工程；（ｃ）成熟ヒトＩＦＮα配列の６〜２７番目の位置を、配列番号６に規定される
２２マーによるりする工程；からなる群から選択される置換工程により達成される、アナログ。
【請求項１２】請求項７に記載のアナログであって、ここで、成熟ヒトＩ
ＦＮα配列の２８〜１６６番目の位置が実質的に不変である、アナログ。
【請求項１３】ウィルスの複製を阻害する方法であって、ウィルスに感染
した細胞に、該細胞内におけるウィルスの複製を阻害する有効濃度の請求項７に
記載の低毒性のヒトＩＦＮαアナログを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１４】腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、腫瘍細胞に、該
腫瘍細胞の増殖を阻害する有効濃度の請求項７に記載の低毒性のヒトＩＦＮαア
ナログを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１５】自己免疫疾患の治療が必要な被験体における自己免疫疾患
の処置の方法であって、該被験体に、請求項７に記載の低毒性のヒトＩＦＮαア
ナログの有効量を投与する工程を含有する、方法。
【請求項１６】慢性炎症の治療が必要な被験体における慢性炎症の処置の
方法であって、該被験体に、請求項７に記載の低毒性のヒトＩＦＮαアナログの
有効量を投与する工程を含有する、方法。
【請求項１７】ＩＦＮαの静脈投与に応答する疾患状態の処置の方法であ
って、経口投与による、請求項７に記載の低毒性のヒトＩＦＮαアナログの有効
量を投与する工程を含有する、方法。