DE3686931T2 - Monoklonale antikoerper, die determinanten gram-negativer bakterien binden. - Google Patents

Monoklonale antikoerper, die determinanten gram-negativer bakterien binden.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein infektiöse Erkrankungen und im spezielleren die Vorbeugung, Diagnose und Behandlung von Infektionen, die durch gram-negative Bakterien verursacht werden.
  • Bakterielle Sepsis und damit in Zusammenhang stehender septischer Schock sind häufig tödliche Zustände, die durch Infektionen verursacht werden, die aus bestimmten Arten chirurgischer Eingriffe, Bauchtrauma und Immununterdrückung resultieren können, die mit Krebs, Transplantationstherapie oder anderen Krankheitszuständen in Verbindung stehen. Schätzungen zufolge werden in den Vereinigten Staaten alleine jährlich mehr als 700.000 Patienten von septischen Schock verursachenden bakteriellen Infektionen betroffen. Davon entwickeln 160.000 tatsächlich septischen Schock, der zu 50.000 Todesfällen jährlich führt.
  • Gram-negative bakterielle Infektionen sind in modernen Spitälern das schwerwiegendste Problem, was infektiöse Erkrankungen betrifft. Vor zwei Jahrzehnten war ein Großteil der in Krankenhäusern erworbenen Sepsisfälle den in höherem Maße akuten gram-positiven bakteriellen Pathogenen wie Staphylococcus und Streptococcus zuzuschreiben. Im Gegensatz dazu hat sich in letzter Zeit das Auftreten von Infektionen aufgrund gram-negativer Bakterien wie Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa verstärkt.
  • Auf gram-negative Bakterien gehen nun in den Vereinigten Staaten jährlich etwa 200.000 Fälle von im Krankenhaus erworbenen Infektionen zurück, wobei die Gesamtmortalitätsrate im Bereich von 20% bis 60% liegt. Die Mehrzahl dieser im Krankenhaus erworbenen Infektionen sind auf solche gram-negative Bazillen wie E. coli (das am häufigsten von Patienten mit gram-negativer Sepsis isolierte Pathogen) zurückzuführen, in der Häufigkeit gefolgt von Klebsiella pneumoniae und P.aeruginosa.
  • Gram-negative Sepsis ist ein Krankheitssyndrom, das aus der systemischen Invasion gram-negativer Stäbchen und darauffolgender Endotoxämie resultiert. Die Schwere der Erkrankung reicht von vorübergehendem, selbsteinschränkendem Bakteriämieschub bis zu plötzlich ausbrechender, lebensbedrohender Erkrankung, oft kompliziert durch Organversagen und Schock. Die Krankheit ist oft das Ergebnis einer Invasion von einer lokalen Infektionsstelle, oder kann aus einem Trauma, Wunden, Geschwüren oder Verstopfungen im Magendarmbereich resultieren. Zu den Symptomen gram-negativer Sepsis gehören Fieber, Schüttelfrost, Lungenversagen und septischer Schock (schwere Hypotonie).
  • Gram-negative Infektionen sind besonders häufig bei Patienten, die anti-Krebs-Chemotherapie und Immunsuppressivbehandlung erhalten. Infektionen bei solchen Wirten mit geschwächtem Immunsystem weisen üblicherweise Widerstandsfähigkeit gegen viele Antibiotika auf oder entwickeln während des langen Infektionsverlaufs Widerstandfähigkeit, was eine herkömmliche Behandlung schwierig macht. Der ständig zunehmende Einsatz zytotoxischer und immunsuppressiver Therapie und die natürliche Selektion gegen Arzneimittel widerstandsfähiger Bakterien durch den weitverbreiteten Einsatz von Antibiotika haben dazu beigetragen, daß gram-negative Bakterien sich zu Pathogenen mit großer klinischer Bedeutung entwickelt haben.
  • Glücklicherweise haben vor mehr als einem Jahrzehnt Forscher in den Vereinigten Staaten und Deutschland aufgezeigt, daß gram-negative Endotoxine vieler verschiedener Bakterien-Genera eine "gemeinsame Kernstruktur" aufweisen. Mit anderen Worten, während viele infektiöse gram-negative Organismen einzelne Kapsel- und Oberflächenpolysaccharide enthalten, gibt es eine Kern-Lipopolysaccharid(LPS)struktur, welche viele der gram-negativen Bakerien- Genera und ihre Endotoxine gemeinsam haben.
  • Diese Kernstruktur enthält als "Lipid A" bezeichnetes Material, von dem angenommen wird, daß es für alle biologischen Eigenschaften von "Endotoxin", einschließlich Pyrogenizität, Aktivierung des Komplement- und des Gerinnungssystems, Hypotonie und Tod bei Versuchstieren verantwortlich ist. Diese Kern- oder LPS-Struktur ist deshalb aus zumindest zwei Gründen von Bedeutung: wegen ihrer Verbindung mit Endotoxizität und ihrer Konservierung in gram-negativen Bakterien-Genera.
  • Da antibiotische Behandlung gegen gram-negative Sepsis, insbesondere die mit P. aeruginosa Bakterien-Infektion verbundene, weitgehend unter dem Optimum bleibt (Antibiotika sind nur bei der Behandlung der Bakterien, nicht aber bei der Verringerung der Wirkungen mikrobieller Endotoxine wirksam), hat sich die Aufmerksamkeit zunehmend auf immunologische Verfahren zur Vorbeugung und Eindämmung derartiger Infektionen gerichtet. Immuntherapie umfaßt die Verabreichung von Immunoglobulinen (Antikörper oder aktive Fragmente davon), um die native Abwehr des Wirtes gegen die toxischen Wirkungen der Bakterien zu verstärken, beispielsweise durch Verstärken der Opsonisierung und Phagozytose der infizierenden Bakterien-Zellen, oder durch Neutralisation der biologischen Wirkungen von LPS. Antikörper oder aktive Fragmente davon, die sich mit der Kernstruktur oder Lipid A, d. h. LPS, verbinden, könnten mit einer Anzahl gram-negativer Endotoxine breite Reaktionsfähigkeit aufweisen.
  • Gegen Epitope oder antigene Determinanten auf den O-spezifischen Nebenketten glatter gram-negativer Bakterien gerichtete Antikörper sind zum Einsatz in der Immuntherapie nur begrenzt geeignet. Der Grund dafür ist, daß sie nur gegen die Bakterienstämme wirksam sind, die komplementäre oder kreuz-reaktive antigene Determinanten aufweisen. Derartige stammspezifische Antikörper sind nur begrenzt nützlich. Während angenommen wird, daß das Kernoligosaccharid und Lipid A aller Stämme antigene Determinanten gemeinsam haben, waren die wenigen vorhergehenden Versuche, monoklonale Antikörper zu erzeugen und einzusetzen, die mit diesen Bereichen in Pseudomonas reaktiv sind, weitgehend erfolglos.
  • Immunoglobuline, welche die meisten klinisch bedeutenden gram-negativen Pathogene binden, sind für den Erfolg der Immuntherapie unabdingbar. P.aeruginosa-Organismen, die für 5% bis 15% der Blutkreislaufinfektionen verantwortlich sind, haben zumindest 16 verschiedene Serotypen (O-antigene Typen). Klebsiella-Organismen haben mehr als 80 Kapseltypen, und E.coli-Organismen, die weitaus häufiger sind, haben mehr als 130 Serotypen.
  • Bei Patienten mit Bakteriämie liegt oft keine bestätigte spezifische Diagnose vor, was den Typ der bakteriellen Infektion betrifft, bis bakteriologische Ergebnisse verfügbar sind, was mehrere Tage dauern kann. Mit der Therapie muß oft aufgrund empirischer Diagnose begonnen werden, um zu verhindern, daß der Zustand eines Patienten sich während der kritischen ersten 24 bis 48 Stunden der Erkrankung rasch verschlechtert.
  • Daher besteht seit langem die Notwendigkeit für die Herstellung monoklonaler Antikörper (MoAb) oder aktiver Fragmente davon, die mit einem Epitop oder antigenen Determinanten reaktiv sind, das/die in allen wichtigen pathogenen Stämmen gram-negativer Bakterien vorhanden ist, wodurch eine wirksame Diagnose, Prophylaxe, Eindämmung bakterieller Infektion und Neutralisation damit verbundener Endotoxämie ermöglicht wird, die auf gram-negative Bakterien-Genera zurückzuführen ist. Es wäre auch vorteilhaft, MoAbs verfügbar zu haben, die mit gram-positiven Bakterien kreuz-reaktiv sind, die bei der Diagnose, Behandlung und Vorbeugung von Bakterien-Infektionen im allgemeinen nützlich sind.
  • Bakteriellen Infektionen ist in der Wissenschafts- und Patentliteratur breiter Raum eingeräumt worden. Vieles davon richtete sich auf Sepsis aufgrund gram-negativen Bakterien-Endotoxins. Es folgt eine Liste relevanter Artikel und veröffentlichter Anmeldungen mit jeweils einer kurzen Beschreibung:
  • Die EP 0 101 039 A2, veröffentlicht am 22. Februar 1984, offenbart einen monoklonalen Antikörper für Pseudomonas aeruginosa und Verfahren für seinen Einsatz bei Diagnose und Therapie;
  • WO 84/04458, veröffentlicht am 22 November 1984, offenbart mit Endotoxinkern reaktive MoAbs;
  • WO 85/01659, veröffentlicht am 25. April 1985, offenbart MoAbs gegen Endotoxin gram-negativer Bakterien;
  • die EP 0 163 493, veröffentlicht am 12 April, 1985, offenbart humane MoAbs gegen gram-negative Bakterien und spezifisch für serotypische Determinanten von Lipopolysaccharid, nützlich zur Behandlung oder Vorbeugung von P. aeruginosa Infektion;
  • Feingold et al., Arch.Int.Med. (1965) 116: 326-28 beschreiben den Einsatz polyklonaler Antiseren, die von menschlichen Patienten abgeleitet wurden, die sich von gram-negativer Infektion erholen, um gram-negative Sepsis bei einem menschlichen Patienten wirksam zu behandeln;
  • Abe et al., Jpn.J.Exp.Med. (1975) 45: 355-59 beschreiben den Einsatz polyklonaler Antiseren, die als Reaktion auf Immunisierung von Mäusen mit P.aeruginosa Endotoxin erzeugt wurden;
  • Apicella et al., Infect.Immun. (1981) 34: 751-56 berichten die Analyse von Lipopolysaccharid von Neisseria gonorrhoeae und N. meningitidis unter Einsatz monoklonaler Antikörper;
  • Zeigler et al., N.Eng.J.Med. (1982) 307: 1225-30 berichten über die Ergebnisse eines Doppelblindversuchs, worin gram-negativ bakteriämische menschliche Patienten mit durch Impfen gesunder Spender mit durch Wärme abgetötetem E.coli J5 Mutant erzeugtem humanem Antiserum behandelt wurden;
  • Hancock et al., Infect.Immun. (1982) 37: 166-71 beschreiben MoAbs, die für Pseudomonas aeruginosa Außenmembranantigene spezifisch sind;
  • Hiernaux et al., Eur.J.Immunology (1982) 12: 797-803 beschreiben MoAbs, die für E.coli 0113 Lipopolysaccharid (LPS) spezifisch sind;
  • Machie et al., J.Immunol. (1982) 129: 829-32, beschreiben MoAbs, die gram-negative Bakterien verschiedener Genera binden;
  • Young et al., Clin.Res. (1982) 30: 522A, beschreiben MoAbs, die unter Einsatz von S.minnesota RS-95 LPS als das Immunogen erzeugt wurden;
  • Pollack et al., J.Clin.Invest. (1983) 72: 1874-81 berichten über das verstärkte Überleben von P.aeruginosa Septikämie in Verbindung mit hohen Gehalten an zirkulierendem Antikörper für E.coli Endotoxinkern;
  • Sawada et al., J.Infect.Dis. (1984) 150: 570-76 berichten über den Schutz bei Mäusen gegen Infektion mit P.aeruginosa durch passiven Transfer von MoAbs zu Lipopolysacchariden und Außenmembranproteinen;
  • Drei relevante Abhandlungen waren in Abstracts of the 24th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (1984) 106 enthalten: Black und Cannon "Monoclonal antibody to common pathogenic neisseria antigen (H8Ag) protects against meningococcemia (ME) in mice"; Williams et al., "Panreactive monoclonal antibody (MCA) To Porin Protein F of Pseudomonas aeruginosa (PA): Passive immunotherapy in mice"; und Kim et al., "Studies of the protective mechanism of monoclonal antibodies against E.coli";
  • Mutharia et al., Infect.Immun. (Sept.1984) 45: 631-36 beschreiben MoAbs, die mit gram-negativen Bakterien verschiedener Genera kreuz-reaktiv sind, von denen angenommen wird, daß sie Lipid A binden und die mit gram-positiven Bakterien nicht reaktiv sind;
  • Nelles und Niswander, Infect. Immun. (Dez. 1984) 46: 677-81 beschreiben zwei monoklonale Maus-Antikörper, die mit Lipopolysaccharid reaktiv sind, abgeleitet vom J5-Mutant von E.coli 0111:B4, das das Lipopolysaccharid von gram-negativen Bakterien sowohl des glatten als auch des rauhen Phänotyps bindet;
  • Young et al., Clin.Res. (1984) 32:518A beschreiben einen MoAb, der gegen den "Kern" von Glykolipid enterobakteriellen Endotoxins gerichtet ist;
  • Young L.S., Clin.Res. (1984) berichtet die funktionelle Wirkung von MoAbs gegen Lipopolysaccharidantigene gram-negativer Bacillen;
  • Young L.S., Principles and Practice of Infectious Disease (1985) John Wiley and Sons, N.Y., NY, S. 452-75 gibt einen Überblick über gram-negative Sepsis;
  • Sadoff et al., Antibiot.Chemother. (1985) 36: 134-46, beschreiben die Eigenschaften monoklonaler Maus-Antikörper, die gegen P.aeruginosa Lipopolysaccharide gerichtet sind;
  • Teng et al., Proc.Nat.Acad.Sci.USA (März 1985) 82: 1790-94, berichten über den Schutz von Mäusen gegen gram-negative Bakteriämie und Endotoxämie mit humanen monoklonalen IgM-Antikörpern. Die MoAbs zeigten keinen wesentlichen Schutz gegen gram-positive Bakterien-Infektion;
  • Gigliotti und Shenep, J.Infect.Dis. (Juni 1985) 151: 1005-11 beschreiben MoAbs, die LPS von E.coli rauhem Mutanten J5 binden, aber keine intakten glatten Stämme von E.coli 0111:B4 oder K1:07 binden;
  • Peters et al., Infect. Immun. (Nov. 1985) 50: 459-66, beschreiben MoAbs gegen enterobaktierell gemeinsames Antigen und E.coli Lipopolysaccharidaußenkern und zeigen einen gemeinsamen antigenen Determinanten, von dem angenommen wird, daß er zumindest teilweise 4-verbundenes α-N-Acetylglukosamin ist;
  • Dunn et al., Surgery (August 1985) 98: 283-90, berichten über die Produktion eines stammspezifisch bindenden MoAbs unter Einsatz von E.coli glattem Stamm 0111: B4 als das Immunogen und die Produktion eines mit gram-negativen Bakterien kreuzreaktiven MoAbs unter Einsatz von E.coli rauhem Mutant J5 als das Immunogen. Diese MoAbs waren mit gram-positiven Bakterien nicht reaktiv;
  • Dunn et al., Arch.Surg. (Jan 1986) 121: 58-62 berichten über die Immuntherapie gram-negativer Sepsis unter Einsatz eines einzelnen monoklonalen IgG-Mäuseantikörpers, wobei die Reaktionsfähigkeit mit einer Vielzahl gram-negativer Organismen, die Förderung der Phagozytose und die Schaffung von Schutz während experimenteller gram-negativer Sepsis gezeigt wurde. Der MoAb zeigte ebenfalls keine Reaktivität mit getesteten gram-positiven Bakterien;
  • Miner et al., Infect Immune. (April 1986) 52: 56-62, beschreiben die Eigenschaften von Maus-MoAbs gegen E.coli J5.
  • Die vorliegende Erfindung schafft neue Hybridoma-Zell-Linien, die monoklonale Antikörper (MoAbs) erzeugen, die Epitope binden, die auf Lipopolysaccharid festgestellt wurden, das am häufigsten mit dem Endotoxinkern gram-negativer Bakterien in Verbindung stand.
  • Ein besonders bevorzugter monoklonaler Antikörper ist der von Hybridoma-Zell-Linie XMMEN-OE5 mit der ATCC-Eingangsnummer HB 9081 erhaltene.
  • Einen Aspekt der Erfindung bildet der Einsatz eines gram-negativen bakteriellen Endotoxinkern-spezifischen monoklonalen Antikörpers oder eines aktiven Fragments davon bei der Erzeugung eines Medikaments zur therapeutischen Behandlung eines zu Behandelnden mit gram-negativer bakterieller Infektion, oder bei der Erzeugung eines Medikaments zur prophylaktischen Behandlung eines zu Behandelnden, bei dem die Gefahr einer gram-negativen Bakterien-Infektion besteht, worin der genannte Antikörper vom IgM-Isotyp ist und der monoklonale Antikörper von Hybridoma-Zell-Linie XMMEN-OE5 (ATCC HB 9081) oder das gram-negative bakterielle Endotoxinkernepitop bindende Äquivalent davon ist.
  • Allgemeiner schafft die Erfindung die obigen monoklonalen Antikörper und aktiven Fragmente davon zum pharmazeutischen Einsatz.
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • An der vorliegenden Erfindung sind bestimmte Hybridzellen und deren funktionale Äquivalente beteiligt, die fähig sind, monoklonale Antikörper (MoAbs) zu erzeugen, die ein oder mehrere Epitope binden, die auf Lipopolysaccharid (LPS) vorhanden sind, das im allgemeinen mit gram-negativen Bakterien assoziiert ist. Des weiteren schafft die Erfindung Verfahren zum Einsatz derartiger Verbindungen bei der Behandlung und Vorbeugung von Bakterien-Infektionen.
  • Hybridoma-Bildung und die Erzeugung monoklonalen Antikörpers kann mit vielen verschiedenen Techniken bewirkt werden, die nach dem Stand der Technik wohlbekannt sind. Im wesentlichen umfaßt das Verfahren zuerst das Erhalten von Immunzellen, wie derjenigen von der Milz eines Säugetiers, die zuvor entweder in vivo oder in vitro mit einem Antigen stimuliert worden sind. Diese Zellen werden dann mit Zellen wie Myelomazellen oder transformierten Zellen verschmolzen, die fähig sind, in Zellkultur unbegrenzt zu replizieren, wodurch eine unsterbliche, Immunoglobulin ausscheidende Zellinie erzeugt wird. Die resultierenden verschmolzenen Zellen oder Hybridomas werden kultiviert und die resultierenden Kolonien auf die Produktion der gewünschten monoklonalen Antikörper gescreent. Derartige Antikörper produzierende Kolonien werden geklont und entweder in vivo oder in vitro gezogen, um große Mengen an Antikörper zu erzeugen (Beschreibung der theoretischen Basis und praktischen Methodik zum Verschmelzen derartiger Zellen siehe Köhler und Milstein, Nature (1975) 256: 495, dessen Offenbarungen durch Verweis hierin eingeschlossen sind). Obwohl derartige Verfahren in der Folge detaillierter beschrieben werden, werden Fachleute verstehen, daß die Techniken verändert und ergänzt werden können, ohne daß vom Schutzumfang der vorliegenden Erfindung abgegangen wird.
  • Säugetierlymphozyten werden durch in vivo Immunisierung des Tiers oder in vitro Kontakt mit ganzen Zellen oder Zellextrakten gram-negativer Bakterien oder freiem Lipopolysaccharid immunisiert. Derartige Immunisierungen werden wie erforderlich in Intervallen von bis zu einigen Wochen wiederholt, um einen ausreichenden Antikörpertiter zu erhalten. Die Zellen oder Zellextrakte werden in geeignete Lösungen oder Hilfsmittel gebracht. Nach der letzten Antigen-Boosterinjektion werden die Tiere getötet und Milzzellen entfernt.
  • Die Verschmelzung mit Säugetier-Myelomazellen oder anderen Verschmelzungspartnern, die fähig sind, in Zellkultur unbegrenzt zu replizieren, wird nach Standard- und wohlbekannten Techniken durchgeführt (z. B. Milstein und Köhler, Eur.J.Immunol. (1976) 6.511, dessen Offenbarungen hierin durch Verweis eingeschlossen sind) beispielsweise durch den Einsatz von Polyäthylenglykol (PEG) oder einem anderen Verschmelzungsmittel. Diese unsterbliche Zellinie, die vorzugsweise ein Maus-Zellinie ist, aber auch von Zellen anderer Säugetierspezies einschließlich, aber nicht begrenzt auf Ratten und Menschen abgeleitet sein kann, wird so ausgewählt, daß ihr die Enzyme fehlen, die für die Nutzung bestimmter Nährstoffe erforderlich sind, daß sie zu raschem Wachstum fähig ist und gute Verschmelzungsfähigkeit aufweist. Fachleuten sind viele derartige Zellinien bekannt, und andere werden immer wieder beschrieben. Enzymmangel kann beispielsweise Thymidinkinase (TK) oder Hypoxanthin-Guaninphosphoribosyltransferase (HGPRT) umfassen. Diese Mängel ermöglichen die Selektion verschmolzener Zellen nach ihrer Fähigkeit auf beispielsweise Hypoxanthin-Aminopterinthymidinmedium (HAT) zu wachsen. Vorzugsweise sind die eingesetzten unsterblichen Verschmelzungspartner von einer Linie abgeleitet, die kein Immunoglobulin ausscheidet.
  • Einzelne verschmolzene Zellen werden in einzelnen Gewebskulturnäpfchen gezogen. Feederzellen wie bestrahlte Thymozyten oder andere Zellen können eingesetzt werden, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhöhen. Hybridoma-Kulturüberstände von den einzelnen Näpfchen werden mittels Assay auf Antikörperbindung an gereinigtes Lipopolysaccharid oder ganze gram-negative Bakterien untersucht, oder durch andere geeignete, nach dem Stand der Technik bekannte Nachweisverfahren, wie enzym-verbundenes Immunoassay (EIA) oder Immunodotassay. Für ersteres werden Kulturüberstände in Reaktionsnäpfchen gegeben, die mit Lipopolysaccharid beschichtet worden waren. Nach dem Inkubieren werden die Reaktionsnäpfchen gewaschen, und verbleibender Antikörper, der an das Antigen gebunden ist, wird durch einen markierten Antikörper nachgewiesen, der mit dem anti-LPS-Antikörper reaktiv ist. Geeignete Markierungen umfassen Radioisotope, lumineszierende Substrate wie fluoreszierende Mittel und Bestandteile enzymatischer Markierungen.
  • Das Immunodotverfahren wird ebenfalls eingesetzt, um auf Klone zu screenen, die anti-LPS-Antikörper exprimieren (Towbin et al., Immunol.Method (1984) 72: 313, deren Offenbarungen hierin durch Verweis eingeschlossen sind). Gereinigtes LPS wird als "Dots" auf Zellulosenitratmembran aufgebracht und trocknen gelassen. Nach dem Blockieren in einer Gelatinelösung werden die Membranen sequentiell in Kulturüberstand getaucht, eine anti-Maus-Ig-peroxidasekonjugatlösung und eine 4-Chlor-1-naphthollösung, mit Wäschen in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) dazwischen. Reaktives Immunoglobulin exprimierende Klone erscheinen als färbige Punkte. Es können auch andere dem Fachmann bekannte Screeningsysteme eingesetzt werden.
  • Große Mengen an monoklonalen Antikörpern von ausscheidenden Hybridomas werden durch Injizieren der Klone in die Peritonealhöhle von Mäusen und Ernten des Aszitesfluid davon erzeugt. Die Mäuse, vorzugsweise mit Pristan oder anderem Tumorpromoter geprimed und chemisch oder durch Bestrahlung immunsupprimiert, können zu verschiedenen Stämmen wie New Zealand Black- oder Balb/c-Stämmen gehören. Das Ascitesfluid wird von den Mäusen geerntet und der monoklonale Antikörper davon gereinigt, beispielsweise durch CM-Sepharosesäule oder andere Chromatographieeinrichtungen. Hohe Antikörper-Titer können so gewonnen werden. Alternativ dazu können die Hybridomas in vitro auf verschiedene Arten kultiviert werden, wobei entweder Perfusionskulturen oder Suspensionskulturen, sowohl in Charge- als auch kontinuierlichen Kulturverfahren eingesetzt werden, und monoklonale Antikörper, die vom Kulturmedium oder Überstand gewonnen werden.
  • Die so erzeugten monoklonalen Antikörper haben eine Anzahl diagnostischer und therapeutischer Anwendungen. Sie werden als in vitro Diagnosemittel eingesetzt, um die Gegenwart gram-negativer Baktieren oder Bakterien allgemein in Säugetieren zu testen, indem Körperflüssigkeiten von Geweben oder anderen vom Menschen abgeleiteten Substanzen oder Fluiden Standard-Immmunoassayprotokollen unterworfen werden. Außerdem können auch Extrakte unbelebter Objekte, deren Verseuchung durch Bakterien schädlich wäre, wie medizinische Vorrichtungen, Nahrungsmittel oder Wasser, getestet werden. Derartige Assays können Radioimmunoassay-, EIA- oder Chemilumineszenzformat haben. Bei einem derartigen Assay wird Körperflüssigkeit mit Antikörpern gemäß vorliegender Erfindung in Kontakt gebracht und ein markierter zweiter Antikörper eingesetzt, um die Gegenwart von Bakterien nachzuweisen, an welche die Antikörper gebunden sind. Alternativ dazu kann ein kompetitives Immunoassay wie ein Assay vom "Sandwichtyp" eingesetzt werden. Derartige histochemische Verfahren sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt; Vorschriften findet man beispielsweise in Methods in Immunodiagnosis, 2. Auflage, Rose und Bigazzi, Hrsg. John Wiley and Sons, 1980, das durch Verweis eingeschlossen ist, und in Campbell et al., Methods of Immunology, W.A. Benjamin, Inc. 1964.
  • Des weiteren können monoklonale Antikörper gemäß vorliegender Erfindung zum in vivo Nachweis lokalisierter Bereiche bakterieller Infektion eingesetzt werden, beispielsweise Abszesse oder Zysten im weichen Gewebe und Osteomyelitis im Knochen. Beispielsweise wird markierter Antikörper einem Säugetier verabreicht, bei dem eine Bakterien-Infektion vermutet wird. Der Antikörper bindet sich selektiv an die im Säugetier vorhandenen Bakterien, wodurch die Markierung im Infektionsbereich konzentriert wird. Für derartige Verwendung geeignete Markierungen umfassen Radioisotope, wie ¹²&sup5;Iod, ¹³¹Iod,&sup9;&sup9;Technetium und ¹¹¹Indium, die unter Einsatz von Standard-Radiographietechniken bestimmt werden können. Alternativ dazu können die monoklonalen Antikörper mit paramagnetischen Kontrastmitteln markiert werden und mit Kernresonanz-Techniken nachgewiesen werden. Die markierten Antikörper erzeugen so ein nachweisbares Bild des bakteriellen Abszesses. Auf ähnliche Weise können diese monoklonalen Antikörper in einem Verfahren zum Nachweisen und Quantifizieren mikrobieller Endotoxine in Körperflüssigkeiten, Sekreten und Extrakten sowie in Arzneimitteln, Diagnosemitteln oder flüssigen Zwischenstoffen eingesetzt werden, die bei der Herstellung von Diagnose- und Therapiemitteln erzeugt werden.
  • Im spezielleren jedoch können die monoklonalen anti-LPS-Antikörper gemäß vorliegender Erfindung prophylaktisch bei Patienten eingesetzt werden, bei denen die Gefahr einer gram-negativen bakteriellen Infektion besteht. Die Verabreichung wirksamer Mengen dieser monoklonalen Antikörper dient dazu, die potentielle Fähigkeit des Körpers zu erhöhen, sich gegen den speziellen Organismus zu verteidigen, wodurch das Risiko darauffolgender Infektion verringert wird.
  • Die monoklonalen Antikörper gemäß vorliegender Erfindung können auch therapeutisch eingesetzt werden, um potentiell tödliche bakterielle Infektionen und septischen Schock zu behandeln. Die Antikörper werden entweder intravenös oder intramuskulär in einer physiologisch verträglichen Lösung verabreicht, entweder allein oder in Kombination mit Antibiotika. Obwohl dadurch die Bindungseigenschaften der vorliegenden monoklonalen Antikörper beeinflußt werden können, können sie zwecks Lagerung und Transport lyophilisiert und vor der Verabreichung rekonstituiert werden.
  • Die monoklonalen Antikörper haben spezielle Affinität zu Lipopolysaccharid und sie bieten selektive Behandlung für lebensbedrohende Symptome von Endotoxämie, wie septischer Schock in Verbindung mit gram-negativen Infektionen, die ansonsten häufig nicht auf antibiotische Behandlung ansprechen. Zu den Wirkungen der Behandlung mit diesen monoklonalen Antikörpern gehört die Erleichterung der Opsonisierung und Phagozytose einiger Bakterien, vermutlich durch Bindung an die Bakterien-Zellwand. Die monoklonalen Antikörper tragen so zum Bekämpfen der toxischen Wirkungen der bakteriellen Infektionen bei.
  • Während die bisherigen Ausführungen sich vornehmlich mit den Anwendungen der vorliegenden Erfindung auf den Menschen beschäftigt haben, wird die der Erfindung eigene Einsatzmöglichkeit in veterinären Anwendungen dem Fachmann klar sein.
  • Für alle derartigen diagnostischen, prophylaktischen und therapeutischen Einsätze können die monoklonalen Antikörper und andere notwendige Reaktionsmittel und geeignete Vorrichtungen und Zubehörteile als Set vorliegen, damit sie leicht verfügbar und einfach einzusetzen sind.
  • Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und sind nicht einschränkend.
    • VERSUCHE BEISPIEL I HYBRIDOMAS XMMEN-OE5, XMMEN-LY1, UND XMMEN-LY2 A. Herstellung der Hybridomas
  • Balb/c-Mäuse (Charles Rivers, Wilmington, MA) wurden mit 1·10&sup8; gekochten Zellen von entweder E.coli J5 oder Salmonella minnesota R595 immunisiert. Dem LPS von J5, ein Mutant von Stamm E.coli 0111, und dem LPS von R595, ein Re-Mutant von S.Minnesota, fehlt beiden die äußeren O-spezifischen Seitenketten und bestehen nur aus dem Kern-LPS (Lipid A und Kernoligosaccharid). Nach primärer Immunisierung wurde den Mäusen in einmonatigen Intervallen eine intraperitoneale Boosterinjektion mit 1·10&sup8; gekochten Zellen verabreicht, denen die O-spezifischen Seitenketten fehlten. (Das vorliegende Beispiel richtet sich auf aus E.coli Immunogen erzeugte XMMEN-OE5 und nicht auf XMMEN-LY1 und XMMEN-LY2, die beide aus R 595 Immunogen erzeugt sind. Es werden jedoch Daten über die Prophylaxe gegen Bakterien-Exposition in von allen drei erzeugten MoAbs angegeben).
  • Vier Tage nach der letzten Antigen-Boosterreaktion wurden Milzzellen von einer immunisierten Maus aseptisch entfernt. Nach an anderer Stelle dargelegten Verfahren (St. Groth J.Immuno.Meth. (1980) 35:1, das durch Verweis eingeschlossen ist) wurden 5·10&sup7; Milzzellen mit einer gleichen Anzahl an P63Ag8.653, einer nicht sekretierenden Mausmyelomazellinie mit Balb/c-Ursprung (American Type Culture Collection, Rockville, MD) verschmolzen, wobei Polyäthylenglykol 4000 (Merck and Co., Inc. Rahway, NJ) eingesetzt wurde. Hybridzellen wurden in 96-Näpfchen-Kulturplatten (Costar, Cambridge, MA#3596) auf Medium gegeben, das mit einer Feederschicht aus normalen Balb/c-Thymocyten (1·10&sup5; Zellen pro Näpfchen, ein Tag vor der Verschmelzung) vorinkubiert worden war. Zellen wurden für die ersten beiden Wochen in folgendem Medium bei 37ºC in 10%iger CO&sub2;-Atmosphäre kultiviert. Dulbecco's Modified Eagle's Medium, mit Glutamin und Glukose bei 4,5 g/l (Gibco, Santa Clara, CA, #320-1965), Fötales Rinderserum (10%) (Microbiological Associates, Walkerville, MD), Natriumpyruvat (1 mM) (Gibco, Santa Clara, CA #320-1360), Penicillin (50 u/ml) - Streptomycin (50 u/ml) (Gibco, Santa Clara, CA, #600-5070) und Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin (HAT), das unter Einsatz von Hypoxanthin (10 mM) Thymidin (1,6 mM) kombiniert mit 0,04 mM Aminopterin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) hergestellt wurde. Medium für die geregelte Aufrechterhaltung (zwei Wochen nach Verschmelzungsdatum) war mit dem obigen ident, mit der Ausnahme, daß im Medium kein Aminopterin enthalten war (HT-Medium).
  • Zwischen zwei und vier Wochen nach der Verschmelzung wurden Kulturen von Hybridzellen mit EIA und Immunodotassay auf Antikörperbindung an gereinigtes LPS getestet. Kulturen, die bei wiederholtem Testen positiv waren, wurden dann durch einschränkende Verdünnungstechniken geklont. Kurz gesagt wurden die Zellen bei unterschiedlichen Verdünnungen zwischen 10-1 Zellen pro Näpfchen in 96-Näpfchengewebekulturplatten (Costar, Cambridge, MA, #3596) kultiviert. Näpfchen, die nur eine Kolonie enthielten, wurden durch mikroskopische Untersuchung identifiziert, dann durch EIA auf anti-J5- oder anti-R595-Wirkung hin getestet. Positive Klone wurden auf 24-Näpfchen Gewebskulturplatten (Costar, Cambridge, MA #3524) ausgebreitet, erneut geklont und nach den gleichen Verfahren erneut getestet. Bei drei Klonen, als XMMEN-OE5, XMMEN-LY1 und XMMEN-LY2 bezeichnet, wurde festgestellt, daß sie stabil monoklonalen Antikörper ausscheiden; durch Radialimmunodiffusion und EIA wurde unter Einsatz von Standardverfahren festgestellt, daß der monoklonale Antikörper der Immunoglobulinklasse IgM angehörte. Die Hybridomas XMMEN-OE5 und XMMEN-LY1 sind zur Zeit bei der American Type Culture Collection (A.T.C.C.), 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, USA hinterlegt. Die Hinterlegung wurde am 24. April 1986 vorgenommen und erhielt die A.T.C.C. -Eingangsnummern HB 9081 bzw. HB 9082.
  • Balb/c-Mäuse (Charles River) wurden eingesetzt, um die Hybridomas intraperitoneal zu kultivieren. Etwa 3·10&sup6; Hybridomazellen wurden intraperitoneal (i.p.) in Mäuse injiziert, die folgendermaßen vorbehandelt worden waren: injiziert i.p. eine Woche zuvor mit 0,5 ml Pristan (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI). Das resultierende Aszitesfluid, 11-15 Tage nach der Injektion der Hybridomas gesammelt, enthielt durchschnittlich 2 mg/ml des Antikörpers, wie durch Radialimmundiffusion bestimmt (Meloy, Radial Immunodiffusion, Springfield, VA, Plattennr. #J-304)
  • Der Antikörper in Aszitesfluid wurde durch Schnellflußionenaustauschchromatographie unter Verwendung einer CM-Sepharosesäule (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) nach dem Fachmann wohlbekannten Verfahren gereinigt.
  • Unter Einsatz von Kulturmedium mit hohem Glucosegehalt (DMEM, 0,45% Glukose, 2 mM Glutamin, 2 mM Pyruvat) wurde die Zellinie in vitro in einem 1,5 l herkömmlichen Chemostat gezogen. Bei einer Verdünnungsrate von 0,02 l/h wurden stabile Bedingungen aufrechterhalten, wobei die Zellkonzentrationen 5 bis 6·10&sup5;/ml mit 84%iger Lebensfähigkeit betrug, die MoAb-Konzentration 25 ug/ml, die volumetrische Produktivität 0,63 ug MoAb pro Stunde und die spezifische Produktivität 30 ug MoAb/10&sup6; Zellen/Tag betrug.
    • B. XMMEN-OE5-MoAb-Enzymimmunoassay (EIA)-Inhibition 1. Herstellung von antigenbeschichteten EIA-Platten: E.coli J5
  • Lipopolysaccharid (List Biologicals, Campbell, CA) wurde in 0,01 PBS (pH 7,4) auf 20 ug/ml verdünnt. 100 ul dieser Lösung wurden jedem Näpfchen der EIA-Reaktionsplatten (Gilford Diagnostics, Oberlin, OH) hinzugefügt, und über Nacht bei Raumtemperatur (RT) inkubieren gelassen. Am darauffolgenden Tag wurden die Platten zweimal mit PBS gewaschen, dann durch Hinzufügen von 150 ul/Näpfchen 2%iger Rinderserumalbumin (Sigma Chemical Col., St.Louis,MO) blockiert, und über Nacht bei RT inkubieren gelassen. Am nächsten Tag wurden die Platten zweimal mit PBS gewaschen und entweder sofort verwendet oder bei 4ºC gelagert.
    • 2. Inhibitionsassay
  • Gereinigter XMMEN-OE5 monoklonaler Antikörper wurde in 0,01 M PBS auf 2 ug/ml verdünnt und mit abgestuften Mengen an gereinigten Antigenen (E.coli J5 Lipopolysaccharid (LPS), Salmonella minnesota R 595 LPS, Salmonella minnesota R 595 Lipid A und Pseudomonas aeruginosa Fisher Type 1 LPS, alle von List Biologicals, Campbell, CA) gemischt. Diese Antikörper-Antigen-Mischungen wurden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Am darauffolgenden Tag wurden 100 ul der verschiedenen Antikörper-Antigen-Mischungen zu mit E.coli J5 LPS beschichteten EIA-Näpfchen hinzugefügt und man ließ sie eine Stunde lang bei RT reagieren, dann wurden sie zweimal mit PBS gewaschen. Der nächste Schritt war das Hinzufügen von 100 ul/Näpfchen Ziegen-anti-Maus-IgM-Peroxidasekonjugat (Cappel, Malvern, PA), das man ebenfalls eine Stunde bei RT reagieren ließ. Nach abschließendem dreimaligem Waschen mit PBS wurde Enzymsubstrat (ABTS, von Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) 100 ul/Näpfchen hinzugefügt und bei RT 45 Minuten lang reagieren gelassen. Die Enzymreaktion wurde durch das Hinzufügen von 100 ul/Näpfchen an 10 mM Natriumazid abgebrochen. Die dekadische Extinktion wurde bei 405 nm unter Einsatz eines Gilford Manual EIA-Lesegerätes aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.
    • Tabelle 1:
  • Hemmung von XMMEN-OE5 Monoklonalem Antikörper, der sich an Festphasen-J5-LPS bindet, wie durch Enzymimmunoassay (EIA) bestimmt Prozent Hemmung Inhibitor
    • C. XMMEN-OE5-MoAb-Immunodotserologie
  • Antigene wurden auf 0,20 um Zellulosenitratmembran (Sartorius) als 1 ul "Dots" aufgebracht und 5 Minuten lang lufttrocknen gelassen. (Eingesetzte Konzentrationen waren: für gereinigtes LPS 100 ug/ml in PBS, für gekochte Zellpräparate etwa 1·10&sup8; Zellen/ml). Die mit Antigentupfen versehenen Membranen wurden dann mit einer 1%igen Lösung (Gew./Vol PBS) Gelatine (Difco, Detroit, MI) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) blockiert. Nach einer raschen Wäsche (2x je 1 min) wurde XMMEN-OE5- Antikörper (2-5 ug/ml in PBS) mit der Membran 30 min lang bei RT inkubiert. Die Membranen wurden rasch 3x mit PBS gewaschen, dann mit Ziegen-anti-Maus-IgM-Peroxidasekonjugat (Cappel, Malvern, PA) 30 min lang bei RT inkubiert. Nach dem 3-4maligen Waschen der Membranen mit PBS wurde Substrat (4 Chlor-1-naphthol, Sigma Chemcial Co., St. Louis, MO) mit den Membranen bei RT inkubiert. Positive Reaktionen erschienen üblicherweise innerhalb von 2-5 Minuten als Purpurdots und wurden visuell als 4+ (sehr stark) bis 1+ (schwach) bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Tabelle 2
    • XMMEN-OE5 Monoklonale Antikörper-Immunodotserologie
  • Antigen Reaktion
  • Salmonella minnesota R60 (Ra) LPS -
  • Salmonella minnesota R345 (Rb) LPS -
  • Escherichia coli JS (Rc) LPS 2+
  • Salmonella minnesota RT (Rd) LPS 1+
  • Salmonella minnesota R595 (Re) LPS 1+
  • Pseudomonas aeruginosa PAC 605 LPS 2+
  • Pseudomonas aervginosa Fisher Typen 1-7
  • (alle Typen)
  • Escherichia coli J5 gekochte Zellen 3+
  • Escherichia coli 014:K7 gekochte Zellen 1+
  • Pseudomonas aeruginosa PAC 605 gekochte Zellen 3+
  • Pseudomonas Aeruginosa Fisher 2 gekochte Zellen -
  • Acinetobacter calcoaceticus gekochte Zellen -
    • D. XMMEN-OE5-MoAb-Plättchenagglutination
  • 100 ul XMMEN-OE5 monoklonaler Antikörper (0,5 mg/ml in PBS) wurden mit einem gleichen Volumen an lebenden Bakterienzellen (etwa 1·10&sup9;/ml) auf einem Glasplättchen gemischt. Positive Agglutination wurde innerhalb von 15 Minuten als stark (4+) bis schwach (1+) bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Tabelle 3
    • XMMEN-OE5-Monoklonale Antikörper-Plättchenagglutination
  • Antigen Reaktion
  • Escherichia coli J5 3+
  • Escherichia coli 014:K7 2+
  • Escherichia coli 085:E9 1+
  • Pseudomonas aeruginosa AAC 557 1+
  • Pseudomonas aeruginosa Fisher Type 2 1+
  • Klebsiella caroli -
  • Staphylococcus aureus -
    • E. In Vivo-Wirksamkeit von XMMEN-OE5 MoAbs 1. Beschreibung des in vivo-Modells:
  • Für alle in vivo Wirksamkeitsstudien wurden weibliche CD-1 Mäuse mit einem Durchschnittsgewicht von 20 g im Alter von 4-6 Wochen von Charles River Breeding Laboratories erhalten. XMMEN-OE5 Antikörper wurde in verschiedenen Dosen in verschiedenen Zeitabständen i.p. injiziert. Der Expositionsorganismus bestand aus einem der folgenden:
  • - Pseudomonas aeruginosa Stamm 3632, der ein Fisher Serotyp 2 serumresistenter Organismus ist, der von einem Patienten am UCLA Medical Center isoliert wurde.
  • - Escherichia coli Serogruppe 014K7, der ein gut charakterisierter serumempfindlicher Stamm ist, der von Dr. Erwin Neter am Buffalo Kinderkrankenhaus erhalten wurde. Dieser Stamm ist der häufigste enterische Organismus, der aus gram-negativen Infektionen beim Menschen isoliert wird.
  • - Escherichia coli 04K12, der ein serumresistenter, eingekapselter Organismus ist, der von einem Patienten am UCLA Medical Center isoliert wurde.
  • - Escherichia coli 085H9, der ein serumresistenter Organismus ist, der von den Centers for Disease Control in Atlanta, Georgia erhalten wurde.
  • Für diese Untersuchungen wurden die Bakterien weder modifiziert noch in eine Muzinexposition aufgenommen. Um das bakterielle Impfmaterial herzustellen, wurden Organismen 16-18 Stunden in Trypticase-Soja-Agarplatten gezogen. Bakterienkolonien wurden dann durch vorsichtiges Waschen unter Einsatz einer Watteappliziereinrichtung geerntet, zentrifugiert, erneut suspendiert und schließlich noch dreimal gewaschen. Eine Stammlösung aus Bakterien wurde aus einer Suspension erzeugt, die einer optischen Dichte von MacFarland-1 entsprach. Eine Reihe von 10-fachen Verdünnungen in Salzlösung wurde auf Agarplatten geimpft, um die Organismen in Suspension zu quantifizieren.
  • Aliquote (0,1 ml) dieser Verdünnungen wurden dann in Tiere geimpft, um ihre Letalität zu bestimmen. Es war möglich, LD&sub1;&sub0;&sub0; in etwa zu bestimmen - die geringste Dosis an Organismen, die, in einzelnen Expositionsversuchen, eine gleichmäßig letale Wirkung bei Mäusen hervorrief. Die LD&sub1;&sub0;&sub0; Dosis für jeden der gram-negativen Organismen wurde in den folgenden Untersuchungen verwendet.
    • 2. Prophylaxe gegen bakterielle Exposition:
  • In einer Reihe von Antikörper-Schutz-Untersuchungen wurden XMMEN-OE5, XMMEN-LY1 und XMMEN-LY2 an Mäuse in Intervallen im Bereich von 4 bis 18 Stunden vor einer Exposition an eine LD&sub1;&sub0;&sub0;.-Dosis von einem von vier gram-negativen Organismen verabreicht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen, wie in den Tabellen 4 und 5 gezeigt, veranschaulichten, daß diese Antikörper beträchtlichen Schutz gegen drei der vier Expositionsorganismen boten. Eine Zusammenfassung einer jeden dieser Untersuchungen folgt.
  • 1) Behandlung: XMMEN-OE5 400 ug (20 mg/kg) i.p. sowohl 48 h als auch 24 h vor der Exposition.
  • Exposition: Pseudomonas aeruginosa Stamm 3632 Injektion i.p. mit einer Dosis von 1·10&sup8; Zellen pro Maus.
  • Ergebnisse: Bei 48 h überlebten 4/4 der Mäuse, die XMMEN-OE5 erhielten, gegenüber 1/4 der Mäuse, die eine Kontrollsalzlösung erhielten.
  • 2) Behandlung: XMMEN-OE5 800 ug (40 mg/kg) i.p. zwei Stunden vor der Exposition.
  • Exposition: E.coli Stamm 014K7 i.p. injiziert mit einer Dosis von 5·10&sup8; Zellen/Maus.
  • Ergebnisse: Bei 48 h überlebten 7/8 der Mäuse, die XMMEN-OE5 erhielten, gegenüber 0/4 der Tiere, die eine Kontrollsalzlösung erhielten.
  • 3) Behandlung: XMMEN-OE5 400 ug (20 mg/kg) i.p. sowohl 48 h als auch 24 h vor der Exposition.
  • Exposition: E.coli-Stamm 085: H9 i.p. injiziert mit einer Dosis von 5·10&sup7; Zellen pro Maus.
  • Ergebnisse: Bei 48 h überlebten 5/12 der Mäuse, die XMMEN-OE5 erhielten, gegenüber 4/12 der Mäuse, die Kontrollsalzlösung erhielten.
  • 4) Behandlung: XMMEN-OE5 400 ug (20 mg/kg) i.p. vier Stunden vor der Exposition.
  • Exposition: E.coli-Stamm 04: K12 i.p. mit einer Dosis von 5·10&sup7; Zellen pro Maus injiziert.
  • Ergebnisse: Bei 48 Stunden überlebten 5/5 der Mäuse, die XMMEN-OE5 erhielten, gegenüber 1/5 der Mäuse, die Kontrollsalzlösung erhielten.
  • Zusammengefaßt zeigten diese Untersuchungen beträchtlichen Schutz gegen drei der vier getesteten Expositionsorganismen - Pseudomonas aeruginosa Stamm 3632, E.coli Stamm 014K7 und E.coli-Stamm 04K12 - als ein Ergebnis der Behandlung mit XMMEN-OE5-Antikörper. Bei diesen Versuchen wurde kein signifikanter Schutz gegen E.coli-Stamm O85H9 festgestellt. Tabelle 4 Exposition Überleben Kontrolle
  • CD-1-Mäusen (weiblich, etwa 22 g) wurden am Tag 1 0,4 mg säulengereinigter anti-Kernendotoxin-monoklonaler Antikörper, entweder XMMEN-LY1 oder XMMEN-LY2 injiziert. Kontrolltiere erhielten Salzlösung (0,2 ml) am Tag 2, diesen selben Mäusen wurde eine in etwa LD&sub1;&sub0;&sub0;-Dosis Bakterien injiziert (i.p.). Überlebende wurden 48 Stunden post-Infektion aufgezeichnet. Tabelle 5:
  • Schutz mit monoklonalem Antikörper gegen Exposition an lebenden Bakterien in CD-1-Mäusen Expositionsbakterien Überleben Kontrolle
    • 3. Prophylaxe gegen Exposition an Endotoxin:
  • Die Fähigkeit von XMMEN-OE5-Antikörper, Bakterien-Endotoxin zu neutralisieren, wurde im gleichen Tiermodell wie oben beschrieben gezeigt. Für die Neutralisationsuntersuchungen, wurde gereinigtes Endotoxin vom J5 E.coli-Mutantstamm 0111 von List Laboratories, Campbell, CA erhalten. Ein LD&sub5;&sub0;-Wert an Endotoxin in Mäusen wurde mit 0,25 mg/Maus bestimmt und der LD&sub1;&sub0;&sub0; mit 0,50 mg/Maus. 24 Stunden vor der Endotoxinexposition erhielten Mäuse entweder 800 ug (40 mg/kg) XMMEN-OE5 oder Kontrollsalzlösung durch IP-Injektion. Aus den Ergebnissen, wie in Tabelle 5 gezeigt, geht hervor, daß 12/17 (71%) der mit Antikörper behandelten Mäuse die LD&sub5;&sub0;-Endotoxinexposition überlebten, gegenüber 7/17 (41%) der Kontrollmäuse, während 5/17 (29%) der mit Antikörper behandelten Mäuse die LD&sub1;&sub0;&sub0;-Endotoxinexposition überlebten, gegenüber 3/17 (18%) der Kontrollmäuse. Diese Beobachtungen weisen darauf hin, daß in einer passiven Schutzuntersuchung XMMEN-OE5 das Überleben nach einer LD&sub5;&sub0;-Endotoxinexposition signifikant erhöhte. Des weiteren scheint diese Schutzwirkung von der Menge der verabreichten Endotoxinexposition abhängig zu sein. Diese Ergebnisse werden unten veranschaulicht. Tabelle 6 Exposition Überleben Kontrolle (P=0,0384 durch einschwänzigen Z-Test)
    • 4. Adjuvanstherapieuntersuchungen:
  • Um die therapeutische Wirksamkeit von an Mäuse verabreichten XMMEN-OE5 in Kombination mit herkömmlicher Antibiotikatherapie nach dem Einsetzen der Infektion zu bestimmen, wurden die folgenden Versuchsreihen durchgeführt.
    • a) Pilotstudien
  • In einer vorbereitenden Untersuchung wurden weibliche CD-1-Mäuse mit Pseudomonas aeruginosa Stamm 3632 (1,6·10&sup8; Zellen/Maus) infiziert. Unmittelbar nach der Exposition erhielten die Mäuse intramuskuläre Antibiotika entweder alleine oder in Kombination mit anti-Endotoxin-Antikörper. Die Antibiotikadosierung bestand aus Amakacin 1,56 mg/Maus und Cefoperazon 12,5 mg/Maus als einzelne Dosen verabreicht. Drei Stunden nach der Exposition erhielten die Mäuse intravenöse Injektionen von 0,4 mg XMMEN-OE5 (20 mg/kg) oder Kontrollsalzlösung. Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigten, daß 11/15 Mäuse, die Antibiotika plus Antiendotoxinantikörper erhielten, überlebten, gegenüber 5/15 Mäusen, die Antibiotika allein erhielten (P 0,02 durch Fisher's Exakt-Test).
    • b) Erweiterte Therapieuntersuchungen
  • Die Therapieuntersuchungen wurden ausgeweitet, um zusätzliche gram-negative Infektionen einzuschließen. Wie in der vorhergehenden Untersuchung wurden weiblichen CD-1-Mäusen LD&sub1;&sub0;&sub0; Mengen an lebenden, gram-negativen Bakterien injiziert. Zwei Stunden nach diesen Impfungen wurden Antibiotika oder Kontrollkochsalzlösungen intramuskulär injiziert. Da sich die vier Bakterienstämme in ihrer Empfänglichkeit für Antibiotika unterschieden, wurden die folgenden berechneten Antibiotikadosen eingesetzt (in mg/Maus): Antibiotikadosis Organismus Cefoperazon Amakazin
  • 4 Stunden nach der Impfung mit einem gram-negativen Organismus und zwei Stunden nach der Behandlung mit Antibiotika erhielten die Mäuse intravenöse Injektionen von entweder XMMEN-OE5-Antikörper oder Kontrollsalzlösung. Für jeden der oben angeführten vier gram-negativen Organismen erhielten alle 5 Gruppen von Mäusen die folgende Reihe von Behandlungen. Bewertungen der Letalität wurden 48 h nach der anfänglichen Impfung durchgeführt.
  • Gruppe 1: LD&sub1;&sub0;&sub0; Bakterien plus Kombination aus Antibiotika plus 300 ug XMMEN-OE5-Antikörper.
  • Gruppe 2: LD&sub1;&sub0;&sub0; Bakterien plus Kombination aus Antibiotika plus 75 ug XMMEN-OE5-Antikörper.
  • Gruppe 3: LD&sub1;&sub0;&sub0; Bakterien plus Salzlösung plus 300 ug XMMEN-OE5 Antikörper.
  • Gruppe 4: LD&sub1;&sub0;&sub0; Bakterien plus Kombination an Antibiotika plus Salzlösung.
  • Gruppe 5: LD&sub1;&sub0;&sub0; Bakterien plus Salzlösung plus Salzlösung.
    • c) Ergebnisse erweiterter Untersuchungen
  • Bei keiner der mehr als 250 Mäuse, die an den Wirksamkeitsuntersuchungen beteiligt waren, oder der Mäuse, Ratten, Meerschweinchen oder nicht-menschlichen Primaten, die in den Toxikologieuntersuchungen behandelt wurden, trat signifikante Toxizität auf.
  • Bei Wirksamkeitsversuchen wurde viel XMMEN-OE5-Antikörper verwendet, mit dem die EIA-Bindung an endotoxinbeschichtete Näpfchen erfolgreich angezeigt wurde. Diese Untersuchungen, die in Tabelle 7 zusammengefaßt sind, zeigten im Vergleich zu Antibiotika alleine ein erhöhtes Überleben von Mäusen, die die höhere Dosis von XMMEN-OE5 plus Antibiotika erhielten. Tabelle 7
  • Behandlung Ergebnisse
  • 1. Antibiotika 34/56 (61%) XMMEN-OE5 300 ug überlebten 48 h
  • 2. Antibiotika 28/56 (50%) XMMEN-OE5 75 ug überlebten 48 h
  • 3. XMMEN-OE5 300 ug 16/56 (29%) Kontroll-Salzlösung überlebten 48 h
  • 4. Antibiotika 25/56 (45%) Kontroll-Salzlösung überlebten 48 h
  • 5. Kontroll-Salzlösung 16/56 (29%) Kontroll-Salzlösung überlebten 48 h
  • Von den vier getesteten gram-negativen Organismen wurde die geringste Wirksamkeit gegen E. coli 014K7 beobachtet. Anderseits war die 300 ug Dosis von XMMEN-OE5 plus Antibiotikakombinations-Therapie mit der höchsten Überlebensrate verbunden, wenn die Exposition an einen der verbleibenden drei Organismen erfolgte - Pseudomonas aeruginosa 3632, E.coli 08H59 oder E.coli 04K12 (siehe Tabelle 8).
    • 5. Zusammenfassung der Wirksamkeitsversuche:
  • Obwohl das für diese Versuche eingesetzte Tierversuchsmodell eine beträchtliche Anzahl an Variablen aufwies, wurde gezeigt, daß XMMEN-OE5 1) signifikanten Schutz gegen mehrere gram-negative Organismen bietet; 2) letale Dosen gereinigten Endotoxins auf eine von der Dosis abhängige Weise neutralisieren; und 3) mäßige Wirksamkeit als ein Adjunkt für herkömmliche Antibiotika bei der Behandlung erwiesener gram-negativer Infektionen aufweist. Tabelle 8 24 Stunden 48 Stunden Behandlung Überlebende Antibiotika hohe Dosis geringe Dosis Salzlösung
    • F. Phase I Klinischer Versuch
  • Frühere Daten vom Phase I klinischen Versuch mit monoklonalen Antikörpern, die durch Hybridoma XMMEN-OE5 hergestellt wurden, liegen nur anekdotisch vor, werden aber unten berichtet.
  • 1. Der erste Patient, F.R., war ein 60jähriger Mann, bei dem gram-negative Sepsis vermutet wurde. Er erhielt 0,1 mg/kg (Gesamtdosis 8,5 mg) XMMEN-OE5 i.v. über einen Zeitraum von einer Stunde. Er erfuhr keine negativen Wirkungen. Blutkulturen zeigten in der Folge, daß er keine gram-negative Bakteriämie aufwies, sondern statt dessen eine akute Fungämie aufgrund von Torulopsis hatte. Das fungale Abszeß wurde chirurgisch entleert und sein Zustand blieb drei Wochen nach der Verabreichung des Antikörpers stabil.
  • 2. Der zweite Patient, T.G., war eine 57jährige Frau mit dokumentierter gram-negativer Bakteriämie und Pyelonephritis als Folge von Harnleiterverschluß. An ihr wurde eine chirurgische Nephrostomieplazierung vorgenommen, und sie erhielt 0,5 mg/kg (Gesamtdosis 36 mg) XMMEN-OE5 i.v. über einen Zeitraum von 1,5 Stunden. Sie erfuhr keine negativen Wirkungen, das Fieber fiel rasch und sie blieb 12 h nach der Infusion fieberfrei. Das sofortige Verschwinden ihres Fiebers ist möglicherweise auf die Verabreichung von Antikörper zurückzuführen.
  • 3. Der dritte Patient, K.S. war eine 60jährige Frau mit schwerer Herzkranzarterienerkrankung, die aufgrund instabil er Angina eingeliefert worden war. An ihr wurde ein chirurgischer Herzkranzarterien-Bypass-Eingriff vorgenommen, der durch einen vorübergehenden Schub von akuter Niereninsuffizienz kompliziert wurde. Nach der Operation entwickelte sie Fieber von 102,8º(F) und daraufhin wurde Acinetobacter von ihrem Blut kultiviert. Es wurde mit Antibiotikabehandlung begonnen, und 10 Tage nach dem Eingriff erhielt sie XMMEN-OE5 in einer Menge von 0,5 mg/kg (Gesamtdosis 42 mg) i.v. über einen Zeitraum von 1,5 Stunden. Nach der Antibiotika- und anti-Endotoxinantikörperbehandlung wurden die Blutkulturen negativ und ihr Zustand verbesserte sich beständig. Sie blieb eine Woche nach der Verabreichung von Antikörper in stabilem Zustand.
  • 4. Der vierte Patient, S.D., war eine 60jährige Frau mit hartnäckiger gram-negativer Bakteriämie (Klebsiella) unbekannter Ursache. Ausgedehnte Untersuchungen zeigten keine Infektionsquelle, aber Harnanomalien ließen Pyelonephritis als die wahrscheinlichste Ursache erscheinen. Am dritten Tag ihres Spitalsaufenthalts entwickelten ihre Blutkulturen trotz Antibiotikatherapie wieder Klebsiellaorganismen. Sie erfuhr Fieberspitzen von bis zu 104,5º(F). Ein Not-CT-Scan ihres Körpers wurde in der Hoffnung durchgeführt, ein Abszeß zu lokalisieren, das entleert werden könnte, um so zu versuchen, ihren klinischen Zustand zu verbessern. Es wurde kein Abszeß oder andere Infektionsstelle gefunden. Sie wurde dann mit XMMEN-OE5 monoklonalem Antikörper in einer Menge von 2 mg/kg (Gesamtdosis 157 mg) i.v. über einen Zeitraum von 2,5 h behandelt. 12 Stunden nach der Infusion war ihre Temperatur unter 100º (F) und ihr klinischer Zustand hatte sich deutlich verbessert. Blutkulturen wurden wiederholt und entwickelten weiterhin gram-negative Organismen. Deshalb verbesserte sich ihr klinischer Zustand trotz fortlaufender gram-negativer Sepsis nach der Verabreichung von monoklonalem Antikörper deutlich. Ihre Antibiotikadosis wurde dann auf eine andere Arzneimittelkombination geändert und ihre Blutkulturen wurden in der Folge negativ. Ihr Zustand blieb 4 Tage nach der Antikörpertherapie verbessert.
    • BEISPIEL III - ZUSAMMENFASSUNG DER MoAb-BINDUNG
  • Die folgende Tabelle stellt eine Zusammenfassung der Bindungseigenschaften der oben beispielhaft behandelten MoAbs dar. Diese Tabelle kennzeichnet die MoAbs durch ihre bekannten Antigene und nicht Epitope, deren Eigenschaften größtenteils noch nicht bekannt sind. Tabelle 9: Zusammenfassung der MoAb-Bindung Antigene rauhes LPS glattes LPS ganze Zelle Innenkern keines heftige Reaktion mäßige Reaktion
    • BEISPIEL III - ABBILDUNG LOKALISIERTER BAKTERIELLER INFEKTION
  • Monoklonale Antikörper, die selektiv mit einer antigenen Determinante reagieren, die Stämmen infizierender Bakterien gemeinsam ist, wurden eingesetzt, um mit nach dem Stand der Technik wohlbekannten Verfahren, z. B. Larson et al., Journal of Clinical Investigation (1983) 72:2101, das hierin durch Verweis eingeschlossen ist, den Ort und das Ausmaß der lokalisierten bakteriellen Infektion zu bestimmen, insbesondere derjenigen, die durch gram-negative Bakterien verursacht werden. Monoklonale Antikörper werden vorzugsweise durch Radiojodierung oder andere nach dem Stand der Technik wohlbekannte Radiomarkierungstechniken radiomarkiert, wie etwa Chelatbildung unter Einsatz eines Chelatbildners wie Diäthylentriaminpentaessigsäure (DTPA); oder sie werden auf andere Weise markiert, wie beispielsweise mit Agenzien, die paramagnetische Eigenschaften aufweisen, mit chemilumineszierenden Substraten oder mit Bestandteilen einer enzymatischen Reaktion. Die radiomarkierten monoklonalen Antikörper werden gereinigt und zur pharmazeutischen Verwendung formuliert. Eine Lösung der markierten monoklonalen Antikörper in einem Träger, beispielsweise in einer phosphatgepufferten Salzlösung, wird intravenös in einen Wirt injiziert. Die geeignete Dosis liegt im Bereich von etwa 100 ug bis 50 mg. Den Antikörpern wird Zeit gelassen, zu den Bereichen des Körpers mit Konzentrationen an Zellen mit antigenen Determinanten zu wandern, die damit reaktiv sind. Konzentrationen von Radioisotopen in bestimmten Geweben werden bestimmt oder können entweder durch Techniken der Ganzkörperabbildung, die nach dem Stand der Technik wohlbekannt sind (siehe z. B. Rainsbury et al., Lancet, 22. Oktober 1983, 934, durch Verweis eingeschlossen) oder durch Bewertung von biopsiertem Gewebe oder extrahierter Körperflüssigkeit unter Einsatz eines Scintillationszählers gemappt werden. Wenn nicht-radioaktive Markierungen verwendet werden, werden andere geeignete Überwachungseinrichtungen eingesetzt, wie ein Detektor für die kernmagnetische Resonanz oder ein Spektrophotometer. Bereiche mit hohen Strahlungsniveaus sind ein Indikator für die Gegenwart lokalisierter bakterieller Infektion.
    • BEISPIEL IV - THERAPEUTISCHE BEHANDLUNG VON BAKTERIEN-INFEKTION
  • Wirte, bei denen festgestellt wurde, daß sie eine bakterielle Infektion aufweisen, werden mit monoklonalen Antikörpern behandelt, die mit einem antigenen Determinanten reaktiv sind, der allen Stämmen des Bakteriums gemeinsam ist. Die monoklonalen Antikörper werden venös, intramuskulär, interperitoneal oder auf ähnliche Weise in einer physiologisch verträglichen Trägerlösung wie phosphatgepufferter Salzlösung verabreicht. Die Dosierung wird durch das Körpergewicht des Wirts bestimmt und liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 0,1 mg/kg bis etwa 40 mg/kg Körpergewicht und üblicherweise etwa 1 mg/kg bis etwa 10 mg/kg Körpergewicht des Wirts. Alternativ dazu wird die Dosis durch Bewertung des Ausmaßes an verbleibender Infektion bestimmt, etwa durch quantitativ standardisiertes EIA-Radioimaging oder andere Verfahren. Die Behandlung wird wie erforderlich in Intervallen wiederholt, um eine Verstärkung der Fähigkeit des Wirts zu bewirken, sich von der Infektion zu erholen.
    • BEISPIEL V - DIAGNOSTISCHES EIA
  • Monoklonale Antikörper gemäß vorliegender Erfindung oder ihre funktionalen Äquivalente werden in einem Immunoassay unter Einsatz von wohlbekannten Standardverfahren (z. B. Methods in Immunodiagnosis, 2.Auflage, Rose und Bigazzi (Hrsg) John Wiley und Söhne, 1980) eingesetzt. Ein derartiges Assay kann beispielsweise ein direktes Format (markierter erster Antikörper, reaktiv mit dem Antigen), ein indirektes Format (markierter zweiter Antikörper reaktiv mit dem ersten Antikörper), ein kompetitives Format (beispielsweise Hinzufügen von markiertem Antigen) oder ein Sandwichformat (sowohl markierter als auch unmarkierter Antikörper) sowie andere nach dem Stand der Technik wohlbekannte Formate haben.
  • Bei einer derartigen Ausführungsform wird ein Gewebeextrakt von einem Patienten, bei dem eine bakterielle Infektion vermutet wird, auf eine unlösliche Matrix oder ein festes Substrat wie Zellulosestreifen, Agarose oder andere Partikel aufgebracht, um einen Bakterien-Substrat-Komplex zu erzeugen. Alternativ dazu kann das Substrat an einem Antikörper befestigt werden, so daß Befestigung von Bakterien von einer Lösung auf das Substrat bewirkt wird. Das Substrat wird dann gewaschen, vorzugsweise mit PBS, um ungebundene Materialien zu entfernen.
    • BEISPIELE VI - QUANTIFIZIERUNG MIKROBIELLER ENDOTOXINE
  • Die MoAbs gemäß vorliegender Erfindung werden bei einem Verfahren zur Quantifizierung mikrobieller Endotoxine in Körperflüssigkeiten, Ausscheidungen und Extrakten oder in Arzneimitteln, Diagnosemitteln oder flüssigen Zwischenstoffen eingesetzt, die bei der Herstellung von Diagnose- und Therapiemitteln erzeugt werden.
  • An IgM MoAb, der eine Bindungsspezifität für eine spezifische und einzige Determinante auf Endotoxin besitzt, wie XMMEN-OE5, wird auf einer festen Oberfläche adsorbiert. Dem Entfernen von überschüssigem unadsorbiertem Material folgt die Blockierung potentieller zusätzlicher nichtspezifischer Bindungsstellen auf der festen Oberfläche durch ein geeignetes Blockierungsreagens wie Albumin. Ungebundenes Albumin wird durch einfache Waschverfahren entfernt. Die aktivierte Oberfläche kann für unterschiedliche Zeiträume im Bereich von 1 h bis 24 h und bei verschiedenen Inkubationstemperaturen im Bereich von 40 bis 37ºC verschiedenen Konzentrationen der Testprobe ausgesetzt sein. Das Entfernen von nicht umgesetzter oder abgereicherter Testprobe wird durch einfache Waschverfahren mit herkömmlichen biochemischen Lösungen wie gepufferter Salzlösung erreicht.
  • Der Nachweis und die Quantifizierung der Endotoxinniveaus in der Testlösung wird durch das Hinzufügen einer Nachweissonde oder eines Bindungspartners erreicht, eines zweiten MoAbs, der zur IgG-Unterklasse gehört und eine Bindungsspezifität für eine spezifische und einzige Determinante wie Endotoxin besitzt, das sich von dem durch den IgM-MoAb gebundenen unterscheidet und in diesem System nicht wesentlich von dem an die feste Oberfläche absorbierten IgM beeinflußt wird.
  • Quantifizierung wird dadurch erreicht, daß die Menge der an die Testprobe gebundenen Nachweissonde mit der Menge der an die definierte Menge eines Endotoxinbezugsstandards gebundenen Nachweissonde in Beziehung gesetzt wird. Die Bewertung der Menge der an den Bezugsstandard und die Testprobe gebundenen Nachweisssonde wird auf unterschiedliche Arten durchgeführt, wie: (a) Radiomarkieren der Sonde und Bestimmung der gebundenen Radioaktivität, (b) enzymatische Markierung der Sonde und Messung der mit spezifischen Mengen der an den Bezugsstandard und die Testprobe gebundenen Sonde verbundenen enzymatischen Aktivität, (c) direktes Koppeln bestimmter spezifische Wellenlängen emittierender Substanzen wie Fluorchrome an die Sonde sowie Quantifizierung und Vergleich dieser Emissionen durch Bezugsstandard und Testproben. Die Quantifizierung wird auch durch Markieren der Nachweissonde mit einer Substanz wie Biotin erreicht, die es ermöglicht, daß das System einen zweiten hochspezifischen Standardindikator einschließt, wie mit einem Radioisotop, Enzym oder Fluorochrom markiertes Avidin.
  • In einer weiteren Ausführungsform dieses Systems kann ein zweiter spezifischer Indikator, der aus radiomarkiertem, enzymmarkiertem oder fluorchrommarkiertem Antikörper besteht, der mit Maus-Ig spezifisch reaktiv ist, eingesetzt werden, um die Endotoxinmenge zu quantifizieren.
  • Ein Vorteil für die anfängliche Adsorption des IgM-monoklonalen Antikörpers an die feste Oberfläche leitet sich von der hohen Bindungsfreudigkeit ab, die mit Antikörpern verbunden ist, die zur IgM-Klasse gehören. Diese verringert das Ausmaß an Endotoxin, das von der primären Bindungsflüssigkeit während des Assayverfahrens verloren gehen kann.
  • Die vorliegende Erfindung schafft pan-reaktive MoAbs, die zur Diagnose, Behandlung und Vorbeugung von bakterieller Infektion nützlich sind. Die erfindungsgemäßen MoAbs sind besonders nützlich zum Blockieren gram-negativen Endotoxins, wodurch seine schädlichen Wirkungen bei mit gram-negativen Bakterien infizierten Wirten verringert werden.
  • Obwohl die vorliegende Erfindung durch Veranschaulichung und Beispiel zum Zweck eines klaren Verständnisses detailliert beschrieben worden ist, ist klar, daß gewisse Veränderungen und Modifikationen durchgeführt werden können.

Claims (6)

1. Verwendung eines gram-negativen bakteriellen Endotoxinkern-spezifischen monoklonalen Antikörpers oder eines aktiven Fragments davon bei der Herstellung eines Medikaments zur therapeutischen Behandlung eines zu Behandelnden mit gram-negativer bakterieller Infektion, worin der genannte Antikörper vom IgM-Isotyp ist und der monoklonale Antikörper aus der Hydridoma-Zell-Linie XMMEN-OE5 (ATEC HB 9081) oder das gram-negative bakterielle Endotoxinkernepitopbindende Äquivalent davon ist.
2. Verwendung eines gram-negativen bakteriellen Endotoxinkern-spezifischen monoklonalen Antikörpers oder eines aktiven Fragments davon bei der Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen Behandlung eines zu Behandelnden, der dem Risiko einer gram-negativen bakteriellen Infektion ausgesetzt ist, worin der genannte Antikörper vom IgM-Isotyps ist und der monoklonale Antikörper aus der Hybridoma-Zell-Linie XMMEN-OE5 (ATEC HB 9081) oder das gram-negative bakterielle Endotoxinkernepitop-bindende Äquivalent davon ist.
3. Hybridoma-Zell-Linie XMMEN-OE5 mit der ATEC-Eingangsnummer HB 9081.
4. Monoklonaler Antikörper, der von der Zell-Linie nach Anspruch 3 abgeleitet ist oder ein aktives Fragment davon oder das gram-negative bakterielle Endotoxinkernepitop-bindende Äquivalent davon.
5. Monoklonaler Antikörper oder aktives Fragment davon nach Anspruch 4 zur pharmazeutischen Verwendung.
6. Verwendung nach Anspruch 1 ,worin der Antikörper im Medikament in einer ausreichenden Menge vorhanden ist, um eine Dosis im Bereich von 0,1 bis 2 mg/kg Körpergewicht zu schaffen.
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