ES2243990T3 - Composicion de interferon hibrido y procedimiento de uso. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE POLIPEPTIDOS HIBRIDOS DE FUSION DEL INTERFERON, FORMADOS POR UN PRIMER SEGMENTO QUE CONTIENE LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS N - TERMINAL DE UN POLIPEPTIDO INTERFERON - TAU, Y UN SEGUNDO SEGMENTO QUE CONTIENE LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS C - TERMINAL DE UN POLIPEPTIDO TIPO I DE INTERFERON NO - TAU. LOS DOS SEGMENTOS SE UNEN EN LA REGION DE UN POLIPEPTIDO DE INTERFERON MADURO ENTRE LOS RESIDUOS 8 Y 37 APROXIMADAMENTE. TAMBIEN SE DESCRIBEN SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICAN DICHOS POLIPEPTIDOS DE FUSION DEL INTERFERON, VECTORES DE EXPRESION QUE CONTIENEN TALES SECUENCIAS Y APLICACIONES TERAPEUTICAS DE LOS POLIPEPTIDOS DE FUSION DEL INTERFERON. LAS APLICACIONES TERAPEUTICAS INCLUYEN APLICACIONES DE PROLIFERACION ANTIVIRAL Y ANTICELULAR. UNA VENTAJA DE LOS POLIPEPTIDOS DE FUSION DEL INTERFERON DE LA PRESENTE INVENCION ES QUE CARECEN DE EFECTOS SECUNDARIOS CITOTOXICOS CUANDO SE UTILIZAN PARA TRATAR CELULAS.

Description

Composiciones de interferón híbrido y procedimientos de uso.

La presente invención se refiere a un polipéptido de fusión de interferón híbrido constituido por una región o regiones derivadas a partir de interferón-\tau y una región o regiones derivadas a partir de otro interferón.

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Las membranas de embrión o trofectodermo de diversos mamíferos producen señales bioquímicas que permiten el establecimiento y mantenimiento de la gestación (Bazer, y col., 1983). Una de estas proteínas, la proteína de trofoblasto ovina (oTP-1), se identificó como una proteína de bajo peso molecular secretada por embriones de oveja entre los días 10 y 12 de gestación (Wilson, y col., 1979; Bazer, y col., 1986). Se demostró que la proteína oTP-1 inhibía la secreción uterina de prostaglandina F_{2}-alfa que hace que el cuerpo lúteo en el ovario sufra la desaparición fisiológica y endocrinológica en ovejas sin preñar (Bazer, y col., 1986). Por consiguiente, oTP-1 tiene actividad biológica antiluteolítica. Se asumió que la principal función de oTP-1 estaba asociada con el establecimiento de la gestación.

Se encontró posteriormente que oTP-1 (i) muestra una homología limitada (50-70%) con los interferones alfa (IFN\alpha) de diversas especies (Imakawa, y col., 1987), y (ii) se une a un receptor de interferón de tipo I (Stewart, y col., 1987). A pesar de algunas semejanzas con el IFN\alpha, oTP-1 tiene varias características que la distinguen del IFN\alpha incluyendo las siguientes: la función de oTP-1 en la bioquímica de la reproducción (no se sabe que otros interferones tengan ninguna función en la regulación bioquímica del ciclo reproductivo), la fuente celular de oTP-1, células de trofoblasto (el IFN\alpha deriva de linfocitos), el tamaño de oTP-1, 172 aminoácidos (típicamente el IFN\alpha tiene aproximadamente 165-166 aminoácidos) y oTP-1 es débilmente inducible por virus (IFN\alpha es altamente inducible por virus). La Sociedad Internacional de Interferón reconoce a oTP-1 como perteneciente a una nueva clase completamente nueva de interferones que se ha denominado interferón tau (IFN\tau). La letra griega \tau significa trofoblasto.

Los interferones se han clasificado dentro de dos grupos distintos: interferones de tipo I, que incluye IFN\alpha, IFN\beta e IFN\omega (también conocido como IFN\alphaII); e interferones de tipo II, representado por IFN\gamma (revisado por DeMaeyer, y col., 1988). En humanos se estima que hay al menos 17 genes no alélicos de IFN\alpha, al menos aproximadamente 2 ó 3 genes no alélicos de IFN\beta y un único gen de IFN\gamma.

Se ha demostrado que los IFN\alpha inhiben la proliferación de diversos tipos celulares. Los IFN\alpha son especialmente útiles contra tumores malignos hematológicos tal como leucemia por tricoleucitos (Quesada, y col., 1984). Se ha demostrado además que estas proteínas tienen también actividad contra mieloma múltiple, leucemia linfocítica crónica, linfoma de bajo grado, sarcoma de Kaposi, leucemia mielógena crónica, carcinoma de células renales, tumores de vejiga urinaria y cánceres de ovario (Bonnem, y col., 1984; Oldham, 1985). Se ha investigado también la función de los interferones y receptores de interferón en la patogénesis de ciertas enfermedades autoinmunes e inflamatorias (Benoit, y col., 1993).

Los IFN\alpha son también útiles contra diversos tipos de infecciones víricas (Finter, y col., 1991). Los interferones alfa han mostrado actividad contra la infección por papilomavirus humano e infecciones por hepatitis B y hepatitis C (Finter, y col., 1991; Kashima, y col., 1988; Dusheiko, y col., 1986; Davis, y col., 1989).

De modo significativo, sin embargo, la utilidad de los IFN\alpha se ha visto limitada por su toxicidad: el uso de interferones en el tratamiento del cáncer y enfermedades víricas ha tenido como resultado serios efectos secundarios, tales como fiebre, escalofríos, anorexia, pérdida de peso y fatiga (Pontzer, y col., 1991; Oldham, 1985). Estos efectos secundarios a menudo requieren (i) reducir la dosificación de interferón a niveles que están en el límite de eficacia del tratamiento, o (ii) la retirada al paciente del tratamiento. Esta toxicidad ha reducido la utilidad de estas potentes proteínas antivíricas y antiproliferativas en el tratamiento de enfermedades debilitantes humanas y animales.

En un aspecto, la invención incluye una molécula de ácido nucleico quimérica que codifica un polipéptido de fusión de interferón híbrido. La molécula está formada por un segmento terminal 5' que codifica la secuencia de aminoácidos N-terminal de un polipéptido de interferón tau y un segmento terminal 3' que codifica la secuencia de aminoácidos C-terminal de un polipéptido de interferón de tipo I no tau. Los dos segmentos se ayustan en una región que corresponde con la porción en el resto 28 de un polipéptido de interferón maduro. Ejemplos de polipéptidos de interferones de tipo I no tau incluyen interferón alfa e interferón beta. En una realización, el segmento terminal 5' además incluye una secuencia líder.

El segmento terminal 3' puede codificar, en diversas realizaciones, una secuencia de aminoácidos derivada de un interferón alfa 1, alfa 2, beta u omega. El segmento terminal 3' también puede codificar una secuencia consenso de cualquiera de los anteriores o una secuencia internamente consistente. Las realizaciones preferidas son aquellas donde la secuencia deriva de una fuente humana, tal como un IFN\alpha humano o un IFN\beta humano.

En otras realizaciones generales, el polipéptido de interferón tau puede ser un polipéptido de interferón tau de humano o rumiante (por ejemplo, ovino), y el polipéptido de interferón de tipo I no tau puede así mismo ser un polipéptido de interferón de tipo I humano o no humano. En una realización preferida, el polipéptido de interferón tau es un polipéptido de interferón tau ovino, y el polipéptido de interferón de tipo I no tau es un polipéptido de tipo I humano.

Un ejemplo de molécula quimérica de ácido nucleico de la presente invención es la ID. SEC. Nº: 54, con un segmento terminal 5' que codifica los aminoácidos 1-28 del IFNtau humano (de ID. SEC. Nº: 3) y un segmento terminal 3' que codifica los aminoácidos 29-166 del IFN\alpha humano (clon pIFN105; Genbank HUMIFNN Nº Acc. M28585).

Cualquiera de las moléculas quiméricas de ácido nucleico descritas anteriormente puede además incluir una secuencia líder.

En un aspecto relacionado, la invención incluye un polipéptido de fusión de interferón híbrido formado por un primer segmento que contiene la secuencia de aminoácidos N-terminal de un polipéptido de interferón tau y un segundo segmento que contiene la secuencia de aminoácidos C-terminal de un polipéptido de interferón de tipo I no tau. Los dos segmentos se unen en la región del resto 28 de un polipéptido de interferón maduro. Las realizaciones específicas son como se ha descrito anteriormente para las moléculas de ácido quiméricas. Interferón-\alpha e interferón-\beta son ejemplos de estos interferones de tipo I no tau. Estas fusiones de híbrido pueden usarse para reducir la toxicidad de los interferones de tipo I no tau cuando los interferones se usan en formulaciones farmacéuticas o en aplicaciones terapéuticas.

El primer segmento puede tener, en diversas realizaciones, una secuencia de aminoácidos contenida en una secuencia seleccionada entre el grupo formado por ID. SEC. Nº: 5, ID. SEC. Nº: 15, ID. SEC. Nº: 45, ID. SEC. Nº: 46, ID. SEC. Nº: 47, ID. SEC. Nº: 48, ID. SEC. Nº: 49, ID. SEC. Nº: 50, ID. SEC. Nº: 51, ID. SEC. Nº: 52 y ID. SEC. Nº: 53. Realizaciones preferidas son aquellas donde la secuencia corresponde a un interferón tau humano, tal como la ID. SEC. Nº: 15 o ID. SEC. Nº: 35.

En otro aspecto, la presente invención incluye un vector de expresión que tiene un ácido nucleico que contiene un marco de lectura abierto (ORF) que codifica un polipéptido de fusión de interferón híbrido, que incluye las secuencias de ácido nucleico y polipéptido descritas anteriormente. El vector además incluye secuencias reguladoras eficaces para expresar el marco de lectura abierto en una célula hospedadora: tales secuencias pueden ser endógenas (tales como las secuencias líder de IFN de origen natural) o heterólogas (tales como una señal secretora reconocida por levaduras, células de mamífero, células de insecto, cultivos tisulares o sistemas de expresión bacteriana). En el vector de expresión, las secuencias reguladoras pueden también incluir en 5' de dicha secuencia de ácido nucleico, una región promotora y un codon de inicio ATG en marco con el polipéptido de fusión de interferón híbrido que codifica la secuencia (molécula de ácido nucleico quimérica) y en 3' de dicha secuencia codificadora, una señal de terminación de la traducción seguida de una señal de terminación de la transcripción. Adicionalmente, la invención incluye un procedimiento para producir de forma recombinante un polipéptido de fusión de interferón híbrido usando los vectores de expresión de la presente invención. Los vectores de expresión se introducen en células hospedadoras adecuadas. Entonces, las células hospedadoras se cultivan en condiciones que dan lugar a la expresión de la secuencia ORF.

En una realización adicional, la invención incluye un procedimiento para producir de forma recombinante un polipéptido de fusión de interferón híbrido. En el procedimiento, el vector de expresión, que contiene secuencias que codifican el marco de lectura abierto (ORF) de un polipéptido de fusión de interferón híbrido, se introduce en células hospedadoras adecuadas, donde el vector se diseña para expresar el ORF en las células hospedadoras. Las células hospedadoras transformadas son entonces cultivadas en condiciones que tienen como resultado la expresión de la secuencia de ORF. Numerosos vectores y sus correspondientes hospedadores son útiles en la práctica de este procedimiento de la invención, incluyendo, el vector de fago lambda gt11 y células de E. coli. Otras células hospedadoras incluyen, levaduras, células de mamífero, células de insecto, cultivos tisulares, cultivo de células vegetales, plantas transgénicas o sistemas de expresión bacterianos.

La invención además incluye una composición farmacéutica para inhibir el crecimiento de células tumorales por medio del cual las células tumorales se ponen en contacto con un polipéptido de fusión de interferón híbrido a una concentración eficaz para inhibir el crecimiento de las células tumorales. El polipéptido de fusión de interferón híbrido puede ser parte de cualquier formulación farmacológica aceptable. Las células tumorales cuyo crecimiento se puede inhibir por un polipéptido de fusión de interferón híbrido incluyen, aunque sin limitación, células de carcinoma, células de cáncer hematopoyético, células de leucemia, células de linfoma y células de melanoma. En una realización, las células tumorales son células tumorales sensibles a esteroides, por ejemplo, células de tumor mamario.

Aún en otro aspecto de la presente invención, los polipéptidos de fusión de interferón híbrido se usan para inhibir la replicación vírica por medio del cual las células infectadas con un virus se ponen en contacto con el polipéptido de fusión de interferón híbrido a una concentración eficaz para inhibir la replicación vírica en dichas células. El polipéptido de fusión de interferón híbrido puede ser parte de cualquier formulación farmacológica aceptable. La replicación tanto de virus de ARN como de ADN puede inhibirse por polipéptidos de fusión de interferón híbrido. Ejemplos de virus de ARN incluyen, virus de leucemia felina, virus de la neumonía progresiva ovina, lentivirus ovino, virus de la anemia infecciosa equina, virus de la inmunodeficiencia bovina, virus visna-maedi, virus de la artritis encefalitis caprina, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o virus de la hepatitis C (VHC). Un ejemplo de virus de ADN es el virus de la hepatitis B (VHB).

Aún en otro aspecto, la presente invención incluye una composición farmacéutica para tratar una enfermedad autoinmune en un sujeto que necesita de este tratamiento. En una realización, la enfermedad autoinmune es la esclerosis múltiple. La composición farmacéutica a administrar al sujeto contiene, una cantidad farmacéuticamente eficaz de un polipéptido de fusión de interferón híbrido. El interferón híbrido (IFNhib) puede administrarse, por ejemplo, por vía oral o por vía intravenosa o por inyección intramuscular. El IFNhib administrado por vía oral es preferiblemente ingerido por el sujeto.

Otras realizaciones de la invención incluyen un procedimiento para el tratamiento del lupus eritematoso, diabetes tipo I y artritis reumatoide en un sujeto que necesita de este tratamiento. El procedimiento incluye administrar, al sujeto, una cantidad farmacéuticamente eficaz de un polipéptido de fusión de interferón híbrido de la presente invención.

Estos y otros objetivos y características de la invención se apreciarán más completamente cuando se lea la siguiente descripción detallada de la invención junto con los dibujos que la acompañan.

Breve descripción de las Figuras

Las Figuras 1A, 1B, 1C, 1D y 1E presentan la secuencia codificadora de ácido nucleico de un gen sintético de OvIFN\tau diseñado para incluir 19 únicos sitios para enzimas de restricción colocados uniformemente a través de la secuencia codificadora.

La Figura 2 muestra la estrategia de clonación usada para fabricar un gen sintético que codifica OvIFN\tau.

La Figura 3 muestra una comparación de la secuencia proteica predicha de un gen de interferón-\tau humano y un gen de interferón-\tau ovino. Los aminoácidos divergentes se indican mediante la presentación del aminoácido alternativo en la línea bajo las secuencias de ácido nucleico.

La Figura 4 presenta los datos que demuestran que tanto OvIFN\tau como IFN\alpha eran capaces de reducir drásticamente el crecimiento de células HL-60.

La Figura 5 presenta los datos que demuestran que rHuIFN\alpha es citotóxico y OvIFN\tau no lo es. En la figura, se presentan los resultados de uno de tres experimentos repetidos como la media del % de viabilidad \pm DE.

La Figura 6 presenta las secuencias de polipéptidos derivada de la secuencia de IFN\tau.

La Figura 7 presenta la secuencia de ácido nucleico y de aminoácidos completa de una secuencia de OvIFN\tau.

La Figura 8 presenta los datos que apoyan la falta de citotoxicidad, relativo a IFN\alpha, cuando IFN\tau se usa para tratar células mononucleares de sangre periférica.

La Figura 9 muestra los resultados del tratamiento de una línea de linfoma de linfocitos T cutáneas humano, HUT 78, con IFN\tau.

La Figura 10 muestra los resultados del tratamiento de una línea de linfoma de linfocitos T humana, H9, con IFN\tau.

La Figura 11A presenta los datos de la inhibición de péptido, relativo a la replicación del VIF (virus de la inmunodeficiencia felina), de polipéptidos derivados de OvIFN\tau con OvIFN\tau completo. La Figura 11B presenta los datos para la inhibición de péptido, relativo a la replicación de VIH (virus de la inmunodeficiencia humana), de polipéptidos derivados de OvIFN\tau con OvIFN\tau completo.

La Figura 12 presenta los datos que demuestran la inhibición de la actividad antivírica de IFN\tau por péptidos derivados de IFN\tau.

La Figura 13 presenta los datos que demuestran la inhibición por péptidos derivados de IFN\tau de la actividad antivírica de OvIFN\tau.

La Figura 14 presenta los datos que demuestran la inhibición por péptidos derivados de IFN\tau de la actividad antivírica de IFN\alpha bovino.

La Figura 15 presenta los datos que demuestran la inhibición por péptidos derivados de IFN\tau de la actividad antivírica de IFN\alpha humano.

La Figura 16 presenta los datos que evalúan la falta de inhibición de péptidos derivados de IFN\tau de la actividad antivírica de IFN\gamma bovino.

La Figura 17 presenta los datos que demuestran la inhibición por antisueros antipéptidos derivados de IFN\tau de la actividad antivírica de IFN\tau.

La Figura 18 presenta los datos que demuestran la inhibición por antisueros antipéptidos derivados de IFN\tau de la unión de IFN\tau marcado radioactivamente a células.

Las Figuras 19A y 19B presentan un alineamiento de secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos de IFN\tau.

Las Figuras 20A y 20B presentan un alineamiento de secuencias de aminoácidos de polipéptidos de IFN\tau.

La Figura 21 presenta los datos que comparan la citotoxicidad de IFN\tau con IFN\beta.

Las Figuras 22A y 22B muestran los perfiles de citotoxicidad de IFN\alphaA (Figura 22A) e IFN\tau (Figura 22B) en células MDBK.

Las Figuras 23A y 23B muestran el efecto de IFN\tau sobre la citotoxicidad de IFN\alphaA en células MDBK.

Las Figuras 24A y 24B muestran la unión de ^{125}I-IFN\tau (Figura 24A) y ^{125}I-IFN\alphaA (Figura 24B) a células MDBK, así como las gráficas de Scatchard de los datos de unión.

Las Figuras 25A y 25B muestran la unión competitiva de IFN\tau (Figura 25A) e IFN\alphaA (Figura 25B) a células MDBK.

La Figura 26 muestra la inhibición de la unión de IFN\tau e IFN\alphaA a células MDBK por antisueros contra el extremo N-terminal (barras rellenas) y C-terminal (barras rayadas) del IFN\tau con respecto a controles preinmunotratados (barras abiertas).

Las Figuras 27A y 27B muestran las curvas dosis- respuesta/ocupación para IFN\tau (Figura 27A) e IFN\alphaA (Figura 27B) en células MDBK de porcentaje de actividad antivírica máxima (\circ), citotoxicidad (\Box) y unión (\diamondsuit).

La Figura 28 muestra un esquema de un polipéptido de fusión de interferón híbrido.

Breve descripción de las secuencias

La ID. SEC. Nº: 1 es la secuencia de nucleótidos de un gen sintético que codifica el interferón-\tau ovino (OvIFN\tau). También se muestra la secuencia de aminoácidos codificada.

La ID. SEC. Nº: 2 es una secuencia de aminoácidos de una proteína OvIFN\tau madura.

La ID. SEC. Nº: 3 es una secuencia de nucleótidos sintética que codifica una proteína de IFN-\tau humana (HuIFN\tau) humano.

La ID. SEC. Nº: 4 es una secuencia de aminoácidos para una proteína de HuIFN\tau1 madura.

La ID. SEC. Nº: 5 es la secuencia de aminoácidos del fragmento 1-37 de la ID. SEC. Nº: 2.

La ID. SEC. Nº: 6 es la secuencia de aminoácidos del fragmento 34-64 de la ID. SEC. Nº: 2.

La ID. SEC. Nº: 7 es la secuencia de aminoácidos del fragmento 62-92 de la ID. SEC. Nº: 2.

La ID. SEC. Nº: 8 es la secuencia de aminoácidos del fragmento 90-122 de la ID. SEC. Nº: 2.

La ID. SEC. Nº: 9 es la secuencia de aminoácidos del fragmento 119-150 de la ID. SEC. Nº: 2.

La ID. SEC. Nº: 10 es la secuencia de aminoácidos del fragmento 139-172 de la ID. SEC. Nº: 2.

La ID. SEC. Nº: 11 es la secuencia de nucleótidos de un gen de HuIFNt1 natural con una secuencia líder.

La ID. SEC. Nº: 12 es la secuencia codificada predicha de aminoácidos de la ID. SEC. Nº: 11.

La ID. SEC. Nº: 13 es un oligonucleótido sintético 25-mérico según la invención en cuestión.

La ID. SEC. Nº: 14 es un oligonucleótido sintético 25-mérico según la invención en cuestión.

La ID. SEC. Nº: 15 es la secuencia de aminoácidos del fragmento 1-37 de la ID. SEC. Nº: 4.

La ID. SEC. Nº: 16 es la secuencia de aminoácidos del fragmento 34-64 de la ID. SEC. Nº: 4.

La ID. SEC. Nº: 17 es la secuencia de aminoácidos del fragmento 62-92 de la ID. SEC. Nº: 4.

La ID. SEC. Nº: 18 es la secuencia de aminoácidos del fragmento 90-122 de la ID. SEC. Nº: 4.

La ID. SEC. Nº: 19 es la secuencia de aminoácidos del fragmento 119-150 de la ID. SEC. Nº: 4.

La ID. SEC. Nº: 20 es la secuencia de aminoácidos del fragmento 139-172 de la ID. SEC. Nº: 4.

La ID. SEC. Nº: 21 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HuIFN\tau6.

La ID. SEC. Nº: 22 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por la secuencia representada como ID. SEC. Nº: 21.

La ID. SEC. Nº: 23 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HuIFN\tau7.

La ID. SEC. Nº: 24 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por la secuencia representada como ID. SEC. Nº: 23.

La ID. SEC. Nº: 25 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HuIFN\tau4.

La ID. SEC. Nº: 26 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por la secuencia representada como ID. SEC. Nº: 25.

La ID. SEC. Nº: 27 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HuIFN\tau5.

La ID. SEC. Nº: 28 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por la secuencia representada como ID. SEC. Nº: 27.

La ID. SEC. Nº: 29 es la secuencia de nucleótidos del ADNc de HuIFN\tau2.

La ID. SEC. Nº: 30 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por la secuencia representada como ID. SEC. Nº: 29.

La ID. SEC. Nº: 31 es la secuencia de nucleótidos, incluyendo la secuencia líder, del clon HuIFN\tau3 de ADN genómico, un gen HuIFN\tau natural.

La ID. SEC. Nº: 32 es la secuencia de aminoácidos predicha (incluyendo la secuencia líder) codificada por la secuencia representada como ID. SEC. Nº: 31.

La ID. SEC. Nº: 33 es la secuencia de nucleótidos, excluyendo la secuencia líder, del clon HuIFN\tau3 de ADN genómico, un gen de HuIFN\tau natural.

La ID. SEC. Nº: 34 es la secuencia de aminoácidos predicha de una proteína de IFN\tau humano madura codificada por HuIFN\tau3, codificada por la secuencia representada como ID. SEC. Nº: 33.

La ID. SEC. Nº: 35 es la secuencia de aminoácidos del fragmento 1-37 de la ID. SEC. Nº: 33.

La ID. SEC. Nº: 36 es la secuencia de aminoácidos del fragmento 34-64 de la ID. SEC. Nº: 33.

La ID. SEC. Nº: 37 es la secuencia de aminoácidos del fragmento 62-92 de la ID. SEC. Nº: 33.

La ID. SEC. Nº: 38 es la secuencia de aminoácidos del fragmento 90-122 de la ID. SEC. Nº: 33.

La ID. SEC. Nº: 39 es la secuencia de aminoácidos del fragmento 119-150 de la ID. SEC. Nº: 33.

La ID. SEC. Nº: 40 es la secuencia de aminoácidos del fragmento 139-172 de la ID. SEC. Nº: 33.

La ID. SEC. Nº: 41 es la secuencia de aminoácidos del fragmento 1-23 de la ID. SEC. Nº: 32.

La ID. SEC. Nº: 42 es la secuencia de aminoácidos del fragmento 1-23 de la ID. SEC. Nº: 11.

La ID. SEC. Nº: 43 es la secuencia de nucleótidos, excluyendo la secuencia líder, del clon HuIFN\tau1 de ADN.

La ID. SEC. Nº: 44 es la secuencia de aminoácidos predicha de una proteína de IFN\tau humano madura codificada por HuIFN\tau1, codificada por la secuencia representada como ID. SEC. Nº: 43.

La ID. SEC. Nº: 45 es la secuencia de aminoácidos predicha del fragmento 1-37 (secuencia madura) a partir de la secuencia A40068 (Bin 12, Nº de acceso gi 108955), que codifica la TP-1 bovina (clon bTP509).

La ID. SEC. Nº: 46 es la secuencia de aminoácidos predicha del fragmento 1-37 (secuencia madura) a partir de la secuencia BovTPH1Bcds1 (Bin 13, Nº de acceso gi 163767), que codifica la TP-1 bovina.

La ID. SEC. Nº: 47 es la secuencia de aminoácidos predicha del fragmento 1-37 (secuencia madura) a partir de la secuencia BovTPH1Ccds1 (Bin 14, Nº de acceso gi 163769), que codifica la TP-1 bovina.

La ID. SEC. Nº: 48 es la secuencia de aminoácidos predicha del fragmento 1-37 (secuencia madura) a partir de la secuencia A39505 (Bin 15, Nº de acceso gi 163769), que codifica la TP-1 bovina (clon bTP4).

La ID. SEC. Nº: 49 es la secuencia de aminoácidos predicha del fragmento 1-37 (secuencia madura) a partir de la secuencia OATPIP5cds1 (Bin 16, Nº de acceso gi 1412), que codifica la TPp5 ovina.

La ID. SEC. Nº: 50 es la secuencia de aminoácidos predicha del fragmento 1-37 (secuencia madura) a partir de la secuencia OATPIP3cds1 (Bin 17, Nº de acceso gi 1410), que codifica la TPp3 ovina.

La ID. SEC. Nº: 51 es la secuencia de aminoácidos predicha del fragmento 1-37 (secuencia madura) a partir de la secuencia SHP010TPcds1 (Bin 18, Nº de acceso gi 165821), que codifica la TP-1 ovina.

La ID. SEC. Nº: 52 es la secuencia de aminoácidos predicha del fragmento 1-37 (secuencia madura) a partir de la secuencia SHP02TPcds1 (Bin 19, Nº de acceso gi 165823), que codifica la TP-1 ovina.

La ID. SEC. Nº: 53 es la secuencia de aminoácidos predicha del fragmento 1-37 (secuencia madura) a partir de la secuencia GOTCTPIcds1 (Bin 21, Nº de acceso gi 164117), que codifica la IFN tau de Capra hircus.

La ID. SEC. Nº: 54 es la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico quimérica derivada del ADN humano, con un segmento terminal 5' que codifica los aminoácidos 1-28 del IFNtau humano (a partir de la ID. SEC. Nº: 3) y un segmento terminal 3' que codifica los aminoácidos 29-166 del IFN\alpha humano (clon pIFN105; Genbank HUMIFNN Nº Acc. M28585).

ID. SEC. Nº: 55 es la secuencia de aminoácidos predicha de la ID. SEC. Nº: 54.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

Interferón-\tau (IFN\tau) se refiera a una cualquiera de las familias de proteínas de interferón que tiene una homología de aminoácido mayor del 70%, o preferiblemente mayor de aproximadamente el 80% o más preferiblemente mayor de aproximadamente el 90% de la secuencia presentada como (a) ID. SEC. Nº: 2 o (b) ID. SEC. Nº: 34. La homología de aminoácidos puede determinarse usando, por ejemplo, el programa LALING con los parámetros por defecto. Este programa se encuentra en el paquete de programas FASTA versión 1.7 de comparación de secuencias (Pearson y Lipman 1988; Pearson 1990; programa disponible en William R. Pearson, Department of Biological Chemistry, Box 440, Jordan Hall, Charlottesville, VA). Típicamente, el IFN\tau tiene al menos una característica del siguiente grupo de características: (a) se expresa durante las etapas embrionarias/fetales por el trofectodermo/placenta, (b) propiedades antiluteolíticas, (c) propiedades antivíricas y (d) propiedades antiproliferación celular. El IFN\tau puede obtenerse de varias fuentes incluyendo vacas, ovejas, buey y humanos.

Un polipéptido de interferón-\tau es un polipéptidos que tiene entre aproximadamente 15 y 172 aminoácidos derivado a partir de una secuencia que codifica los aminoácidos del interferón-\tau, donde dichos 15 a 172 aminoácidos son contiguos en el interferón-\tau nativo. Estas regiones de 15-172 aminoácidos pueden también ensamblarse en polipéptidos donde dos o más de estas regiones de interferón-\tau que están normalmente discontinuas en la proteína nativa se unen.

Una secuencia o fragmento polipeptídico "deriva de" otra secuencia o fragmento de polinucleótidos cuando contiene la misma secuencia de nucleótidos que la que está presente en la secuencia o fragmento de la cual deriva. Por ejemplo, un plásmido bacteriano contiene un inserto "derivado de" un gen humano seleccionado si la secuencia de polinucleótidos del inserto es la misma que la secuencia de polinucleótidos del gen humano seleccionado.

De modo similar, una secuencia o fragmento polipeptídico "deriva de" otra secuencia o fragmento polipeptídico cuando contiene la misma secuencia de aminoácidos que la que está presente en la secuencia o fragmento de la cual deriva.

El porcentaje (%) de identidad, con respecto a dos secuencias de aminoácidos, se refiere al % de restos que son idénticos en las dos secuencias cuando las secuencias están alineadas de forma óptima y no se da ninguna falta debida a "huecos". En otras palabras, si se necesita insertar un hueco en una primera secuencia para alinearla óptimamente con una segunda secuencia, el % de identidad se calcula usando sólo los restos que están apareados con un resto de aminoácido correspondiente (es decir, los cálculos no consideran restos de la segunda secuencia que están en el "hueco" de la primera secuencia). El alineamiento óptimo se define como el alineamiento que da el valor del % de identidad más alto. Tales alineamientos se pueden realizar usando el programa "GENEWORKS". Alternativamente, los alineamientos se pueden realizar usando el programa de alineamiento local LALING con un ktup de 1, los parámetros por defecto y el PAM por defecto.

Tratar una enfermedad se refiere a administrar una sustancia terapéutica eficaz para reducir los síntomas de la enfermedad y/o atenuar la gravedad de la enfermedad.

II. Aislamiento y caracterización del interferón-\tau A. Interferón-\tau ovino y bovino 1. Secuencias que codifican el interferón-\tau

El interferón-\tau ovino (OvIFN\tau) es una proteína secretora embrionaria importante producida por el trofectodermo embrionario durante el periodo crítico de reconocimiento materno en la oveja. Un OvIFN\tau maduro aislado es de 172 aminoácidos de longitud (ID. SEC. Nº: 2). La secuencia codificadora de ADNc contiene 23 aminoácidos adicionales en el extremo amino-terminal de la proteína madura (Imakawa, y col., 1987). La secuencia codificadora de este aislado de OvIFN\tau se presenta como la Figura 7.

Con respecto a otros interferones, oIFN\tau comparte aproximadamente del 45 al 68% de homología de aminoácidos con el interferón-\alpha y la mayor similitud de secuencia con el interferon-\omegas(IFN\omegas) de aproximadamente el 68%.

Para el aislamiento de la proteína OvIFN\tau, se cogieron embriones de ovejas preñadas y se cultivaron in vitro en Medio Esencial Mínimo modificado como se describe previamente (Godkin, y col., 1982). Los embriones se cogieron a distintos días de gestación, describiéndose el primer día de apareamiento como día 0. Se purificó OvIFN\tau a partir del medio de cultivo de los embriones, esencialmente como describen Vallet, y col., 1987 y Godkin, y col., 1982.

La homogeneidad de OvIFN\tau se evaluó por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE; Maniatis y col.; 1982; Ausubel y col., 1988). La determinación de la concentración de proteínas en las muestras de OvIFN\tau purificado se realizó usando el ensayo del ácido bicinconínico (BCA) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Smith, P.K. y col., 1985).

Una proteína homóloga a OvIFN\tau se aisló a partir de vacas (BoIFN\tau; Helmer, y col., 1987; Imakawa, y col., (1989). OvIFN\tau y BoIFN\tau (i) tienen funciones similares en el reconocimiento materno del embarazo y (ii) comparten un alto grado de homología de secuencia de aminoácidos y nucleótidos entre las proteínas maduras. La homología de secuencia de ácidos nucleicos entre OvIFN\tau y BoIFN\tau es del 76,3% para la región 5' no codificadora, 89,7% para la región codificadora y 91,9% para la región 3' no codificadora. La homología de la secuencia de aminoácidos es del 80,4%.

El ejemplo 1 describe las funciones reproductoras de OvIFN\tau. OvIFN\tau y el interferón-\alpha2 humano recombinante (rHuIFN\alpha) se infundieron en el lumen uterino de ovejas a distintas concentraciones. La vida útil del cuerpo lúteo se evaluó por el examen de los intervalos interestro, el mantenimiento de la secreción de progesterona y la inhibición de la secreción de prostaglandina (Davis, y col., 1992). La comparación de los datos resultantes de estos exámenes demostró una prolongación considerable de los intervalos interestro cuando se administraba OvIFN\tau a 100 \mug/día y ningún efecto significativo cuando se administró rHuIFN\alpha. Estos datos apoyan la conclusión de que OvIFN\tau influye significativamente en los sucesos bioquímicos del ciclo estral.

También se examinaron las propiedades antivíricas del interferón-\tau en diversas etapas del ciclo reproductor (Ejemplo 2). Se establecieron cultivos embrionarios usando embriones obtenidos a partir de ovejas en los días 12 a 16 del ciclo estral. Se evaluó la actividad antivírica del sobrenadante de cada cultivo embrionario. Los sobrenadantes de los cultivos incrementaron la actividad antivírica asociada con el desarrollo avanzado del embrión hasta el día 16 tras el estro.

2. Producción recombinante de IFN\tau

El OvIFN\tau recombinante se produjo usando linfocitos Bacterianas y de levadura. Se usó la secuencia codificadora de aminoácidos de OvIFN\tau para generar una secuencia codificadora de ADN correspondiente con el uso de codones optimizados para la expresión en E. coli (Ejemplo 3). La secuencia codificadora de ADN se construyó de forma sintética mediante la adición secuencial de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos clonados se fusionaron en un único polinucleótido usando las digestiones de restricción y ligamientos esquematizados en la Figura 2. La secuencia codificadora de polinucleótidos tenía la secuencia presentada como ID. SEC. Nº: 1.

Para la expresión de polipéptidos de interferón recombinante, tales como OvIFN\tau sintético o los polipéptidos de fusión de interferón híbrido de la presente invención, la secuencia codificadora quimérica puede situarse en varios vectores de expresión bacterianos: por ejemplo, lambda gt1 (Promega, Madison WI); pGEX (Smith, D.B. y col., 1988); pGEMEX (Promega) y pBS (Stratagene, La Jolla CA). También pueden usarse otros vectores de expresión bacterianos que contienen promotores adecuados, tales como el promotor de la ARN polimerasa de T7 o el promotor tac. La clonación del polinucleótido sintético de OvIFN\tau en un vector de expresión pIN III omp-A modificado se describe en el Ejemplo 3. La producción de la proteína OvIFN\tau se inducía por la adición de IPTG. El IFN\tau recombinante soluble se liberó de las células por sonicación o fraccionamiento osmótico.

La proteína puede purificarse adicionalmente por procedimientos convencionales, incluyendo fraccionamiento por tamaño (cromatografía en columna o electroforesis en gel preparativo) o cromatografía de afinidad usando, por ejemplo, anticuerpos anti-interferón (soporte sólido disponible en Pharmacia, Piscataway NJ). Las preparaciones de proteínas también pueden concentrarse mediante, por ejemplo, filtración (Amicon, Danvers, Mass.).

El gen OvIFN\tau sintético también se clonó en el vector de clonación de levaduras pBS24Ub (Ejemplo 4; Sabin, y col., 1989; Ecker, y col., 1989). Los conectores sintéticos se construyeron para permitir la fusión en marco de las secuencias codificadoras de OvIFN\tau con las secuencias codificadoras de la ubiquitina en el vector. La unión resultante permitía la escisión in vivo de las secuencias de ubiquitina a partir de las secuencias de OvIFN\tau.

El plásmido recombinante pBS24Ub-INF\tau se transformó en la levadura S. cerevisiae. Las células de levadura transformadas se cultivaron, se lisaron y la proteína recombinante INF\tau (r-INF\tau) se aisló a partir de los lisados celulares.

La cantidad de r-INF\tau se cuantificó por radioinmunoanálisis. Se realizó la microsecuenciación de la r-INF\tau purificada. Los resultados demostraron identidad con la OvIFN\tau nativa a lo largo de los primeros 15 aminoácidos. Los resultados también confirmaron que la proteína de fusión ubiquitina/INF\tau se había procesado correctamente in vivo.

El INF\tau recombinante obtenido por este procedimiento mostraba actividad antivírica similar a la actividad antivírica del IFN\tau purificado a partir de los medios de cultivo condicionados con el embrión.

Pueden usarse otros vectores de levaduras en la práctica de la presente invención. Estos incluyen vectores plasmídicos de 2 micrómetros (Ludwig, y col.; 1993), plásmidos de integración de levaduras (YIps, por ejemplo, Shaw, y col., 1988), vectores YEP (Sehn, y col., 1986), plásmidos centroméricos de levaduras (YCps; por ejemplo, Ernst, 1986) y similares. Preferiblemente, los vectores incluyen un casete de expresión que contiene un promotor de levadura eficaz, tal como el promotor MF\alpha1 (Ernst, 1986; Bayne, y col., 1988). El promotor de GADPH (gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa; Wu, y col., 1991), el promotor inducible por galactosa GAL10 (Ludwing, y col., 1993; Feher, y col. 1989; Shen, y col., 1986) o el promotor de la alcohol oxidasa regulada por metanol (AOX). El promotor AOX es particularmente útil en células hospedadoras de Pichia pastoris (por ejemplo, el promotor AOX se usa en vectores pHIL y pPIC incluido en el kit de expresión de Pichia, disponible en Invitrogen, San Diego, CA).

El casete de expresión puede incluir elementos adicionales para facilitar la expresión y purificación de la proteína recombinante y/o facilitar la inserción del casete en un vector o en un cromosoma de levadura. Por ejemplo, el casete puede incluir una secuencia señal para la secreción directa de la proteína. Un ejemplo de secuencia señal adecuada para su uso en diversos vectores de expresión de levaduras es la secuencia señal de pre-pro MF\alpha1 (Bayne, y col., 1988; Ludwig, y col., 1993; Shaw, y col., 1988). También pueden usarse otras secuencias señal. Por ejemplo, la secuencia señal PhoI (Elliot, y col., 1986); es particularmente eficaz en células hospedadoras de Pichia pastoris y Schizosaccharomyces pombe.

Los ejemplos de casetes de expresión incluyen (i) un casete que contiene (5' a 3') el promotor AOX, la secuencia señal PhoI y una secuencia de ADN que codifica OvIFN\tau, para la expresión en células hospedadoras de P. pastoris y (ii) un casete que contiene (5' a 3') el promotor MF\alpha1, la secuencia señal de pre-pro MF\alpha1 y una secuencia de ADN que codifica una composición de interferón de la presente invención, para la expresión en células hospedadoras de S. cerevisiae.

Vectores de levaduras adicionales adecuados para su uso con la presente invención incluyen, aunque sin limitación, otros vectores con expresión regulable (Hitzeman, y col., 1988; Rutter, y col., 1988; Oeda, y col., 1988). El hospedador de levadura para la transformación es típicamente Saccharomyces cerevisiae, sin embargo, como se ha ilustrado anteriormente, puede así mismo usarse otras levaduras adecuadas para la transformación (por ejemplo, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris y similares).

El ADN que codifica el polipéptido de interferón puede clonarse en cualquiera de los numerosos vectores disponibles en el mercado para general la expresión del polipéptido en el sistema hospedador apropiado. Estos sistemas incluyen los sistemas de expresión de bacterias y levaduras descritos anteriormente así como los siguientes: expresión en baculovirus (Reilly, y col., 1992; Beames y col., 1991; Clontech, Palo Alto CA); expresión en células vegetales, expresión en plantas transgénicas (por ejemplo, S.B. Gelvin y R.A. Schilperot, Plant Molecular Biology, 1988) y expresión en células de mamíferos (Clontech, Palo Alto CA; Gibco-BRL, Gaithersburg MD). Estos polipéptidos recombinantes pueden expresarse como proteínas de fusión o como proteínas nativas. Pueden incluirse varios elementos en los vectores de expresión, tales como secuencias líderes que promueven la secreción de las secuencias expresadas en el medio de cultivo. Los polipéptidos producidos de forma recombinante típicamente se aíslan a partir de células lisadas o medios de cultivo. La purificación puede realizarse por procedimientos conocidos en la técnica incluyendo fraccionamiento salino, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad. La cromatografía de inmunoafinidad puede emplearse, como se ha descrito anteriormente, usando anticuerpos generados en función de los polipéptidos de IFN.

B. Interferón-\tau humano 1. Identificación y clonación de secuencias genómicas humanas que codifican una proteína de interferón-\tau

El ADN genómico humano se seleccionó a partir de secuencias homólogas para interferón-\tau (Ejemplo 5). Se identificaron varias secuencias que hibridaban con la sonda de ADNc de OvIFN\tau. Después se aislaron varios clones que contenían secuencias parciales de interferón-\tau humano (Ejemplo 6). Se sintetizaron dos oligonucleótidos sintéticos 25-méricos, correspondientes a secuencias del ADNc de OvIFN\tau (Imakawa, y col., 1987; Whaley, y col., 1994). Estos cebadores se emplearon en reacciones de amplificación usando derivados de ADN a partir de las dos genotecas de ADNc siguientes: placenta humana y células del citotrofoblasto humano aisladas de placenta a término. Los fragmentos de ADN amplificados resultantes se separaron por electroforesis y se aisló una banda que contenía productos de amplificación de INFr humano. Los productos de amplificación se subclonaron y los productos de amplificación insertados se secuenciaron usando el procedimiento didesoxi de terminación de cadena.

La comparación de las secuencias de cinco de estos clones reveló un alto grado de homología de secuencia entre los aislados, pero las secuencias no eran idénticas. Este resultado sugiere la existencia de múltiples variantes de genes de interferón-\tau humano. El análisis de las secuencias de nucleótidos y de proteína sugiere que los genes de interferón-\tau humano se pueden clasificar en función de la homología de secuencia en al menos tres grupos. Los tres grupos se presentan a continuación.

El Ejemplo 7 describe el aislamiento de varios genes de IFN\tau humano de longitud completa. Se aisló el ADN de alto peso molecular a partir de células mononucleares de sangre periférica human (PBMC) y se fraccionó por tamaño. Se analizaron las fracciones para la presencia de secuencias de IFN\tau usando la reacción en cadena de la polimerasa: las moléculas de ADN de las fracciones que resultaron positivas en la amplificación se utilizaron para generar una genoteca subgenómica en \lambdagt11.

La genoteca subgenómica se puso en placas y se hibridó con una sonda de ADNc de OvIFN\tau (Ejemplo 7A). Se identificaron aproximadamente 20 clones que hibridaban con la sonda. Se pasaron las placas correspondientes a los clones positivos, se aisló el ADN y se analizó mediante reacciones de amplificación usando cebadores de OvIFN\tau. De estas veinte placas, seis placas generaron señales de PCR positivas. Se purificaron los fagos de estos seis clones y se secuenciaron los insertos. Uno de los insertos de uno de estos seis clones se utilizó como sonda de hibridación en la siguiente selección.

El fago recombinante de la genoteca subgenómica \lambdagt11 se seleccionó usando la sonda de hibridación como se describe (Ejemplo 7B). Se aislaron cinco clones que dieron señales de hibridación positivas y se secuenciaron los insertos. Las secuencias de tres de los clones se solaparon y la secuencia de ácido nucleico consenso resultante (HuIFN\tau1) se presenta como la ID. SEC. Nº: 11 con la secuencia codificadora de la proteína predicha presentada como la ID. SEC. Nº: 12. La secuencia codificadora de la proteína madura predicha se presenta como la ID. SEC. Nº: 4. Las secuencias de los otros dos clones se presentan como la ID. SEC. Nº: 29 (HuIFN\tau2) y ID. SEC. Nº: 31 (HuIFN\tau3). La secuencia de aminoácidos madura predicha de HuIFN\tau2 se presenta como la ID. SEC. Nº: 30. La secuencia de aminoácidos predicha del HuIFN\tau3 se presenta como la ID. SEC. Nº: 32 y la secuencia de aminoácidos madura como la ID. SEC. Nº: 34.

La comparación de las secuencias de proteína predichas (Figura 3) de uno de los genes de interferón-\tau humano (ID. SEC. Nº: 4) y del gen del interferón-\tau ovino demuestra los niveles de homología y divergencia de secuencia al nivel de aminoácidos.

En las Figuras 19A y 19B se muestra un alineamiento de secuencias de ácido nucleico de las siete secuencias de ácido nucleico del interferón-\tau humano, descrito en este documento (Ejemplos 6 y 7), con el interferón-\tau ovino. Las secuencias de OvIFN\tau (oIFN\tau), HuIFN\tau1, HuIFN\tau2 y HuIFN\tau3 comienzan en la esquina superior izquierda de la Figura 19A con el codon de iniciación ATG y continúan en la segunda página de la figura. Las secuencias de HuIFN\tau4, HuIFN\tau5, HuIFN\tau6 y HuIFN\tau7 comienzan aproximadamente en la mitad inferior de la Figura 19A con el codon CAG en el aminoácido en posición 40 (a la derecha de los signos de admiración) y continúan en la segunda página de la figura. Los extremos 5' y 3' de cada uno de los clones para HuIFN\tau4, HuIFN\tau5, HuIFN\tau6 y HuIFN\tau7 se representan mediante signos de admiración.

La secuencia codificadora completa de OvIFN\tau se presenta en la línea superior de cada grupo alineado. En las otras secuencias los nucleótidos sólo se indican en las posiciones donde difieren de los de OvIFN\tau. Las letras minúsculas representan cambios de nucleótidos que no tienen como resultado un cambio de aminoácido, mientras que las letras mayúsculas representan aquellos cambios que tienen como resultado la sustitución de un aminoácido.

En las Figuras 20A y 20B se presenta un alineamiento de las siete secuencias de aminoácidos correspondientes, construido esencialmente de la misma manera que la descrita anteriormente. Como anteriormente, la secuencia completa de aminoácidos de OvIFN\tau se presenta en la línea superior, y los aminoácidos de las otras secuencias se indican sólo en las posiciones donde difieren de la secuencia ovina.

Un examen de los alineamientos revela que las siete secuencias se pueden agrupar en al menos tres grupos. El grupo I contiene HuIFN\tau1 y HuIFN\tau2, el grupo II contiene HuIFN\tau3, HuIFN\tau4 y HuIFN\tau5 y el grupo III contiene HuIFN\tau6 y HuIFN\tau7. Estos grupos pueden representar familias de genes de interferón-\tau que tienen distintas funciones celulares.

Estos agrupamientos se establecieron en función de los siguientes criterios. En proteínas maduras, los HuIFN\tau del grupo I tienen una asparragina (ASN) en el aminoácido en posición número 95 (números en referencia a las Figuras 20A y 20B), una metionina (MET) en el aminoácido en posición número 104 y una leucina (LEU) en el aminoácido en posición número 120; los HuIFN\tau del grupo II tienen un ácido aspártico (ASP) en el aminoácido en posición número 95, una treonina (THR) en el aminoácido en posición número 104 y una metionina (MET) en el aminoácido en posición número 120; y los HuIFN\tau del grupo III tienen una arginina (ARG) en el aminoácido en posición número 72, una valina (VAL) en el aminoácido en posición número 120 y una serina (SER) en el aminoácido en posición número 122.

Las secuencias de ácido nucleico y de polipéptidos de IFN\tau humano presentadas como ID. SEC. Nº: 3, ID. SEC. Nº: 4, ID. SEC. Nº: 11, ID. SEC. Nº: 12, ID. SEC. Nº: 21, ID. SEC. Nº: 22, ID. SEC. Nº: 23, ID. SEC. Nº: 24, ID. SEC. Nº: 25, ID. SEC. Nº: 26, ID. SEC. Nº: 27, ID. SEC. Nº: 28, ID. SEC. Nº: 29, ID. SEC. Nº: 30, ID. SEC. Nº: 31, ID. SEC. Nº: 32, ID. SEC. Nº: 33 y ID. SEC. Nº: 34 se pueden usar como fuente para cebadores y sondas específicos para detectar aislados de secuencias que codifican IFN\tau humano adicionales y/o pseudogenes. Además, como se ha descrito anteriormente, puede haber más de una isoforma de la proteína IFN\tau y más de una secuencia codificadora por especie. Las sondas de ácido nucleico específicas usadas en la práctica de la presente invención y los anticuerpos reactivos con los polipéptidos de IFN\tau pueden ser útiles para aislar variantes sin identificar de interferón-\tau en mamíferos, según los procedimientos de la invención descritos en este documento.

2. Caracterización de la expresión de interferón-\tau en tejidos humanos

Se analizaron genotecas de ADNc de placenta humana y una genoteca de ADNc ovino mediante hibridación con la sonda de ADNc de OvIFN\tau (Ejemplo 8). Este análisis de hibridación de ADN sugirió que las señales de IFN\tau de genotecas de ADNc humano eran aproximadamente 1/100 de la señal obtenida usando una genoteca de ADNc ovino. Los ADNc de OvIFN\tau constituyen aproximadamente el 0,4% de la genoteca de ADNc ovino. En consecuencia, la abundancia de ADNc humanos que responden a la sonda de OvIFN\tau parece ser baja, al menos en la placenta a término de la que se generaron las genotecas de ADNc.

Se analizó también la presencia de ARNm de HuIFN\tau en placenta a término y en amniocitos humanos. Los resultados sugieren la presencia de ARNm de HuIFN\tau en el anexo fetoplacentario. Los amniocitos también expresaban el mensajero correspondiente a los cebadores de OvIFN\tau y a la sonda humana, sugiriendo que la expresión del ARNm de IFN\tau no se limita a la placenta a término.

Además, se aplicó un análisis de RT-PCR al ARN celular total aislado a partir de linfocitos adultos humanos para la presencia de HuIFN\tau: los resultados sugieren que existe ARNm de IFN\tau en linfocitos.

Se examinó también la expresión de interferón-\tau en tejido humano usando hibridación in situ (Ejemplo 9). Se examinaron las secciones de cuatro placentas humanas a término diferentes y del primer trimestre. Para este análisis se empleó una sonda de ADNc derivada de la secuencia de OvIFN\tau (Ejemplo 9B). La hibridación in situ se realizó usando una sonda de ARN antisentido. En tres experimentos independientes, se observó hibridación específica en todos los tejidos placentarios a término y del primer trimestre.

Las vellosidades placentarias del primer trimestre (compuestas de una capa externa de sincitiotrofoblasto, una capa subyacente de citotrofoblasto y una región estromal central con varios tipos de células mesenquimales) presentaban los niveles de transcrito de IFN\tau más altos en las células de citotrofoblasto. Tanto en las células del sincitiotrofoblasto como estromales había niveles menos intensos, pero detectables. En las vellosidades placentarias de tejido a término se demostró un patrón similar de expresión del transcrito, pero el nivel de detección de la señal era bajo. Los trofoblastos extravellosos del primer trimestre presentaron la cantidad más elevada de mensajero y de positivos teñidos cuando estaban presentes en los espacios sanguíneos maternos en la decidua.

Howatson, y col., (1988) observaron la producción de IFN\alpha en el sincitiotrofoblasto de las vellosidades coriónicas tanto en tejidos del primer trimestre como a término. Paulesu, y col. (1991) también observaron IFN\alpha en trofoblasto extravelloso, así como en sincitiotrofoblastos, notando una reactividad más intensa y abundante en el tejido placentario del primer trimestre cuando se comparaban con aquellos tomados a término. Estos investigadores emplearon anticuerpos obtenidos contra subtipos de IFN\alpha humano y ninguno observó IFN\tau en el citotrofoblasto
velloso.

Los presentes resultados demuestran que el gen de IFN\tau humano se expresa de forma elevada en tejido placentario temprano por trofoblastos extravellosos migratorios, pero también se expresa en sincitiotrofoblastos vellosos, citotrofoblastos y diversas células estromales. Estos resultados demuestran la detección de transcritos de IFN\tau en tejidos gestacionales y la expresión de IFN\tau en los citotrofoblastos vellosos, así como en el trofoblasto extravelloso de placenta del primer trimestre.

C. Propiedades antivíricas del interferón-\tau

La actividad antivírica de OvIFN\tau se ha evaluado frente a varios virus, incluyendo tanto virus de ARN como de ADN. La actividad específica relativa de OvIFN\tau, purificado hasta la homogeneidad, se evaluó en ensayos antivíricos (Ejemplo 10). OvIFN\tau tiene una actividad antivírica específica más alta que rBoIFN\alpha o rBoIFN\gamma (Ejemplo 10, Tabla 3).

Una ventaja de la presente invención es que OvIFN\tau tiene una actividad antivírica potente con efectos citotóxicos limitados. Se ensayaron los efectos antirretrovíricos y citotóxicos de OvIFN\tau altamente purificado en linfocitos de sangre periférica expuestos a los retrovirus del SIDA felino y del SIDA humano (Bazer, y col., 1989). El lentivirus del SIDA felino produce un síndrome crónico similar al SIDA en gatos y es un modelo para el SIDA de humanos (Pederson, y col., 1987). La replicación de ambos virus en los linfocitos de sangre periférica (PBL) se siguió por la actividad de la transcriptasa inversa (RT) en los sobrenadantes de los cultivos a lo largo del tiempo.

Para determinar la actividad antivírica de IFN\tau contra VIF y VIH, se ensayó la actividad RT de la ADN polimerasa dependiente de ARN en cultivos de PBL de felino y humanos infectados con VIF y VIH tratados con OvIFN\tau (Ejemplo 11). La replicación de VIF se redujo en aproximadamente un tercio de los valores de control cuando las células se cultivaron en presencia de OvIFN\tau. La adición de OvIFN\tau produce un rápido descenso dependiente de dosis de la actividad de transcriptasa inversa (RT) (Ejemplo 11, Tabla 4). Mientras que concentraciones tan bajas como 0,62 ng/ml de IFN\tau inhibían la replicación vírica, concentraciones mucho mayores (40 ng/ml) que tenían efectos mayores en la actividad RT, no tenían efectos tóxicos en las células. Los resultados sugieren que la replicación del virus de la inmunodeficiencia felina se reducía significativamente en comparación con los valores de control cuando las células se cultivaban en presencia de OvIFN\tau.

Parece que el IFN\tau no ejerce efectos citotóxicos en células que alojan los retrovirus. Esto era cierto incluso cuando el IFN\tau estaba presente a 40 ng por ml en el medio de cultivo. Esta concentración de IFN\tau es equivalente a aproximadamente 8.000 unidades antivíricas de interferón alfa, cuando se ensaya la capacidad de OvIFN\tau y HuIFN\alpha para proteger las células Mandin-Darby de riñón bovino de la lisis por el virus de la estomatitis vesicular (ensayo de lisis como describen Pontzar, y col., 1988).

También se ensayó la actividad de IFN\tau contra la replicación de VIH en células humanas. Los linfocitos periféricos humanos, que se habían infectado con VIH se trataron con diversas concentraciones de IFN\tau (Ejemplo 12). La replicación de VIH en linfocitos de sangre periférica se controló por la actividad transcriptasa inversa en los sobrenadantes de los cultivos a lo largo del tiempo. Un intervalo de concentraciones de IFN\tau producen efectos anti-HIV significativos (Ejemplo 12, Tabla 5). Una concentración de sólo 10 ng/ml tiene como resultado una reducción de más del 50% de la actividad RT después de sólo seis días. Una concentración de 500 ng/ml tenía como resultado una reducción del 90% de la actividad RT en 10 días. Adicionalmente, no hubo evidencia de ningún efecto citotóxico atribuible a la administración de IFN\tau (Ejemplo 12, Tabla 5).

Además, los efectos antivíricos de IFN\tau contra VIH se evaluaron tratando células PBMC humanas con diversas cantidades de IFN\tau recombinante o IFN\alpha recombinante humano durante la infección con VIH (Ejemplo 19). Los datos de estos experimentos (Ejemplo 19, Tabla 11) apoyan la conclusión de que, a concentraciones similares, IFN\alpha e IFN\tau son eficaces para reducir la replicación de VIH en linfocitos humanos. Sin embargo, el tratamiento de células con IFN\alpha daba lugar a citotoxicidad, mientras que no se ha observado esta citotoxicidad con el tratamiento usando IFN\tau, incluso cuando se usó IFN\tau a concentraciones mucho más altas. No se observó citotoxicidad usando INF\tau, incluso cuando se usó IFN\tau a dosificaciones de 200 veces las del interferón-alfa II.

Las propias transcriptasas inversas de VIF y VIH no se veían afectadas por IFN\tau en ausencia de PBL. Por tanto, la actividad antivírica no es debida a un efecto directo en la RT vírica.

El interferón-\tau también ha mostrado inhibición de la replicación del ADN del virus de la hepatitis B en hepatocitos (Ejemplo 19). Se usó una línea celular humana derivada de células de hígado transfectadas con el virus de la hepatitis B (VHB) para ensayar los efectos antivíricos de IFN\tau. Las células se trataron tanto con IFN\alpha como con IFN\tau sobe un intervalo de concentraciones. Tanto IFN\alpha como IFN\tau reducían la producción de ADN en aproximadamente dos veces en comparación con el control sin interferón.

Para demostrar que el efecto de los interferones era específico del virus infeccioso y no el resultado de un efecto sobre el metabolismo general de la célula, se examinaron los efectos de IFN\alpha e IFN\tau en la producción de ARNm hepatoespecífico en los hepatocitos (Ejemplo 19). Dos proteínas específicas de hepatocitos, Apo E y Apo A1, se detectaron median análisis por hibridación. No se observó reducción aparente de la producción de ARNm para cualquier ARNm hepatoespecífico a concentraciones de hasta 40.000 unidades/ml de IFN\alpha o IFN\tau. Adicionalmente, no se vieron evidencias de hepatotoxicidad con IFN\tau en este ensayo.

También se evaluaron los efectos del interferón tau ovino recombinante (roIFN\tau) en la replicación de lentivirus ovino (OvLV). Se ensayaron los efectos in vitro infectando células de membrana sinovial de cabra con diluciones seriadas de OvLV. Las células infectadas se trataron diariamente con roIFN\tau (0-2.500 unidades antivíricas/ml [UAV/ml]) durante 6 a 12 días, y se evaluaron la replicación vírica y el efecto citopático (ECP; por ejemplo, como en el Ejemplo 2).

Los procedimientos de evaluación incluían curvas de crecimiento vírico, ensayo de proliferación celular (por ejemplo, como en los Ejemplos 13, 14 y 15), ensayo de formación de sincitios (por ejemplo, como en Nagy, y col., 1983; Dalgleish, y col., 1984) y cuantificación de ADN provírico por PCR y ensayo de transcriptasa inversa (Mullis, 1987; Mullis y col., 1987). Se observó una reducción (p < 0,001) del título de OvLV y CPE (80-99%) en los cultivos tratados con roIFN\tau.

Los efectos in vivo de roIFN\tau se ensayaron mediante la inoculación de veinticuatro corderos recién nacidos con 5 x 10^{6} DICT_{50} de OvLV cepa 85/34. Once de éstos corderos se trataron con 10^{5}-10^{6} UAV/kg de roIFN\tau una vez al día durante 30 días tras la inoculación (PI) y dos veces por semana después de esto. Se usaron trece corderos como controles. Los títulos de virus en la sangre, según se determinó por un procedimiento de dilución a punto final, alcanzó el máximo a las 4-6 semanas PI en ambos grupos. Los títulos de OvLV en corderos tratados con roIFN\tau se redujeron con respecto a los animales de control. La mayor reducción, un descenso del 90% en el título de OvLV en animales tratados con respecto a los animales de control (p<0,01), se obtuvo a las 4 semanas PI.

Los estudios de OvLV descritos anteriormente indican que OvIFN\tau recombinante puede reducir significativamente la replicación de OvLV, y sugieren que el IFN\tau puede usarse para el control de enfermedades clínicas causadas por infecciones con lentivirus. Tomados en conjunto con los otros datos antivíricos, estos resultados sugieren que el IFN\tau en un agente antivírico eficaz contra una amplia variedad de virus, incluyendo tanto virus de ARN como de ADN.

Las composiciones de interferón de la presente invención pueden ser útiles en aplicaciones veterinarias incluyendo, aunque sin limitación, el tratamiento de las siguientes enfermedades víricas: virus de la leucemia felina, virus de la neumonía progresiva ovina, lentivirus ovino, virus de la anemia infecciona equina, virus de la inmunodeficiencia bovina, virus visna-maedi y artritis encefalitis caprina.

Las composiciones de interferón derivado de humano pueden usarse para el tratamiento de, por ejemplo, las siguientes enfermedades víricas: virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis C (VHC) y virus de la hepatitis B (VHB).

D. Propiedades antiproliferativas del IFN\tau

Se han examinado los efectos del IFN\tau sobre el crecimiento celular. En un análisis se examinó la actividad anticrecimiento celular usando un ensayo de inhibición de colonias (Ejemplo 13). Las células de amnios humano (WISH) o MDBK se pusieron en placas a baja densidad celular para formar colonias originadas a partir de células únicas. Las diluciones de interferón se añadieron en pocillos por triplicado y las placas de incubaron para permitir la formación de colonias. El IFN\tau inhibía tanto el tamaño como el número de colonias en estos ensayos. El IFN\tau fue más eficaz para inhibir la proliferación celular de la línea celular humana (WISH) que el IFN\alpha humano. La actividad proliferativa del IFN\tau era dependiente de dosis. Las altas concentraciones de IFN\tau detenían la proliferación, mientras que la viabilidad celular no se veía alterada.

En función de los análisis del ciclo celular, usando citometría de flujo, parece que el IFN\tau inhibe la progresión de las células a través de la fase S. Estos resultados demuestran los efectos antiproliferativos del IFN\tau y acentúa su baja citotoxicidad.

Los efectos antiproliferativos del IFN\tau también se estudiaron en líneas celulares de rata y bovinas (Ejemplo 14). La tasa de incorporación de ^{3}H-timidina se usó para evaluar la tasa de proliferación celular. Los datos obtenidos demuestran que el IFN\tau reduce drásticamente la tasa de proliferación celular (Ejemplo 14, Tabla 7) para cada línea celular ensayada.

La actividad antiproliferativa y la falta de toxicidad del IFN\tau se examinaron además usando una serie de líneas celulares tumorales humanas (Ejemplo 15). Se seleccionaron diversas líneas celulares tumorales humanas a partir de líneas convencionales usadas en los procedimientos de selección del NIH para agentes antineoplásicos (Pontzer, y col., 1991). Se examinó al menos una línea celular de cada categoría neoplásica principal.

Las siguientes líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection (12301 Parklawn Dr., Rockville MD 20852):

NCI-H460	carcinoma de pulmón de células grandes humano;
DLD-1	adenocarcinoma de colon humano;
SK-MEL-28	melanoma maligno humano;
ACHN	adenocarcinoma renal humano;
HL-60	leucemia promielocítica humana;
H9	linfoma de linfocitos T humano;
HUT 78	linfoma cutáneo de linfocitos T humano; y
MCF7	adenocarcinoma de mama humano

Como anteriormente, la actividad antiproliferativa se evaluó midiendo la tasa de incorporación de ^{3}H-timidina en las células que se habían tratado con IFN\tau. Se valoraron las diferencias significativas entre los tratamientos mediante un análisis de varianza seguido de la prueba F de Scheffe. El análisis de ciclo celular se realizó mediante citometría de flujo.

El examen de la inhibición por IFN\tau de la proliferación de MCF7 (adenocarcinoma de mama) demostró que el IFN\tau reducía la proliferación de MCF7 de una manera dependiente de la dosis. Se observó una reducción del 50% en la ^{3}H-timidina con 10.000 unidades/ml de IFN\tau (Ejemplo 15, Tabla 8). Previamente se había encontrado que esta línea celular no respondía al tratamiento con antiestrógenos.

Se realizó una comparación de los efectos antiproliferativos de IFN\tau e IFN\alpha usando células HL-60 (leucemia promielocítica humana). Los resultados con la leucemia promielocítica (HL-60) son los típicos de aquellos obtenidos comparando IFN\tau con IFN\alpha humano (Ejemplo 15). Concentraciones tan bajas como 100 unidades/ml de ambos IFN producían una reducción significativa (> 60%) del crecimiento. Cantidades mayores de IFN disminuían más la proliferación de células tumorales (Figura 4). Dosis altas de HuIFN\alpha, pero no de OvIFN\tau, eran citotóxicas (Figura 5). La viabilidad celular se reducía aproximadamente el 80% por el IFN\alpha. Por el contrario, cerca del 100% de las linfocitos Tratadas con IFN\tau se mantenían viables cuando se aplicaba IFN\tau a 10.000 unidades/ml. De este modo, mientras que ambos interferones inhibían la proliferación, sólo IFN\tau no era citotóxico. Esta falta de toxicidad proporciona una ventaja al IFN\tau para su uso en terapias in vivo.

El linfoma cutáneo de linfocitos T humano, HUT 78, responde de forma similar a HL-60 cuando se trata con IFN\tau (Ejemplo 15, Figura 9) Tanto OvIFN\tau como rHuIFN\alpha reducen el crecimiento celular de HUT 78, pero IFN\alpha demostró efectos adversos sobre la viabilidad celular.

El linfoma de linfocitos T H9 era menos sensible a los efectos antiproliferativos del IFN\alpha que las líneas celulares tumorales descritas anteriormente. Mientras que el IFN\alpha no era tóxico para las células H9, no era capaz de inhibir significativamente la división celular a ninguna de las concentraciones analizadas (Ejemplo 15, Figura 10). Por el contrario, se observó que el IFN\tau reducía el crecimiento de H9 aproximadamente el 60%. De este modo, sólo OvIFN\tau es un inhibidor eficaz del crecimiento de este linfoma de linfocitos T.

En tres líneas celulares tumorales adicionales (NCI-H460, DLD-1 y SK-MEL-28) IFN\tau e IFN\alpha eran agentes antitumorales igualmente eficaces. En el melanoma, SK-MEL-28, se logró una inhibición de la proliferación por IFN\alpha con una caída del 13% en la viabilidad, mientras que IFN\tau no era citotóxico. En la mayoría de los tumores examinados, IFN\tau es igual o preferible a IFN\alpha como agente antineoplásico contra tumores humanos.

El IFN\tau muestra una actividad antiproliferativa contra células tumorales humanas sin toxicidad y es tan potente o más que el IFN\alpha humano. Los ensayos clínicos de los IFN\alpha2 han mostrado a estos como agentes antitumorales eficaces (Dianzani, 1992; Krown, 1987). Una ventaja del IFN\tau como terapéutico es la eliminación de los efectos tóxicos que se ven con altas dosis de los IFN\alpha.

Una aplicación adicional del IFN\tau es contra tumores como el sarcoma de Kaposi (asociado con la infección por VIH) donde los efectos antineoplásicos del IFN\tau están acompañados de la capacidad del IFN\tau para inhibir el crecimiento retrovírico.

Se examinó en un sistema de ratón la eficacia in vivo del tratamiento con interferón-\tau (Ejemplo 16). B16-F10 es un tumor singénico trasplantable en ratones seleccionado por su alta incidencia de metástasis pulmonar (Poste, y col., 1981). El tratamiento con interferón se inició 3 días después de la introducción de las células tumorales. La administración in vivo de IFN\tau reducía de modo espectacular los tumores pulmonares de B16-F10. Así, IFN\tau parece ser un agente antineoplásico eficaz in vivo, así como in vitro.

Estos resultados sugieren que las composiciones de interferón de la presente invención pueden usarse en procedimientos para inhibir o reducir el crecimiento de células tumorales, incluyendo, aunque sin limitación, los siguientes tipos de células tumorales: células de carcinoma humano, células de cáncer hematopoyético, células de leucemia humana, células de linfoma humano, células de melanoma humano y células de tumores sensibles a esteroides (por ejemplo, células de tumor de mama).

E. IFN de tipo I como tratamiento para trastornos autoinmunes

Las composiciones y procedimientos de la presente invención pueden usarse para tratar terapéuticamente y, por consiguiente, aliviar diversos trastornos relacionados con el sistema inmunitario, caracterizados por una función hiper o hipoactiva del sistema inmunitario. Estos trastornos incluyen trastornos de hiperalergenicidad y autoinmunes, tales como esclerosis múltiple, diabetes mellitus tipo I (dependiente de insulina), lupus eritematoso, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, estomatitis, asma, alergias, psoriasis y similares.

F. Eficacia de la administración oral de IFN\tau

Experimentos realizados en apoyo de la presente invención demuestran que la administración oral de composiciones de polipéptidos de IFN\tau son comparables en eficacia a las composiciones de IFN\tau inyectadas con respecto al tratamiento de enfermedades o estados de enfermedades que se benefician del tratamiento con IFN\tau, tales como enfermedades autoinmunes (por ejemplo, esclerosis múltiple).

No sólo el IFN\tau administrado por vía oral era eficaz en el tratamiento de una enfermedad que se beneficia del tratamiento con IFN\tau (EAE), sino que la vía oral de administración tuvo como resultado inesperadas ventajas con respecto al tratamiento con composiciones de IFN\tau inyectadas. Por ejemplo, el IFN\tau administrado por vía oral tuvo como resultado unos niveles significativamente más bajos de anticuerpos anti-IFN\tau en el suero de los individuos tratados. Esto es beneficioso porque es menos probable que el IFN\tau administrado por vía oral se vuelva ineficaz por una respuesta inmune del hospedador (es decir, la desensibilización al tratamiento y/o el nivel de dosis disminuye significativamente) y es menos probable que el individuo que recibe el tratamiento sufra efectos secundarios adversos como resultado de esta respuesta inmune.

G. Citotoxicidad de interferones

Una ventaja del IFN\tau sobre otros interferones, tal como IFN\alpha, es que el tratamiento de un sujeto con dosis terapéuticas de IFN\tau no parece estar asociado con citotoxicidad. En particular, el IFN-\tau no parece ser tóxico a concentraciones a las que el IFN-\tau induce toxicidad. Esto se demuestra mediante experimentos en los que células L929 se trataron con varias concentraciones de oIFN\tau o MuIFN-\tau (Lee Biomolecular, San Diego, CA), oscilando desde 6000 U/ml a 200.000 U/ml (Ejemplo 19E).

Se añadió oIFN\tau, MuIFN-\beta o medio (control) a tiempo cero y se incubaron las células durante 72 horas. Los resultados de los experimentos se presentan en la Figura 21. El porcentaje de células vivas (con respecto al control) se indica a lo largo del eje y (\pm error típico). El 100% de viabilidad es igual a la viabilidad de las células L929 tratadas con medio solo. Los resultados indican que esencialmente oIFN\tau no es tóxico a concentraciones de hasta 100.000 U/ml, y es significativamente menos tóxico que MuIFN-\beta sobre el intervalo terapéutico completo de los compuestos.

Se ha demostrado previamente que el tratamiento in vivo con ambos INF de tipo I, IFN\beta e IFN\alpha, en humanos y animales causa toxicidad que se manifiesta como varios efectos secundarios incluyendo fiebre, letargia, taquicardia, pérdida de peso y leucopenia (Degre, 1974; Fent y Zbinden, 1987). Se examinó el efecto del tratamiento in vivo con IFN\tau, IFN\beta, e IFN\alpha (10^{5} U/inyección) sobre la fórmula leucocitaria (WBC) total, el recuento de linfocitos totales y las medidas de peso en ratones NZW (Tabla 13) como se describe en el Ejemplo 19F. No se observaron diferencias significativas entre los ratones tratados con IFN\tau y los no tratados para WBC, recuento de linfocitos o cambios de peso.

En comparación, los ratones tratados con IFN\beta mostraban una caída del 31,7% en el recuento de linfocitos 12 horas después de la inyección. Además, la caída del recuento de linfocitos continuó 24 horas después de la inyección de IFN\beta. Los ratones tratados con IFN\alpha mostraron una caída del 55,8% de linfocitos y pérdida de peso significativa 12 horas después de la inyección. Experimentos adicionales realizados como apoyo de la presente invención demostraban que el IFN\tau no suprimía la médula ósea a altas dosis. De este modo, parece que el IFN\tau no tiene toxicidad in vivo a diferencia de IFN\alpha e IFN\beta como se evidenció por los estudios en sangre periférica y medidas de peso. Como se describe a continuación, los experimentos realizados como apoyo de la presente invención indican que la toxicidad reducida del IFN\tau con respecto al IFN\beta e IFN\alpha, como se ha resumido anteriormente, puede ser debida a secuencias presentes en los 37 aminoácidos del extremo N-terminal de IFN\tau, y a que la sustitución de estas secuencias por las secuencias correspondientes en los interferones de tipo I no tau, tales como los IFN\beta y/o los IFN\alpha, puede conferir esta citotoxicidad reducida en los polipéptidos de fusión de interferón híbrido resultante.

III. Fragmentos polipeptídicos de interferón-\tau y reconocimiento diferencial del receptor de interferón de tipo I por IFN-\tau e IFN-\alpha A. Fragmentos polipeptídicos de IFN\tau

La diversidad de actividades de IFN\tau, su potencia y falta de citotoxicidad, según se muestra en la presente memoria descriptiva, sugieren la importancia del análisis de estructura/función para este nuevo interferón. La base estructural para la función de OvIFN\tau se ha examinado usando seis péptidos sintéticos solapados correspondientes a la secuencia completa de OvIFN\tau (Figura 6). Los polipéptidos correspondientes derivados de la secuencia del IFN\tau ovino se presentan como ID. SEC. Nº: 5 a ID. SEC. Nº: 10. Se ha demostrado que tres péptidos que representan los aminoácidos 1-37, 62-92 y 139-172 inhiben la actividad antivírica de IFN\tau (Ejemplo 17). Los péptidos eran competidores eficaces a concentraciones de 300 \muM y superiores.

El polipéptido sintético que representa la región C-terminal de ovIFN\tau, OvIFN\tau(139-172), y el péptido interno OvIFN\tau(62-92), inhibían la actividad antivírica de IFN\tau y rBoIFN\alpha_{\pi } en el mismo grado, mientras que el péptido N-terminal OvIFN\tau(1-37) era más eficaz inhibiendo la actividad antivírica de OvIFN\tau. Los datos de dosis frente a respuesta indicaron que IFN\tau(62-92) e IFN\tau(139-172) inhibían la actividad antivírica de IFN\tau en el mismo grado. Los mismos péptidos que bloqueaban la actividad antivírica de IFN\tau también bloqueaban la actividad antivírica del IFN\alpha recombinante bovino (rBoIFN\alpha); el IFN\gamma recombinante bovino no estaba afectado por los péptidos. Estos dos péptidos de IFN\tau pueden representar regiones de unión a receptor comunes para IFN\tau y varios IFN\alpha.

Los dos péptidos sintéticos OvIFN\tau(1-37) y OvIFN\tau(139-172) también bloqueaban la actividad anti-VIF y anti-VIH de OvIFN\tau (Ejemplo 17; Figuras 11A y 11B). Mientras que ambos péptidos bloqueaban la actividad RT de VIF, sólo el péptido C-terminal, OvIFN\tau(139-172), parecía ser un inhibidor eficaz de la actividad del virus de la estomatitis vesicular en la línea celular felina, Fc9.

Los antisueros policlonales anti-péptido contra los péptidos de IFN\tau rindieron resultados similares a los estudios de inhibición de polipéptidos, descritos anteriormente. Anticuerpos dirigidos contra las mismas tres regiones (OvIFN\tau(1-37), IFN\tau(62-92) e IFN\tau(139-172)) bloqueaban la función de OvIFN\tau, confirmando la importancia de estos tres dominios en la actividad antivírica (Ejemplo 17). Estos péptidos, aunque aparentemente se unen al receptor de interferón, por sí mismos no desencadenan en las células efectos semejantes a los del interferón.

La actividad antiproliferativa del IFN\tau (Ejemplo 17, Tabla 11) implicaba una región adicional de la molécula, puesto que IFN\tau(119-150) era el inhibidor más eficaz de la reducción de proliferación celular inducida por OvIFN\tau. Este resultado sugiere que la región de la molécula responsable ante todo de la inhibición de la proliferación celular es la región IFN\tau(119-150). Esta región de la molécula de IFN\tau puede ser útil sola o fusionada con otras proteínas (tales como albúmina sérica, un anticuerpo o un polipéptido de interferón alfa) como agente antineoplásico. Una proteína conjugada entre un péptido N-terminal derivado del interferón-\alpha humano y la albúmina sérica se demostró que tenía actividad antiproliferación celular (Ruegg, y col., 1990).

Finalmente, la unión de ^{125}I-OvIFN\tau a su receptor en las células MDBK se pudo bloquear mediante antisueros frente a 4 de los 6 péptidos; los 4 polipéptidos representan los aminoácidos 1-37, 62-92, 119-150 y 139-172 de OvIFN\tau. Esto refleja los múltiples dominios de unión, así como el significado funcional de estas regiones. Puesto que diferentes regiones de IFN\tau están implicadas en el desencadenamiento de diferentes funciones, la modificación de los aminoácidos seleccionados podría resultar potencialmente en interferones semejantes al IFN\tau con actividad biológica selectiva.

Se han propuesto fragmentos polipeptídicos de proteínas de IFN\tau humano, que tienen propiedades similares a los polipéptidos de OvIFN\tau ya descritos, basados en los datos presentados anteriormente para los fragmentos polipeptídicos de OvIFN\tau combinados con la información de la secuencia de HuIFN\tau descrita en este documento. Estos polipéptidos derivados de la secuencia humana incluyen, aunque sin limitación, los siguientes: ID. SEC. Nº: 15 a ID. SEC. Nº: 20 y ID. SEC. Nº: 35 a ID. SEC. Nº: 40.

B. Efectos e interacciones del IFN-\tau e IFN-\alpha en los receptores de interferón de tipo I

Consecuentemente con los estudios de péptidos antagonistas descritos anteriormente y en el Ejemplo 17, los experimentos descritos en el Ejemplo 18 muestran que altas concentraciones (hasta un exceso de 10 veces) de OvIFN\tau no son capaces de competir por el receptor y bloquear los efectos tóxicos del IFN\alphaA en células MDBK. Una comparación de las propiedades relativas antivíricas citotóxicas de unión a receptor y de competición por el receptor de OvIFN\tau y de IFN\alphaA humano proporciona entendimiento en cuanto a interacciones de ligando y receptor. El IFN\tau y el IFN\alphaA poseen actividades antivíricas específicas similares, como se ha demostrado previamente (Pontzer, y col., 1988). Sin embargo, como se muestra en el Ejemplo 18, el IFN\alphaA tiene una K_{d} para el receptor aproximadamente 10 veces más baja que la que tiene el IFN\tau y, por tanto, una afinidad de unión al receptor más alta. Además, el IFN\alphaA es varias veces más eficaz que el IFN\tau en los ensayos de competición de unión usando ^{125}I-IFN\tau o ^{125}I-IFN\alphaA (Figuras 24A, 24B). Puesto que el número de sitios de unión por célula para el IFN\tau y el IFN\alphaA es muy similar, y el IFN\tau compite con el IFN\alphaA por la unión, parece que IFN\alphaA e IFN\tau reconocen el mismo complejo receptor.

Una comparación de las curvas de dosis frente a respuesta/ocupación para las citotoxicidades y actividades antivíricas (Figuras 27A y 27B) muestra que la citotoxicidad está asociada con la ocupación máxima del receptor y, por tanto, con las afinidades de unión; el IFN\alphaA tiene una mayor afinidad de unión y, de este modo, posee una toxicidad sustancialmente mayor. Por otro lado, la actividad antivírica es máxima a concentraciones que tienen como resultado sólo una fracción pequeña de ocupación de receptores y no se representa por datos de unión en equilibrio.

Experimentos realizados como apoyo de la presente invención han demostrado también que el IFN\tau ovino, como el IFN\alphaA, puede inducir una fosforilación muy rápida de la quinasa TyK2 asociada al receptor de tipo I y de los factores de transcripción Stat1\alpha y Stat2. Dadas las escalas de tiempo de la estimulación por IFN\tau e IFN\alphaA, parece que sólo una pequeña fracción de los receptores necesita ser ocupada para inducir la fosforilación de TyK2, Star1\alpha y Stat2. Considerados en conjunto, estos datos sugieren que la fosforilación de estas proteínas de la transducción de señales puede no ser suficiente para inducir la toxicidad celular asociada con "otros" IFN de tipo I (es decir, IFN de tipo I aparte del IFN-tau).

La afinidad de unión más alta del IFN\alphaA por el receptor y las propiedades de competición diferencial del IFN\tau e IFN\alphaA también sugieren que los dos IFN reconocen el receptor de forma diferente. Experimentos realizados como apoyo de la presente invención usando antagonistas de péptidos sintéticos, incluyendo los experimentos descritos en el Ejemplo 17, demostraron que el péptido C-terminal IFN\tau(139-172) (ID. SEC. Nº: 10) era competitivo contra las actividades tanto de IFN\alphaA como IFN\tau, mientras que el péptido N-terminal IFN\tau(1-37) (ID. SEC. Nº: 5) era eficaz a una concentración de 5 a 10 veces superior sólo contra la actividad de IFN\tau. Los experimentos usando antisueros conseguidos contra el IFN\tau-(139-172) e IFN\tau-(1-37) han demostrado que el antisuero contra el IFN\tau-(1-37) bloquea sólo la unión de IFN\tau, mientras que el antisuero contra el IFN\tau-(139-172) bloquea la unión tanto de IFN\alpha como de IFN\tau. Estos datos sugieren que las porciones N-terminales del IFN\tau e IFN\alphaA representan determinantes significativos de la unión de alta afinidad y que las diferencias en la unión en equilibrio de alta afinidad entre IFN\alphaA e IFN\tau son debidas a diferencias en interacciones con el receptor en los extremos N de esas moléculas. En consecuencia, los extremos N de estas moléculas también parecen ser determinantes significativos de los efectos citotóxicos de los IFN.

C. Proteínas de fusión de interferón híbrido

Los datos anteriores considerados en conjunto sugieren que las regiones C-terminales de los interferones de tipo I se unen a un sitio común en el receptor de interferón de tipo I (es decir, en un sitio que afecta las propiedades de activación del receptor tanto del IFN\alpha como del IFN\tau), mientras que la región N-terminal puede estar implicada en el desencadenamiento de funciones únicas (es decir, se une a un sitio que afecta sólo a las propiedades de activación del receptor del IFN\tau). En particular, los datos sugieren que la región N-terminal es responsable de la disminución de citotoxicidad del IFN\tau con respecto a otros IFN de tipo I, por ejemplo, el IFN\alpha.

La presente invención emplea observaciones respecto a la citotoxicidad disminuida conferida por la región N-terminal del IFN\tau como apoyo de las construcciones de ADN quimérico usadas para producir proteínas de fusión de interferón híbrido que tienen una porción N-terminal derivada del IFN\tau y una porción C-terminal derivada de un polipéptido de interferón de tipo I no tau cuya eficacia como terapéutico está reducida por su citotoxicidad relativamente alta. Ejemplos de tales polipéptidos de interferón de tipo I no tau incluyen IFN\beta y varias isoformas de IFN\alpha.

Con referencia a la Figura 28, tal proteína o polipéptido de fusión de interferón híbrido 40, codificado por una molécula quimérica de ácido nucleico, tiene un extremo N-terminal 42 y un extremo C-terminal 44. La proteína de fusión se construye con un primer segmento (N-terminal) 46 y un segundo segmento (C-terminal) 48. El segmento N-terminal contiene la secuencia de aminoácidos N-terminal de un polipéptido de interferón tau codificado por un extremo 5' de la molécula quimérica de ácido nucleico. El segmento C-terminal contiene la secuencia de aminoácidos C-terminal de un polipéptido de interferón de tipo I no tau y la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de interferón tau codificado por un segmento del extremo 3' de la molécula quimérica de ácido nucleico. Los dos segmentos se unen o ayustan en el punto de unión 50 que es una región (región de unión) que corresponde a la porción de un polipéptido de interferón maduro en el resto del aminoácido 28. Nótese que el polipéptido de IFN\tau maduro comienza típicamente con una cisteína en el aminoácido 24 de la secuencia completa (que incluye la secuencia líder y comienza con una metionina).

La región de unión está contenida en el péptido N-terminal de 37 aminoácidos (ID. SEC. Nº: 5) empleado en los experimentos detallados anteriormente. Un alineamiento de las secuencias de aminoácidos maduras de varios clones de IFN\tau, IFN\alpha e IFN\beta entre los aminoácidos 1 a 37 reveló que el mayor grado de divergencia entre las secuencias tiene lugar cerca del extremo N-terminal. En particular, el mayor grado de divergencia entre secuencias tiene lugar entre los aminoácidos 1 y 16, con un grado intermedio de divergencia entre los aminoácidos 17 a 28. La región entre los aminoácidos 29 y 37 está relativamente bien conservada entre los diferentes interferones de tipo I, y se piensa que está implicada en las interacciones de unión con el receptor del interferón de tipo I (Fish, 1992).

La unión óptima (es decir, el resto de aminoácido en posición secuencia arriba del cual (hacia el extremo N-terminal ó 5') la secuencia corresponde al interferón tau, y secuencia abajo del cual (hacia el extremo C-terminal ó 3') corresponde a otro interferón, por ejemplo, IFN\alpha o IFN\beta) se puede identificar, por ejemplo, mediante los procedimientos descritos en este documento, usando péptidos o secuencias de ADN que codifican péptidos que corresponden a regiones más largas o más cortas en el IFN\tau(1-37), en combinación con los ensayos funcionales descritos en este documento (tales como ensayos antivíricos, antiproliferativos y de citotoxicidad). Se contempla que, por ejemplo, un interferón híbrido o quimérico de la presente invención que contiene los aminoácidos 1-28 del interferón tau y el resto de aminoácidos de un interferón de tipo I no tau posee la baja toxicidad asociada con el interferón tau junto con la actividad biológica asociada normalmente atribuida a tal interferón de tipo I. Por ejemplo, un híbrido de IFN\tau/IFN\alpha puede, por ejemplo, reducir la toxicidad del IFN\alpha, pero no interferir con las propiedades antivíricas del IFN\alpha.

Como se ha expuesto anteriormente, el polipéptido de fusión de interferón de la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos donde los primeros 28 aminoácidos de la proteína madura de interferón tiene una secuencia de una molécula de IFN\tau y los aminoácidos restantes tienen una secuencia de un polipéptido de interferón de tipo I no tau. Ejemplos de secuencias a partir de las cuales se pueden seleccionar los primeros 28 aminoácidos de la proteína de fusión de interferón incluyen las secuencias presentadas en este documento como ID. SEC. Nº: 5, ID. SEC. Nº: 15, ID. SEC. Nº: 35, ID. SEC. Nº: 45, ID. SEC. Nº: 46, ID. SEC. Nº: 47, ID. SEC. Nº: 48, ID. SEC. Nº: 49, ID. SEC. Nº: 50, ID. SEC. Nº: 51, ID. SEC. Nº: 52 y ID. SEC. Nº: 53.

La secuencia restante (es decir, la secuencia de aminoácidos del "segundo" segmento C-terminal que está codificada por el segmento del extremo 3' de la molécula quimérica de ácido nucleico) se puede seleccionar entre cualquier polipéptido de interferón de tipo I no tau adecuado, tales como interferón alfa (por ejemplo, alfa-1 o alfa-2), interferón beta, interferón omega, un interferón híbrido o un interferón consenso. Las secuencias para los interferones de tipo I no tau son conocidas en la técnica. Por ejemplo, Gunther, y col., 1990; Leibowitz, y col., 1990; Goeddel, 1983, 1984, 1987, y Creasey, y col., 1986, 1988, proporcionan ejemplos de secuencias de interferones híbridos. Stabinsky, 1990, proporciona ejemplos de secuencias de interferones consenso. Ejemplos de secuencias de interferón alfa se presentan en Capon, 1983, Dworkin-Rastl, 1989, Sato, 1988 y Sloma, 1988. Secuencias de interferón alfa y beta adicionales se proporcionan en Fish, 1992. También se pueden obtener secuencias adecuadas del GenBank u otros depositarios públicos de secuencias.

La determinación de la posición del resto de aminoácido del interferón de tipo I no tau con el cual comienza el segmento del extremo 3' o C-terminal se lleva a cabo mediante el alineamiento óptimo de las secuencias parentales y diseñando una unión de modo que la secuencia de la molécula quimérica de interferón resultante esté alineada perfectamente con (i) la secuencia de interferón tau parental en el segmento del extremo 5' o N-terminal y (ii) la secuencia de interferón de tipo I no tau parental en el segmento del extremo 3' o C-terminal. Las secuencias parentales, por supuesto, son las secuencias de interferón a partir de las cuales derivan el segmento del extremo 5' o N-terminal y el segmento del extremo 3' o C-terminal.

La posición del resto en el interferón de tipo I no tau con el cual comienza el segmento del extremo 3' o C-terminal es típicamente el número siguiente al último resto de aminoácido del segmento del extremo 5' o N-terminal de IFN-tau.

Las realizaciones preferidas de la presente invención son proteínas de fusión donde las secuencias tanto del segmento N-terminal como del C-terminal derivan de secuencias de interferón humano. Por ejemplo, construcciones donde los primeros 28 aminoácidos corresponden a los primeros 28 aminoácidos de la ID. SEC. Nº: 15 o ID. SEC. Nº: 35 y la secuencia restante corresponde a la de un interferón alfa o beta humano. Las secuencias de interferón tau humano se presentan, por ejemplo, en Bazer, y col., 1994. Las secuencias de interferón alfa y beta se pueden obtener del GenBank.

Se apreciará que aunque las proteínas de fusión de interferón descritas son proteínas "maduras", esto es, comienzan con el resto 24 de la secuencia de interferón completa, la invención también incluye proteínas de fusión y moléculas quiméricas de ácido nucleico que codifican proteínas de fusión que contienen la secuencia líder, es decir, que comienzan con la metionina de iniciación. La secuencia líder en estas proteínas de fusión de interferón puede derivar a partir de interferón de tipo I tau o no tau.

Además, se entenderá que las secuencias tanto del primero como del segundo fragmento pueden ser secuencias "consenso". En otras palabras, la secuencia del segmento 5', podría no corresponder a un IFN\tau "natural", sino a una secuencia consenso obtenida mediante la comparación de secuencias alineadas de varios IFN\tau diferentes. De forma similar, la secuencia del segmento 3' podría no corresponder a un IFN de tipo I no tau "natural", sino a una secuencia consenso obtenida mediante la comparación de secuencias alineadas de varios IFN de tipo I no tau.

Alternativamente, la secuencia de cualquier fragmento puede corresponder a una secuencia "internamente consistente", es decir, a una secuencia donde cada posición en la secuencia contiene un resto que se encuentra en al menos una isoforma de origen natural de un IFN\tau (para el segmento N-terminal) o un IFN de tipo I no tau (para el segmento C-terminal) en esa posición, pero donde la secuencia final no corresponde a ninguna isoforma de origen natural ni a ninguna secuencia consenso. Por ejemplo, si dos isoformas, cada una de 3 aminoácidos de longitud, tienen las secuencias "C R S" y "C K G", una secuencia internamente consistente es "C R G".

Además, se apreciará que la presente invención también incluye más quimeras complejas, por ejemplo, quimeras que contienen más de una región discreta derivada del IFN\tau y/o más de una región de otro interferón adecuado. Estas quimeras pueden originarse, por ejemplo, en casos donde el interferón de tipo I no tau que comprende el segundo segmento (C-terminal) es en sí mismo un interferón híbrido formado de, por ejemplo, un interferón alfa y un interferón beta (Creasey, y col., 1986, 1988), un interferón alfa1 y un interferón alfa2 (Leibowitz, y col., 1990) o un interferón alfa y un interferón omega (Gunther, y col., 1990).

Como se ha indicado anteriormente, una considerable ventaja contemplada para las composiciones de proteínas de fusión de interferón híbrido de la presente invención es la reducida toxicidad de las composiciones con respecto a los interferones de tipo I no tau nativos que, por ejemplo, se han aprobado como terapéuticos. Las composiciones de híbridos pueden tener la misma actividad biológica que los interferones de tipo I no tau aprobados con la citotoxicidad disminuida del IFNtau.

Las moléculas de ácido nucleico quiméricas pueden producirse sintéticamente o con protocolos y manipulaciones moleculares convencionales (Ausubel, y col., 1988; Sambrook, y col., 1989) como se ilustra en este documento. Las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos parentales (los dos polipéptidos a partir de cuyas secuencias derivan los dos segmentos que forman la proteína híbrida) se clonan adyacentes el uno del otro en un vector de expresión usando procedimientos de recombinación convencionales (por ejemplo, mediante el diseño de sitios de restricción que no alteren la secuencia de aminoácidos traducida dentro de las secuencias de ADN, la digestión de los plásmidos y la clonación de fragmentos apropiados en el vector de expresión seleccionado). Ejemplos de vectores de expresión adecuados se han descrito anteriormente.

Los polipéptidos de fusión de interferón híbrido recombinante se producen entonces a partir de tales vectores de expresión como se ha descrito anteriormente, se purifican y se emplean para el tratamiento de enfermedades y/o dolencias que se benefician del tratamiento con interferón.

IV. Modelado de proteínas y modificaciones proteicas

Los datos de las secciones anteriores demuestran la identificación de péptidos sintéticos que tienen cuatro sitios discontinuos en la proteína de OvIFN\tau que están implicados en la interacción con el receptor y en la actividad biológica. Para explicar la relación estructural de estas regiones, se abordó el modelado de la estructura tridimensional del IFN\tau. Un modelo tridimensional podría ser útil para la interpretación de datos existentes y el diseño de futuros estudios de estructura/función.

A. Modelado molecular de la proteína

Combinando los datos de dicroismo circular (DC) del OvIFN\tau recombinante de longitud completa y del IFN\beta (una proteína de estructura tridimensional conocida (Senda, y col., 1992)), se construyó un modelo de OvIFN\tau. La característica más llamativa de este modelo es que IFN\tau está dentro de una clase de proteínas con un motivo de cuatro hélices empaquetadas. Los espectros de DC del IFN\tau se tomaron en un espectropolarímetro AVIV 60 S. Se emplearon dos procedimientos diferentes para las estimaciones de la estructura secundaria, el algoritmo de Perczel, y col., (1991) y la selección variable de W.C. Johnson, Jr. (1992).

Las estimaciones de la estructura secundaria de los espectros indican el 70-75% de alfa hélice (caracterizada por mínimos a 222 y 208 nm y máximo a 190 nm). El algoritmo de selección variable estima que el resto de la molécula es el 20% beta laminar y 10% de giro. El método de Chang estima que el resto es el 30% de espiral al azar. El alineamiento de las secuencias de IFN\tau e IFN\beta reveló homología entre las dos moléculas, específicamente entre las regiones de estructura helicoidal conocida en IFN\beta. El análisis de la secuencia de IFN\tau también demostró que las regiones helicoidales propuestas poseen una periodicidad apolar indicativa de un motivo de cuatro hélices empaquetadas.

La etapa final de modelado fue aplicar los coordinados cristalográficos por rayos x de IFN\beta del esqueleto de carbono de IFN\beta a la secuencia del IFN\tau. Los dominios funcionalmente activos del IFN\tau, identificados anteriormente, se localizaban en un lado de la molécula y se encontró que estaban en estrecha proximidad espacial. Esto es consistente con los múltiples sitios de unión en IFN\tau que interaccionan simultáneamente con el receptor de IFN de tipo I.

Los datos de modelado tridimensional combinados con los datos de función descritos anteriormente, proporcionan la información necesaria para introducir variaciones de secuencia en regiones específicas del IFN\tau para potenciar funciones seleccionadas (por ejemplo, antivírica o antiproliferación celular) o para sustituir una región o regiones de función seleccionada en otra molécula de interferón (por ejemplo, antivírica, antineoplásica o citotoxicidad reducida).

B. Tratamientos de recombinación y sintéticos

La construcción de un gen sintético para OvIFN\tau se describe en el Ejemplo 3. Brevemente, una secuencia de aminoácidos de OvIFN\tau se retrotranscribió a partir de un ADNc de OvIFN\tau (Imakawa, y col., 1987) usando un uso de codones óptimos para E. coli. La secuencia se editó para incluir 20 únicos sitios de restricción espaciados a lo largo de la longitud de la construcción. Esta secuencia del gen sintético de 540 pares de bases se dividió en 11 fragmentos de oligonucleótidos. Se sintetizaron y clonaron los fragmentos individuales, de cadena sencilla o doble, en pTZ 19R, pTZ 18R o pBluescript, se amplificaron y se fusionaron. La construcción de OvIFN\tau sintético se clonó entonces en un vector de expresión pIN-III-ompA modificado para la expresión en bacterias y también se clonó en un plásmido de expresión de levadura. Un gen sintético de IFNr humano construido de forma similar (ID. SEC. Nº: 3) se ha diseñado, construido y expresado en células de levadura.

La expresión del gen sintético de OvIFN\tau en levaduras (Ejemplo 4) permitió la sobreproducción de IFN\tau recombinante en S. cerevisiae: se pueden purificar grandes cantidades (5-20 mg/l) de IFN\tau recombinante a partir de extracto soluble de levadura usando de forma secuencial cromatografía de intercambio iónico y de exclusión molecular. El IFN\tau recombinante purificado de esta forma muestran una potente actividad antivírica (2 a 3 x 10^{8} unidades/mg) similar al OvIFN\tau nativo.

La construcción del gen sintético facilita la introducción de mutaciones para una posible potenciación de las actividades antitumoral (antiproliferativa celular) y antivírica. Además las regiones dispares de la molécula, responsables de las diferentes funciones se pueden modificar independientemente para generar una molécula con una función deseada. Por ejemplo, se han construido dos mutantes de deleción, OvIFN\tau(1-162) y OvIFN\tau(1-166) para examinar la fusión de las secuencias carboxi terminales en moléculas de IFN\tau.

Se han construido moléculas de IFN\tau mutantes adicionales para identificar restos críticos para la actividad antiproliferativa. Por ejemplo, un resto en particular, TYR 123 se ha implicado en la actividad antiproliferativa celular del IFN\alpha (MacInnes, y col., 1989). El equivalente de la TYR 123 en el IFN\tau está contenido en el péptido OvIFN\tau(119-150): este polipéptido inhibe la actividad antiproliferativa de OvIFN\tau y de IFN\alpha humano. Se han generado mutaciones que convierten la TYR 123 en sustituciones conservativas (TRP) y no conservativas (ASP), así como secuencias mutantes con la deleción de este resto. El codon para la TYR 123 se localiza en un sitio SspI; se ha usado la eliminación de este sitio para la selección. La actividad antiproliferativa de estos IFN\tau mutantes se evaluaron como se describe en este documento.

Se pueden generar péptidos sintéticos que corresponden a los polipéptidos de IFN\tau de la presente invención. Los péptidos sintéticos pueden sintetizarse comercialmente o prepararse utilizando procedimientos y aparatos convencionales en la técnica (Applied Biosystems, Foster City CA).

Alternativamente, las secuencias de oligonucleótidos que codifican péptidos pueden sintetizarse bien directamente por procedimientos convencionales de síntesis de oligonucleótidos, o bien, en el caso de grandes secuencias codificadoras, sintetizarse mediante una serie de etapas de clonación que implican un ordenamiento en tándem de múltiples fragmentos de oligonucleótidos en la secuencia codificadora (Crea, 1989; Yoshio, y col., 1989; Eaton, y col., 1988). Las secuencias codificadoras de oligonucleótidos se pueden expresar por procedimientos convencionales de recombinación (Maniads, y col., 1982; Ausubel, y col., 1988).

Las actividades biológicas de los polipéptidos de interferón-\tau descritos anteriormente pueden explotarse usando los polipéptidos de interferón-\tau solos o conjugados o fusionados con otras proteínas como se ha descrito anteriormente y más adelante.

V. Producción de proteínas de fusión

También se describe interferón-\tau unido covalentemente a un segundo polipéptido para formar una proteína de fusión o híbrida. Las secuencias de interferón-\tau para construir estas proteínas de fusión puede ser interferón-\tau producido de forma recombinante o una porción bioactiva de él, como se ha descrito anteriormente.

Por ejemplo, donde se usa el interferón-\tau para inhibir la expresión vírica, pueden fusionarse de forma ventajosa polipéptidos derivados de IFN\tau que demuestren actividad antivírica con un polipéptido de interferón alfa. En una realización, descrita anteriormente con referencia a polipéptidos de fusión de interferón híbrido, los polipéptidos de IFN\tau proporcionan un procedimiento de reducción de la toxicidad de otras moléculas de interferón (por ejemplo, IFN\beta o IFN\alpha) reemplazando la región asociada con la toxicidad de tales interferones por las correspondientes regiones del interferón-\tau que tienen más baja toxicidad. También se describen proteínas de fusión que contienen regiones de interferón-\tau que tienen propiedades de antiproliferación celular. Estas regiones pueden obtenerse a partir, por ejemplo, de secuencias de interferón-\tau humano, descritas en este documento.

Las proteínas fusionadas pueden formarse mediante conjugación química o mediante técnicas de recombinación. En el primer procedimiento, el interferón y el segundo polipéptido seleccionado se modifican mediante agentes de acoplamiento convencionales para la unión covalente. En un ejemplo de procedimiento para acoplar albúmina de suero soluble a un polipéptido de interferón, se deriva la albúmina de suero con tioacetato de N-succinimidil-S-acetilo (Duncan, y col., 1983), rindiendo albúmina de suero tiolada. El polipéptido de albúmina de suero activado se hace reaccionar entonces con interferón derivado con 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (Cumber, y col., 1985) para producir la proteína fusionada unida a través de un puente disulfuro.

Como procedimiento alternativo, el interferón recombinante puede prepararse con un resto de cisteína para permitir el acoplamiento disulfuro del interferón a un ligando activado, simplificando de este modo la reacción de acoplamiento. Un vector de expresión de interferón-\tau, usado para la producción de interferón-\tau recombinante, puede modificarse para la inserción de un codon de cisteína interno o terminal según procedimientos convencionales de mutagénesis dirigida a sitio (Ausubel, y col., 1988).

En un procedimiento, una proteína fusionada se prepara de forma recombinante usando un vector de expresión en el que la secuencia codificadora de un segundo polipéptido seleccionado se une a la secuencia codificadora del interferón-\tau. Por ejemplo, las secuencias que codifican la albúmina sérica humana se pueden fusionar en marco con la secuencia codificadora de un polipéptido de interferón-\tau, tales como, ID. SEC. Nº: 9, ID. SEC. Nº: 19 o ID. SEC. Nº: 39. La proteína fusionada se expresa entonces usando una célula hospedadora adecuada. La proteína de fusión puede purificarse mediante procedimientos de cromatografía de exclusión molecular e intercambio iónico, con la purificación adicional mediante la separación electroforética en gel de poliacrilamida y/o cromatografía HPLC, si es necesario.

Se apreciará de lo anterior cómo pueden prepararse proteínas de fusión que contengan interferón-\tau. Una variación sobre la fusión anterior es intercambiar posiciones del interferón-\tau y de la segunda molécula de proteína seleccionada en la proteína de fusión (por ejemplo, fusiones del extremo carboxi terminal frente al extremo amino terminal). Además, posiciones internas de un polipéptido de interferón-\tau nativo (por ejemplo, regiones de aminoácidos de entre 15 y 172 aminoácidos) se pueden ensamblar en polipéptidos donde dos o más de tales porciones de interferón-\tau, que normalmente están discontinuas en la proteína nativa, están contiguas.

VI. Anticuerpos reactivos con interferón-\tau

Las proteínas de fusión que contienen los antígenos de polipéptidos de la presente invención fusionados con la proteína glutatión-S-transferasa (Sj26) pueden expresarse usando el sistema vector pGEX-GLI en células E. coli JM101. La proteína Sj26 fusionada puede aislarse fácilmente mediante una cromatografía de afinidad con el sustrato glutatión (Smith, D.B., y col., 1988). La expresión y purificación parcial de las proteínas de IFN se describe en el Ejemplo 21 y se puede aplicar a cualquiera de los polipéptidos solubles inducidos codificados por secuencias descritas en la presente invención.

Las proteínas de fusión GST (Sj26) insolubles pueden purificarse mediante electroforesis preparativa en gel.

También se incluye en la invención un vector de expresión, tales como los vectores lambda gt11 de pGEX descritos anteriormente, que contienen las secuencias codificadoras de IFN\tau y los elementos de control de la expresión que permiten la expresión de las regiones codificadoras en un hospedador adecuado. Los elementos de control generalmente incluyen un promotor, un codon de iniciación de la traducción y secuencias de terminación de la transcripción y traducción, y un sitio de inserción para introducir el inserto en el vector.

El ADN que codifica el polipéptido deseado se puede clonar en muchos vectores (discutido anteriormente) para generar la expresión del polipéptido en el sistema hospedador apropiado. Estos polipéptidos recombinantes se pueden expresar como proteínas de fusión. Pueden diseñarse vectores de expresión con varios elementos, tales como secuencias líderes que promueven la secreción de las secuencias expresadas en el medio de cultivo. Los IFN producidos de forma recombinante, y los polipéptidos derivados de ellos, se aíslan típicamente a partir de las células lisadas o de los medios de cultivo. La purificación puede realizarse mediante procedimientos conocidos en la técnica incluyendo el fraccionamiento salino, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad. Puede emplearse cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos generados contra antígeno seleccionados de IFN\tau o interferón hibrido.

VII. Utilidad A. Propiedades antivíricas

Los interferones de tipo I muestran potentes propiedades antivíricas. La actividad antivírica del IFN\tau tiene amplias aplicaciones terapéuticas sin los efectos tóxicos que se asocian generalmente con los IFN\alpha. Aunque la presencia de IFN\tau en el medio de cultivo inhibía la actividad transcriptasa inversa del virus de la inmunodeficiencia felina (Ejemplo 11), esto no se debe a un efecto directo del IFN\tau sobre la transcriptasa inversa. Antes bien, parece que el IFN\tau induce en la célula hospedadora la producción de un factor o factores que inhiben la transcriptasa inversa del virus.

Se ha encontrado que el IFN\tau ejerce su actividad antivírica sin efectos adversos sobre las células: no se han observado evidencias de efectos citotóxicos atribuibles a la administración de IFN\tau. Es la falta de citotoxicidad del IFN\tau lo que le hace extremadamente valioso como agente terapéutico in vivo. Esta falta de citotoxicidad diferencia al IFN\tau de la mayoría de los otros agentes antivíricos conocidos y de todos los demás interferones conocidos.

Se pueden usar formulaciones que comprenden compuestos de fusión de interferón híbrido de la presente invención que contienen IFN\tau para inhibir la replicación vírica.

Los polipéptidos de fusión de interferón híbrido de la presente invención pueden emplearse en procedimientos que afectan a la relación inmune entre el feto y la madre, por ejemplo, para prevenir la transmisión de virus maternos (por ejemplo, VIH) al feto en desarrollo. Las composiciones de interferón humano son particularmente útiles para el tratamiento de humanos, ya que son menos probables las respuestas antigénicas potenciales usando una proteína homóloga.

B. Propiedades de antiproliferación celular

Los interferones de tipo I muestran una potente actividad antiproliferación celular. Interferones híbridos tales como los que se describen en este documento pueden usarse también para inhibir el crecimiento celular sin los efectos secundarios negativos asociados con otros interferones que se conocen actualmente. Pueden usarse formulaciones que comprenden los compuestos de interferón híbrido de la invención en cuestión para inhibir, prevenir o ralentizar el crecimiento tumoral.

El desarrollo de ciertos tumores está mediado por estrógenos. Experimentos realizados como apoyo a la presente invención indican que el IFN\tau puede suprimir numerosos receptores de estrógenos. Por tanto, pueden usarse composiciones que contienen IFN\tau en el tratamiento o prevención de tumores dependientes de estrógenos.

C. Trastornos del sistema inmunitario

Las enfermedades que se pueden tratar usando procedimientos de la presente invención incluyen enfermedades autoinmunes, inflamatorias, proliferativas e hiperproliferativas, así como manifestaciones cutáneas de enfermedades mediadas inmunológicamente. En particular, los procedimientos de la presente invención son ventajosos para tratar dolencias relacionadas con la hipersensibilidad del sistema inmunitario. Hay cuatro tipos de hipersensibilidad del sistema inmunitario (Clayman). El tipo I, o hipersensibilidad inmediata/anafiláctica, se debe a la desgranulación de mastocitos en respuesta a un alergeno (por ejemplo, polen), e incluye asma, rinitis alérgica (fiebre del heno), urticaria (ronchas), choque anafiláctico y otras enfermedades de naturaleza alérgica. El tipo II, o hipersensibilidad autoinmune, se debe a anticuerpos que se dirigen contra "antígenos" detectados en las células del propio cuerpo. La hipersensibilidad de tipo III se debe a la formación de complejos inmunes antígeno/anticuerpo que se depositan en diversos tejidos y activan respuestas inmunes adicionales, y es responsable de dolencias tales como la enfermedad del suero, alveolitis alérgica y los grandes hinchazones que a veces se forman después de las vacunaciones de refuerzo. La hipersensibilidad de tipo IV se debe a la liberación de linfoquinas de linfocitos T sensibilizados, lo que da lugar a una reacción inflamatoria. Los ejemplos incluyen dermatitis de contacto, la erupción del sarampión y reacciones "alérgicas" a ciertos medicamentos.

Los mecanismos por los cuales ciertas dolencias pueden dar lugar a hipersensibilidad en algunos individuos generalmente no se entienden bien, pero pueden implicar tanto factores genéticos como extrínsecos. Por ejemplo, bacterias, virus o medicamentos pueden tener una función importante en el desencadenamiento de una respuesta inmune en un individuo que ya tiene una predisposición genética al trastorno autoinmune. Se ha sugerido que la incidencia de algunos tipos de hipersensibilidad puede estar correlacionada con otros. Por ejemplo, se ha propuesto que individuos con ciertas alergias comunes son más susceptibles a trastornos autoinmunes.

Los trastornos autoinmunes se pueden agrupar aproximadamente en aquellos restringidos principalmente a órganos o tejidos específicos y aquellos que afectan al cuerpo entero. Ejemplos de trastornos específicos de órgano (con el órgano afectado) incluyen esclerosis múltiple (procesos de mielinización del nervio), diabetes mellitus de tipo I (páncreas), tiroiditis de Hashimoto (glándula del tiroides), anemia perniciosa (estómago), enfermedad de Addison (glándulas adrenales), miastenia grave (receptores de acetilcolina en las uniones neuromusculares), artritis reumatoide (revestimiento de la articulación), uveítis (ojo), psoriasis (piel), síndrome de Guillain-Barré (células nerviosas) y enfermedad de Grave (tiroides). Las enfermedades autoinmunes sistémicas incluyen lupus eritematoso sistémico y dermatomiositis.

Otros ejemplos de trastornos de hipersensibilidad incluyen asma, eccema, dermatitis atópica, dermatitis de contacto, otras dermatitis eccematosas, dermatitis seborreica, rinitis, liquen plano, pénfigo, penfigoide ampollar, epidermólisis ampollar, urticaria, angiodermas, vasculitis, eritemas, eosinofilias cutáneas, alopecia areata, ateroesclerosis, cirrosis biliar primaria y síndrome nefrótico. Las enfermedades relacionadas incluyen inflamaciones intestinales, tales como enfermedad celiaca, proctitis, gastroenteritis eosinofílica, mastocitosis, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa, así como alergias relacionadas con los alimentos.

Enfermedades autoinmunes particularmente sensibles al tratamiento usando los procedimientos de la presente invención incluyen esclerosis múltiple, diabetes mellitus de tipo I (dependiente de insulina), lupus eritematoso, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, estomatitis, asma, uveítis, alergias y psoriasis.

Pueden usarse medicamentos que contienen IFNhib para tratar terapéuticamente y, por tanto, aliviar los síntomas de trastornos autoinmunes tales como aquellos descritos anteriormente.

D. Composiciones farmacéuticas

Los polipéptidos de fusión de interferón híbrido de la presente invención pueden formularse según procedimientos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. Se han descrito previamente formulaciones que comprenden compuestos de interferones o semejantes a interferones (por ejemplo, Martin, 1976). En general, las composiciones de la invención en cuestión se formularán de modo que una cantidad eficaz del interferón híbrido se combina con un vehículo adecuado para facilitar la administración eficaz de la composición.

Las composiciones usadas en estas terapias pueden estar también en una diversidad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación sólidas, semisólidas y líquidas, tales como comprimidos, píldoras, polvos, soluciones o suspensiones líquidas, liposomas, supositorios, soluciones inyectables y soluciones infundibles. La forma preferida depende del modo de administración deseado y de la aplicación terapéutica. Las composiciones también incluyen preferiblemente vehículos y adyuvantes farmacéuticamente aceptables convencionales que son conocidos por aquellos expertos en la materia. Preferiblemente, las composiciones de la invención están en forma de una única dosis y se administrará generalmente al paciente una o más veces al día.

Los polipéptidos de fusión de interferón híbrido pueden administrarse a un paciente en cualquier forma de dosificación farmacéuticamente aceptable, incluyendo bebible, inhalación, pulverizador intranasal, inyección intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, intralesional o subcutánea. Pueden usarse específicamente composiciones y procedimientos usados para otros compuestos de interferón para la administración de estos compuestos.

Una ventaja principal de estos compuestos de la invención en cuestión, sin embargo, es la extremadamente baja citotoxicidad de las proteínas de IFN\tau. Debido a esta baja citotoxicidad, es posible administrar las composiciones de interferón híbrido a concentraciones que son mayores que las que generalmente se pueden utilizar para otros compuestos de interferón (por ejemplo, IFN\alpha). De este modo, se contempla que las composiciones de interferón híbrido de la presente invención pueden administrarse a tasas de aproximadamente 5 x 10^{4} a 20 x 10^{6} unidades/día a aproximadamente 500 x 10^{6} unidades/día o más. En una realización preferida, la dosificación es de aproximadamente 20 x 10^{6} unidades/día. Se prefieren altas dosis para la administración sistémica. Debe entenderse, por supuesto, que las composiciones y procedimientos de esta invención pueden usarse en combinación con otras terapias.

Una vez se ha producido la mejora de la dolencia del paciente, si es necesario se administra una dosis de mantenimiento. Posteriormente, la dosificación o la frecuencia de administración, o ambas, pueden reducirse, en función de los síntomas, a un nivel al cual se mantiene la dolencia mejorada. Cuando los síntomas se han aliviado al nivel deseado, el tratamiento debe cesar. Los pacientes pueden, sin embargo, necesitar tratamiento intermitente a largo plazo en función de cualquier recurrencia de los síntomas de la enfermedad.

Las composiciones de la invención en cuestión pueden administrarse mediante procedimientos convencionales para tratar una diversidad de cánceres y enfermedades víricas incluyendo aquellas para las cuales otros interferones han demostrado previamente actividad. Véase, por ejemplo, Finter, y col., 1991; Dianzani, 1992; Francis, y col., 1992 y las Patentes de EE. UU. Nº 4.885.166 y 4.975.276. Sin embargo, como se ha planteado anteriormente, las composiciones de la invención en cuestión tienen características y ventajas únicas, incluyendo la capacidad para tratar estas dolencias sin toxicidad.

E. Tratamiento de trastornos de la piel

Los trastornos de la piel pueden tratarse de forma intralesional usando interferones híbridos de la presente invención, en el que la formulación y dosis dependerá del procedimiento de administración y del tamaño y gravedad de la lesión que se va a tratar. Los procedimientos preferidos incluyen inyecciones intradérmicas y subcutáneas. Pueden ser posibles múltiples inyecciones en lesiones grandes, y pueden tratarse a la vez varias lesiones en la piel de un único paciente. El programa para la administración puede determinarse por una persona experta en la materia. Las formulaciones diseñadas para liberación mantenida puede reducir la frecuencia de administración.

F. Tratamiento sistémico

El tratamiento sistémico es esencialmente equivalente para todas las aplicaciones. Son posibles dosis intravenosas, subcutáneas y/o intramusculares múltiples, y en el caso de procedimientos con implantes para tratamiento, son particularmente útiles las formulaciones diseñadas para liberación mantenida. Los pacientes pueden tratarse usando portales, depósitos o bombas subcutáneas implantables.

G. Tratamiento regional

El tratamiento regional con los polipéptidos de fusión de interferones híbridos de la presente invención es útil para el tratamiento de cánceres en órganos específicos. El tratamiento puede llevarse a cabo mediante infusión intraarterial. Puede implantarse quirúrgica o angiográficamente un catéter para dirigir el tratamiento al órgano afectado. Se puede usar un portal subcutáneo conectado al catéter para el tratamiento crónico, o se puede emplear también una bomba recargable implantable.

Los siguientes ejemplos ilustran, aunque de ninguna forma pretenden limitar la presente invención.

Materiales y procedimientos

Las endonucleasas de restricción, ADN ligasa de T4, polinucleótido quinasa de T4, ADN polimerasa Taq y fosfatasa intestinal de ternera se adquirieron de New England Biolabs (Beverly, MA) o Promega Biotech (Madison, WI): estos reactivos se usaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para las reacciones de secuenciación, se usó un kit de secuenciación "SEQUENASE DNA II" (United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH). Los reactivos de inmunotransferencia y otros eran de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) o Fisher Scientific (Needham, MA). Los filtros de nitrocelulosa se obtienen de Schleicher y Schuell (Keene, NH).

Los conectores y cebadores de oligonucleótidos sintéticos se preparan usando sintetizadores de oligonucleótidos automatizados disponibles en el mercado (por ejemplo, un sintetizador de ADN ABI modelo 380B-02 (Applied Biosystems, Foster City, CA)). De forma alternativa, pueden adquirirse oligonucleótidos sintéticos diseñados de encargo, por ejemplo, de Synthetic Genetics (San Diego, CA). El kit de síntesis de ADNc y los kit de marcaje de cebadores aleatorios se obtienen de Boehringer-Mannheim Biochemical (BMB, Indianapolis, IN).

Las secuencias de oligonucleótidos que codifican los polipéptidos pueden sintetizarse directamente mediante procedimientos convencionales de síntesis de oligonucleótidos o, en el caso de secuencias codificadoras grandes, sintetizarse mediante una serie de etapas de clonación que implican un ordenamiento en tándem de fragmentos múltiples de oligonucleótidos correspondientes con la secuencia codificadora (Crea, 1989; Yoshio, y col., 1989; Eaton, y col., 1988). Las secuencias codificadoras de oligonucleótidos pueden expresarse mediante procedimientos de recombinación convencionales (Maniatis, y col., 1982; Ausubel, y col., 1988). De forma alternativa, los péptidos pueden sintetizarse directamente mediante técnicas in vitro convencionales (Applied Biosystems, Foster City,
CA).

El IFN\alpha humano recombinante (rHuIFN\alpha) y rBoIFN\gamma se obtuvieron de Genentech Inc. (South San Francisco, CA). La preparación de referencia del IFN\alpha humano recombinante (rHuIFN\alpha) se obtuvo de los Institutos Nacionales de la Salud: el rHuIFN\alpha está disponible en el mercado en Lee Biomolecular (San Diego, CA). El IFN\alphaA humano recombinante purificado (2 x 10^{8} unidades/mg) se obtuvo de Biosource International (Camarillo, CA). A menos que se indique lo contrario, la concentración de proteína se determinó con un kit de ensayo de ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, IL) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Las manipulaciones comunes implicadas en la obtención de anticuerpos policlonales y monoclonales, incluyendo la purificación de anticuerpos a partir de los sueros, se realizan mediante procedimientos convencionales (Harlow, y col., 1988). Pierce (Rockford, IL) es fuente de muchos reactivos de anticuerpos.

Los anticuerpos antipéptido de conejo purificados por afinidad específicos de Tyk2, Stat1\alpha y Stat2 se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). El anticuerpo monoclonal antifosfotirosina (4G10) se obtuvo de Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY). Las transferencias por Western se desarrollaron con un kit de detección de quimioluminiscencia potenciada (ECL) (Amersham Corp., Arlington Heights, IL).

La línea celular de riñón bovino MDBK y la línea celular de linfoma de Burkitt humano Daudi se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD). Las células Daudi se crecieron en medio RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal al 20% y antibióticos (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD). Las células MDBK se crecieron en medio mínimo esencial de Eagle (EMEM) complementado con suero de caballo al 10% y antibióticos (Gibco/BRL).

Todos los medios de cultivo tisular, sueros y los IFN usados en este estudio eran negativos para la endotoxina, como se determinó mediante el ensayo con lisado de amebocito de Limulus (Associates of Cape Cod, Woods Hole, MA) a un nivel de sensibilidad de 0,07 ng/ml.

Protocolo general de ELISA para la detección de anticuerpos

Se cubrieron placas de 96 pocillos de poliestireno Immulon II (PGC) con 5 \mug/ml (100 \mul por pocillo) de antígeno en tampón carbonato/bicarbonato 0,1 M, pH 9,5. Las placas se sellaron con parafilm y se conservaron a 4ºC durante una noche.

Las placas se aspiraron y se bloquearon con 300 \mul de NGS al 10% y se incubaron a 37ºC durante 1 h.

Las placas se lavaron 5 veces con PBS con "TWEEN-20" al 0,5%.

Los antisueros se diluyeron en PBS 0,1 M, pH 7,2. Se añadieron la dilución o diluciones deseadas de los antisueros (0,1 ml) a cada pocillo y se incubó la placa 1 hora a 37ºC. Entonces se lavaron las placas 5 veces con PBS con "TWEEN-20" al 0,5%.

El antisuero antihumano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) (Cappel) se diluyó 1/5.000 en PBS. Se añadieron 0,1 ml de esta solución a cada pocillo. Se incubaron las placas 30 min a 37ºC, luego se lavaron 5 veces con PBS.

El ABTS (sustrato) de Sigma se preparó justo antes de añadirlo a la placa.

El reactivo contiene 50 ml de ácido cítrico 0,05 M, pH 4,2, 0,078 ml de solución de peróxido de hidrógeno al 30% y 15 mg de ABTS. Se añadieron 0,1 ml del sustrato a cada pocillo y se incubó entonces durante 30 min a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con la adición de 0,05 ml de SDS al 5% (p/v). La absorbancia relativa se determina a 410 nm.

Ejemplo 1 Funciones reproductoras del IFN\tau

Se examinó el efecto del interferón-\tau en la vida del cuerpo lúteo.

Se infundió IFN\tau en el lumen uterino de ovejas a las concentraciones dadas en la Tabla 1. Se infundió IFN\alpha humano recombinante (rHuIFN\alpha) a concentraciones similares. Además, también se usaron animales de control que recibieron proteínas de control. Se valoró la vida del cuerpo lúteo mediante el examen de los intervalos interestro, el mantenimiento de la secreción de progesterona y la inhibición de la secreción de prostaglandina (Davis, y col., 1992).

TABLA 1 Efecto de los interferones en la fisiología reproductora

Interferón	Tratamiento	Intervalo interestro (días) (Medias)
Control	-	17,3
	100 \mug/día	16,0
rHuIFN\alpha	200 \mug/día	16,0
	2000 \mug/día	19,0
OvIFN\tau	100 \mug/día	27,2

La comparación de los intervalos interestro de los animales de control y de los animales que recibieron OvIFN\tau demostró una prolongación considerable del intervalo cuando el IFN\tau se administraba a 100 \mug/día. Por otro lado, la comparación de los intervalos interestro de los animales de control y de los animales que recibieron IFN\alpha humano recombinante demostró que rHuIFN\alpha no tenía efecto significativo.

Estos resultados demuestran que el interferón-\tau tiene la capacidad de influir significativamente los sucesos bioquímicos del ciclo reproductor.

Ejemplo 2 Propiedades antivíricas del interferón-\tau en diversas etapas del ciclo reproductor

Se establecieron cultivos embrionarios usando embriones obtenidos de ovejas en los días 12 a 16 del ciclo estro. Se valoró la actividad antivírica del sobrenadante de cada cultivo embrionario usando un ensayo del efecto citopático (Familetti, y col., 1981). Brevemente, diluciones de IFN\tau u otros IFN se incubaron con células de riñón bovino Madin-Darby (MDBK) de 16-18 horas a 37ºC. Tras la incubación, se determinó la replicación vírica en un ensayo de efecto citopático usando el virus de la estomatitis vesicular (VEV) como virus de estimulación (Armstrong, 1981).

Una unidad antivírica provoca una reducción del 50% en la destrucción de la monocapa, con respecto a las células MDBK sin tratar infectadas con VEV (placas de control). Las actividades específicas se evaluaron adicionalmente usando fibroblastos ovinos normales (Shnf) en un ensayo de inhibición de placa (Langford, y col., 1981). Se examinaron un mínimo de tres muestras para cada punto de tiempo y cada muestra se ensayó por triplicado. Los resultados presentados en la Tabla 2 se expresan como la media de unidades/ml.

TABLA 2 Actividad antivírica del IFN\tau de cultivos embrionarios y líquidos alantoico y amniótico

	Día	Muestras	Unidades/ml
	10	9	<3
	12	5	34
Cultivos embrionarios	13	6	4,5 x 10^{3}
	14	3	7,7 x 10^{3}
	16	12	2,0 x 10^{6}

TABLA 2 (continuación)

	Día	Muestras	Unidades/ml
	60	3	1,4 x 10^{3}
Líquido alantoico	100	4	11
	140	3	<3
Líquido amniótico	60	3	22
	100	4	<3

Los sobrenadantes de los cultivos tenían la actividad antivírica aumentada asociado con el desarrollo avanzado de los embriones (Tabla 2).

Ejemplo 3 Expresión de IFN\tau en bacterias

Se usó la secuencia codificadora de aminoácidos para OvIFN\tau (Imakawa, y col., 1987) para generar una secuencia codificadora de ADN correspondiente con el uso de codones optimizado para la expresión en E. coli. Se añadieron las secuencias conectoras a los extremos 5' y 3' para facilitar la clonación en vectores de expresión bacterianos. La secuencia de nucleótidos se diseñó para incluir 19 sitios de enzimas de restricción únicos espaciados uniformemente a lo largo de la secuencia codificadora (Figuras 1A y 1B).

La secuencia de nucleótidos se dividió en once fragmentos de oligonucleótidos que oscilaban en tamaño de 33 a 75 bases. Cada uno de los once oligonucleótidos se sintetizaron en un sintetizador de ADN 380-B 2-columna (Applied Biosystems) y se clonaron como cadena sencilla o cadena doble en uno de los siguientes vectores: vectores de clonación "pBLUESCRIPT^{+}(KS)" (Stratagene, La Jolla, CA), pTZ18R (Pharmacia, Piscataway, NJ) o pTZ19R (Pharmacia, Piscataway, NJ).

Los vectores se transformaron en la cepa "XL1-BLUE" de E. coli K. (recA1, endA1 gyrA96 thi hsdR17 (r_{k}^{-}, m_{k}+) supE44 rela1 \lambda-(lac), {F', proAB, lac^{q}Z\DeltaM15, Tn10(tet^{R})}) que está disponible en el mercado en Stratagene (La Jolla, CA). Las linfocitos Transfectadas se crecieron en medio L complementado con ampicilina (50 \mug/ml). La clonación y fusión de oligonucleótidos se realizó usando técnicas convencionales de recombinación de ADN.

Los vectores de clonación se cortaron con las enzimas de restricción apropiadas para insertar los oligonucleótidos sintéticos. Los vectores se trataron con fosfatasa alcalina de intestino de ternera (CIP) para eliminar los grupos fosfato terminales. Los oligonucleótidos se fosforilaron y clonaron, como moléculas monocatenarias o bicatenarias, en el vector apropiado usando la ADN ligasa de T4. Cuando se introdujeron cadenas sencillas en los vectores de clonación, la segunda cadena se completó por el hospedador bacteriano seguido de la transfección.

Para la clonación de cadena doble, primero se hibridaron los oligonucleótidos con su cadena complementaria sintética y luego se ligó en el vector de clonación. Se transformaron entonces las cepas SB221 o NM522 de E. coli K12 con la ligación. La cepa GM119 de E. coli se uso para la clonación cuando estaban implicados los sitios de restricción StuI y ClaI sensibles a la metilación. Los análisis de restricción se realizaron en el ADN aislado en cada etapa del procedimiento de clonación.

Los oligonucleótidos clonados se fusionaron en un único polipéptido usando las digestiones de restricción y las ligaciones esquematizadas en la Figura 2. Los fragmentos de ADN que contenían los oligonucleótidos se aislaron típicamente tras el fraccionamiento electroforético por tamaño en geles de agarosa de bajo punto de fusión (Maniatis, y col., 1982; Sambrook, y col., 1989; Ausubel, y col., 1988). La secuencia codificadora polinucleotídica de IFN\tau resultante abarca la posición 16 a la 531: una secuencia codificadora de 172 aminoácidos.

La secuencia de nucleótidos del polipéptido final se confirmó mediante secuenciación del ADN usando el procedimiento didesoxi de terminación de cadena.

El fragmento StuI/SstI de longitud completa (540 pb; Figura 2) se clonó en un vector de expresión pIN III omp-A modificado y se transformó en una cepa competente SB221 de E. coli. Para la expresión de la proteína de IFN\tau, las células portadoras del vector de expresión se crecieron en medio L con ampicilina hasta una DO (550 nm) de 0,1-1, inducida con IPTG durante 3 horas y recogida mediante centrifugación. El IFN\tau recombinante soluble se liberó de las células mediante sonicación o fraccionamiento osmótico.

Ejemplo 4 Expresión del IFN\tau en levaduras

El gen de IFN\tau sintético, sintetizado en el Ejemplo 3, se flanqueó en el extremo 5' con un sitio de restricción StuI y en el extremo 3' con un sitio de restricción SacI.

A. Aislamiento del gen de IFN\tau sintético

Se usaron dos cebadores de oligonucleótidos (ID. SEC. Nº: 13 y ID. SEC. Nº: 14) para unir los conectores al gen de IFN\tau sintético usando la reacción en cadena de la polimerasa. El conector en el extremo 5' permitió la colocación del gen de IFN\tau sintético en lectura correcta con la secuencia codificadora de la ubiquitina presente en el vector de clonación de levadura pBS24Ub (Chiron Corp., Emeryville, CA). El conector también construyó una región de unión ubiquitina-IFN\tau que permitió la escisión in vivo de las secuencias de ubiquitina de las secuencias de IFN\tau. El oligonucleótido 5' también codificaba un sitio de escisión de endonucleasa de restricción SacII. El oligonucleótido 3' contenía un sitio de escisión StuI.

El vector portador del gen de IFN\tau sintético (Ejemplo 3) se aisló de la cepa "XLI-BLUE" de E. coli por el procedimiento de lisis alcalina. El vector aislado se diluyó 500 veces en Tris 10 mM, pH 8.0/EDTA 1 mM/NaCl 10 mM. La reacción de PCR se realizó en un volumen de 100 \mul usando la ADN polimerasa Taq y los cebadores ID. SEC. Nº: 13/ID. SEC. Nº: 14. Los fragmentos amplificados se digirieron con StuI y SacII. Estos fragmentos digeridos se ligaron en los sitios SacII y SmaI de "pBLUESCRIPT+(KS)".

El plásmido resultante se denominó pBSY-IFN\tau La secuencia de ADN se verificó usando ADN de doble cadena como molde.

B. Construcción del plásmido de expresión

El plásmido pHSY-IFN\tau se digirió con SacII y EcoRV y se aislaron los fragmentos que contenían el gen de IFNr sintético. El vector de expresión de levadura pBS24Ub (Sabin, y col., 1989; Ecker, y col., 1989) se digirió con SalI. Se generaron extremos romos usando la ADN polimerasa de T4. El vector de ADN se extrajo con fenol y se precipitó con etanol (Sambrook, y col., 1989). El plásmido linealizado recuperado se digirió con SacII, se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa, y se ligó al fragmento SacII-EcoRV aislado de pBSY-IFN\tau. El plásmido recombinante resultante se denominó pBS24Ub-IFN\tau.

El plásmido recombinante pHS24Ub-IFN\tau se transformó en E. coli. Los clones recombinantes que contenían el inserto IFN\tau se aislaron e identificaron mediante el análisis con enzimas de restricción. El ADN de plásmido de los clones que contenían la secuencia codificadora de IFN\tau se utilizó para la transformación de S. cerevisiae (Rothstein, 1986). Las mezclas de transformación se pusieron en placas sobre medio sin uracilo y se incubaron durante 3-5 días a 30ºC. Entonces se picaron las colonias y se mantuvieron en medio sin uracilo ni leucina (Rothstein, 1986).

C. Experimentos de expresión

Para la expresión a pequeña escala, se picó una única colonia de S. cerevisiae AB116 que contenía pBS24Ub-IFN\tau de una placa sin leucina ni uracilo y se creció a 30ºC en medio YEP (extracto de levadura al 1%, peptona al 2%) que contenía glucosa al 1% para la inducción de condiciones o glucosa al 8% para no inducir condiciones. Se recuperaron los lisados celulares y se sometieron a SDS-PAGE en acrilamida al 15%, bisacrilamida al 0,4% (Sambrook, y col., 1989). Las proteínas fraccionadas se visualizaron mediante la tinción con azul de Coomassie.

El IFN\tau recombinante se visualizó específicamente mediante inmunotransferencia con un anticuerpo monoclonal o antisuero policlonal contra IFN\tau ovino tras la electrotransferencia del extracto celular fraccionado a papel "NYTRAN" (Rothstein, 1986).

Para la expresión a gran escala, se creció pBS24Ub-IFN\tau durante 24 horas a 30ºC en medio sin uracilo ni leucina 5x que contenía glucosa al 8%. Este cultivo se diluyó entonces 20 veces en medio YEP que contenía glucosa al 1% y se incubó durante otras 24-36 horas más.

Las células se recogieron por centrifugación, se lavaron en Tris 50 mM, pH 7,6/EDTA 1mM y se resuspendieron en tampón de lavado que contenía PMSF 1mM. Las células se lisaron usando un aparato Bead-beater (Biospec Products, Bartlesville, OK). El lisado se centrifugó a 43.000 x g durante 20 minutos. Se recuperó la fracción sobrenadante y se sometió al protocolo de purificación descrito a continuación.

D. Purificación de roIFN\tau a partir del lisado de células de levadura

El sobrenadante se cargó en una columna de DEAE de 1 x 10 cm y se lavó con Tris 10 mM, pH 8,0. Las proteínas retenidas se eluyeron con 300 ml de un gradiente de NaCl de 0 a 0,5 M en Tris 10 mM, pH 8,0. Se recogieron fracciones de tres mililitros. Muestras de 10 \mul de las fracciones 17-26 que contenían el recombinante (roIFN\tau) se separaron electroforéticamente en geles de SDS-poliacrilamida al 15%. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie.

Las fracciones 18, 19 y 20 contenían la mayor cantidad de roIFN\tau. Estas fracciones se cargaron individualmente en una columna de Sephadex S-200 de 1,5 x 90 cm y las proteínas se resolvieron en dos picos. Alícuotas de cada pico de proteína (25 \mul) se separaron electroforéticamente en geles de SDS-poliacrilamida al 15% y las proteínas se visualizaron con tinción Coomassie.

Se combinaron las fracciones que contenían roIFN\tau purificado y se cuantificó la cantidad de roIFN\tau por radioinmunoanálisis (Vallet, y col., 1988). La concentración total de proteína se determinó usando el ensayo de proteínas de Lowry (Lowry, y col., 1951).

La microsecuenciación del roIFN\tau purificado demostró identidad con el IFN\tau nativo en los primeros 15 aminoácidos, confirmando que la proteína de fusión ubiquitina/roIFN\tau se había procesado correctamente in vivo.

El roIFN\tau purificado mostraba de 2 a 3 x 10^{8} unidades de actividad antivírica por miligramo de proteína (n = 3 placas replicadas) que es similar a la actividad antivírica del IFN\tau purificado de medio de cultivo condicionado con embriones (2 x 10^{8} U/mg).

Ejemplo 5 Análisis por transferencia Southern del ADN humano de alto peso molecular

Se recogieron muestras de sangre venosa humana de donantes sanos en tubos heparinizados y se aislaron los linfocitos de sangre periférica mediante centrifugación en gradiente de densidad usando un gradiente de Ficoll-Isopaque (1,077 g/ml) (Sigma Chemical Co.). El ADN de alto peso molecular (APM) se aisló de estas células (Sambrook, y col., 1989).

Se digirieron dos muestras de 10 \mug de ADN APM con las endonucleasas de restricción HindIII o PstI (Promega) durante 2 horas a 37ºC, y los fragmentos de ADN se separaron electroforéticamente en un gel de agarosa al 0,8% (Bio-Rad, Richmond, CA) a 75 voltios durante 8 horas. Los fragmentos de ADN se transfirieron a una membrana de nailon (IBI-International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT). Las membranas se calentaron a 80ºC durante 2 horas y se incubaron a 42ºC durante 4 horas en la siguiente solución de prehibridación: SSC 5x (SSC 1x es NaCl 0,15 M y citrato sódico 0,15 M), formamida al 50% v/v, SDS al 0,6% (p/v), leche desnatada en polvo al 0,5% (p/v), Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), EDTA 4 mM y 0,5 mg/ml de ADN de cadena sencilla de esperma de salmón (Promega).

Después se incubaron los filtros en una solución de hibridación (SSC 5x, formamida al 20% v/v, SDS al 0,6% (p/v), leche desnatada en polvo al 0,5% (p/v), Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), EDTA 4 mM y ADNc de OvIFN\tau marcado con ^{32}P 2 x 10^{8} cpm/ml (Imawaka, y col., 1987) durante 18 horas a 42ºC. Los filtros se lavaron a 42ºC durante 15 min con SSC 2x y SDS al 0,1% (p/v) y se expusieron a una película de rayos x (XAR, Eastman Kodak, Rochester, NY) a -80ºC durante 48 horas en presencia de una pantalla intensificadora.

La autorradiografía detectó una señal de hibridación a aproximadamente 3,4 kb en el ADN digerido con PstI y un fragmento ligeramente más pequeño (aproximadamente 3,0 kb) en el ADN digerido con HindIII. Estos resultados indican la presencia de secuencias de ADN humano complementarias a la sonda de ADNc de OvIFN\tau.

Ejemplo 6 Aislamiento de la secuencia parcial del ADNc de IFN\tau humano por PCR

Se sintetizaron dos oligonucleótidos sintéticos (cada uno de 25-meros) que correspondían a los nucleótidos en la secuencia de ADN de 231 a 255 (contenidos en la ID. SEC. Nº: 13) y 566 a 590 (contenidos en la ID. SEC. Nº: 14) del ADNc de OvIFN\tau (numeración con respecto al sitio cap, Imawaka, y col., 1987). Estos cebadores contenían, respectivamente, sitios de escisión para las endonucleasas de restricción PstI y EcoRI. La ID. SEC. Nº: 13 se modificó para contener un sitio EcoRI que comienza en la posición 569.

El ADN se aisló de aproximadamente 1 x 10^{5} unidades formadoras de placa (ufp) de las siguientes dos genotecas de ADNc: placenta a término humana (Clontech, Inc., Palo Alto, CA) y citotrofoblasto a término humano (Dr. J.F. Strauss, Universidad de Pensilvania, Filadelfia, PA). El ADN se empleó en amplificaciones de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Mullis, 1987; Mullis, y col., 1987; Perkin Elmer Cetus Corp. Norwalk, CT). Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo durante 30 ciclos (45ºC, 1 min; 72ºC, 2 min; 94ºC, 1 min) (termociclador y reactivos, Perkin Elmer Cetus) usando los cebadores ID. SEC. Nº: 13/ID. SEC. Nº: 14.

Los productos de amplificación se separaron electroforéticamente (100 voltios en gel de agarosa al 1,5% (Bio-Rad)) y se transfirió a una membrana de nailon (IBI). La membrana se calentó a 80ºC durante 2 horas y se prehibridaron e hibridaron con ADNc de OvIFN\tau marcado con ^{32}P como se ha descrito anteriormente. Las membranas se lavaron en SSC 5x/SDS 0,1% (p/v) durante 5 minutos a 42ºC y en SSC 2x/SDS 0,1% (p/v) durante 2 minutos a 42ºC. Se expuso entonces a -80ºC a una película de rayos x "XAR" (Eastman Kodak) durante 24 horas en presencia de una pantalla intensificadora. Se detectó el producto de amplificación que hibridó con la sonda de ADN marcada.

\newpage

La PCR se realizó de nuevo como se hizo anteriormente. Los productos de la amplificación se digirieron con las endonucleasas de restricción EcoRI y PstI (Promega) durante 90 minutos a 37ºC. Los fragmentos de ADN resultantes se separaron electroforéticamente como se ha descrito anteriormente y las bandas que contenían el producto de amplificación de IFN\tau se escindieron del gel. Los fragmentos de ADN se recuperaron por electroelución, se subclonaron en el plásmido pUC 19 desfosforilado digerido con EcoRI/PstI y se transformó en la cepa JM101 de E. coli (Promega) por el procedimiento de cloruro de calcio (Sambrook, y col., 1989). Se aislaron los plásmidos y el producto de amplificación insertado se secuenció usando el procedimiento didesoxi de terminación (Sanger, y col., 1977; reacciones "SEQUENASE", United States Biochemical, Cleveland, OH). Se determinaron las secuencias de nucleótidos y se realizó la comparación de éstas, así como de las secuencias de aminoácidos deducidas para otras secuencias de IFN usando "DNA STAR SOFTWARE" (Madison, WI).

La comparación de las secuencias de estos clones reveló los siguiente cuatro clones diferentes: de la genoteca de placenta humana, HuIFN\tau6 (299 pb), HuIFN\tau7 (288 pb) y HuIFN\tau4 (307 pb), que mostraban el 95% de identidad en sus secuencias nucleotídicas; de la genoteca de citotrofoblasto, el clon CTB 35 (HuIFN\tau5; 294 pares de bases), que comparte 95% y 98% de identidad con HuIFN\tau6 y HuIFN\tau4, respectivamente.

Ejemplo 7 Aislamiento de genes de IFN\tau humano de longitud completa

Se digirieron 10 mg de ADN APM de PBMC con la endonucleasa de restricción EcoRI y se sometió a análisis electroforético en un gel de agarosa al 0,8%. Se escindieron del gel una serie de muestras que contenían fragmentos de ADN con intervalos de tamaño de 1,5 a 10 kb (por ejemplo, 1,5 a 2,5 kb, 2,5 kb a 3 kb). Se electroeluyeron y purificaron los ADN. Cada muestra de ADN se amplificó como se ha descrito anteriormente usando los cebadores de OvIFN\tau. Las moléculas de ADN y cualquier muestra que rindiera una señal de PCR positiva se clonaron en \lambdagt11 (la genoteca subgenómica de \lambdagt11).

A. Identificación por PCR de clones que contienen secuencias complementarias a OvIFN\tau

Entonces, el fago \lambdagt11 se dispuso en placas para la formación de placas y se realizó una hibridación por transferencia de placas usando la sonda de ADNc de OvIFN\tau marcada con ^{32}P. Se identificaron aproximadamente 20 clones que hibridaron con la sonda.

Las placas que hibridaron con la sonda se analizaron adicionalmente por PCR usando los cebadores de OvIFN\tau descritos anteriormente. Se purificaron seis placas que generaron señales de PCR positivas. El ADN de fago de estos clones se aisló y digirió con la endonucleasa de restricción EcoRI. Los insertos de ADN se subclonaron en vectores pUC19 y se determinó su secuencia nucleotídica mediante secuenciación didesoxi de nucleótidos.

B. Identificación por hibridación de los clones que contienen secuencias complementarias a la fase PCR positiva

El fago recombinante de la genoteca subgenómica de \lambdagt11 se propagó en E. coli Y1080 y se dispuso en placas a una densidad de E. coli Y1090 de aproximadamente 20.000 placas/placa de 150 mm. Las placas se cubrieron con filtros de nitrocelulosa duplicados, los cuales se hibridaron con la sonda marcada con ^{32}P de uno de los seis clones de ADNc de IFN\tau humano aislados anteriormente.

Los clones que dieron señales de hibridación positivas se seleccionaron y purificaron adicionalmente. Los ADN de fago de clones positivos en la hibridación se aislaron, se digirieron con EcoRI, se subclonaron en el vector pUC19 y se secuenciaron. Se analizó, entonces, la información de la secuencia.

1. HuIFN\tau1

Tres clones dieron información de solapamiento de secuencia para más de 800 bases con respecto al sitio cap del ARNm (los clones se secuenciaron en ambas orientaciones). La información de secuencia de ácido nucleico combinada se presenta como ID. SEC. Nº: 11 y la secuencia codificadora de la proteína predicha se presenta como ID. SEC. Nº: 12. La comparación de la secuencia de la proteína madura predicha (ID. SEC. Nº: 12) de este gen con la secuencia de la proteína predicha de OvIFN\tau se muestra en la Figura 3.

2. HuIFN\tau2, HuIFN\tau3

Dos clones adicionales que dieron señales de hibridación positivas (HuIFN\tau2 y HuIFN\tau3) también se seleccionaron, se purificaron y los ADN de fago se subclonaron y secuenciaron como anteriormente. Las secuencias de estos dos clones se presentan en las Figuras 19A y 19B. Como se puede apreciar en las Figuras 19A y 19B, la secuencia de nucleótidos de ambos clones (HuIFN\tau2 y HuIFN\tau3) es homóloga a la de HuIFN\tau1 y OvIFN\tau.

HuIFN\tau2 (ID. SEC. Nº: 29) puede ser un pseudogen y parece que contiene un codon de terminación en posición 115-117. La secuencia, ID. SEC. Nº: 29, se presenta sin la secuencia líder. La secuencia líder se muestra en la Figura 20A. Como puede verse de la secuencia de HuIFN\tau2 presentada en la Figura 20A, los primeros aminoácidos presentes en el HuIFN\tau1 maduro (un resto CYS) no está presente en la secuencia de HuIFN\tau2. Por consiguiente, la secuencia de aminoácidos predicha presentada como ID. SEC. Nº: 29 corresponde a una proteína de IFN\tau madura con la excepción del primer resto CYS y el codon de terminación interno.

El codon de terminación interno en la secuencia codificadora de ácido nucleico se puede modificar mediante procedimientos convencionales para reemplazar el codon de terminación por un codon de aminoácido, por ejemplo, que codifique GLN. El aminoácido GLN está presente en esta posición en los otros aislados de IFN\tau humanos (HuIFN\tau). Las manipulaciones de recombinación convencionales también permiten la introducción de un resto de CYS inicial si se desea.

HuIFN\tau3 (ID. SEC. Nº: 31) parece codificar una proteína de IFN\tau humana. La secuencia de aminoácidos traducida de la proteína completa, incluyendo la secuencia líder, se presenta como ID. SEC. Nº: 32. La secuencia de aminoácidos traducida de la proteína madura se presenta como ID. SEC. Nº: 34.

Ejemplo 8 Análisis de la presencia de ARNm de HuIFN\tau por RT-PCR

Se analizaron mediante hibridación con la sonda de ADNc de OvIFN\tau, descrita anteriormente, las genotecas de ADNc de placenta humana y la genoteca de ADNc ovino, construida a partir de embriones de 15-16 días. Los ADNc se fraccionaron por tamaño en geles de agarosa y se transfirieron a filtros (Maniatis, y col., 1982; Sambrook, y col, 1989). El análisis por transferencia en Southern con la sonda de OvIFN\tau mostró que las señales autorradiográficas de las genotecas de ADNc humano eran aproximadamente 1/100 de la señal obtenida usando la genoteca de ADNc de OvIFN\tau.

La presencia de ARNm de HuIFN\tau en placenta a término y amniocitos humanos (26 semanas, 2 millones de células) se analizó usando el procedimiento de PCR con transcripción inversa (RT-PCR) (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA).

El ARN celular total (ARNct) aislado de placenta humana, amniocitos y embriones ovinos se retrotranscribió usando el cebador de ID. SEC. Nº: 14. El cebador de ID. SEC. Nº: 13 se añadió, entonces, a la reacción y se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa durante 40 ciclos. Los productos de PCR se fraccionaron por tamaño en geles de agarosa y se transfirieron a filtros. El ADN de los filtros se hibridó con ADNc de OvIFN\tau y HuIFN\tau marcado con ^{32}P. Los resultados de estos análisis demostraron la presencia de ARNm de IFN\tau humano en el anexo fetoplacentario. Los amniocitos también expresaban el mensajero correspondiente a los cebadores y sonda de OvIFN\tau humana.

Además, se aplicó un análisis por RT-PCR de la presencia de HuIFN\tau al ARNct aislado de linfocitos adultos humanos. Un análisis densitométrico reveló que existe ARNm de IFN\tau en linfocitos.

Ejemplo 9 Hibridación in situ A. Tejido

Se examinaron portaobjetos de cortes seriados de 5 \mum de cuatro placentas humanas sanas diferentes a término y del primer trimestre incluidas en parafina.

B. Preparación de la sonda de ARNc

A partir del clon de ADNc aislado de la genoteca amplificada de OvIFN\tau se subclonó un fragmento correspondiente a las bases Nº 177-736 (la base Nº 1 es el sitio cap; el marco de lectura abierto del ADNc de OvIFN\tau es la base Nº 81-665; Figura 7) en el vector de transcripción, pBS (New England Biolabs). Se aislaron varios clones pBS, se subclonaron y se secuenciaron sus nucleótidos. A partir de este clon se escindió un fragmento 3' (bases Nº 425-736) usando las endonucleasa de restricción NlaIV y EcoRI y se subclonó en el vector de transcripción pBS. Este vector se denominó pBS/OvIFN\tau.

Tras la linearización del plásmido pBS/OvIFN\tau, se sintetizó una sonda de ARNc mediante transcripción in vitro (Sambrook, y col., 1989) usando la ARN polimerasa de T_{7} (Stratagene). Se usaron trazas de ^{3}H-CTP (NEN-DuPont, Cambridge, MA) en la reacción de transcripción. Se incorporó dUTP marcado con digoxigenina (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) en el ARNc y se estimó el rendimiento por precipitación con TCA y recuento de centelleo.

C. Hibridación

La hibridación in situ se realizó usando la sonda de ARN antisentido, como describen Lawrence, y col. (1985) con las siguientes modificaciones. Los cortes desparafinados e hidratados se prehibridaron durante 10 min a temperatura ambiente en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía MgCl_{2} 5 mM. Se desnaturalizaron los ácidos nucleicos de los cortes durante 10 min a 65ºC en formamida al 50%/SSC 2x. Los cortes se incubaron una noche a 37ºC con una mezcla de hibridación (30 \mul/porta) que contenía 0,3 \mug/ml de la sonda de ARNc marcada con digoxigenina y luego se lavaron durante 30 minutos cada uno a 37ºC en formamida al 50%/SSC 1x. Los lavados finales se realizaron durante 30 min cada uno a temperatura ambiente en SSC 1x y SSC 0,1x. Los cortes se bloquearon durante 30 minutos con Triton X-100 (Sigma) al 0,5% y leche desnatada en polvo al 0,5%.

La señal de hibridación se detectó usando fragmentos Fab antidigoxigenina purificados de oveja conjugados con fosfatasa alcalina (Boehringer-Mannhein). Después se eliminó el anticuerpo no unido y se añadió el sustrato nitroazul de tetrazolio/5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (Promega) y levamisol (Bector Laboratories, Burlingame, CA) para detectar la señal a través de la generación colorimétrica del sustrato. Los tejidos se contrastaron con verde de metilo (Sigma), se deshidrataron y se montaron.

Como control, se pretrataron algunos cortes de tejido con 100 \mug/ml de ribonucleasa A pancreática (Sigma) durante 30 minutos a 37ºC. La ribonucleasa se inactivó en los cortes con 400 unidades de inhibidor de ribonucleasa (Promega). Entonces se lavaron los cortes dos veces en 250 ml de PBS/MgCl_{2} 5 mM. En otros experimentos de control, el ARNt (Sigma) se sustituyó por la sondas de digoxigenina.

Se observó hibridación específica en todos los tejidos de placenta a término y del primer trimestre en tres experimentos independientes con diversas concentraciones de sonda de ARNc de OvIFN\tau y reactivos de bloqueo.

Los compuestos de vellosidades placentarias del primer trimestre de una capa externa de sincitiotrofoblasto, una capa subyacente de citotrofoblasto y una región estromal central con diversos tipos de células mesenquimales, mostraron el nivel de transcrito de IFN\tau más alto en las células del citotrofoblasto. Niveles menos intensos, pero detectables, estaban presentes tanto en las células del sincitiotrofoblasto como del estroma. Un patrón similar de expresión del transcrito se demostró en las vellosidades placentarias de tejido a término, pero el nivel de detección de la señal era bajo. El trofoblasto extravelloso del primer trimestre mostró la cantidad más alta de mensajero y positivos teñidos cuando estaba presente en los espacios sanguíneos maternos.

Ejemplo 10 Actividad antivírica de IFN\tau

La actividad específica relativa de OvIFN\tau, purificado hasta la homogeneicidad, se evaluó en ensayos antivíricos. Los ensayos antivíricos se realizaron esencialmente como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2. Las actividades específicas se expresan en unidades antivíricas/mg de proteína obtenidas de los ensayos antivíricos usando células de riñón bovino Madin-Darby (MDBK) o fibroblastos normales de oveja (Shnf). Todas las muestras se ensayaron simultáneamente para eliminar la variabilidad entre ensayos. Los resultados, presentados en la Tabla 3, son las medias de cuatro determinaciones donde la desviación típica era de menos del 10% de la media.

TABLA 3 Actividad antivírica del IFN\tau y de los IFN conocidos

Actividades específicas
	MDBK	Shnf
OvIFN\tau	2 x 10^{8}	3 x 10^{8}
rBoIFN\alpha	6 x 10^{7}	1 x 10^{7}
rBoIFN\gamma	4,5 x 10^{6}	3 x 10^{6}
NIH rHuIFN\alpha	2,2 x 10^{8}	2,2 x 10^{8}
rHuIFN\alpha	2,9 x 10^{8}	4,3 x 10^{5}

El IFN\tau tiene una actividad específica más alta que rBoIFN\alpha o rBoIFN\gamma (Tabla 3). La preparación convencional del NIH de rHuIFN\alpha tenía una actividad específica similar, mientras que la preparación comercial de rHuIFN\alpha mostraba baja actividad antivírica específica. Se demostró una actividad antivírica específica relativa comparable usando linfocitos Bovinas u ovinas.

Ejemplo 11 Actividad antirretrovírica y efectos citotóxicos de IFN\tau

Se probaron los efectos antirretrovíricos y citotóxicos de OvIFN\tau altamente purificado en linfocitos de sangre periférica de felinos expuestos al retrovirus de la inmunodeficiencia felina. Este lentivirus produce un síndrome similar al SIDA crónico en gatos y es un modelo para el SIDA humano (Pederson, y col., 1987). La replicación del virus en linfocitos de sangre periférica se controla por la actividad transcriptasa inversa en los sobrenadantes de los cultivos a lo largo del tiempo. Los datos de estos ensayos se presentan en la Tabla 4.

TABLA 4

1

La adición de OvIFN\tau producía un rápido descenso dependiente de la dosis en la actividad de la transcriptasa inversa (RT) (Tabla 4). Mientras que las concentraciones inferiores a 0,62 ng/ml de IFN\tau inhibían la replicación vírica, concentraciones mucho más altas (40 ng/ml) tenían efectos mayores en la actividad RT sin efectos tóxicos en las células. Los resultados sugieren que la replicación del virus de la inmunodeficiencia felina se redujo significativamente en comparación con valores de control cuando las células se cultivaron en presencia de OvIFN\tau.

Parecía que IFN\tau no ejercía efecto citotóxico en las células que hospedaban al retrovirus. Esto era verdad cuando el IFN\tau estaba presente a 40 ng por ml de medio de cultivo.

Ejemplo 12 Efectos de IFN\tau en linfocitos periféricos humanos infectados por VIH

También se ensayó la actividad de IFN\tau frente a la infección por VIH en células humanas. Se trataron linfocitos de sangre periférica humana, que se habían infectado por VIH (Crowe, y col., 1987), con concentraciones diversas de OvIFN\tau. La replicación de VIH en los linfocitos de sangre periférica se controló por la actividad transcriptasa inversa en los sobrenadantes de los cultivos a lo largo del tiempo. La actividad transcriptasa inversa se midió esencialmente por el procedimiento de Hoffman, y col., (1985). Los datos de estos ensayos se presentan en la Tabla 5.

TABLA 5 Efecto de OvIFN\tau en la replicación de VIH en linfocitos periféricos humanos

Concentración de	Actividad RT
IFN\tau (ng/ml)	Día 6 cpm/ml % de reducción	Día 10 cpm/ml % de reducción
0	4.214	- -	25.994	- -
10	2.046	51	9.883	62
50	1.794	57	4.962	81
100	1.770	58	3.012	88
500	1.686	60	2.670	90
1000	1.499	64	2.971	89

Como se muestra en la Tabla 5, concentraciones de OvIFN\tau producían efectos antivíricos significativos. Una concentración de sólo 10 ng/ml daba lugar a una reducción del 50% en la actividad RT después de sólo seis días. Una concentración de 500 ng/ml daba lugar a una reducción del 90% en la actividad RT en 10 días.

Se evaluó por exclusión de azul de tripán la viabilidad de los linfocitos humanos de sangre periférica tras el tratamiento con IFN\tau, para un intervalo de concentraciones de 3-13 días. Los resultados de este análisis de viabilidad se presentan en la Tabla 6.

TABLA 6 Efecto de OvIFN\tau en la viabilidad de linfocitos periféricos humanos infectados por VIH

Concentración de	Células viables/ml x 10^{5}
IFN\tau (ng/ml)	Día 3	Día 6	Día 13
0	16,0	7,5	5,3
10	13,0	7,5	6,0
50	13,0	11,5	9,0
100	15,0	8,5	9,5
500	16,5	12,0	11,0
1000	21,9	9,5	8,5

Los datos presentados en la Tabla 6 no muestran evidencias de los efectos atribuibles a la administración de IFN\tau.

Ejemplo 13 Inhibición del crecimiento celular

También se examinaron los efectos de IFN\tau sobre el crecimiento celular. La actividad anti-crecimiento celular se examinó usando un ensayo de inhibición de colonia. Células del amnios humano (WISH) o MDBK se dispusieron en placas a bajas densidades celulares para formar colonias originarias de células únicas. Las células se cultivaron a 200 ó 400 células/pocillo en placas de 24 pocillos en HMEM complementado con suero bovino fetal al 2% (FBS) y aminoácidos esenciales y no esenciales. Se añadieron diversas diluciones de interferones a pocillos por triplicado, y las placas se incubaron durante 8 días para permitir la formación de colonia. Las colonias se visualizaron tras la tinción con violeta de cristal y se contaron. El análisis del ciclo celular se realizó con HMEM que contenía medios "agotados" al 0,5% durante 7 días más. Se usaron células WISH que no habían sido sincronizadas.

Para el examen de la actividad IFN\tau, las células se dispusieron otra vez en placas a 2,5 x 10^{5} células/pocillo en HMEM con FBS al 10% en placas de 6 pocillos. Se añadieron diversas diluciones de OvIFN\tau solo o en combinación con péptidos hasta alcanzar un volumen final de 1 ml. Las placas se incubaron a 37ºC en CO_{2} al 5% durante 12, 15, 18, 24 ó 48 horas. Las células se trataron con tripsina, se recogieron por centrifugación a baja velocidad y se lavaron. El sedimento celular se secó con un papel secante y se añadieron a cada tubo 250 \mul de una solución de tinción nuclear (5 mg de yoduro de propidio, 0,3 ml de NP40 y 0,1 g de citrato sódico en 100 ml de H_{2}O destilada). Los tubos se incubaron a temperatura ambiente. Después de 10 min, se añadieron 250 \mul por tubo de ribonucleasa (500 unidades/ml en citrato sódico al 1,12%) y se incubaron otros 20 minutos. Los núcleos se filtraron a través de una malla de 44 \mum, y se analizaron en un FACStar (Becton Dickinson, Mountain View, CA) usando el programa DNA Start 2.0.

En el ensayo de crecimiento celular usando formación de colonia tanto de la línea epitelial bovina, MDBK, como de la línea amniótica humana WISH, OvIFN\tau inhibía tanto el tamaño de la colonia como el número. El IFN\tau ovino era más eficaz que el IFN\alpha en la línea celular humana; de este modo, es muy potente en la actividad en especies cruzadas. Su actividad era dependiente de dosis, y la inhibición de la proliferación podía observarse a concentraciones tan bajas como 1 unidad/ml. A concentraciones tal altas como 50.000 unidades/ml (unidades de actividad antivírica/ml) se paraba la proliferación, mientras que no se alteraba la viabilidad celular.

El análisis del ciclo celular por citometría de flujo con células WISH teñidas con yoduro de propidio revelaba una proporción aumentada de células en G2/M después de 48 horas de tratamiento con OvIFN\tau. Por tanto, parece que el IFN\tau inhibe la progresión de las células a través de la fase S. Los efectos antiproliferativos de IFN\tau ovino puede observarse tan pronto como a las 12 horas después del inicio del cultivo y se mantiene durante 6 días.

Los resultados presentados anteriormente demuestran tanto el efecto antiproliferativo de IFN\tau como su baja citotoxicidad.

Ejemplo 14 Efectos antiproliferativos adicionales de IFN\tau

Los efectos antiproliferativos de OvIFN\tau se estudiaron en una línea celular de rata y una línea celular bovina. La tasa de incorporación de ^{3}H-timidina se usó para evaluar la tasa de proliferación celular.

Las células de riñón de rata (MtBr7.c5) o bovino (MDBK) se dispusieron en medio DME-F12 sin rojo de fenol complementado con Controlled Process Serum Replacement 2 (CPSR 2, Sigma) sin esteroides por tratamiento con carbón recubierto de dextrano al 3% y suero fetal bovino (FBS) sin esteroides por tratamiento con carbón recubierto de dextrano al 5%. Después de la unión durante aproximadamente 15-18 horas, las células se lavaron una vez con medio DME-F12 sin suero. El medio se sustituyó por medio DME-F12 sin rojo de fenol con CPSR2 sin esteroides al 3%, FBS sin esteroides al 1% (medio "3/1") o medio 3/1 que contenía OvIFN\tau a diversas unidades de actividad antivírica como se determinó en el ensayo de estimulación con el virus de la estomatitis vesicular para interferones (Ejemplo 2). Se usaron como controles medios que contenía una dilución similar del tampón (tampón sin diluir = Tris 10 mM, NaCl 330 mM, [TS]), en los que se disolvió OvIFN\tau.

Las células se marcaron con un pulso de ^{3}H-timidina de dos horas a aproximadamente 48 horas post-tratamiento. Se determinaron las cuentas incorporadas precipitables con ácido tricloroacético (TCA) por recuento de centelleo. Se incluyeron tres replicados por tratamiento. Los valores medios para los tratamientos de OvIFN\tau se compararon con muestran que contenían diluciones comparables de tampón TS vehículo. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Tabla 7.

TABLA 7 Incorporación de ^{3}H-Timidina

Tratamiento	% de reducción de incorporación de ^{3}H-timidina
Experimento 1: MtBr7.c5 (rata)
\hskip0,5cm 3/1	-
\hskip0,5cm 10^{3} u de OvIFN\tau /ml	0 (+12)
\hskip0,5cm 1:5000 TS	-
\hskip0,5cm 10^{4} u de OvIFN\tau /ml	24
\hskip0,5cm 1:500 TS	-
\hskip0,5cm 10^{5} u de OvIFN\tau /ml	87

TABLA 7 (continuación)

Tratamiento	% de reducción de incorporación de ^{3}H-timidina
Experimento 2: MDBK
\hskip0,5cm 3/1	-
\hskip0,5cm 10^{3} u de OvIFN\tau /ml	74
\hskip0,5cm 1:5000 TS	-
\hskip0,5cm 10^{4} u de OvIFN\tau /ml	83
\hskip0,5cm 1:500 TS	-
\hskip0,5cm 10^{5} u de OvIFN\tau /ml	83

Como se puede ver en la Tabla 7, OvIFN\tau reduce drásticamente la tasa de proliferación celular (en función de la incorporación de timidina) para cada línea celular ensayada.

Ejemplo 15 Efectos antiproliferativos de IFN\tau en líneas celulares tumorales humanas

La actividad antiproliferativa de OvIFN\tau en líneas celulares tumorales humanas se evaluó midiendo la proporción de incorporación de ^{3}H-timidina en células que han sido tratadas con OvIFN\tau.

Para los experimentos en líneas tumorales que crecen en suspensión, se dispuso 1 ml de células de 2,5-5 x 10^{5} células/pocillo en placas de 24 pocillos. Los pocillos por triplicado recibieron los medios apropiados con 100, 1.000 o 10.000 unidades/ml de OvIFN\tau o concentraciones equivalentes antivíricos de rHuIFN\alpha2A (Lee Biomolecular). Después de 48 horas de incubación, las células se contaron y se valoró la viabilidad por exclusión con azul de
tripan.

Las líneas tumorales adherentes se dispusieron en placas a 2,5 x 10^{5} células/pocillo en 1 ml en placas de 6 pocillos. Recibieron tratamientos con interferón como ya se ha descrito, pero se tripsinizaron antes del recuento.

Se valoraron las diferencias significativas entre los tratamientos mediante un análisis de varianza seguido de una prueba F de Scheffe. El análisis del ciclo celular se realizó por citometría de flujo usando yoduro de propidio.

A. Células de adenocarcinoma de mama

Células de adenocarcinoma de mama humano MCF7 se dispusieron en placas a partir de cultivos en crecimiento logarítmico en medio DME-F12 sin rojo de fenol complementado con CPSR2 sin esteroides por tratamiento con carbón recubierto de dextrano al 3% y FBS recubierto de dextrano al 5%. Tras la unión durante aproximadamente 15-18 horas, las células se lavaron una vez con medio DME-F12 sin suero. El medio se sustituyó por medio DME-F12 sin rojo de fenol complementado con CPSR2 sin esteroides al 3%, FBS sin esteroides al 1% (medio "3/1") o medio 3/1 que contenía OvIFN\tau al número de unidades de actividad antivírica indicado como se determinó en el ensayo de estimulación con el virus de la estomatitis vesicular para interferones. Se usaron como controles medios que contenía una dilución similar del tampón (tampón sin diluir = Tris 10 mM, NaCl 330 mM, [TS]). Las células se marcaron con un pulso de ^{3}H-timidina de dos horas a aproximadamente 48 horas post-tratamiento.

Se determinaron las cuentas incorporadas precipitables con ácido tricloroacético (TCA) por recuento de centelleo. Se incluyeron tres replicados por tratamiento. Los valores medios para los tratamientos con OvIFN\tau se compararon con muestran que contenían diluciones comparables de tampón TS vehículo. Los resultados de estos análisis se muestran en la Tabla 8.

TABLA 8 Incorporación de ^{3}H-timidina

Tratamiento	% de reducción de incorporación de ^{3}H-timidina
MCF7 humano
\hskip0,5cm 3/1	-
\hskip0,5cm 10^{3} u de OvIFN\tau/ml	35
\hskip0,5cm 1:5000 TS	-
\hskip0,5cm 10^{4} u de OvIFN\tau/ml	53
\hskip0,5cm 1:500 TS	-
\hskip0,5cm 10^{5} u de OvIFN\tau/ml	70

Como puede verse a partir de los resultados mostrados en la Tabla 8, OvIFN\tau era capaz de reducir sustancialmente la proporción de incorporación de ^{3}H-timidina en la línea celular de carcinoma humano. Esto demuestra la eficacia de OvIFN\tau para inhibir la proliferación de las células tumorales, en particular, la proliferación de células tumorales mamarias.

B. Leucemia promielocítica humana

Se llevó a cabo una comparación de los efectos antiproliferativos de OvIFN\tau y de IFN\alpha usando células HL-60 (leucemia humana) (Foa, y col., 1982; Todd y col., 1981) esencialmente como se ha descrito anteriormente para las células MDBK. Tanto OvIFN\tau como rHuIFN\alpha inhiben la proliferación de células HL-60. Los resultados de uno de los tres experimentos replicados se presentan como media del % de reducción del crecimiento \pm DT en la Figura 4. La Figura 4 muestra que tanto OvIFN\tau como IFN\alpha eran capaces de reducir radicalmente el crecimiento de células HL.60. La reducción de crecimiento para cada compuesto excede el 60% para cada concentración ensayada. A 10.000 unidades/ml, OvIFN\tau causa aproximadamente una reducción del 80% en el crecimiento mientras que IFN\alpha causa una reducción del 100% del crecimiento.

Sin embargo, los datos presentados en la Figura 4 revelan que un factor sustancial en la capacidad de IFN\alpha para reducir el crecimiento era su efecto tóxico en las células. A 10.000 unidades/ml, la toxicidad de IFN\alpha tiene como resultado que menos del 25% de las células permanecía viable. Por el contrario, aproximadamente el 100% de las células permanecía viable cuando se aplicaban 10.000 unidades/ml de OvIFN\tau.

La Figura 5 representa los datos que demuestran que rHuIFN\tau es citotóxico. En la figura, se representan los resultados de tres experimentos replicados como media del % de viabilidad \pm DT.

C. Linfoma cutáneo de linfocitos T humano

El linfoma cutáneo de linfocitos T, HUT 78, respondía de forma similar a HL-60 cuando se trataban con IFN\tau (Figura 9). Tanto OvIFN\tau como rHuIFN\alpha reducen el crecimiento de células HUT 78, pero 10.000 unidades/ml de rHuIFN\alpha disminuían el número de células por debajo de las dispuestas originalmente (5 x 10^{5}). Esto es indicativo de una reducción en la viabilidad celular de aproximadamente el 60%.

El análisis del ciclo celular (realizado por citometría de flujo celular) reveló un aumento de la proporción de células en la fase G2/M del ciclo celular a las 48 horas del tratamiento con ambos interferones (Tabla 9). En la Tabla 9 se representan los resultados de uno de los tres experimentos replicados como el porcentaje de células en cada fase del ciclo celular. Se analizaron 10.000 sucesos por muestra.

Este resultado probablemente se debe al progreso más lento de las células a lo largo del ciclo celular. En la muestra tratada con 10.000 unidades/ml de rHuIFN\alpha, se presentó un gran porcentaje de sucesos con dispersión frontal baja y lateral alta, identificando células muertas. Esto concuerda con los datos de los experimentos de proliferación, en los que sólo OvIFN\tau inhibe la proliferación de HUT 78 sin toxicidad.

TABLA 9 Análisis del ciclo celular de HUT 78

Tratamiento (unidades/ml)	G0/G1	S	G2/M
Medios	44,43	49,95	5,61
100 OvIFN\tau	44,35	47,45	8,20
100 rHuIFN\alpha	40,01	57,53	2,45
1.000 OvIFN\tau	41,29	50,50	8,21
1.000 rHuIFN\alpha	41,73	44,91	13,36
10.000 OvIFN\tau	42,79	42,61	14,60
10.000 rHuIFN\alpha	18,01	71,31	10,67 (células muertas)

D. Linfoma de linfocitos T humano

La línea celular de linfoma de linfocitos T H9 era ligeramente menos sensible a los efectos antiproliferativos de los IFN que las líneas celulares tumorales descritas anteriormente. Los resultados de uno de los tres experimentos replicados se presentan en la Figura 10 como media del % de reducción de crecimiento \pm.DT. Mientras que rHuIFN\alpha no era tóxico en las células H9, falló para inhibir de forma significativa para inhibir la división celular a cualquier concentración examinada. Por el contrario, se observó que OvIFN\tau reducía el crecimiento de H9 en aproximadamente el 60% (Figura 10). De este modo, sólo OvIFN\tau es un inhibidor del crecimiento eficaz de este linfoma de linfocitos T.

Los resultados presentados anteriormente demuestran tanto el efecto antiproliferativo de IFN\tau como su baja citotoxicidad.

Ejemplo 16 Tratamiento preliminar in vivo con OvIFN\tau

Tres grupos de 4 ratones C57B1/6 por grupo recibieron por medio de de la vena de la cola 2,5 x 10^{4} linfocitos B16-F10: B16-F10 es un tumor singénico de ratón trasplantable seleccionado debido a su alta incidencia de mestástasis pulmonar (Poste, y col., 1981). El tratamiento con interferón se inició 3 días antes de la introducción de las células tumorales. Cada ratón recibió 100 \mul de PBS solo, PBS que contenía 1 x 10^{5} unidades de OvIFN\tau o PBS que contenía 1 x 10^{5} unidades de IFN\alpha murino recombinante (MuIFN\alpha) i.v. al día durante 3 días consecutivos.

Los ratones se sacrificaron a día 21 y se conservaron los pulmones en formalina tamponada al 10%. Se comparó la frecuencia de metástasis pulmonares entre los ratones de control (PBS), ratones tratados con OvIFN\tau y ratones tratados con MuIFN\alpha. Los resultados de estas administraciones in vivo demostraban que OvIFN\tau reducía de forma radical los tumores pulmonares de B16-F10. Estos resultados apoyan el uso de IFN\tau como un agente antineoplásico eficaz in vivo.

Ejemplo 17 Unión competitiva de fragmentos peptídicos de IFN\tau A. La capacidad de péptidos basados en IFN\tau para bloquear la actividad antivírica de IFN\tau e IFN\alpha

Se sintetizaron péptidos sintéticos solapados correspondientes a la secuencia completa de IFN\tau (Figura 6). Se calcularon los valores medios de hidropaticidad tomando la suma de los valores de hidropatía de cada aminoácido dividido por el número total de aminoácidos de cada secuencia. Los valores de hidropatía se tomaron de Kyte, y col. (1982).

Estos péptidos eran de aproximadamente el mismo peso molecular pero ligeramente diferentes en la hidrofilicidad total. A pesar de esta diferencia, todos los péptidos eran antigénicos como demostraba la producción de antisueros en conejos con valores mayores de 1:3.000 como se evaluó por ELISA (Harlow, y col., 1988).

Los péptidos se usaron para inhibir la actividad antivírica (Ejemplo 2) de OvIFN\tau y rBoIFN\alpha. Los resultados de este análisis se presentan en la Figura 12: tanto péptidos del extremo N- como del C- terminal a 1 mM bloqueaban de forma eficaz la actividad antivírica de OvIFN\tau usando células MDBK. Un tercer péptido, que representaba los aminoácidos 62-92, también reducía la actividad antivírica del IFN\tau (70% de inhibición). El péptido de OvIFN\tau (119-150) mostraba una actividad inhibidora mínima. Los péptidos de OvIFN\tau (34-64) y (90-122) no tenía actividad inhibidora aparente.

También se examinó la inhibición peptídica de la actividad antivírica de OvIFN\tau como sigue. Monocapas de células de riñón bovino de Madin Darby se incubaron con 40 unidades/ml de OvIFN\tau en presencia o ausencia de diversas concentraciones de péptidos de OvIFN\tau (véase la Figura 13). Los resultados de la Figura 13 se expresan como el porcentaje de la actividad antivírica del control: esto es, en ausencia de cualquier péptido competidor. Los datos presentados son las medias de 6 experimentos replicados. Los datos demuestran que la inhibición por OvIFN\tau (1-37), (62-92), (119-150) y (139-172) era significativamente diferente que la de OvIFN\tau (34-64) y (90-122) a 10^{-3} M y 3 x 10^{-3} M. OvIFN\tau (139-172) era significativamente distinto a todos los otros péptidos a 10^{-3} M. La significancia se valoró por análisis de varianza seguido de la prueba T de Scheffe a p < 0,05. De este modo, OvIFN\tau (1-37), (62-92), (119-150) y (139-172), en particular (139-172), pueden representar las regiones de unión al receptor para el IFN\tau.

La capacidad de los péptidos de OvIFN\tau para inhibir la actividad antivírica del IFN\alpha bovino (BoIFN\alpha) se examinó como sigue. Las monocapas de células de riñón bovino de Madin Darby se incubaron con 40 unidades/ml de IFN\alpha bovino en presencia o ausencia de diversas concentraciones de péptidos de OvIFN\tau. Los resultados se presentan en la Figura 14 y se expresan como el porcentaje de la actividad antivírica del control en ausencia de los péptidos de OvIFN\tau. Los datos presentados son la media de 4 experimentos replicados. Los resultados indican que la inhibición por OvIFN\tau (62-92), (119-150) y (139-172) eran significativamente diferentes de las de OvIFN\tau (1-37), (34-64) y (90-122) a 3 x 10^{-3} M. La significanza se valoró por análisis de varianza seguido de una prueba F de Scheffe a p < 0,05. De este modo, OvIFN\tau (62-92), (119-150) y (139-172), en particular (139-172), pueden representar regiones comunes de unión al receptor para IFN\tau.

También se examinó la inhibición peptídica de la actividad antivírica de IFN\alpha humano por los péptidos de OvIFN\tau. Monocapas de células de riñón bovino de Madin Derby se incubaron con 40 unidades/ml de IFN\alpha humano en presencia o ausencia de diversas concentraciones de péptidos de OvIFN\tau. Los resultados se expresan como el porcentaje de la actividad antivírica del control en ausencia de los péptidos de OvIFN\tau. Los datos se presentan en la Figura 15 y son las medias de 3 experimentos replicados. OvIFN\tau (139-172) era significativamente diferente de todos los otros péptidos a 10^{-3} M. La significanza se valoró por análisis de varianza seguido de una prueba F de Scheffe a p < 0,05. De este modo, OvIFN\tau (139-172) pueden representar una región de unión al receptor común para IFN\tau y diversos IFNa.

Los péptidos de OvIFN\tau descritos anteriormente parecen no tener efecto en la actividad antivírica de IFN\gamma. La inhibición peptídica de la actividad antivírica del IFN\gamma bovino se evaluó como sigue. Las monocapas de células de riñón bovino de Madin Darby se incubaron con 40 unidades/ml de IFN gamma bovino en presencia o ausencia de diversas concentraciones de péptidos de OvIFN\tau. Los resultados se expresan como el porcentaje de la actividad antivírica del control en ausencia de los péptidos de OvIFN\tau. Los datos se presentan en la Figura 16 y son las medias de 3 experimentos replicados. No hubo diferencias significativas entre péptidos según se valoró por análisis de varianza seguido de una prueba F de Scheffe a p < 0,05.

Los dos péptidos sintéticos OvIFN\tau(1-37) y OvIFN\tau(139-172) también bloqueaban la actividad de OvIFN\tau anti-VIF y anti-VIH. La actividad transcriptasa inversa (RT) (Ejemplos 12 y 13) se controló por un periodo de 14 días en células FET-1 infectadas con VIF (1x10^{6}/ml) y HPBL infectadas por VIH (1 x 10^{6}/ml). Los cultivos de control no recibieron OvIFN\tau. OvIFN\tau se usó a 100 ng/ml y los péptidos se usaron a 200 \muM. Los datos de un experimento representativo se expresan como cpm/ml de sobrenadante de cultivo y se presentan para las células infectadas por VIF, Figura 11A, y para la células infectadas por VIH, Figura 11B. Tanto el extremo N-terminal como el C-terminal parecen estar implicados en su actividad antirretrovírica. Aunque ambos péptidos bloquean la actividad RT del VIF, sólo el péptido del extremo C-terminal, OvIFN\tau (139-172), era un inhibidor eficaz de la actividad del virus de la estomatitis vesicular en las línea celular felina, Fc9. De este modo, las regiones C-terminal de los IFN de tipo I pueden unirse al sitio común en el receptor del IFN de tipo I, mientras que la región N-terminal puede estar implicada en el desencadenamiento de funciones únicas.

B. Sueros antipéptidos

También se determinó la capacidad de los antisueros antipéptidos para inhibir la actividad antivírica de OvIFN\tau. La inhibición de la actividad antivírica de OvIFN\tau por antisueros antipéptidos se evaluó como sigue. Monocapas de células MDBK se incubaron con 20 unidades/ml de OvIFN\tau en presencia de una dilución 1:30 de sueros preinmunes o antisueros para cada péptido de OvIFN\tau descrito anteriormente. Los datos de los experimentos duplicados se presentan en la Figura 17 como la media del porcentaje de inhibición de la actividad antivírica de OvIFN\tau producida por los antisueros antipéptidos en relación con los sueros preinmunes apropiados \pm error típico. Las diferencias significativas se valoraron por análisis de varianza seguido de la prueba F de Scheffe a p < 0,05. En consecuencia con la inhibición peptídica de las actividades antivíricas, los sueros que contenían anticuerpos inmunorreactivos con OvIFN\tau(1-37), OvIFN\tau(62-92) y OvIFN\tau(139-172) también fueron los inhibidores más eficaces de la actividad antivírica de OvIFN\tau, siendo los más eficaces los anticuerpos dirigidos contra los péptidos de los extremos N-terminal y C-terminal.

Los mismos sueros también se usaron para examinar su efecto en la unión de IFN\tau a su receptor.

El ensayo de unión de IFN\tau se realizó como sigue. Cinco \mug de IFN\tau se marcaron con yodo radiactivo durante 2 minutos con 500 \muCi de Na^{125}I (15 mCi/\mug; Amersham Corporation, Arlington Heights, IL) en 25 \mul de tampón fosfato potásico 9,5 M, pH 7,4 y 10 \mul de cloramina-T (5 mg/ml)(Griggs, y col., 1992). La actividad específica de la proteína marcada con yodo era de 137 \muCi/\mug. Para los ensayos de unión, monocapas de células MDBK se fijaron con paraformaldehído y se bloquearon con leche desnatada en polvo al 5%. Las células se incubaron con ^{125}I-IFN\tau en solución salina tamponada con fosfato con BSA al 1% durante 2 horas a 4ºC en presencia o ausencia de una dilución 1:30 de los sueros que contienen anticuerpos obtenidos contra los péptidos de IFN\tau o los sueros preinmunes apropiados. La unión específica se valoró por incubación con un exceso molar de 100 veces de IFN\tau sin marcar. La unión específica del 36% se determinó por competición con IFN\tau sin marcar 500 nM. Por ejemplo, el total de cuentas unidas fue de 6850 \pm 133, y un exceso molar de 100 veces de OvIFN\tau producía 4398 \pm 158 cuentas por minuto. Tras la incubación, las monocapas se lavaron tres veces, se solubilizaron con dodecil sulfato sódico al 1% y se contó la radiactividad. Los datos de tres experimentos replicados se presentan en la Figura 18 como la media del porcentaje de reducción de una unión específica de OvIFN\tau producida por los antisueros antipeptídicos en relación con los sueros preinmunes apropiados \pm desviación típica. Las diferencias significativas de valoraron por análisis de la varianza seguido de la prueba de Scheffe.

Los mismos sueros (que contenían anticuerpos inmunorreactivos con OvIFN\tau(1-37), OvIFN\tau(62-92) y OvIFN\tau(139-172)) eran los inhibidores más eficaces de la unión de ^{125}I-IFN\tau a su receptor el células MDBK. La falta de efecto de los sueros inmunorreactivos con otros péptidos derivados de IFN\tau no estaba en función del valor contra OvIFN\tau, ya que cada suero tenía igual o mayor título que sus respectivos péptidos en relación con los tres sueros inhibidores: se obtuvieron similares resultados cuando se valoró por ELISA para cada suero la reactividad de los sueros contra la molécula de OvIFN\tau completa.

Aunque estos péptidos aparentemente se unión al receptor de interferón, no estimulan por sí mismo efectos similares al interferón en las células.

C. Actividad antiproliferativa

Los sitios funcionalmente importantes para la actividad antiproliferativa de IFN\tau también se examinaron usando péptidos sintéticos (Tabla 10). La proliferación celular se evaluó como se ha descrito anteriormente usando células MDBK. Las células MDBK se cultivaron a 5x10^{5} células/ml en los experimentos 1 y 2 o a 10x10^{5} células/ml en el experimento 3 y se trataron con medio sólo, IFN\tau a una concentración de 300 unidades/ml y péptidos a 1 mM durante 48 horas. Los pocillos duplicados se contaron en cada uno de los experimentos replicados. Para el análisis estadístico, los datos se normalizaron en función del medio solo y se valoraron por análisis de varianza seguido de la prueba de comparación multiplaca de Menor Diferencia Significativa (p > 0,05).

TABLA 10 Inhibición peptídica de la actividad antiproliferativa de IFN\tau

2

Cuando se controló la proliferación de las células MBDK durante un período de dos días, el número de células aumentaba aproximadamente en 2 veces con una viabilidad mayor del 95%. La adición de 300 unidades/ml de OvIFN\tau eliminaba completamente la proliferación celular sin un descenso de la viabilidad celular. El IFN\tau ovino (119-150) era el inhibidor más eficaz de la actividad antiproliferativa de IFN\tau.

Los antisueros de IFN\tau(119-150), que inhiben la unión de OvIFN\tau al receptor, también invierten el efecto antiproliferativo de OvIFN\tau. Algunos otros péptidos, especialmente IFN\tau (139-172), invierten el efecto antiproliferativo de OvIFN\tau, pero en menor extensión.

Ejemplo 18 Reconocimiento diferencial del receptor de interferón de tipo I por IFN-\tau e IFN-\alpha A. Citotoxicidades relativas del OvIFN\tau y del IFN\alphaA humano ensayadas en células MDBK

Los ensayos de citotoxicidad se realizaron en células MDBK cultivada hasta la confluencia en placas de 96 pocillos. Las células del ensayo se trataron con diversas concentraciones (indicadas en las Figuras) de IFN, por triplicado, en 100 \mul de EMEM complementado con suero de ternera fetal al 2% y las células de control se trataron con medio solo. Las secuencias de ADN codificadoras de ADN de OvIFN\tau se clonaron en el plásmido pHIL-S1 de Pichia (Invitrogen, San Diego, CA), el plásmido se cortó con BglII y se usó el plásmido linealizado para transformar esferoplastos de Pichia pastoris (cepa GS115; Invitrogen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante). La proteína recombinante de OvIFN\tau se expresó en células de levadura His^{+} Mut^{-} transformadas y se purificó del medio de cultivo mediante cromatografía de intercambio iónico e hidroxiapatita hasta homogeneidad (0,8 x 10^{8} unidades/mg). El IFN\alphaA humano recombinante purificado (2 x 10^{8} unidades/mg) se obtuvo de Biosource International (Camarillo, CA).

Las células se incubaron a 37ºC hasta que se manifestó una muerte celular significativa por examen microscópico. Entonces las células se tiñeron con violeta de cristal, se lavaron las placas, se dejaron secar al aire y el colorante se extrajo con 2-metoxietanol (metil cellosolve). La absorbancia del eluído seco se midió a 570 nm.

Los resultados se muestran en las Figuras 22A y 22B. El IFN\tau era al menos 30 veces menos tóxico para las células MDBK que el IFN\alpha. La concentración que causaba el 50% de muerte celular era aproximadamente de 2.500 unidades/ml para el IFN\alpha, en comparación con aproximadamente 85.000 unidades/ml para el IFN\tau. Estos resultados confirman además que el IFN\tau y el IFN\alpha difieren notablemente en sus efectos citotóxicos.

B. OvIFN\tau no inhibe la citotoxicidad mediada por IFN\alphaA

Se investigó el potencial de concentraciones subtóxicas de IFN\tau para actuar como antagonista competitivo del efecto citotóxico del IFN\alpha usando el ensayo de citotoxicidad descrito inmediatamente antes.

En el primer experimento, mostrado en la Figura 23A, se añadieron a las células IFN\tau (50.000 unidades/ml) y/o IFN\alphaA (5.000 unidades/ml) y se realizó el ensayo como se describe inmediatamente antes. Los datos indican que el tratamiento con IFN\tau a una concentración 10 veces superior (pero no tóxica) que la del IFN\alphaA, no bloquea la toxicidad de IFN\alphaA sobre las células MDBK.

En el segundo experimento, mostrado en la Figura 23B, las células se trataron durante 1 h a 37ºC con IFN\tau (25.000 unidades/ml) antes de la adición del IFN\alphaA (5.000 unidades/ml) sin eliminar el IFN\tau. Los resultados muestran que la adición de IFN\tau a una concentración 5 veces superior 1 h antes de la adición de IFN\alphaA a las células no bloquea la toxicidad de IFN\alphaA.

Considerados en conjunto, estos resultados muestran que el IFN\tau es un pobre antagonista del efecto citotóxico de IFN\alphaA. Esta fue una observación sorprendente en vista de la homología estructural y funcional establecida de estos dos interferones de tipo I (Jarpe, y col., 1994) y sus actividades antivíricas específicas similares sobre células MDBK (Pontzer, y col., 1988). La incapacidad del IFN\tau para bloquear la citotoxicidad del IFN\alphaA sugiere que estos IFN se unen de forma diferente al complejo receptor de tipo I, iniciando, quizás, diferentes sucesos de señalización.

C. Unión de IFN\tau e IFN\alpha marcados con ^{125}I a células MDBK

Se marcaron IFN\tau e IFN\alphaA con el reactivo Bolton-Flunter (derivado de mono[^{125}I]yodo, \sim2000 Ci/mmol, Amersham; 1 Ci = 37 GBq) como se ha descrito (Langer y Pestka, 1986). La actividad específica de las proteínas marcadas era 40-70 \muCi/\mug. Los IFN marcados retenían la actividad antivírica completa en células MDBK que no había variado durante al menos 4 semanas a 4ºC.

Los ensayos de unión usando células MDBK se realizaron como se describe para IFN\alpha (Zoon, y col., 1986). Se incubaron monocapas confluentes de células MDBK en placas de 6 pocillos enfriadas previamente a 4ºC durante 4 h para ^{125}I-IFN\alphaA o toda la noche (\geq 17 h) para ^{125}I-IFN\tau para permitir la unión hasta alcanzar el equilibrio. Los datos de saturación de unión se analizaron con el programa "EBDA" (McPherson, 1985).

Los resultados se muestran en las figuras 24A (^{125}I-IFN\tau) y 24B (^{125}I-IFN\alphaA). La unión específica se calculó por sustracción de la unión inespecífica determinada para cada concentración en presencia de un exceso de 100 veces del correspondiente IFN sin marcar. La unión inespecífica era < 20% para IFN\tau y < 7% para IFN\alphaA. Los valores se representan como la media \pm DT. En las inserciones de cada figura se muestran los gráficos de Scatchard de los datos de unión (U, unido; L, libre).

Los datos muestran que ^{125}I-IFN\tau se une a las células MDBK con alta especificidad (Figura 24A). El análisis de Scatchard de la unión (inserción en la Figura 24A) revela una K_{d} aparente de 3,90 x 10^{-10} M. El valor de K_{d} está dentro del intervalo (10^{-11} a 10^{-9} M) para la unión de los diversos IFN\alpha a una diversidad de tipos celulares (Rubinstein, y col., 1986; Aguet, y col., 1983) y es similar al valor de unión del IFN\alphaD recombinante bovino (3,5 x 10^{-10} M) y del IFN\tau recombinante bovino (3,7 x 10^{-10} M) a membranas del endometrio bovino (Li y Roberts, 1994). Sin embargo, el análisis de Scatchard de la unión de ^{125}I-IFN\alphaA a células MDBK (Figura 24B) rindió una Kd aparente de 4,45 x 10^{-11} M para IFN\alphaA, similar a aquella (6,0 x 10^{-11} M) previamente publicada (Zoon, y col., 1986). La concentración total de receptor para ^{125}I-IFN\alphaA (4,62 pM) era muy similar a la de ^{125}I-IFN\tau (4,22 pM) de los gráficos de Scatchard. Estos resultados indican que el IFN\alphaA tiene una Kd para los receptores de IFN en las células MDBK casi 10 veces menor que la del IFN\tau. Además, los resultados sugieren que esta diferencia sustancial en las afinidades de unión es responsable de la incapacidad del IFN\tau para "competir" por los receptores y bloquear la toxicidad del IFN\alphaA.

D. Unión competitiva de IFN\tau e IFN\alpha marcados con ^{125}I a células MDBK

Se llevaron a cabo experimentos de unión competitiva para confirmar que IFN\tau e IFN\alphaA se unían al mismo receptor. Se incubaron monocapas confluentes de células MDBK en placas de 6 pocillos, por triplicado, con las concentraciones indicadas de IFN\alphaA o IFN\tau sin marcar y ^{125}I-IFN\tau 0,2 nM (Figura 25A) o ^{125}I-IFN\alphaA 0,02 nM (Figura 25B). Los valores se representan como porcentaje de la unión específica del control determinado en ausencia de competidor. Un valor del 100% representa una media de unión media de 1673 \pm 51 cpm (media \pm DT) para ^{125}I-IFN\tau y de 1255,7 \pm 16,3 cpm (media \pm DT) para ^{125}I-IFN\alphaA. La unión inespecífica se determinó en presencia de 200 nM de IFN\tau sin marcar para ^{125}I-IFN\tau (11% de unión inespecífica) y 20 nM de IFN\alphaA sin marcar para FNaA (5% de unión inespecífica) y se sustrajo de la unión total.

El IFN\alphaA era un potente competidor de la unión de ^{125}I-IFN\tau a células MDBK (Figura 25A). De hecho, el IFN\alphaA era 40 veces más eficaz que el propio IFN\tau para inhibir la unión de ^{125}I-IFN\tau a un nivel del 50%. Se obtuvieron resultados similares cuando se usó IFN\alphaD recombinante humano como competidor. Los estudios de competición cruzada usando ^{125}I-IFN\alphaA (Figura 25B) de nuevo mostraban que el IFN\alphaA era > 40 veces más eficaz que el IFN\tau en desplazar el ^{125}I-IFN\alphaA a un nivel del 50%.

Estos datos indican que el IFN\alphaA tenía mucha mayor afinidad que el IFN\tau por los receptores de IFN en las células MDBK, un resultado que concuerda con la K_{d} 10 veces menor. Además, los resultados de los experimentos de competición proporcionan una explicación para la incapacidad de que un exceso (5:1) de IFN\tau bloquee los efectos citotóxicos de IFN\alphaA en células MDBK. La afinidad más alta por parte del receptor de IFN\alphaA sugiere un reconocimiento por el receptor diferencial entre IFN\tau e IFN\alphaA y explica la incapacidad de IFN\tau para bloquear la toxicidad de IFN\alphaA.

E. Inhibición de la unión de los IFN a células MDBK por antisueros contra los extremos N o C-terminal del IFN\tau

Se ensayó la capacidad de los antisueros de conejo obtenidos contra péptidos de IFN\tau IFN\tau(1-37) (N-terminal; ID. SEC. Nº: 5) e IFN\tau(139-172) (C-terminal; ID. SEC. Nº: 10) como se describen en el Ejemplo 17, para bloquear la unión de IFN\alpha e IFN\tau a células MDBK. Se incubaron monocapas confluentes de células MDBK en placas de 96 pocillos con 0,3 \muM de IFN\alpha o IFN\tau biotinilados en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía suero bovino fetal al 5% y una dilución 1:30 del antisuero apropiado durante 3 h a temperatura ambiente. Tras lavar con solución salina tamponada con fosfato con suero bovino fetal al 5%, las placas se revelaron con un conjugado "EXTRAVIDIN"-fosfato alcalino usando fosfato de p-nitrofenilo como sustrato (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). IFN\alpha e IFN\tau se biotinilaron con el kit de biotinilización NHS-LC (Pierce) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La unión específica se determinó como se ha descrito anteriormente para los IFN marcados con ^{125}I.

Los resultados se muestran en la Figura 26. Las barras rellenas representan la inhibición de la unión de IFN\tau e IFN\alphaA a células MDBK por antisueros obtenidos contra el extremo N-terminal, mientras que las barras rayadas representan la inhibición por antisueros obtenidos contra el extremo C-terminal. Los datos se representan como la media de absorbancia \pm DT. Las muestras de control se trataron con suero preinmune (barras vacías).

Los datos indican que el antisuero contra el péptido N-terminal IFN\tau(1-37) (ID. SEC. Nº: 5) bloqueaba específicamente la unión de IFN\tau, pero no la de IFN\alpha, a células MDBK. Por el contrario, el antisuero contra el péptido C-terminal IFN\tau(139-172) (ID. SEC. Nº: 10) bloqueaba la unión tanto del IFN\tau como del IFN\alpha. Estos hallazgos concuerdan con la hipótesis de que el IFN\tau(1-37) contiene un epítopo que es único para el IFN\tau y que contribuye materialmente tanto a la unión como a la actividad biológica del IFN\tau en células MDBK. Además, los datos sugieren que esta interacción diferencial en el extremo N-terminal del IFN\tau y del IFN\alpha da cuenta, al menos en parte, de la competición diferencial por el receptor en las células MDBK.

F. Curvas dosis-respuesta/ocupación para IFN\tau e IFN\alphaA en células MDBK

Las curvas de dosis frente a respuesta/ocupación, o curvas del efecto de la concentración, para (i) porcentaje de actividad antivírica máxima, (ii) porcentaje de citotoxicidad máxima y (iii) porcentaje de unión máxima para IFN\tau e IFN\alphaA en células MDBK se calcularon usando los datos descritos anteriormente y se representaron como funciones de concentración en las Figuras 27A (IFN\tau) y 27B (IFN\alphaA). La actividad antivírica se cuantificó mediante un ensayo de inhibición del efecto citopático usando el virus de la estomatitis vesicular (Armstrong, 1981) como se describe en el Ejemplo 2, y se normalizaron usando un valor de 2 x 10^{8} unidades/mg para IFN\alphaA. Los datos de las curvas de dosis frente a respuesta de citotoxicidad y las curvas de saturación de unión se representaron como porcentaje de los valores máximos. Las concentraciones se determinaron a partir de las unidades antivíricas, usando una actividad específica de 2,0 x 10^{8} unidades/mg para IFN\alphaA y 0,8 x 10^{8} unidades/mg para IFN\tau en células MDBK. Los símbolos son como sigue: porcentaje de la actividad antivírica máxima (\circ), porcentaje de citotoxicidad máxima (\Box) y porcentaje de unión máxima (\diamondsuit).

Los resultados demuestran que la citotoxicidad está asociada a la saturación de unión al receptor, mientras que la actividad antivírica implica una ocupación fraccionaria de los receptores. En otras palabras, la toxicidad se correlaciona con la K_{d}. El IFN\alphaA se une a células MDBK con una afinidad 10 veces mayor que el IFN\tau y es tóxico a concentraciones mucho más bajas. Las actividades antivíricas específicas de los dos IFN son similares, 2 x 10^{8} unidades/mg de proteína para IFN\alphaA y 0,8 x 10^{8} unidades/mg para IFN\tau, que concuerda con la inducción de actividad antivírica máxima sólo con una ocupación fraccionaria baja de los receptores.

G. Fosforilación de Tyk2, Stat1\alpha y Stat2 inducida por IFN\tau e IFN\alphaA

La unión de los IFN a sus receptores se traduce en la célula por la maquinaria de transducción de señales que implican un grupo de tirosina quinasas y factores de transcripción que se activan por fosforilación. De este modo, se realizaron los experimentos para determinar si las diferencias en la unión del IFN\alpha y del IFN\tau se manifiestan en cambios en la activación de la tirosina quinasa TyK2 asociada al receptor de tipo I y los factores de transcripción Stat1\alpha y Stat2.

Se estimularon células Daudi en medio RPMI 1640 (4-5 x 10^{7} células por ml de muestra) con IFN\alphaA o IFN\tau a 5000 unidades/ml o se dejaron sin tratar durante 4 min (Tyk2) o 10 min (Stat1\alpha y Stat2) a 37ºC. Luego se lisaron las células a 4ºC durante 20 min en 500 \mul de tampón de lisis enfriado en hielo que contenía Tris HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, EGTA 2mM, EDTA 2 mM, NaF 50 mM, fosfato de B-glicerilo 20 mM, Na_{3}VO_{4} 2 mM, p-guanidinobenzoato de p-nitrofenilo 0,05 mM (de una solución madre en dimetilformamida), leupeptina (10 \mug/ml), pepstatina (10 \mug/ml), aprotinina (10 \mug/ml), benzamidina (5 \mug/ml), fluoruro de fenilmetanosulfonilo 1 mM, glicerol al 10% (vol/vol) y "NONIDET P-40" al 1% (vol/vol).

Tras la inmunoprecipitación de los extractos (500 \mul) con 1 \mug de anticuerpos anti-Tyktc2, o una mezcla de 1 \mug de anticuerpos anti-Stat1\alpha y 1 \mug de anti-Stat2 y la inmunotransferencia, las transferencias se incubaron (transferencia por Western) con anticuerpo monoclonal antifosfotirosina (anti-PY) (4G10) y se detectó la fosforilación en la tirosina de Tyk2, Stat1\alpha y Stat2 con ECL (Amersham). Luego las transferencias se limpiaron del anti-PY y se reincubó bien con anticuerpos contra la proteína Tyk2 o con una mezcla de anticuerpos contra Stat1\alpha y Stat2.

Los resultados demuestran que el IFN\tau era tan eficaz como el IFN\alpha en la fosforilación de Tyk2. No se vieron diferencias en los niveles de proteína Tyk2 en células sin estimular y células estimuladas con los IFN. Además, el IFN\tau y el IFN\alpha inducían niveles comparables de fosforilación tanto de Stat1\alpha como de Stat2. De nuevo, no se observaron diferencias en los niveles de proteína de los inmunoprecipitados de Stat1\alpha y Stat2 a partir de células estimuladas o no estimuladas. De este modo, el IFNr es similar al IFN\alpha en la activación de estas proteínas de transducción de señales asociadas con los receptores de tipo I, en mantener sus semejanzas estructurales y funcionales con los
IFN\alpha.

Ejemplo 19 Análisis adicionales de los efectos celulares y antivíricos de IFN\tau A. Efectos antivíricos VIH

Los efectos antivíricos del IFN\tau contra VIH se evaluaron tratando células PBMC humanas con diversas cantidades de IFN\tau recombinante ovino (r-OvIFN\tau) o de IFN\alpha2a recombinante humano en el momento de la infección con VIH. El IFN\tau estuvo presente a lo largo de todo el experimento. El día 7 y el día 14 se determinó la producción de p24 (mediante ELISA (Wang, y col., 1988, 1989)) y se comparó con un control cero de medicamento. Los resultados de este análisis se presentan en la Tabla 11.

TABLA 11

Cantidades de medicamento Unidades/ml	% de inhibición	% de inhibición
IFN\alpha2a	IFN\tau	Día 7	Día 14
10		58%, 48%	91%, 91%
	26	48%, 45%	88%, 59%
100		68%, 74%	94%, 91%
	260	58%, 51%	82%, 70%
1.000		89%, 86%	97%, 93%
	2.600	65%, 68%	87%, 79%
10.000		90%, 86%	99%, 99%
	26.000	77%, 85%	77%, 96%
	260.000	85%, 84%	96%, 86%

Los datos de estos experimentos apoyan la conclusión que, a concentraciones relativamente bajas, IFN\alpha2a e IFN\tau son eficaces reduciendo la replicación del VIH en linfocitos humanos.

B. Test de citotoxicidad in vitro en PBMC

Se dispusieron en placas PBMC humanos a 5 x 10^{5} células/ml. Las células se estimularon a día 0 con 3 \mug/ml de PHA. Las células se trataron con IFN\alpha2a recombinante humano (a concentraciones de 10, 100, 1.000 y 10.000 unidades/ml) y con IFN\tau (a concentraciones de 2,6, 26, 260, 2.600, 26.000, 260.000 y 2.600.000 unidades/ml) en 200 \mul/pocillo (4 replicados de cada concentración usando placas de 96 pocillos con fondo plano). A los cultivos de control no se les suministró interferón. Después de 4 días de incubación, las células recibieron un pulso de 9 horas usando ^{3}H-timidina a 1 \muCi/pocillo. Se recogieron las células y se determinó la incorporación de timidina marcada en el ADN (Figura 8).

No se observó citotoxicidad midiendo la captación de timidina a ninguna concentración de IFN\tau. Sin embargo, el rHuIFN\alpha2a era tóxico para las células a 1.000 unidades/ml.

En el segundo experimento, los mismos PBMC humanos se trataron con IFN\tau o con IFN\alpha2a humano a concentraciones de 100 unidades/ml o 10.000 unidades/ml. Después de 3 días u 8 días de incubación, se contaron las células viables por citometría de flujo. Los resultados de este análisis se presentan en la Tabla 12.

TABLA 12

Tratamiento (unidades/ml)	Número de células viables x 10.000
	Día 3	Día 8
Sin tratamiento	735	840
IFN\tau 100 unidades/ml	745	860
IFN\tau 10.000 unidades/ml	695	910
IFN\alpha2a 100 unidades/ml	635	750
IFN\alpha2a 10.000 unidades/ml	680	495

No se observó citotoxicidad en las linfocitos Tratadas con IFN\tau. Sin embargo, había el 10% de muerte celular en las linfocitos Tratadas con IFN\alpha2a a día 3 y el 49% a día 8.

C. Inhibición de la replicación del ADN del virus de la hepatitis B en hepatocitos

La línea celular usada, HepG2-T14, es una célula humana que deriva de células de hígado transfectadas con el virus de la hepatitis B (VHB). La línea celular produce virus VHB de forma semiestable: a lo largo del tiempo disminuye la producción de ADN intracelular de VHB de la línea celular y el virus secretado. Para maximizar la producción de ADN y de virus VHB, las células se pretratan con deAZA-C (5-azacitidina; Miyoshi, y col., 1992) para inducir la producción del virus. El tratamiento fue de 2-3 días y la cantidad de inducción fue aproximadamente un factor o dos.

Entonces se trataron con IFN\alpha e IFN\tau a concentraciones de 0, 5.000, 10.000, 20.000 y 40.000 unidades por ml.

Todas las concentraciones de IFN\alpha o IFN\tau reducían la producción de ADN aproximadamente un factor o 2 comparado con el control sin medicamento.

D. Inhibición de la producción de ARN mensajero hepatoespecífico en hepatocitos

Los efectos del IFN\alpha y del IFN\tau en la producción de ARNm hepatoespecífico se examinaron en la línea celular de hepatocito HepG2-T14 (descrita anteriormente). Las células se incubaron con concentraciones de IFN\alpha o de IFN\tau de 0, 5.000, 10.000, 20.000 y 40.000 unidades/ml. Los ARN mensajeros de las proteínas específicas de hepatocito Apo E y Apo A1 se detectaron por análisis de hibridación (Sambrook, y col. 1989; Maniatis, y col., 1982) usando sondas específicas para estos dos ARNm (Shoulders, y col., 1982; Wallis, y col., 1983).

No se observó reducción de la producción de ARNm para la producción de ARNm Apo E o Apo A1 con hasta 40.000 unidades de IFN\alpha o de IFN\tau. Este resultado sugiere que la reducción de la replicación del ADN vírico en experimentos previos no era debida a los efectos de los IFN en las actividades celulares constitutivas; más que la reducción fuera probablemente debida a la inhibición específica de la replicación vírica en las células hospedadores.

E. Toxicidad in vitro de IFN\beta, IFN\gamma e IFN\tau- Ensayo de células L929

La toxicidad del tratamiento con IFN se midió in vitro usando la línea celular de ratón L929. Las células de L929 se trataron con 6000 U/ml a 200.000 U/ml de OvIFH\tau o MuIFN\beta. Los interferones se añadieron a tiempo cero y las células se incubaron durante 72 horas y se tiñeron con violeta de cristal. El porcentaje de células vivas se determinó midiendo la absorbancia a 405 nm.

En la Figura 21 se presentan ejemplos de los datos. Los valores se representan como porcentaje de viabilidad \pm error típico en los que el 100 por ciento es igual a la viabilidad de las células L929 tratadas sólo con medios. A 6000 U/ml, las linfocitos Tratadas con IFN\beta mostraban una viabilidad del 77,0 \pm 0,6. La viabilidad de las células L929 disminuía cuando aumentaban las concentraciones de IFN\beta de manera dependiente de la dosis. Por el contrario, las células L929 no mostraron disminución de la viabilidad a ninguna de las concentraciones de IFN\tau ensayadas. Estos datos indican que, a diferencia de IFN\beta, IFN\tau carece de toxicidad a altas concentraciones in vitro.

Tomados conjuntamente, los resultados resumidos anteriormente demuestran que IFN\tau es esencialmente no tóxico a concentraciones a las que IFN\beta induce toxicidad tanto in vitro como in vivo.

F. Toxicidad in vivo de IFN\beta, IFN\gamma e IFN\tau- Recuento celular y cambios de peso

Los efectos del tratamiento in vivo con IFN\tau, IFN\beta e IFN\gamma (10^{5} U/inyección) en linfocitos totales (WBC), el recuento de linfocitos totales y las medidas de peso en ratones NZW se evaluaron como sigue. Los interferones (OvIFH\tau, MuIFN\beta y MuIFN\alpha) se inyectaron por vía intraperitoneal (i.p.) a una concentración de 10^{5} U en un volumen total de 0,2 ml en PBS en grupos de ratones blancos New Zealand (NZW) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). En cada grupo se incluyeron de tres a cuatro animales. Los recuentos de linfocitos (WBC) se determinaron antes de la inyección y a intervalos de tiempo seleccionados a partir de entonces (típicamente a 12 y 24 horas) usando un hemocitómetro y técnicas convencionales. Los recuentos diferenciales de WBC se realizaron en frotis de sangre teñidos con Wright-Giemsa. Antes de la inyección inicial, los pesos de los animales oscilaban de 20 a 23
gramos.

Los resultados se resumen en la Tabla 13, a continuación.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 13 Toxicidad in vivo de interferones medida por recuento de linfocitos y porcentaje de cambio de peso

3

No se observaron diferencias significativas en el recuento de WBC, recuento de linfocitos o cambios de peso entre los ratones tratados y no tratados con IFN\tau. Por el contrario, los ratones tratados con IFN\beta mostraban un decaimiento del 31,7% en el recuento de linfocitos 12 horas después de la inyección, que continuaba durante al menos las siguientes 12 horas. Los ratones tratados con IFN\alpha mostraban un decaimiento del 55,8% en los linfocitos y una pérdida de peso significativa 12 horas después de la inyección. Estos datos indican que, al contrario que el IFN\beta y el IFN\alpha, el IFN\tau carece de toxicidad in vivo a las concentraciones anteriores como evidencia el recuento de linfocitos periféricos y las medidas de peso.

Ejemplo 20 Aislamiento de la proteína de fusión de interferón híbrido

Las perlas de Sepharosa 4B conjugadas con anti-beta galactosidasa se obtuvieron de Promega. Las perlas se empaquetaron en una columna de 2 ml y se lavaron sucesivamente con solución salina tamponada con fosfato con azida sódica al 0,02% y 10 ml de tampón TX (tampón Tris 10 mM, pH 7,4, aprotinina al 1%).

Una secuencia que codifica el interferón híbrido se clona en el sitio del policonector de lambda gt11. La secuencia codificadora quimérica se sitúa en marco con las secuencias de lambda gt11 que codifican el extremo amino terminal de la \beta-galactosidasa. Se usan lisógenos infectados con gt11/IFN para inocular 500 ml de caldo de cultivo NZYDT. El cultivo se incuba a 32ºC con aireación hasta una D.O. de aproximadamente 0,2 a 0,4, después se lleva a 43ºC rápidamente en un baño con agua a 43ºC durante 15 minutos para inducir la síntesis del péptido gt11, y se incuba a 37ºC durante 1 hora más. Las células se sedimentan por centrifugación, se suspenden en 10 ml de tampón de lisis (Tris 10 mM, pH 7,4 que contiene "TRITON X-100" al 2% y aprotinina al 1% añadida justo antes del uso).

Las células resuspendidas se congelan en nitrógeno líquido y luego se descongelan, dando como resultado una lisis celular sustancialmente completa. El lisado se trata con desoxirribonucleasa I para digerir el ADN bacteriano y del fago, como se ponía de manifiesto por una pérdida gradual de viscosidad en el lisado. El material no solubilizado se retira por centrifugación.

El material lisado aclarado se carga en una columna de Sepharosa, se cierran los extremos de la columna y la columna se coloca en un agitador rotatorio durante 2 h a temperatura ambiente y 16 horas a 4ºC. Después de que la columna se deposite, se lava con 10 ml de tampón TX. La proteína de fusión se eluye con tampón carbonato/bicarbonato 0,1 M, pH 10. Típicamente, se pasan a través de la columna 14 ml del tampón de elución, y la proteína de fusión eluye en los primeros 4-6 ml de eluído.

El eluído que contiene la proteína de fusión se concentra en cartuchos de "CENTRICON-30" (Amicon, Danvers, Mass.). El concentrado de la proteína final se resuspende en, por ejemplo, 400 \mul de tampón PBS. La pureza de la proteína se analiza por SDS-PAGE.

Para los anticuerpos policlonales, la proteína de fusión purificada se inyecta por vía subcutánea en adyuvante de Freund en un conejo. Aproximadamente se inyecta 1 mg de la proteína de fusión los días 0 y 21, y el suero del conejo se recoge típicamente a las 6 y 8 semanas.

Ejemplo 21 Preparación de anticuerpo anti-IFNhib A. Expresión de proteínas de fusión de la glutation-S-transferasa

Una molécula quimérica de ácidos nucleicos de secuencia codificadora de un interferón híbrido se clona en el vector pGEX (Boyer, y col., 1992; Frangioni, y col., 1993; Guan, y col., 1991; Hakes, y col., 1992; Smith, D.B., y col., 1988). El vector pGEX (Smith, D.B., y col., 1988) se modificó por inserción de una secuencia en marco de trombina escindible con la proteína glutation-S-transferasa (GST - secuencia que codifica sj26). Este vector se denomina pGEXthr. La secuencia codificadora del IFN híbrido (IFNhib) se sitúa en marco con las secuencias que codifican sj26-trombina (Guan, y col., 1991; Hakes y col., 1992).

La secuencia codificadora del IFN híbrido se liga a vector pGEXthr linealizado. La mezcla de ligamiento se transforma en E. coli y se seleccionan colonias resistentes a ampicilina. Los plásmidos se aíslan a partir de las colonias resistentes a ampicilina y se analizan por digestión con enzima de restricción para identificar los clones que contiene la inserción de IFN (vector denominado pGEXthr-IFNhib).

La cepa XL-I Azul de E. coli se transforma con pGEXthr-IFNhib y se crece a 37ºC durante una noche. El ADN se prepara a partir de colonias seleccionadas al azar. La presencia de la secuencia codificadora insertada típicamente se confirma por (i) mapeo de digestión de restricción, (ii) análisis de hibridación usando sondas IFNhib marcadas (es decir, análisis por Southern), o (iii) análisis directo de la secuencia de ADN.

B. Purificación parcial de las proteínas de fusión

El clon pGEXthr-IFNhib se crece durante una noche. El cultivo de una noche se diluye 1:10 con medio LB que contiene ampicilina y se crece durante 1 hora a 37ºC. De forma alternativa, el cultivo de una noche se diluye 1:100 y se crece hasta D.O. de 0,5-1,0 antes de la adición de IPTG (isopropiltio-\beta-galactosidasa). Se añade IPTG (GIBCO-BRL, Gaithersburg MD) a una concentración final de 0,2-0,5 mM para la inducción de la expresión de proteína y la incubación se continúa típicamente de 2-5 horas, preferiblemente 3,5 horas.

Las células Bacterianas se recogen por centrifugación y se resuspenden en un volumen 1/100 del cultivo de MTPBS (NaCl 150 mM, Na_{2}PO_{4} 16 mM, NaH_{2}PO_{4}). Las células se lisaron con lisozima, sonicación o con prensa de French, y los lisados se aclararon de los detritus celulares por centrifugación.

Se analiza una alícuota del sobrenadante obtenido de cultivos de células que contienen pGEXthr-IFNhib inducidos con IPTG y una alícuota del sobrenadante obtenido de cultivos de vector pGEXthr-IFNhib solo inducidos con IPTG mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida seguido de transferencia por Western, como se ha descrito anteriormente.

Si es necesario, los extractos se pueden concentrar por ultrafiltración usando, por ejemplo, un filtro "CENTRICON 10".

Alternativamente, las proteínas de fusión se purifican parcialmente en una columna de afinidad de agarosa glutatión como describen en detalle Smith, D.B., y col., 1988. En este procedimiento, se crecen 100 ml de cultivo durante una noche. Los cultivos se diluyen hasta 1 litro, y las células se crecen otra hora a 37ºC. La expresión de las proteínas de fusión se induce usando IPTG. Los cultivos inducidos se crecen a 37ºC durante 3,5 horas. Se recogen las células y se usa un sonicador para lisar las células. Se sedimentan los restos celulares y el lisado claro se carga en una columna "SEPHAROSE" glutatión. La columna se lava con varios volúmenes de columna. Se eluye la proteína de fusión de la columna de afinidad con glutatión reducido y se dializa. El IFN puede liberarse de la proteína híbrida combinada mediante el tratamiento con trombina. Los fragmentos sj26 e IFNhib de la proteína híbrida combinada se pueden separar después por fraccionamiento en función del tamaño en columnas o en geles.

Alternativamente, la porción de IFNhib de la proteína híbrida combinada se libera de la columna mediante el tratamiento con trombina (Guan, y col., 1991; Hakes, y col., 1992).

C. Anticuerpos contra la proteína de fusión

La proteína de fusión Sj26/IFN se inyecta por vía subcutánea en adyuvante de Freund en un conejo. Se inyecta aproximadamente 1 mg de la proteína de fusión los días 0 y 21 y típicamente, el suero del conejo se recoge a las semanas 6 y 8. Un segundo conejo se inmuniza de forma similar con proteína Sj26 purificada obtenida del lisado bacteriano de control.

Se preparan minilisados de los siguientes cultivos bacterianos: (1) células KM392 infectadas con pGEXthr y pGEXthr que contiene el inserto IFNhib; y (2) células infectadas con lambda gt11 que contiene la inserción IFNhib. Los minilisados y una fuente comercial de \beta-galactosidasa de origen comercial se fraccionan mediante SDS-PAGE y se transfieren las bandas a filtros de nitrocelulosa mediante transferencia por Western (Sambrook, y col., 1989; Ausubel, y col., 1988).

Resumiendo los resultados esperados, el suero de conejos de control (Sj26) es inmunorreactivo con cada uno de los antígenos de Sj26 y de las proteínas fusionadas Sj26. El suero de los animales inmunizados con la proteína de fusión Sj26/IFNhib es reactivo con todas las proteínas de fusión Sj26 y beta-gal que contenían la secuencia codificadora de IFNhib, indicando la presencia de una inmunoreacción específica con el antígeno IFNhib. No se esperaba que ninguno de los sueros fuera inmunorreactivo con beta-galactosidasa.

El anticuerpo anti-IFNhib presente en los sueros de los animales inmunizados con Sj26/IFNhib se purifica mediante cromatografía de afinidad (usando IFNhib producido de forma recombinante inmobilizado como ligando, esencialmente como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 12 para el anticuerpo anti-beta-galactosidasa).

Mientras que la invención se ha descrito con referencia a procedimientos y realizaciones específicos, será evidente que se pueden hacer diversas modificaciones y cambios sin apartarse de la invención.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: UNIVERSIDAD DE FLORIDA

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Composiciones de interferón híbrido y procedimientos de uso

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 55

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(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Dehlinger & Associates

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(B)

CALLE: 350 Cambridge Ave., Suite 250

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(C)

CIUDAD: Palo Alto

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(D)

ESTADO: CA

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(E)

PAÍS: Estados Unidos

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 94306

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(v)

FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

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(B)

ORDENADOR: IBM compatible con PC

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

PROGRAMA: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.25

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 11 de abril de 1997

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/631.328

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 12 de abril de 1996

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(viii)

INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:

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(A)

NOMBRE: Sholtz, Charles K.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 38.615

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 5600-0201.41

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A)

TELÉFONO: 415-324-0880

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(B)

TELEFAX: 415-324-0960

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 516 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Ovis aries

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: Doméstica

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO DE DESARROLLO: Blástula (Blastocisto)

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: Trofectodermo

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TIPO CELULAR: Células mononucleares de trofectodermo

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: oTP-1a

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

POSICIÓN EN EL GENOMA:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

UNIDADES: pb

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..516

\vskip0.800000\baselineskip

(x)

INFORMACIÓN SOBRE LA PUBLICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

AUTORES: Ott, Troy L

\vskip0.500000\baselineskip

Van Heeke, Gino

\vskip0.500000\baselineskip

Johnson, Howard M

\vskip0.500000\baselineskip

Bazer, Fuller W

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TÍTULO: Cloning and Expression in Saccharomyces cerevisiae of a Synthetic Gene for the Type I Trophoblast Interferon Ovine Trophoblast Protein-1: Purification and Antiviral Activity

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REVISTA: J. Interferon Res.

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

VOLUMEN: 11

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

PÁGINAS: 357-364

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

FECHA: 1991

\vskip0.500000\baselineskip

(K)

RESTOS IMPORTANTES EN LA ID. SEC. Nº: 1: DEL 1 AL 516

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 1:

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 172 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos de una proteína OvIFNtau madura

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 2:

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 516 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de nucleótidos sintéticos que codifica una proteína de interferón tau humana madura, HuIFNtau1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 3:

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 172 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos para una proteína HuIFNtau madura, RuIFNtau1.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 4:

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos del fragmento 1-37 de la ID. SEC. Nº: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys}

\sac{Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp}

\sac{Arg Lys Asp Phe Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos del fragmento 34-64 de la ID. SEC. Nº: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Asp Gln Leu Gln}

\sac{Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos del fragmento 62-92 de la ID. SEC. Nº: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp}

\sac{Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu Gln Gln Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos del fragmento 90-122 de la ID. SEC. Nº: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Gln Leu Asp His Leu Asp Thr Cys Arg Gly Gln Val Met Gly}

\sac{Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly Asn Met Asp Pro Ile Val Thr Val Lys}

\sac{Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos del fragmento 119-150 de la ID. SEC. Nº: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr Asp Tyr Leu Gln Glu Lys}

\sac{Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Val Glu Met Met Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos del fragmento 139-172 de la ID. SEC. Nº: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val}

\sac{Ser Thr Thr Leu Gln Lys Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 588 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia que codifica el interferón tau humano HuIFNtau con una secuencia líder.

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..585

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 11:

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 195 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos predicha codificada por la ID. SEC. Nº: 11 (HuIFNtau1)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 12:

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: oligonucleótido sintético 25-mérico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGTCTGCA GGACAGAAAA GACTT

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: oligonucleótido sintético 25-mérico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTGAATTCT GACGATTTCC CAGGC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos del fragmento 1-37 de la ID. SEC. Nº: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Arg Lys Asn Leu Arg}

\sac{Leu Leu Asp Glu Mer Arg Arg Leu Ser Pro Arg Phe Cys Leu Gln Asp}

\sac{Arg Lys Asp Phe Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos del fragmento 34-64 de la ID. SEC. Nº: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Asp Phe Ala Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln}

\sac{Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos del fragmento 62-92 de la ID. SEC. Nº: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Ser Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp}

\sac{Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos del fragmento 90-122 de la ID. SEC. Nº: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Gln Gln Leu Asp Asn Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Met Gly}

\sac{Glu Glu Asp Ser ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Leu Lys}

\sac{Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos del fragmento 119-150 de la ID. SEC. Nº: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Leu Lys Arg Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys}

\sac{Gly Tyr Ser Asp Gys Ala Trp Glu Thr Val Arg Leu Glu Ile Met Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos del fragmento 139-172 de la ID. SEC. Nº: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ala Trp Glu Thr Val Arg Leu Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ser}

\sac{Leu Ile Ser Leu Gln Gln Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser}

\sac{Ser Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 299 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: HuIFNtau6

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..298

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

11

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 99 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos predicha codificada por la ID. SEC. Nº: 21 (HuIFNtau6)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 288 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: HuIFNtau7

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..286

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 23:

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 95 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos predicha codificada por la ID. SEC. Nº: 23 (HuIFNtau7)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 307 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: HuIFNtau4

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..307

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 25:

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 102 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos predicha codificada por la ID. SEC. Nº: 25 (HuIFNtau4)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 26:

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 294 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: HuIFNtau5

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 2..292

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 97 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos predicha codifica por la ID. SEC. Nº: 27 (HuIFNtau5)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 28:

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 516 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: HuIFNtau2

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..516

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 29:

19

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 115-117

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "para permitir la expresión de la proteína codificada, este sitio puede modificarse para codificar un aminoácido, por ejemplo, Gln"

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 171 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos predicha codificada por la ID. SEC. Nº: 29 (HuIFNtau2)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 30:

20

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 39

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "donde Xaa es un aminoácido seleccionado, por ejemplo, Gln"

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 588 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: HuIFNtau3

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..588

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 31:

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 195 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos predicha codificada por la ID. SEC. Nº: 31 (HuIFNtau3)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 32:

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 518 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: HuIFNtau3, madura sin secuencia líder

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..518

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 33:

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 172 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 34:

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos del fragmento 1-37 de la ID. SEC. Nº: 33

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Asp Leu Ser Gln Asn His Val Leu Val Gly Ser Gln Asn Leu Arg}

\sac{Leu Leu Gly Gln Mer Arg Arg Leu Ser Leu Arg Phe Cys Leu Gln Asp}

\sac{Arg Lys Asp Phe Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos del fragmento 34-64 de la ID. SEC. Nº: 33

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Asp Phe Ala Phe Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Gly Gln Leu Gln}

\sac{Glu Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln Gln Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos del fragmento 62-92 de la ID. SEC. Nº: 33

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln SEr Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp}

\sac{Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Arg Thr Gly Leu His Gln Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos del fragmento 90-122 de la ID. SEC. Nº: 33

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Gln Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Gln Val Thr Gly}

\sac{Glu Glu Asp Ser Ala Leu Gly Arg Thr Gly Pro Thr Leu Ala Met Lys}

\sac{Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos del fragmento 119-150 de la ID. SEC. Nº: 33

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Mer Lys Arg Tys Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys}

\sac{Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Gly Ile Val Arg Leu Glu Ile Met Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos del fragmento 139-172 de la ID. SEC. Nº: 33

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ala Trp Glu Ile Val ARG Leu Glu Ile Met Arg SEr Leu Ser Ser}

\sac{Ser Thr Ser Leu His Lys Arg Leu Arg Met Met Asp Gly Asp Leu Ser}

\sac{Ser Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos del fragmento 1-23 de la ID. SEC. Nº: 32

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr}

\sac{Gly Pro Gly Glu Ser Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia de aminoácidos del fragmento 1-23 de la ID. SEC. Nº: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr}

\sac{Gly Pro Gly Gly Ser Leu Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 519 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: secuencia codificadora de ADN derivado-genómico de HuIFNtau1, sin sec. líder

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..519

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 43:

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 172 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 44:

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: Bin 12, A40068, Nº Acc. gi 108955, TP-1 bovina (clon bTP509) (aa 1-37)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 45:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Tyr Leu Ser Glu Asp His Met Leu Gly Ala Arg Glu Asn Leu Arg}

\sac{Leu Leu Ala Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Pro Cys Leu Gln Asp}

\sac{Arg Lys Asp Phe Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: Bin 13, BovTPH1Bcds1, Nº Acc. gi 163767, TP-1 bovina (aa 1-37)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 46:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Tyr Leu Ser Glu His His Ile Leu Gly Pro Arg Gln Asn Leu Ser}

\sac{Leu Leu Ala Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Pro Cys Leu Gln Asp}

\sac{Arg Lys Asp Phe Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: Bin 14, BovTPH1Ccds1, Nº Acc. gi 163769, TP-1 bovina (aa 1-37)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 47:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Tyr Leu Ser Glu His His Met Leu Gly Ala Arg Gln Asn Leu Arg}

\sac{Leu Leu Ala Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Pro Cys Leu Gln Asp}

\sac{Arg Lys Asp Phe Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: Bin 15, A39505, TP-1 bovina (clon bTP4) (aa 1-37)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 48:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Tyr Leu Ser Glu Asn His Met Leu Gly Ala Arg Glu Asn Leu Arg}

\sac{Leu Leu Ala Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Pro Cys Leu Gln Asp}

\sac{Arg Lys Asp Phe Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: Bin 16, OATP1P5cds1, Nº Acc. gi 1412, TPp5 ovina (aa 1-37)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 49:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Tyr Leu Ser Gln Arg Leu Met Leu Asp Ala Lys Glu Asn Leu Lys}

\sac{Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp}

\sac{Arg Lys Asp Phe Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: Bin 17, OATP1P3cds1, Nº Acc. gi 1410, TPp3 ovina (aa 1-37)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 50:

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Tyr Leu Ser Gln Arg Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys}

\sac{Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp}

\sac{Arg Lys Asp Phe Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: Bin 18, SHP010TPcds1, Nº Acc. gi 165821, TP-1 ovina (aa 1-37)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 51:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Tyr Leu Ser Gln Arg Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys}

\sac{Leu Leu Glu Pro Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp}

\sac{Arg Lys Asp Phe Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: Bin 19, SHP02TPcds1, Nº Acc. gi 165823, TP-1 ovina (aa 1-37)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

ESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 52:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Tyr Leu Ser Gln Arg Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Arg}

\sac{Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp}

\sac{Arg Lys Asp Phe Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: Bin 21, GOTCTP1cds1, Nº Acc. gi 164117, IFN tau de Capra hircus (aa 1-37)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 53:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Tyr Leu Ser Arg Arg Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Arg}

\sac{Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Gln Gln Asp}

\sac{Arg Lys Asp Phe Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 498 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: híbrido huIFNtau/huIFNalfa (1-28/29-167)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..498

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 54:

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 166 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 55:

28

Claims (11)

1. Un polipéptido de fusión de interferón híbrido, formado por:

una primera secuencia de aminoácidos que se extiende desde el resto de aminoácido 1 hasta el resto de aminoácido 28 de un polipéptido de interferón tau maduro, y

una segunda secuencia de aminoácidos que se extiende desde el resto de aminoácido 29 al resto de aminoácido C-terminal de un polipéptido de interferón de tipo I no tau.

2. El polipéptido de fusión de interferón híbrido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido de interferón tau es un polipéptido de interferón de rumiante y el polipéptido de interferón de tipo I no tau es un polipéptido de interferón de tipo I no tau humano.

3. El polipéptido de fusión de interferón híbrido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido de interferón de tipo I no tau es interferón alfa o interferón beta.

4. Un ácido nucleico que incluye una secuencia de marco de lectura abierto (ORF) que codifica el polipéptido de fusión de interferón híbrido de la reivindicación 1.

5. Un vector de expresión que incluye

(a) el ácido nucleico de la reivindicación 4, y

(b) secuencias reguladoras eficaces para expresar la secuencia del ORF en una célula hospedadora.

6. Un procedimiento para producir de forma recombinante un polipéptido de fusión de interferón híbrido, que incluye introducir en una célula hospedadora adecuada, un vector de expresión recombinante que incluye el ácido nucleico de la reivindicación 4, donde el vector está diseñado para expresar la secuencia del ORF en las células hospedadoras, y cultivar las células hospedadoras en condiciones que dan lugar a la expresión de la secuencia del ORF.

7. Una composición farmacéutica para inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto, que comprende el polipéptido de fusión de interferón híbrido de la reivindicación 1 en una cantidad eficaz para inhibir el crecimiento de las células tumorales.

8. Una composición farmacéutica para inhibir la replicación vírica en células de un sujeto infectado por un virus, que comprende el polipéptido de fusión de interferón híbrido de la reivindicación 1 en una cantidad eficaz para inhibir la replicación vírica en las células.

9. Una composición farmacéutica para tratar una enfermedad autoinmune en un sujeto que necesita este tratamiento, que comprende

una cantidad eficaz del polipéptido de fusión de interferón híbrido de la reivindicación 1.

10. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 7-9 formulada para ser administrada mediante inyección intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, intralesional o subcutánea.

11. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 7-9 formulada para ser administrada mediante administración oral.