JPS62228295A - グラム陰性菌の単クロ−ン抗体結合決定因子 - Google Patents

グラム陰性菌の単クロ−ン抗体結合決定因子

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JPS62228295A
JPS62228295A JP61229481A JP22948186A JPS62228295A JP S62228295 A JPS62228295 A JP S62228295A JP 61229481 A JP61229481 A JP 61229481A JP 22948186 A JP22948186 A JP 22948186A JP S62228295 A JPS62228295 A JP S62228295A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は一般に感染症、より詳細にはグラム隘性菌によ
り起こる感染症の予防、診断および治療に関する。
（従来技術） 細菌性敗血症および関連の敗血症性ショックは、ある種
の外科処置、腹部外傷、および癌、移植療法もしくは他
の病的状態に関連する免疫抑制の結果生じる感染により
起こる、しばしば致命的な状態である。米国内だけでも
年間７００，０００人を起える患者が敗血症性ショック
を起こす細菌感染を受けやすい状態にあると推定される
。これらのうち１６０，０００人は実際に敗血症性ショ
ックを発現し、年間５０，０００人が死亡している。
ダラム陰性菌感染症は近代的な病院にみられるきわめて
重大な感染症の問題である。２０年はど前は病院で生じ
る敗血症は大部分が比較的急性のグラム陽性菌糸病原体
、たとえばぶどう球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
　）および連鎖球内（Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｃａｃｃｕｓ）
に起因するものであった。これに対し最近はグラム隘性
菌、たとえば大腸菌（Ｈ：５ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｔ
ｉ）および緑膿菌（Ｐｓｔｔｕｄｏｒｎｏｎａａ　ａｅ
ｍｇｉｎｏｓａ）による感染の発生が増加している。
グラム隘性菌は現在では米国内で年間はぼ２００．００
０例の院内感染症に関与しており、総死亡率は２０〜６
０％の範囲にある。これらの病院内感染症の大部分は大
腸菌（ダラム陰性敗血症の患者から単離される最も一般
的な病原体）などのダラム陰性杆菌によるものであり、
頻度において肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｇｌｌａ　ｐｎａ
ｓｒｎｏｎｉａｓ　）および緑膿菌がこれに続く。
グラム陽性敗血症はグラム陽性杆菌の全身的侵入および
これに続く内毒素血症（ｇｎｄｏｔｏｚｅｒｎｉα）に
より生じる症候群である。この疾病の程度は、一過性の
自己限定性の置皿症の症状から、しばしば器官不全およ
びショックが重なった、生命をお。
ひやかす疾病にまで及ぶ。この疾病はしばしば局部感染
部位からの侵入の結果であるか、あるいは外傷、創傷、
潰瘍形成、または胃腸閉塞により起こる可能性もある。
ダラム陰性敗血症の症状には発熱、悪寒、肺機能不全、
および敗血症性ショック（重症の低血圧）が含まれる。
ダラム陰性感染症は特に抗癌化学療法および免疫抑制療
法を受けている患者の間で一般的である。
このように免疫寛容状態を生じた宿主は特徴的に多くの
抗生物質に対して抵抗性を示し、あるいは長い感染期間
にわたって抵抗性を発現し、一般の治療を困難にする。
細胞毒性の免疫抑制療法の採用、および抗生物質の広範
な使用による薬剤耐性細菌の自然選択が絶えず増加して
いることは、ダラム陰性細蔚が臨床上の主要な病原体と
なるのに関与している。
幸いに１０年以上前にアメリカおよびドイツの研究者ら
が、多くの異なる細菌属のグラム隨性菌内毒素が１共通
コア構造（ｃｏｒｐｖｎｏｎ　ｃｏｒｅ　ｓｔｒｘ−Ｃ
ｔｓｒｇ）−をもつことを証明した。すなわち多くの感
染性ダラム陰性菌は独自のきよう（莢）膜および表面多
糖類をもつが、種々のダラム陰性細菌属およびそれらの
内毒素の間に広く共有されているコアリポ多糖類（ＬＰ
：Ｓ）がある。
このコア構造は、”脂質Ａ”と同定される物質を含み、
これが発熱性、補体および凝血系の活性化、低血圧、な
らびに実験動物の死を含む“内毒素“の生物学的特性の
すべてに関与すると考えられる。従ってこのコアまたは
ＬＰＳ構造は少なくとも２つの理由から重要である。す
なわちこれと同毒性が関連をもつこと、およびこれがダ
ラム陰性細菌属に保持されていることである。
抗生物質療法はダラム陰性敗血症、特に緑膿菌感染症に
関連するものに対しては依然として著しく不適当である
ため（抗生物質は細菌の処理にのみ有効であって、微生
物内毒素の作用は低減させない）、これらの感染症を予
防および抑制するための免疫学的方法に次第に関心が向
けられてきた。
免疫療法は免疫グロブリン（抗体またはその有効断片）
全投与して、たとえば感染菌体のオブンニン作用および
食作用を高めることにより、またはＬＰＳの生物学的作
用を中和することにより、細菌の毒作用に対する宿主の
天然の防御を支援する。
脂質Ａ（すなわちＬＰＳ　）のコア構造と結合する抗体
またはその有効断片は多数のダラム陰性菌内′ａ素と広
範な反応性をもつであろう。
スムーズ型ダラム陰性菌のＱ−９異性側鎖上のエピトー
プまたは抗原決定因子は、免疫療法に用いるのには有用
性が限られている。これは、これらが相補的な、または
交叉反応性の抗原決定因子をもつ細菌に対して有効であ
るにすぎないからである。この種の菌株特異性抗体は限
られた有用性をもつにすぎない。すべての歯株のコア少
糖類および脂質Ａは共通の抗原決定因子をもつと考えら
れるが、緑膿菌においてこれらの領域と反応性の単クロ
ーン抗体を製造し、使用する試みは大部分が不成功であ
った。
大部分の臨床上重要なダラム陰性病原体に結合する免疫
グロブリンは免疫療法の成功にとって必須である。血流
感染症の５〜１５％を占める緑膿菌は少なくとも１６種
の血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｇ）（０−抗原型）をもつ。
クレブシェラ稿菌は８０種以上の莢膜型をもち、はるか
に一般的な大腸菌は１３０８ｉ以上の血清盟をもつ。
菌皿症を伴う患者は細菌検査の結果が得られるまで細菌
感染症の型についての特異的診断がＮ認されない場合が
しはしはあり、しかも、そのような細菌検査には数日を
要することがある。患者の状態が疾病の最初の危機的２
４〜４８時間に急激に悪化するのを防ぐためには、しば
しば経験的な診断に基ついて治療を開始しなければなら
ない。
従って、ダラム陰性菌の重要な病原性菌株すべてに存在
するエピトープ捷たは抗原決定因子と反応性であり、こ
れにより細菌感染を効果的に診断、予防、制御すること
ができ、かつダラム陰性細菌編に起因する付随する内毒
素血症を中和しつる単クローン抗体（＋１１０Ａ６）の
製造が長年求められている。細菌感染一般の診断、治療
および予防に有用な、ダラム陽性菌と交叉反応しつる。
１（ｏ　Ａ　ｂを得ることも石塁であろう。
細菌感染症は科学および医学＋；′ｌ保文献に広く扱わ
れている。取扱われているものの多くはグラム隨性菌内
毒素による敗血症に集中している。以下は関連報文およ
び公表でれた出願明細書のリストおよびそれぞれの抄録
である。
欧州特許出願公開１０．１　０３９　　Ａ２号明細曹（
１９８４年２月２２日発行）：緑膿菌に対する単クロー
ン抗体３よびこれを診断および治療に使用する方法に関
する： 国際特許出願公開８４７０４４５８号明細省（１９８４
年１１月２２日発行）：内４素コアと反応性のＭｏＡｂ
に関する； 国際特許出願公開８５１０１６５９号明細書（１９８５
年４月２５日発行）ニゲラム陰性細菌の内毒素に対する
Ｍ　ｏ　Ａ　ｂに関する；欧州特許出願公開１６３４９
３号明細省（１９８５年４月１２日発行〕ニゲラム陰性
細菌に対するヒ）ＭＯＡｂであって、リポ多糖類の血清
型決定因子に対し特異的であり、緑膿菌感染症の治療に
有用なものに関する： ファインゴールドら、アーチ、インタ、メデイ。
（Ａｒｃｈ、Ｉｎｔ、Ｍａｄ、）　（１９６５）　１１
６　：　３２６−２８；グラム陰性感染から回復しつつ
ある患者に白米する多クローン抗血清を患者のダラム陰
性敗血症の効果的治療に用いることに関する：アベら、
ジャバ、ジエイ、エクス、メデイ。
（Ｊａｐ、Ｊ、Ｅｙ；ｐ、Ｍｅｄ、）　（１９７５）　
４５　：　３５５−５９：緑膿菌によるマウスの免疫処
理に応答して産生された多クローン抗血清の使用に関す
る：アビセラら、インフエクト、イムン（Ｉｎｆｔｔｃ
ｔ。
ＺｒｒｕｒＬ％ｉ、）（１９８１）３４ニア５１−５６
：単クローン抗体を用いた淋菌（Ｎａ１ｓｓｅｒｉａ　
ｇｏｎｏｆｆ−ｈｏｔｔａｅ　）　２よび髄膜炎菌（Ｎ
、ｍａｎｔｎｇｉｔｉｄｉｓ　）からのリポ多糖類の分
析についての報告；ツアイグラーら、エン、インダ、ジ
エイ、メデイ、　（Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｓｄ、）　（１
９Ｂ　２．　）　３０７　：１２２５−３０：健康な提
供者に熱により死滅さぜた大腸菌Ｊ５変異株を接種する
ことにより調製したヒト抗血渭でグラム陰性菌血症患者
を治療した二重盲検試験の結果についての報告：ハンコ
ツクラ、インフエクト、イムン（Ｉｎｆｅｃｔ。
Ｉｒｒｕｎｇｎ、）（１９８２）３７：１６６−７１：
緑膿菌の外膜抗原に特異的なＭｏＡｂに関する；ハイエ
ルナウフら、ヨーロ、シエイ、イムノロジー（Ｅｕｒ、
１．Ｉｒｎｍｗｎｏｌｏｇ’／　）（１９８２）１且ニ
ア９７−８０３：大腸菌０１１３リポ多糖類（Ｌｐｓ）
に関する： マキエら、ジエイ、イムノロ、（、ｒ、Ｉ鴫ｕｎｏ１．
）（１９８２）１２９：８２９−３２：異なる属のダラ
ム陰性菌に結合するＭ　ｏ　Ａ　ｂに関する：ヤングら
、クリニ、リサ、　（Ｃ１ｉｎ、Ｒｇｓ、　）（１９８
２）３０：５２２Ａ：免疫原としてサルモ不う・ミネソ
タＣ３ａｌｒｎｏｎａｌｌａ　ｒｎｓｎａａｏｔα）Ｒ
８−９５ＬＩ＃を用いて調製したＭ　ｏ　Ａ　ｂに関す
る； ボラックら、ジエイ、クリニ、インベスト。
（１９８３）７２：１８７４−８１：大腸菌内毒素コア
に対する高水準の循環抗体に関連する緑膿直敗血症の生
存率の上昇についての報告；サワダら、ジエイ、イン７
エクト、ディジ（Ｊ。
ＩｎＪ’ｅｃｔ、Ｄｉｓ、）（１９８４）　１５０　：
　５７０−７６：リポ多糖類および外膜蛋白質に対する
受動的ＭｏＡｂ伝達による、マウスにおける緑膿菌感染
に対する防御に関する； 第２４回、抗微生物薬および化学療法に関するインター
サイエンス会−の抄録（１９８４）１０６には関連の３
報の抄録が含まれている：即ち、ブラックおよびキャノ
ン、“一般的病原体ナイセリア抗原（ｆｆ８Ａｆ）に対
する単クローン抗体がマウスにおける髄膜炎菌血症（Ｍ
Ｅ）を防御”；ウィリアムズら、１緑膿菌（ＰＡ）のボ
リン蛋白質下に対する汎反応性（ｐａｎｒｔｔａｃｔｔ
ｖｅ）単クローン抗体ＣＭＣＡ）：マウスに？ける受動
免疫療法”：およびキムら、”大腸菌に対する単クロー
ン抗体の防御機構についての研究”の７報である；ムタ
リアら、イン７エクト、イムノ（Ｉｎｆｅｃｔ。
Ｉｒｍｍｂｎ、）　（１９８４年９月）４５：６３１−
３６：脂質Ａに結合し、ダラム陽性菌とは反応しないと
思われる、種々の蛋のダラム陰性菌と交叉反応しうるＡ
ｆ　ｏ　Ａ　ｂに関する； ネルズおよびニスワンダー、イン７エクト、イム７　（
Ｉｎｆｅｔｃｔ　、Ｉｍｍｕｎ、）　（１９８４年１２
月）４６：６７７−８１：大腸菌０１１１：Ｒ４のＪ５
変異株から得られるリポ多糖類と反応性のマウスモノク
ローナル抗体２種に関する、これはスムーズ型およびラ
フ型双方の表現型のダラム陰性菌からのリポ多糖類と結
合する： ヤングら、クリニ、リサＣＣ１１ｎ、Ｒｔｓ、）Ｃ１９
８４）３２：５１８Ａ：腸内細菌内毒素の糖脂質の°コ
ア”に指向するＭｏＡｂＬ／Ｃ関する；エル・ニス・ヤ
ング、クリニー　！Ｊ　ｆ　（Ｃ１１ｎ。
Ｒｇａ、）（１９８４）ニゲラム随性杆菌のリポ多糖類
型抗原に対するＭ　ｏ　Ａ　ｂの機能活性についての報
告； エル・ニス・ヤング、感染症の原理と実際（１９８５）
、ジョン・ワイリ・アンド・サンス、ニューヨーク州ニ
ューヨーク、４５２−７５ニゲラム陰住菌敗皿症につい
ての概観を提示：サドフら、アンティバイオティ、ケモ
テラ。
（Ａｎｔｉｂｉｏｔ、Ｃｈｅｍｏｔんｇｒ、）（１９８
５）　　３６　　：１３４−４６：緑膿菌リポ多糖類指
向のマウス単クローン抗体の特性６１１１定についての
記述：テングら、プロシーデイングズ・オブ・ナショナ
ル・アカデミ〜・オブ・サイエンス・ニー・工、＜−ｘ
−−（１９８５年３月）８２：１７９０−９４：マワス
をヒト単クローン１１Ｍ抗体によりダラム陰性医皿症お
よび同毒素血症に対し防御することにつき報告：このＭ
ｏＡｂはグラム陽性菌感染からは有意の防御を示ブなか
った； ギグリオツテイおよびシエネプ、ジエイ、インフエクト
、ディジ、　（Ｊ、Ｉｎｆａｃｔ、Ｄｔｓ、）　（１９
８５年６月）１５１：１００５−１１＋大腸菌ラフ変異
株Ｊ５からのＬＰＳＶＣ結合するが、大腸菌０１１１：
Ｂ４またはＫＩ：０７の無傷スムーズ株には結合しない
Ｍ　ｏ　Ａ　ｂに関する：ビーターら、インフエクト、
イムン、　（Ｉｎｆｅｃｔ。
−Ｉｍｍｕｎ、）（１９８５年１１月）５０：４５’１
−６６：腸内＃ｌ１ｌｌ菌摘共通抗原Ｓよび大腸菌リボ
多糖類外側コアに対するＭｏＡｂについて記載し、少な
くトモ一部が４−結合α−Ｎ−アセチルダルコサミンで
あると考えられる共通の抗体決定因子を証明： ダンら、サージエリ−（１９８５年８月）９８：２８３
−９０：大腸呵スムーズ株０１１１：Ｂ４を免疫原とし
て用いた菌株特異性結合ＭｏＡｂの産生、および犬ＰＪ
ＪｃＩＫラフ変異株Ｊ５を免疫原として用いたダラム陰
性菌交叉反応性ＭｏＡｂの産生についての報告。これら
のＭｏＡｂはダラム陽性菌とは反応性でなかった； ダンら、アーチ、サージ、　（ｍｃｈ、ｓｘｒｇ−）（
１９８６年１月）１２１：、５８−６２：種々のグラム
陽性微生物との反応性を示し、食作用を促進し、実、＠
的グラム陰性敗血症期間中に防御を与えたマウス単クロ
ーンＩｆＧ抗体を用いるダラム陰性敗血症の免疫療法に
ついて報告。このＭｏＡｂも破験グラム陽性菌との反応
性を示さなかった：マイナーら、インフエクト、イムン
、（Ｉｎｆａｃｔ。
Ｉｍｒｍｂｎｇ、）　（１９８６年４月）５２：５６−
６２：大腸菌１５に対するマワスＭ　ｏ　Ａ　ｂの特性
測定に関する。
（発明が解決しようとする問題点） 本発明は、ダラム陰性菌の内毒素コアに最も一般的に付
随するリボ多糖類に見出されるエピトープに結合し、異
なる属のダラム陰性菌との広範な交叉反応性を示しかつ
効果的に内毒素を中和する単クローン抗体（ＭｏＡ６）
を産生ずる新規なハイブリドーマ細胞系を提供する。開
示されたＭｏＡｂのうち少なくとも１種（ＸＭＭＥＮ−
Ｊ５Ｄ）は、ダラム陽性菌にも見出されるエピトープと
結合する。
これらのハイブリドーマは不滅の細胞←細胞培養におい
て無限に複製する能力をもつ骨随腫細胞）とエフェクタ
ー免疫細胞とを、ダラム陰性菌ｆＡ製物による免疫細胞
宿主の免疫処理ののち融合させることにより得られる。
リポ多糖類に対する単クローン抗体を産生ずる幾つかの
個々のハイブリドーマ細胞系を記載しているが、本発明
はリポ多糖類関連エピトープに対する単クローン抗体を
産生するハイブリドーマの全体を現在の技術水準に追加
するものである。
本発明のハイブリドーマ細胞系により産生される単クロ
ーン抗体は細菌感染症の検出、細菌内毒素崩症およびダ
ラム陰性菌により起こる感染症の検出、治療および予防
に有用である。
本発明はダラム隙憔菌に一般に付随するリボ多糖類（Ｌ
ＰＳ）上に′存在するエピトープ１種または２種以上と
結合する単クローン抗体（ＭｏＡｂ）を産生じつる特定
のハイブリッド細胞、およびそれらの機能均等物を提供
する。さらに本発明は、これらの化合物を細−■感染症
の検出、治療および予防に用いる方法を提供する。
（ｉ’ｄ１題点を鱗決するための技術的手段）ハイブリ
ドーマの形成および単クローン抗体の産生は、当技術分
野で周九の多種多様な方法によう行うことができる。基
本的にはこの方法は、まずあらかじめインビボまたはイ
ンビトロで刺激した免疫細胞（たとえは哺乳動物の牌櫂
かも得られるもの）を得ることによる。次いでこれらの
細胞を、細胞培養において無限に複製しつる細胞（たと
えば骨髄ＭＭ胞またはトランスフォーメーションした細
胞）と融合ぢぜると、これにより不滅の免疫グロブリン
分ｇｍ胞系が得られる。得られた融合細胞、すなわちハ
イブリドーマを培養し、得られるコロニーを目的の単ク
ローン抗体の産生につきスクリーニングする。この種の
抗体を産生するコロニーをクローニングし、インビボま
たはインビトロで増殖させて大量の抗体を産生さぜる（
これらの細胞の融合の理論的根拠および実際の方法につ
いてはコーラ−およびミルシュタインのネイチャー（１
９７５）２旦６：４９５を参照されたい。その記載をこ
こに参考として引用する）。
これらの方法についてはさらにのちに詳述するが、本発
明の範囲から逸脱することなくこれらの方法を変更し、
かつこれらに追加しうろことは当業者には認められるで
あろう。
哺乳動物のリンパ球を、ダラム陰性菌の全菌体もしくは
菌体抽出ｇ１だはリボ多糖類による動物のインビボ免疫
処理により、あるいはインビトロ接触により免疫処理す
る。この種の免疫処理は、十分な力価の抗体を得るため
に数週間１での間隔を置いて必要なだけ繰り返される。
上記の菌体または菌体抽出物は適宜な溶ｇまたはアジュ
バント中に保耳される。ａ後の抗原ブースター処理のの
ち動物を層殺し、ＩｌＩ！識細胞を取出す。
覗孔動物の骨髄ｄ細胞、または細胞培養において無限に
複製しつる他の融合パートナ−との融合は、標準的な周
知の方法（たとえばミルシュタインオヨびコーラ−、ユ
ーロ、シェイ、イムノｉ。
（Ｅｕｒ、Ｊ、ＩｒｒｍｕｒＬｏ１、）　（１９７６）
　６　：　５１１　；その記載をここに参考として引用
する）により、たとえばポリエチレングリコールＣＰＥ
Ｇ）−！たは他の融合剤を用いて行われる。この不滅の
細胞系（マウスであることが好ましいが、他の唾乳動物
梗の細胞に白米するものでもよい。これにはラットおよ
びヒトが會まれるが、これらに限、定されない）は、特
定の栄養素の利用に必要な酵素が欠損し、急速に増殖し
、良好な融合症をもつように選ばれる。この棟の細胞系
は多数が当業者に知られて２つ、他は定期的に報告され
ている。酵素欠損にはたとえばチミンキナーゼ＜ＴＫ）
−ｆ、たはヒボキサンチン−グアニンホスホリボシルト
ランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）が言１れる。これらの
欠損により、融合細胞をそれらのたとえばヒボキサンチ
ン−アミノプテリン−チミジン培地（ＨＡＴ）での増殖
能ｅこよって選択することができる。使用する不滅の融
合パートナ−は免疫グロブリンを分泌しない系に白米す
るものであることが好ましい。
個々の融合細胞を個々の組織培養ワエル甲で増殖きぜる
。フィーダー細胞（たとえば照射した胸腺細胞その他の
細胞）を用いて細胞の生存性を高めることもできる。個
々の培養ウェルからのハイブリドーマ培養上清液を、精
製したリボ多糖類またはダラム陰性菌の全歯体に結合す
る抗体につきアッセイするか、あるいは当技術分野で知
られている他の適切な検出法、たとえば酵素結合イムノ
アッセイ法（Ａ’ＩＡ）およびイムノドツト（ｉＭｌＬ
ｎｏ−ｄａｔ）アッセイ法によりアッセイする。前者に
ついては培養上清液を、リボ多糖類で憶った反応ウェル
に入れる。インキュベーション後に反厄ウェルを洗浄し
、抗原に結合した残留抗体を、抗ＬＰＳ抗体と反応性の
標識抗体により検出する。適切な標識には、ラジオアイ
ソトープ、発光基質、たとえば螢光剤、および酵素標識
の成分が含まれる。
イムノドツト法も抗ＬＰＳ抗体を発現するクロ−７をス
クリーニングするために用いられる（タウビンら、イム
ノロ、メソード（Ｉｍｒｍｂｎｏ　ｌ　。
Ｍｏｔｈｏｄ）　（１９８４）　７２　：　３１３　：
その記載をここに参考として引用する）。精製したＬＰ
Ｓを硝酸セルロース膜に“ドツト（ｄａｔ）”として施
し、乾燥させる。ゼラチン溶液中でブロックしたのち膜
を順次、培養上清液、抗マウスＩｆ−パーオキシダーゼ
結合体溶液、および４−クロル−１−ナフトールＭ液に
浸漬し、各浸漬の間にはリン酸塩緩衝化食塩液（ＰＥＳ
）洗浄を行う。反応性免疫グロブリンを発現するクロー
ンは着色したドツトとして現われる。当業者に知られて
いる他のスクリーニング系も使用できる。
上記クローンをマウス腹腔内に注射し、これから腹水を
採取することにより、分泌型ハイブリドーマから大量の
単クローン抗体が産生される。マウス（好１しくはブリ
スタンその他の腫瘍促進系で処理され、化学的にまたは
照射により免疫抑制処理される）は各種系統のものであ
ってよく、たとえばニューシーラントブラックまたはバ
ルブ／ｃ（ＢｃＬｌｂ／Ｃ）系統である。腹水をマウス
から採取し、単クローン抗体をこれから、たとえばＣＭ
セファロースカラムその他のクロマトグラフィ一手段に
よりｆｌｖ製する。こうして高力価の抗体が採取される
。あるいはハイブリドーマをインビトロで種々の方法に
より、潅流培養または懸濁培養を用いて、バッチ式また
は連続式培養法で培養し、単クローン抗体を培地または
上清から採取してもよい。
こうして製造された単クローン抗体は診断上および治療
上多くの用途をもつ。これらは、組餓の体液または他の
ヒト白米物質もしくは板体を標準的なイムノアッセイプ
ロトコールに従って処理することにより、哺乳動物に２
けるダラム陰性菌または細菌一般の存在を試験するため
のインビトロ診断薬として用いられる。あるいは細菌に
よる汚染が有害となると思われる無生物の抽出液、たと
えば圀療器具、食品または水も試験できる。この種のア
ッセイ法はラジオイムノアッセイ、ＥＩＡまたは化学発
光型のものであってよい。この種のアッセイ法の１つに
おいては、体液を本発明の抗体と接触させ、標識された
第２抗体を用いて、抗体が結合している細菌の存在を検
出する。あるいは競合イムノアッセイ法または１サンド
イツチ”型アッセイ法も採用できる。この種の組織化学
的方法は当技術分野で周知であり、プロトコールはたと
えば免疫診断法、第２版、ローズξよびビガッツイ編（
ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、１９８０年、参考
として引用する）およびカンイルらの免疫学的方法（ダ
ブリュー・ニー・べ／ジャミツ社、１９６４年）に見出
される。
さらに本発明の単クローン抗体は細菌感染の限局領域、
たとえば軟組織における腫瘍もしくはのう嘘、２よび骨
に３ける骨髄炎のインビボ検出に用いられる。たとえば
標識抗体を細菌感染が疑われる呻乳動物に投与する。抗
体は唾乳動物内に存在する細菌に選択的に績合し、これ
により感染領域に標識が濃縮される。このような用途に
適した標識にはラジオアイソトープ、たとえば１２１ヨ
ウ素、ＩＵヨウ素、″テクネチウムおよび１１ｍインジ
ウムが含まれる。次いでこれを標準的なラジオグラフィ
ー法により検出できる。あるいは単クローン抗体を常磁
性コントラスト剤で標識し、核磁気共鳴法により検出す
る。こうして標識抗体は細菌性腫瘍の検出可能な映像を
与える。同様に体液、分泌液および抽出液中の、ならび
に薬物、診断薬、または診断薬、治療薬の整造に際して
得られる液状中間体中の微生物内毒素の検出および定量
にこれらの単クローン抗体を用いることができる。
単クローン抗ＬＰＳ抗体はグラム陰性菌感染の恐れのあ
る患者に予防的に用いられる。これらの単クローン抗体
の投与は特定の微生物に対して防御するだめの身体の潜
在的能力を高める作用をもち、これによりその後の感染
の危険性が少なくなる。
本発明の単クローン抗体は死亡をもたらす可能性のある
細菌感染症および敗血症性ショックを処置するために治
療用として使用できる。抗体は生理学的に受容できる溶
液状で、単独でまたは抗体物質と組合わせて静脈内また
は筋肉内に投与される。本発明の単クローン抗体の結合
特性がそれにより影響を受ける可能性はあるが、これを
貯蔵および輸送のために凍結乾燥し、投与前に再構成す
ることもできる。
これらの単クローン抗体はリボ多糖類に対して特異的な
親和性をもつので、これらは内毒素血症の生命を脅かす
症状、たとえばしばしば抗生物質療法に対して応答しな
いダラム陰性感染症に付随する敗血症性ショックに対す
る選択的な治療法を提供する。これらの単クローン抗体
の幾つかを用いた治療の効果には、ある種の細菌のオプ
ンニ７作用および食作用の助長がある。これはおそらく
細胞壁への結合によるものであろう。このように単クロ
ーン抗体は細菌感染症の毒作用と戦うのを補助する。
以上の説明は本発明を人体に適用することに基ついて行
ったが、獣圀字的用途における本発明の固有の有用性は
当業者には明らかであろう。
これらの診断、予防Ｂよび治療上の用途すべてについて
、単クローン抗体８よび他の必要な試薬、ならびに適宜
な装ｆｉｔおよび付属品をキットの形で提供し、これに
よって容易に入手し、容易に使用することができる。
以下の例は説明のために提示てれるものであり、限定で
はない。
実施例１゜ ハイブリドーマＸＭＭＥＮ−ＯＥ５、　）（ＭＭＥＮ−
ＬＹ１、およびＸＭＭＥＮ−ＬＹ２゜ バルブ／Ｃマウス（チャールズ・リバーズ、クイルミン
トン、ＨＡ）を大腸菌Ｊ５″またはカルモネラ・ミネソ
タＲ５９５の煮沸菌体ｌＸｌ０’個で免疫処理した。大
腸菌０１１１株の変異株であるＪ５のＬＰＳ、サルモネ
ラ・ミネソタの８６変異株であるＲ５９５のＬＰＳは共
に外側のｏ−ｑ−を異性側鎖が欠如し、コアＬＰＳ　　
（脂質Ａおよびコア少糖類）のみからなる。初回免疫処
理ののち、Ｏ−特異性側鎖を欠如する菌体（煮沸）ＩＸ
ＩＯ’個を１か目間隔で腹腔的注射することによりマウ
スをブースター処理した。（本実施例はＸＭＭＥＮ−Ｌ
ＹｌおよびＸＭＭＥＮ−ＬＹ２．（共に８５９５免疫原
からｖ！４製）ではなく、大腸菌免疫源から調製したＸ
ＭＭＥＮ−Ｑ　Ｅ　５に焦点を合わせる。しかし３種す
べてにより産生されたＭｏＡｂによる細菌への攻撃に対
する予防についてのデータを示す。）最後の抗原ブース
ター処理の５日後に、免疫処置したマウスから牌Ｉｌｌ
細胞を無菌的に取出した。
他に概説てれる方法（セイント・グロス、ジエイ。
イムノ、メン（Ｊ、Ｉｒｒｖｎ１Ｌ？Ｌｏ、Ｍ＠ｔｈ、
　）　（１９８０）３５：１、これを参考として引用す
る）に従って、５Ｘ１０’個の牌ＰＩ１．羅胞を同数の
Ｐ６３Ａｆ８．６５３すなわちバルブ／Ｃ由来の非分泌
型７９ス骨髄膝細胞系（アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション、ロックビル、ＭＤ）と、ポリエチレ
ングリコール４０００（メルク・アンド・コ社、ロー９
エイ、ＮＪ）を用いて融合させた。このハイブリッド細
胞を、培養ウェル９６個の培養プレート（コスタ−、ケ
ンブリクジ、ＭＡ、÷３５ＬＩ６）中の、正常バルブ／
Ｃ胸腺細胞のフィーダ一層と共に予備インキュベートし
た培地（Ｉ　Ｘ　１０’／培養ウエル、融合の１日前）
に乗せた。細胞は３７℃で１０％ＣＯ１の雰囲気におい
て下記の培地中で最初の２週間培養された。ダルベツコ
の改良イーグル培地（グルタミンを含む）、ならびにグ
ルコース４．５．＠／ｌ（ギブコ、サンタ・クララ、Ｃ
Ａ、φ３２０−１９６５）、ウシ給仕血清（１０％）（
マイクロバイオロジカル・７ンシエーツ、ウォーカービ
ル、ＭＤ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｒｒＭ：（ギブ
フ、サンタ・クララ、ＣＡ、÷　３２０−１３６０）、
−ｅニジｒ）　：ｙ　（５０ｐ／Ｒ１）　−−ストレプ
トマイシン（５０μ／ａｔ）（ギブコ、サンタ・クララ
、ＣＡＳす６ｏｏ−５ｏ７ｏ）およびヒボキサンチン−
アミノプテリン−チミジン（ＩＩＡＴ）〔ヒボキサンチ
ン（１ｏｒｒＬＭ）、チミジ７　（１，６ｒ１ｗ）を０
．０４　ｍＷアミノプテリン（シグマ・ケミカル社、セ
ントルイス、ＭＯ）と合わせて用いることにより調製〕
。定期的な維持のための培地（融合日２週間以後）は、
アミノプテリンを培地に含まない（ＨＴ培地）点を除い
て上記と同じであった。
融合後２週から４週箇で、ハイブリッド細胞の培養物を
ＥＸＡ　ｇよびイムノドツトアッセイ法により精製ＬＰ
Ｓへの抗体結合性を試験した。反復試験に際して陽性で
あった培養物を次いで限界希釈法によりクローニングし
た。すなわち細胞を培養９工ル９６個の組織培養プレー
ト（コスタ−１ケンブリツジ、ＭＡ、÷３５９６）中で
各培養ウェル当たり細胞１０〜１個の種々の希釈度で培
養した。１個のコロニーのみを含む培養ウェルを鏡検に
より確認し、次いでＥＸＡにより抗Ｊ５または抗Ｒ５９
５活性について試験した。陽性のクローンを培養ウェル
２４個の組織培養プレート（コスタ−、ケンブリッジ、
ＭＡ、す３５２４）上に広げ、再クローニングし、同じ
方法で爵試験した。ＸＭｕＥＮ−ＯＲ５、ＸＭＭｌｉ：
Ｎ−ＬＹｌおよびＸＭＭＥＮ−ＬＹ２と表示される２橿
のクローンが持続的に単クローン抗体を分泌することが
見出された。標準法による放射免疫拡散法３よびＥＸＡ
により、この単クローン抗体は免疫グロブリンの１９Ｍ
群のものであると判定された。ハイブリドーマＸＭＭＥ
Ｎ−０１：５２よびＸＭＭＥＮ−ＬＹｌは現在アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ。
ｒ、ｃ、ｃ、）　（１２３０１ハークローン・　ドライ
ブ、ロックビル、ＭＤ、２０８５２、アメリカ合衆国）
に寄託でれている。寄託は１９８６年４月２４日になさ
れ、それぞれＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，寄託番号７／Ｂ９０８１
およびＨＢ９０８２をもつ。
バルブ／ｃマ９ス（チャールズ・リバー）ヲ用いてハイ
ブリドーマを腹腔内培養した。約３×１０６個のハイブ
リドーマ細胞を下記のように前処理したマウス、丁なわ
ち１週ＱＪＩ前にブリスタン（アルドリッチ・ケミカル
社、ミルウォーキー、Ｗｌ）ｏ、ｓｍｔを腹腔的注射し
たマウスに腹腔内注入した。得られた腹水（ハイプリド
ーマ圧入の１１〜１５日後に採取）は放射免疫拡散法（
メロイ、放射免疫拡散、スプリングフィールド、ＶＡ、
プレートナＪ−３０４）により測定して平均２η／　ｙ
ｔｌの抗体を富有していた。
腹水中の抗体を０Ｍセファロースカラム（ファルマシア
社、ビスカットアワエイ、ＮＪ）を用いた高速イオン交
換クロマトダラフイーにより、当業者に周知の方法で精
製した。高グルコース含量の組織培養培地（ＤＭＥＭ、
ゲルコール０．４５％、グルタミン２　ｒｎＭ、ピルビ
ン酸２　ｒｎＭ　）を用いて上記の細胞系をインビトロ
で一般の１．５を容ケモスタット甲において増殖させた
。０．０２ｔ／時間の希釈速度で定常法帖が維持され、
その際細胞濃度は８４％の生存率で５〜６Ｘ１０’個／
ｙｔ１、　ＭｏＡｂ濃度は２５　ｐｇ／ｍ１、容積生産
性はＭｏＡｂ　０．６３　ｐｙ／時間であり、化生産性
はＭＯＡα３０μｇ／ｉ胞１０６個／日であった。
菌Ｊ５リボ多糖類（リスト・バイオロジカルズ、キャン
ベル、ＣＡ）を０．０１　Ｍ−ＰＥＳ　（ＰＨ７，４）
甲で２０μｇ／ＩＬｔに希釈した。この浴液１００μｔ
をＥＸＡ反応プレート（ギルフォード・ダイアグノステ
ィックス、オーバーリン、ＯＲ）の各培養ワエルに添加
し、室温で一夜インキユベートした。
翌日、プレートｆＰＢｓで２回洗浄し、２％９シ血清ア
ルブミン（シグマ・ケミカル社、セントルイス、Ｍ□）
１５０μｔ／培養ウエルを添加することにより遮断し、
この溶液を室温で一夜インキユベートシた。翌日、プレ
ートをＰＢＳで２回洗浄し、直ちに使用するか、あるい
は４℃で保存した。
２、抑制アッセイ：精製したＸＭＭＥＮ−ＯＥ５単クロ
りン抗体を０．０ＩＭ−ＦＢＩ中２　ｐ　ｇ／ｎｌ　Ｋ
希釈し、漸増する量の精製抗原と混合した（大腸菌Ｊ５
リボ多糖類（ＬＰＳ）、サルモネラ・ミネソタＲ５９５
ＬＰ：！１．サルモネラ・ミネソタＲ５９５脂質Ａ、お
よび緑膿菌フィッシャータイプＩ　ＬＰＳ、すべてリス
ト・バイオロジカルズ、キャンぜル、ＣＡ）。これらの
抗体−抗原混合物ヲ呈温で一夜インキユベートした。
翌日、各種抗体−抗原混合物を、大腸菌Ｊ５ＬＰＳを塗
布したＥＩＡ培養培養シェル加し、室温で１時間反応て
ぜ、欠いでＰＢＳで２回洗浄した。
久き゛の工程は１００μｔ／ｒ＝　妥ワエルのヤギ抗マ
ヮスＩｙＭ−パーオキシダーゼ績合体（カッペル、マル
バーン、ＦＡ）の添加であり、これも室温で１時間反応
させた。最後にＰＢＳで３回洗浄したのち、酵素基質（
ＡＥＴＳ、ペーリンガー・マンノ・イムから、インディ
アナポリス、ＩＮ）１００μｔ／培養ワエルを添加し、
室温で４５分間反応嘔せた。１００μｔ／培蚤ウエルの
１０ｒｒＬＭナトリウムアジドを添加することにより酵
素反応を停止させた。ギル７オード・マニュアルＥＸＡ
　ａ取器を用いて４０５ｒＬｒｎにおける吸光度を記録
した。結果を表ＩＫまとめる。
表　　　１ 酵素イムノアッセイ（Ａ；’７Ａ）により測定した固相
Ｊ５ＬＰＳへのＸＭＭＥＮ−ＯＥ５単０．５　　　２２
　　　３５　　　０　　　００．２５　　　０　　　２
９　　　０　　　０的検査 抗原を０．２０μｍの硝酸セルロース膜（ザートリ９ス
）に１μｔの１ドツト”として施し、５分間風乾した。
（用いた濃度は精製ＬＰＳについては１００μｊ／／１
ｎｔ（ＦＥＢ）、煮漣菌体調製液については約１　ｘ　
１０″個／ｒｎｌであった）、抗原スポットを施した膜
を次いでゼラチン（ディフコ、デトロイト、ＭＩ）の１
％浴液（ｗ／υ・ＰＢＳ）により室温で３０分間ブロッ
クした。速やかに（１分間ずつ２回）洗浄したのち、Ｘ
ＭＭＥＮ−ＯＥ５抗体（２〜５μｇ７ｍｔ；−ｐＢｓ）
１１上記の膜と共に室温で３０分間インキュベートした
。ｇを速やかにＰＥＳで３回洗浄し、次いでヤギ抗マウ
スＩｆＭ−パーオキシクーセ績合体（カッイル、マルバ
ーン、ＰＡ）と共に室温で３０分間インキュベートした
。膜をＰＢＳで３〜４回洗浄したのち、基質（４−クロ
ル−１−ナフトール、シグマ・ケミカル社、セントルイ
ス、Ｍｏ）を膜と共に室温でインキュベートした。陽性
の反応は通常は２−５分間で紫色のドツトとして現われ
、視覚的に４＋（きわめて強い）〜１＋（弱い）とグレ
ード評価された。結果を表２に１とめる。
表　　　２ ＸＭＭＥＮ−ＯＥ５単クワクローン抗体イムノサルモネ
ラネソタＲ６０（Ｒａ）ＬＰＳ　　　　　−サルモネラ
・ミ不ソタＲ３４５（Ｒｈ）ＬＰＳ　　　　　−大腸菌
Ｊ　５　（Ｒｃ）ＬＰＳ　　　　　　　　　　　　２＋
サルモネラ・ミネソタＲ７（Ｒｄ）ＬＰＳ　　　　　　
　１＋サルモネラ・ミネソタＲ５９５（Ｒｅ）ＬＰＳ　
　　　　１＋緑膿菌　ＰＡＣ６０５ＬＰＳ　　　　　　
　　　　　　２＋大腸ｆＭＪ５煮沸細胞　　　　　　　
　　　　　　３十大腸菌０１４：に７煮沸細胞　　　　
　　　　　　ｌ＋＃膿菌ＰＡＣ６０５煮沸細胞　　　　
　　　　　　３＋緑ｐａ歯フイツシヤー２煮沸細胞　　
　　　　　　　−ＸＭＭＥＮ−ＯＥ５単クワクローン抗
体Ｅｊ中０、５　ｍｅ／ｍｌ　）　１００　ｐＬを等容
積の生細菌（約１×１０９個／ａｔ）とガラススライド
上で混合した。
陽性の凝集を視覚的に１５分以内に強（４＋）〜弱（１
＋）と採点した結果を表３にまとめる。
表　　　３ ＸＭＭＥＮ−ＯＥＳ単クロりン抗体スライ抗原 大腸菌Ｊ５　　　　　　　　　　　　　　３十大腸菌Ｏ
１４：に７　　　　　　　　　　　Ｂ＋大腸菌０８５：
Ｈ９１＋ 緑膿菌ＰＡＣ５５７１＋ 緑膿菌フイツシヤータイプ２　　　　　　　　１＋黄色
ふどう球−− 効力試験において、平均体重２０ｇの４〜６週令の酸Ｃ
Ｄ−１マウスを千ャールズ・リバー・ブリーディング・
ラボラトリーズから得られた。ＸＭＭＥＮ−ＯＡ７５抗
体を腹腔内に種々のユで種々の時間を置いて注射した。
攻撃微生物は下記のうちの１つからなるものであった。
一緑膿菌３６３２ｉ：これはＵＣＬＡ医療センターで患
者から単離すれたフィッシャー血清型２の血清抵抗性菌
である。
一大腸菌血清群０１４に７　；これはバッファロー小児
病院のエルビン・ネーター博士から得られた、十分に特
性が明らかにされた血清感受性菌株である。
一大腸菌０４に１２；これはＵＣＬＡ医療センターで患
者から単離された血清抵抗性のきよう膜保有（ｅｎｃａ
ｐｓｕＬａｔｅｄ　）　囚である。
−大腸菌０８５Ｈ９；これはジョーシア州アトランタの
疾病コントロールセンターかう得り血清抵抗性菌である
。
これらの実験においてＲ菌は変性されず、ムチン攻撃も
受けなかった。１１ｆＩＩ醒接種物を調製するためには
、菌をトリプチケースンイ寒天平板で１６〜１８時間増
殖させた。欠いて綿棒で緩和にふき取り、遠心分離し、
再懸濁し、最後にさらに３回洗浄することにより細菌コ
ロニーを採取した。細菌原液はマク７アーラ／ドｌの光
学濃度に相当する懸濁液から調製された。食塩液中１０
倍希釈の系列を寒天平板上に接種し、懸濁液中の菌を定
量した。
次いでこれらの希釈液のアリコートを（０，ＩＭ）動物
に接種して致死率を判定した。おおよそのＬＤ、ｏｏ、
すなわち各攻撃試験においてマウスに均一な致死作用を
与えた最低菌量を判定することができた。各グラム陰性
菌についてのＬＤ、。。量を以下の試験に用いた。
試験において、ＸＭＭｋ：Ｎ−ＯＥ　５、ＸＭＭＥＮ−
Ｚ。
ｙｌｇよびＸＭＭＥＮ−Ｚ、Ｙ２単クローン抗体をマウ
スに、４種のグラム陰性菌のうちの１揮をＬＤ、。
量用いて攻撃する前４〜１８時間の間隔で投与した。こ
れらの試験の結果は、表４２よび５に示されるようにこ
れらの抗体が４種の攻撃菌のうち３種に対して■意の防
御金与えることを証明した。
これらの試１噴そｎぞれの要約は下記のとおりである。
ｌ）処置：攻撃の４８時間前２よび２４時間前ＫＸＭＭ
ＥＮ−ＯＥ：５抗体４００　ｐ＆　（２０ｍｑ／Ｉｃ９
）を腹腔内へ。
攻撃：緑膿菌３６３２株をマウス当たり１Ｘ１０”個の
肴で腹腔内注射。
結果：４８時間目に、対照食塩液を投与したマウスは４
匹中１匹（Ｋ匹）が生存したのに対しＸＭｌｆＥＮ−Ｏ
Ｅ５抗体を投与したマウスに匹が生存した。
２）処置：攻撃の２時間前にＸＭＭＥＮ−ＯＥ５抗体８
００　ＰＭ　（４０ｍ９７に＝９）を腹腔内へ。
攻ＩＪ−二大腸菌０１４に７株をマウス当たり５Ｘ１０
’個の量で腹腔内注射。
紹未＝４８時間目に、対照食塩ｇを投与したマウスの生
存が２匹であったのに対し、ＸＭＭＥＮ−ＯＥ５抗体抗
体膜与したマウスＸ匹が生存した。
３）処立：攻寥の４８時間前および２４時間前にＸＭＭ
ＥＮ−ＯＥ５抗体４００μ、！／　（２０■／に９）を
腹腔内へ。
攻撃：大腸［０８５：３９株をマウス当たり５×１０１
個の量で腹腔的注射。
縛果：４８時間目に、対照食塩液を投与したマウスの生
存がη匹であったのに対し、ＸＭＭＥＮ−〇Ｅ５抗体を
投与したマウスはｈ匹が生存した。
４）処置：攻撃の４時間前にＸＭＭＥＮ−ＯＥ５抗体４
００１１ｇ　（２０ｍ９／ＪＣ９）を腹腔内へ。
攻撃：大腸菌０４：に１２株をマウス当たり５×ｌＯ？
個の量で腹腔的注射。
結果：４８時間目に、食塩対照液を投与したマクスの生
存かに匹であったのに対し、ＸＭＭＥＮ−ＯＥ５抗体を
投与し１こマウス×匹が生存した。
丁なわち、これらの試験により被験攻撃囚４種甲３種−
−−緑膿丙３６３２株、大腸菌０１４に７株、３よび大
腸菌０４Ｋ１２株、−一一に対する有意の防御をＸＭＭ
ＥＮ−ＯＥ５抗体による処置の結果として示した。これ
らの実験においては大腸菌０８５ｇ９株に対しては有意
の防１卸が認められなかった。
表　　　４ 攻撃　　　　　　生存 ＸＭＭＥＮ−Ｑ　Ｅ　５　　　　対照１、緑膿菌　　　
　　　　　４　／　４　　　１　／　４２、大腸菌Ｏ１
４に７　　　　７／８　　　　０／４３、大腸菌０８５
ｆｆ９　　　　５／１２　　４／１２ＣＤ−１−＝ｒ’
７Ｋ（雌１．Ｂｚ２Ｉ）Ｋ１１日目カラム精製抗コア内
毒素単クローン抗体ＣＸＭＭＩ！：Ｎ−ＬＹｌまたはＸ
ＭＭＥＮ−ＬＹ２抗体）０．４ｇを注射した。対照動物
には２日目に食塩液（Ｑ、９ｒＲｊ）を投与し、これら
同じマウスに約ｚｔＤｔｏｏｔの細菌を注射した（腹腔
内）。注射後４８時間目に生存数を記録した。
表　　　５ ＣＤ−１マウスにおける生細菌攻撃に対生存 大腸菌０１４：に７　　６／８　　４／８　　０／４大
腸菌０４：に１２　　５１５　　　ＮＤ　　　　２１５
大ｕ１菌０８５：Ｈ９２／８　　１／８　　２／８５Ｌ
Ｑ１．体が細菌内毒素を中和する効力を上記と同じ動物
モデルにおいて証明した。中和実験には大腸菌Ｊ５変異
株０１１１からの精製内毒素をリスト・ラボラトリーズ
（カンイル、ＣＡ）から得た。マウスにおけるＬＤ、。
値は０．２５ダ／マ９スであり、ＬＤｌｏｏは０．５０
Ｍ９／マウスであると判定された。
内毒素攻撃の２４時間前にマウスにＸＭＭＥＮ−ＯＥ５
抗体５ｏｏｐｙ　Ｃ４０ｍ９７に９）または対照食塩液
を腹腔的注射した。その結果は第５図に示すように抗体
処理したマウス１２／１７匹（７１％）がＬＤ郭のＦ’
３ｍ素攻撃に際し生存しく対照マウスなしでは７／１７
匹（４１％）であった）、さらに抗体処理したマウス５
／１７匹（２９％）がＬＤｌｏｏの内毒素攻撃に際し生
存した（対照マウスでは３／１７匹（１８％）であった
）。これらの所見は受動防御試験においてＸＭＭＥＮ−
ＯＥ５抗体がＬＤ、ｏの内毒素攻撃後に生存率を有意に
高めることを示す。さらにこの防御効果は投与される内
毒素攻撃後量に依存すると思われる。これらの結果を以
下に示す。
表　　６ 攻撃　　　　生存 ＸＭＭＥＮ−ＱＥ５　　　　対照 ０．２５■　１２／１７　　　７／１７スに投与された
標準的な抗生物質療法と組合わせたＸＭＭＥＮ−ＯＥ５
抗体の治療効力を評価するために下記の一連の実験を行
った。
α）予備実験 予備実験においては、雌ＣＤ−１マウスに緑膿菌３６３
２株（１，６ｘ　１０”個／マウｘ　）　ヲ注Ｈｔ。
た。攻ｇ＆面後にマウスに抗生物質を単独で、または杭
内毒素抗体と組合わせて筋肉内投与した。抗生物質療法
はアマ力シン１．５６ｍｑ／マウスオヨヒセフオ・くラ
ゾンＩＺ、５Ｊｎ９／マウスの１回投与からなっていた
。攻撃の３時間後に、マ９スにＸＭＭＥＮ−Ｑｆｆ５（
２０■／に９）０．４ダまたは対照食塩液を静脈内投与
した。この実験の結果、抗生物質を単独投与したマウス
５／１５匹に対し、抗生物質プラス抗内毒素抗体を投与
した７９ス１１／１５匹が生存したことが証明てれた（
Ｐ−０，０２、フィッシャーの厳正試験（Ｆｉｓｈｔｔ
ｒ’ｓ　ｅｘａｃｔ　ｔｅｓｔ）による〕。
ｂ）抗張療法試験 治療試験を拡張して、他のダラム陰性菌感染症を取入れ
た。上記の実験と同様に、雌ＣＤ−１マ＋７スにＬＤｔ
ｏｏｆｔのダラム鴎注菌の生菌を注射した。
これらのインキュベーションの２時間後に抗生物質また
は対照食塩液を筋肉内注射した。Ｆｒ１１記４種の菌株
は抗生物質に対する感受性が異なるので、下記の計算哲
の抗生物質を用いた（■／マウス）。
大腸菌０１４に７　　　　０．３　　　　　０．０１５
大賜ｆＡ０４に１２　　　　　０．８　　　　　０．２
大腸菌０８５１１９　　　　　０．９　　　　　　０．
０１５緑Ｉ１ｇＩ！菌３６３２　　　　　１２．５　　
　　　　１．６ダラムは性菌接種の４時間後、３よび抗
生物質療法の２時間後１（、−ｒｒ７スにＸＭＭＥＮ−
ＯＥ５抗体または対照食塩液を静脈内注射した。上記４
櫨のダラム陰性菌それぞｎにつき、５群のマウスすべて
に下記の一連の処置を行った。致死率の評価は初回°接
種の４８８時間後行った。
１ｎ”、ＬＤ、ｏｏの細菌十組合わせ抗生物質十ＸＭＭ
ＥＮ−ＱＥ５抗体３００１１ｇ。
２群：ＬＤ、ｏ、、の細醒＋組合わせ抗生物質十ＸＭＭ
ＥＮ−ＯＪ５抗体７５μｙ。
３群二ＬＤＫＧｏの細菌十食塩液＋ＸＭＭＮ：Ｎ−０Ｅ
５抗体３００μｇ。
４群：ＬＤ、６ｇの細菌十組合わせ抗生物質十食塩液。
５群：ＬＤ、ａｏの細菌十食塩液十食塩液。
Ｃ）拡張試験の結果 効力試験に用いた２５０匹以上のマウスのいずれにも、
また毒性試験において処置した７９ス、ラット、モルモ
ットまたはヒト以外の霊長類のいずれにおいても、有意
の毒性は生じなかった。
効力実験には、内毒素−Ｗ！覆した培養ウェルへのＥＸ
Ａ結合を証明できたＸＭＭＥＮ−ＯＥ５抗体のロットを
用いた。これらの試験（表７に示す）は、抗生物質単独
の場合と比較した場合、より多量のＸＭＭＥＮ−ＯＥ５
抗体を抗生物質と共に投与したマウスの方がより高い生
存率を示した。
表　　　７ ＸＭＭＥＮ−ＯＨ２３００４８時間生存μｙ ２、抗生物質　　　　　　　　　２８１５６（５０％）
ＸＭＭＥＮ−ＯＨ２７５４８時間生存 Ｊ ３、ＸＭＭＥＮ−ＯＨ２３００１６１５６（２９％）２
ｇ　対照食塩液　　　　　４８時間生存４、抗生物質　
　　　　　　　　２５１５６　（４５％）対照食塩液　
　　　　　　　４８時間生存５、対照食塩液　　　　　
　　　１６１５６　（２９％）対照食塩液　　　　　　
　　４８時間生存破験グラム陰性菌４種のうち、最小の
効力は大腸菌０１４に７に対して認められた。他方、Ｘ
ＭＭＥＮ−ＯＨ２３００μＪ十組合わせ抗生物質療法は
、攻撃が残り３橿の菌−一緑膿菌３６３２、大腸菌ＯＢ
Ｈ５９、′１には大腸菌０４に１２−一のいずれかによ
るものである場合に最高の生存率を伴った（表８参照）
。
５、効力試験のまとめ： これらの実験に用いた実験動物モデル本来の変数の数が
著しいにもかかわらず、ＸＭＭＥＮ−ＯＥ５抗体は１）
数Ｕのダラム陰性菌に対して有意の防御′（ｆ−与え、
２）致死量の精製内毒素を用量に依存した様式で中和し
、かつ３）設定されたダラム陰性感染症の治療に際して
慣用される抗生物質に対するアジュバントとして適度の
効力をもつことが示された。
ハイブリドーマＸＭＭＥＮ−ＯＡ’５　ｒこより産生し
１こ単クローン抗体の７エイズ■臨床試験で得た初期的
なデータを以下に報告する。
１、最初の患者（Ｆ、Ｅ、）はダラム陰性敗血症の疑い
がある６０才の男性であった。この患者はＸＭＭＥＮ−
ＯＥ：５抗体０．１■／にｇ（総＠８．５■）を静脈内
に１時間にわたって投与された。投与は有害な作用をも
１こらさなかった。その後の血液培養によりこの患者は
グラム１寝性菌血症を伴うのではなく、トルロプシス稿
菌による激しい真菌血症を伴うことが証明された。この
真菌性敗血症は外科的に排除され、患者は抗体投与の３
週間経過後も安定した状態を維持した。
２、第２の患者（Ｔ、Ｇ、）は証明済みのグラム陰性菌
血症および腎孟腎炎（尿管閉塞から派生したもの）を伴
う５７オの女性であった。この患者は外科的腎フイステ
ル形成術金受けた状態にあり、０．５８り／に９（総量
３６■）のＸＩＶ！ｙｌＥＮ　−ＯＥ　５抗体を静脈内
にＩＫ待時間わたって投与された。投与は有害な作用ケ
もたらさず、急速に熱が下がり、注入の１２時間経過後
も無熱であった。患者の熱が速やかに下がったのは抗体
の投与によるものであろう。
３、第３の患者Ｃ，に、Ｓ、）は重症の冠動脈性疾患を
伴う６０才の女性であり、非持続性狭心症（ａｎｇｉｎ
α）が認められた。患者は冠動脈バイパス形成術を受け
、こｎが一退性の急性腎不全の発症を併発していた。患
者は手′＃後に１０２．８７（３９，３℃）の発熱を生
じ、その後血液からアシネトバクタ−属菌（Ａｃｉｎｇ
ｔｏｂａｃｔｔｔｒ）が培養で観祭をれた。投生物質の
投与が開始され、手術の１０日後にＸＭＭＥＮ−ＯＥ５
抗体０．５　ｍｇ／　／Ｇｌ？　（ｔ＝ｔ４２ｍ９）が
静脈内に１イ時間にわたって投与された。抗生物質およ
び杭内毒素抗体療法に伴って血液培養は陰性となり、患
者の状態は着実に改善し、抗体投与の１週間後も安定し
た状態を維持した。
４、第４の患者（Ｓ、Ｄ、）は病因不明の持続性ダラム
陰性菌血症（タレブシエラ嬌、ＫＬｅｂｓｉｅＬｌａ　
）を伴う６０才の女性であった。徹底的な調査によって
も感染源が明らかにならなかったが、尿の異常から腎孟
腎炎が最も可能性のある原因であると思われた。入院３
日目に、抗生物質療法にもかかわらず血液培養で再びク
レブシェラＪ＝Ｊ［が増殖した。そして１０４．５７（
４０，３℃）に及ぶ急激な発熱を生じた。膿瘍の位置を
見出して排除することにより患者の臨床状態の改善を試
みつるであろうという希望をもって、身体の緊急ＣＴス
キャンが行われた。膿瘍その他の感染部位は見出されな
かった。そこでＸＭＭＥＮ−０Ｅ５単クロ一ン抗体２Ｉ
ＩＩｇ／／ｃ９（ａｆｃｘ　ｓ　７ｑ）を静脈内に２に
時間にわたって投与することにより治療した。注入の１
２時間後に体温が１００″Ｆ（３７，８℃）以下となっ
た。七〇で抗生物質療法を異なる組合わせの薬剤に変更
し、その後血液培養は陰性になった。
患者は抗体療法の４日後も改善された状態を維持した。
実施例２゜ ハイブリドーマＸＭＭＥＮ−Ｊ５Ｄ Ａ、ＸＭＭＥＮ−Ｊ５Ｄハイブリドーマの調製Ｐ６３Ａ
ｆ８．６５３の代わりに親の骨髄ｍ細胞系ＳＰ２，１Ｏ
−Ａｆ１４を用いた点板外は前記のハイブリドーマのプ
ロトコールを採用して、第２のクロー　７　（ＸＭＭＥ
Ｎ−Ｊ　５　Ｄ　トに示されル）ｔｌ−ｖ！４製した。
これは前記の方法により免疫グロブリン亜群ＩｆＧ２α
であると判定された単クローン抗体を持続的に分泌する
ことが認められた。ハイブリドーマＸＭＭＥＮ−１５Ｄ
は１９８６年４月２４日にＡ。
Ｔ、　Ｃ，Ｃ，に寄託され、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，寄託番号
ＨＥ９０８３を与えられた。
生菌を普通食塩液中に１．５Ｘ１０’個／Ｍとなるよう
に調整した。平底ポリビニルプレートにこの懸濁液５０
μｔ／培養ワエルを塗布し、欠いで２０００　Ｘｐで３
０分間遠心分離した。４レツト化した菌体を、１５０μ
ｔ／培養ウエルの０．２５％グルタルアルデヒド／ＰＢ
Ｓを室温で１５分間添加することにより固定した。上清
液を廃棄し、次いでプレートをＰＢＳで洗浄したのち１
００μｔ／培養ウェルの０．１％ゼラチン／　Ｐ　Ｂ　
Ｓの６５万口により一投ブロックした。
プレートを丹び洗浄し、１００μｔ／培養クエルの親和
法により精製したＸＭＭＥＮ−Ｊ５Ｄ　　ＭｏＡｂ（１
Ｎ１／１！Ｌｔ）を塗布抗原と室温で１時間反応させた
。ＦＥＢ洗浄ののちヤギ抗マヮスＩｆＧ−パーオキシダ
ーゼ結合体（１００μｔ／培養ウエル）を室温で１時間
反応させた。最終洗浄ののち、ＡＥＴＳ基質を添加しく
１００μｔ／培養ウエル）、室温で４５分間反応させ、
４０５　ｎｍにおける吸光度をタイターチック・エリザ
胱取器（フロー、ラボズ。
マレリーン、ＶＡ）により記録した。結果全表９ＶＣま
とめる。
細　　菌　　　　　　　　　　吸光度＠４０５％ｆｉ表
　９　（続） （Ｐ−ｐ％ｔｉｄａ） 表　９　（続） 細　　菌　　　　　　　　　　吸光度０４０５％ｍ緑膿
菌　ＰＡＣｔＲ１，１７” 緑膿菌　ＰＡＣ５５７１，２５” 緑膿菌　ＰＡＣ６０５３，１２” 緑膿菌　フィッシャータイプ２　　　　　０．２１緑膿
菌　　フィッシャータイプ４　　　　　０．１４緑膿菌
　フィッシャータイプ６　　　　　０．４７”表　９　
（続） す４１９４ 大腸菌　０１４：に７　　　　　　　　０．１２大腸＠
　　０４：に１２　　　　　　　　０．２７大腸菌　０
９：に５７：Ｈ３２０，２１大腸菌　０１１３：に７５
　　　　　　０．１０大腸菌　Ｊ５−ＲＲ３，２５゜ 大腸菌　０８５：ｆｆ９　　　　　　　　０．０５アシ
ネトバクタ−・カルコアセ　　　　０．０９チカスナ７
７１１ 緑膿菌　フィッシャータイプ１　　　　　０．２０緑膿
菌　フィッシャータイプ３　　　　　０．１９緑膿菌　
フィッシャータイプ７　　　　　０．１ル−ドナ３６３
２ 憂　バックグラウンドよりも明らかに陽性精製抗原調製
物を０．０５％トリエチルアミン／Ｈ，Ｏまたは０．０
５　Ｍ−Ｍｇ　Ｃ１ｔ／　Ｆ　Ｂ　！ｌ　Ｋ希釈して２
５μｔ／−となし、溶解性が結果に影響を与えるか否か
を調べた。これらの抗原１００μｌ培養ウエルを、培養
ウェル９６個の平底ポリスチレンＥＸＡプレート上に塗
布した。室温で一夜インキユベートしたのち、プレート
を０．０１　Ｍ−ＰＢｌｌ中の０．１θ％ゼラチンで３
７℃において２時間ブロックし、次いで０．０１Ｍ−Ｐ
ＢＳで洗浄した。
親和法により精製したＸＭＭＥＮ−Ｊ５Ｄ　ＭｏＡｂを
０．１０％ゼラチン１ＰＢＳ中に希釈して１０μＶｄと
なし、塗布した抗原と室温で１時間反応させた。プレー
トを洗浄し、１００μｔ／培養ウエルのヤギ抗マウスＩ
ｇＧ−パーオキシダーゼ結合体を抗原と共に室温で１時
間インキュベートした。
再度洗浄工程を行ったのち１００μν培養ウエルの基質
、２，２′−アジノージ−（３−エチル−ベンゾチアゾ
リンスルホネート（６１）（ＡＢｒＳ）の添加により陽
性の反応体を検出した。４５分間発色を進行させ、光学
濃度（０，Ｄ、）を４０５％偽で記碌した。結果を表１
０にまとめる。
表　　　１０　（続） 大腸菌（リスト・バイオロジカルより）大腸菌（リスト
・バイオロジカルより）緑膿菌フィッシャーｌ（バーク
−ディビス社より）緑膿菌フィッシャー２（バーク−デ
ィビス社よす）緑膿菌フィッシャー３（バーク−ディビ
ス社より）緑ＭＡ菌フィッシャー４（バーク−ディビス
社より）緑膿菌フィッシャー５（バーク−ディビス社よ
り）緑膿菌フィッシャー６（バーク−ディビス社より）
緑膿菌フィッシャー７（バーク−ディビス社より）０．
０４　　　　　　　　　　　　　　０．１１０．１６　
　　　　　　　　　　　　０．０８０．０５　　　　　
　　　　　　　　０．０３０．００　　　　　　　　　
　　　　０．０２０．０３　　　　　　　　　　　　　
０．０２０．０７　　　　　　　　　　　　　　０．０
５（１０５０，０４ ０，０００，０３ ０、θ６　　　　　　　　　　　　　　０．０３０．０
０　　　　　　　　　　　　　　０．０３０．００　　
　　　　　　　　　　　　０．０３０．００　　　　　
　　　　　　　　　０．０３０．０２　　　　　　　　
　　　　　　０．０１Ｃ，ＸＭＭＥＮ−Ｊ５Ｄ　ＭｏＡ
ｂイムノドツト血清学的検査 抗原を０．２０μへ硝酸セルロース膜（ザートリウス）
Ｋｌμｔの”ドツト”として施し、５分間風乾した（用
いた濃度は精製ＬＰ８１００μｔ／１１１７！・ＰＥＦ
Ｉであった）。次いでこの抗原をスポットした膜をゼラ
チン（ディフコ、デトロイト、ＭＩ）の１％溶液（ｖ／
ｖ−ＰＢｓ）Ｋより室温で３０分間ブロックした。速や
かに（１分間ずつ２回）洗浄したのち、ＸＭＭＥＮ−Ｊ
Ｄ５抗体（２〜５μｆ／−・ＰＢＳ）を上記の膜と共に
室温で３０分間インキュベートした。膜を速やかにＰＥ
Ｓで３回洗浄し、次いでヤギ抗マウスＩｇＧ−パーオキ
シダーゼ結合体（カッペル、マルバーン、ＰＡ）と共に
室温で３０分間インキュベートした。膜をＰＢＳで３〜
４回洗浄したのち、基質（４−クロル−１−ナフトール
、シグマ・ケミカル社、セントルイス、ＭＯ）を膜と共
に室温でインキュベートした。陽性の反応は通常は２〜
５分間で紫色のドツトとして現われ、視覚的に４＋（き
わめて強い）〜１＋（弱い）とグレード評価された。結
果を表１１にまとめる。
抗　　原　　　　　　　　　　　　反応サルモネラ・ミ
ネソタＲ６０ＣＲｓ）　　　　　　　３＋サルモネラ・
ミネソタＲ３４５（Ｒ６）　　　　　　３＋大腸菌　　
ＣＥａ　）　　　　　　　　　　　　　１　＋サルモネ
ラ・ミネソタＲ７（Ｒｄ）　　　　　　　　−サルモネ
ラ・ミネンタＲ５９５（Ｒｃ）　　　　　　−緑膿＠　
　　ＰＡＣ６０５− 緑膿菌フィッシャータイプ１　　　　　　　　−クレブ
シェラ・ニューモニア　　　　　　　　−アシネトバク
ター・カルコアセチカス　　　　−緑膿ｍＰＡＣ６０５
ＬＰＳおよびアシネトバクタ−・カルコアセチカスＬＰ
Ｓはダーバーらのジエイ、パクテ、　（Ｊ、Ｂａａｔｇ
）（１９８３）１５５　：８３１により精製された。他
のＬＰＳ調製物はすべてリストーバイオロジカルズ（カ
ンベル、ＣＡ）から購入された。
１．攻撃実験：　ＣＤ−１雌マウスに生菌による腹腔内
攻撃の２４時間前に単クローン抗体１５０μ２を腹腔内
注射した。結果を表１２にまとめる０緑膿菌フイツシヤ
ー１　　　２１５　　１１５　　１１５緑膿菌フイツシ
ヤー２°　　３１５　　４１５　　１１５緑膿菌フイツ
シヤー３　　　０１５　　０１５　　０１５緑膿菌フイ
ツシヤー、ｉ　　　　５１５　　４１５　　１１５大腸
菌０４に１２　　　　　４１５　　５１５　　１１５大
腸菌０１４に７　　　　　１／１０　１１５　０１５大
Ｂｍ０８５　　二Ｈ９３１５−θ１５大腸菌０８５：Ｈ
９−３１５２１５ （螢　３６３２株） 実施例３゜ ハイブリドーマＸＭＭＩ’ｌ−６０５ Ａ、ＸＭＭＰＳ−６０５ハイブリドーマの調製ニュージ
ーランドブラックマウス（ジャクソン・ラボラトリーズ
・パーハーバ−１ＭＥ）ｆコンプリート・フロインズ・
アジュバント（ディフコ・ラボラトリーズ、デトロイト
、Ｍｌ）中の緑膿菌ｐＡｃ　　６０５株のホルマリン死
ＵＩＸＩＯ’個で免疫処理した。ＰＡＣ６０５（ＰＡＣ
ＩＲ株のバタテリオファージ討性変異株）のＬＰＳは、
ドデシルＪｒｉ酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル
電気泳動にＤＢ−ＰＡＧＥ）分析（ミードら、ジャーナ
ル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（１９８
４）１３０：６３１−６４４）により示されるように外
側のＯ−特異性側鎖が欠如し、コアＬＰＳ（リビドＡお
よびコア少糖類）のみからなる。初回免疫処理ののち、
マウスをＯ−％異性側鎖が欠如したホルマリン死緑膿菌
ｌＸｌ０’個の腹腔内注射によりブースター処理した。
最後の抗原ブースター処理の４日後に、免疫処理マウス
から膵臓細胞を無菌的に取出した。他に概説された方法
（セント、ダロス、ジエイ、イム７　、　）ｔ　：／　
、　（Ｊ、Ｉｍｕｎｏ、Ｍｅｔｈ、）（１９０８）３５
　：ｌに従って５Ｘ１０’個の膵臓細胞を同数の５Ｐ２
１０−ＡＧ１４、すなわちバルブ／Ｃ由釆の非分調型マ
ウス骨髄１庫細胞系（アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションズ、ロックビル、ＡｆＤ）ト、ポリエチ
レングリコール４０００を用いて融合させた。培養ウェ
ル９６個の培養プレート（コースタ−、ケンブリッジ、
ＭＡ、＋３５９６）中の、正常ニューシーラントブラッ
ク胸腺細胞のフィーダー八４と予備インキュベートした
培地（ｉ胞Ｉ　Ｘ　１０’個／培養ウェル、融合の１日
前）上にハイブリッド細胞な乗せた。細胞は３７℃で１
０％ＣＯ７の雰囲気に２いて下記の培養中で最初のｚ３
１！ｌｉ間培養された。ダルベツコの改良イーグル培地
（グルタミンを含む）、およびグルコース４．．５１／
ｌ（ギブコ・サンタ・クララ、ＣＡ）、ウシ給仕血清（
１０％）（マイクロバイオロジカル・アンシエーツ・ウ
ォーカースピル、ＭＤ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｙ
ｌＬＡｆ）（ギブコ、サンタクララ、ＣＡ、＋３２０−
１３６０）、ベニシリア　（５０ｐ／ｍ）−ストレフト
マイシン（５０μ／［）（ギブコ、サンタクララ、ＣＡ
、φ６００−５０７０）、およびヒポキサンチン−アミ
ノブチリ／−チミジン（ＨＡ７’）（１，０％ｙ／ｙ（
１００Ｘ）ヒポキサンチン−チミジン補充材料（マイク
ロバイオロジカル・アソシエーツ、ウォーカースピル、
ＭＤ、す１７−７８２Ａ）を０．０４　ｍＭアミノプテ
リン（シグマ・ケミカル社、セントルイス、ＭＯ）と合
わせて用いることにより調製〕。定期的な維持のための
培地（融合日２週間以後）はアミノブチリ／を培地に含
まない（ＨＴ培地）点を除いて上記と同じであった。
融合板２週から４週まで、ハイブリッド細胞の培養物を
ＥＸＡ　（実話例２に詳述）′Ｊ６よびイムノドツトア
ッセイ法（実施例２に詳述）により緑膿閑の絹製ＬＰＳ
への抗体結合性につき試験した。
反復試験に際して陽性であった培養物を次いで限界＃ｉ
釈法によりクローニングした。すなわち細胞を培養フェ
ル９６個の組ｇ＆培養プレート（コスタ−、ケンブリッ
ジ、ＭＡ、＋３５９６）中で各培養ウェル当たり１０〜
１個の種々の希釈度で培養した。１個のコロニーのみを
含む培養ウェルを鏡検により確認し、次いでＥＸＡによ
り抗ＰＡＣ６０５活性について試験した。陽性のクロー
ンを培養ウェル２４個の組織培養プレート（コスクー、
ケンブリッジ、ＭＡ、＋３５２４）上に広げ、　再クロ
ーニングし、同じ方法で再試験した。ＸＭＭＰ：Ｓ−６
０５と表示される１種のクローンが持続的に単クローン
抗体を分泌することが見出された。この単クローン抗体
は、標準法による放射免疫拡散法およびラジオイムノア
ッセイ法により免疫グロブリンのＩｆＧ、Ｂ群のもので
あると判定された。
ニュージーランドブラックマ９ス（ジャクリン・ラボラ
トリーズ、バーハーバ−１ＭＥ）ｆ用いてハイブリドー
マを腹腔内培養した。あらかじめ下記の処理を流したマ
ウスに約３Ｘ１０’個のハイブリドーマ細胞を腹腔的注
射した。丁なわち１）　１週間前に０．５　Ｍのブリス
タン（アルドリッチ・ケミカルズ社、ばル９オーキー、
Ｗｌ）ｆ腹腔的注射し、そして２）１日前に２■のシク
ロホス７アミド（アトリア・ラボラトリーズ、コロンフ
ｙ、ＯＨ）を腹腔的注射した。得られた腹水（ハイブリ
ドーマ注射の１１〜１５日後に採取）は放射免疫拡散法
（メロイ（Ｍｇｌｏｙ）、放射拡散、スプリングフィー
ルド、ＶＡ、　　プレートナ、７−３０７）により測定
して平均５■／１１ｔの抗ＰＡＣ６０５抗体を金石して
いた。これは１７９ス免疫グロブリン用定量免疫拡散プ
レート”と題するメロイ説明書に示された方法に従って
行われた。これを参考として引用する。
腹水中の抗体は蛋白質Ａセファロースｃ１−４Ｂカラム
（ファルマシア社、ビスカットアクエイ、ＮＪ）を用い
て、他に記載されるように当業者に周知の方法により精
製された（ジェイ、イムノケミストリー（１９７８）１
５：４２９−４３６）。
免疫グロブリン亜群ＣＩｙＧｔＢ）の測定はイムノドツ
トアッセイ法により、パーオキシダーゼに結合した亜群
特異性抗体（サザーン・バイオテクノロジー・アソシエ
ーツ社、バーミンガム、ＡＬ）’ｉｔ：用いて行われた
。
ハイブリドーマＸＭＭＰＳ−６０５は１９８５年９月２
６日にＡ、Ｔ、Ｃ０Ｃ，に寄託され、Ａ、　Ｔ、　Ｃ，
Ｃ，寄託番号ＨＢ　８９０９を与えられた。
Ｂ、全菌体を用いる酵素結合免役検定（ＥＩＡ）ＸＭＭ
ＰＳ−６０５単クロ一ン抗体の交叉反応性を判定するた
めに、３０株のダラム陰性菌を試験した。これらのη株
の入手先は下記のとおりであった。１）サルモ不う・ミ
ネソタＲ５９５、化学型Ｒｅ、ＫＮＶ株はドクター・オ
ツトー・ウエストファル（マックス・ブランク免疫学研
究所、フライブルク、西ドイツ）から人手され：２）緑
ｐａ岨インターナショナルタイプ、大腸菌血清型０５５
：５５２よび０２６：Ｂ６はアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ−）から購入さ
れ；３）緑膿菌ＰＡＣＩＲ％ＰＡＣ５５７、ＰＡＣ６０
５はボーリン・ミードウ（ロンドン・ユニバーシティ・
カレッジ〕から入手され：４）緑膿菌フィッシャータイ
プ１〜７はドクター・マツチュー・ボラック（ユニフォ
ームド・サービス大学、ペテスダ、ＭＤ　）から供与式
れ；５）大腸菌０１４二に７はエルビン・ネーターおよ
びドクター・エッチ・クイ。ワン（バッファロー小児病
院、二ニーヨーク）から入手され；６）大腸菌０８５　
：　Ｈ９ハ疾病コントロールセンター（アトランタ、Ｇ
Ａ）から入手され；７）大腸菌Ｊ５ラフ変異株はドクタ
ー・アブラハム・ブロイデ（カリ７オルニア大学、サン
ディエゴ）から入手され：８〕　残りの菌株はＵＣＬＡ
医療センターから入手された臨床的に単離されたす’１
７１１．す３６３２、φ４１９４であった。
これらの１ｗＢ１をまずトリブチケース−ソイ寒天（Ｔ
ＥＡ）平板で培養した。細菌細胞を採取し、それらの濃
度を１．５ｘｌ□ａ個／ｃｊ（普通食塩液）に調整した
。濃度は５７０４ｍで測定された菌体懸濁液の吸元度（
光学濃度）により判定された。これらの懸濁液のｓ　ｏ
　ｐｔアリコートを平底ポリビニルプレート（ファルコ
ン・ラボ９エア、オックスナード、ＣＡ、す３９１２　
）の培養フェル上に塗布し、次いで２０００　ｘＧで３
０分間遠心分離した。イレット化した菌体に０．２５％
グルタルアルデヒド／リン酸塩緩衝化食塩液（０，０１
Ｍ、　　ｐＨ７，４、以下ＰＲ３）１５０μｔ／培養ウ
エルの添加により室温で１５分間固定した。上滑液を廃
棄し、プレートをＰＲＥで洗浄し、次いで室温で０．１
％ゼラチンｌＦＥ＆を用いてブロックした。
アッセイの他の部分はＬＰＳを用いたＥＸＡにつき記載
したものと同じであった（実施例３）。
プレートを洗浄し、１００　ｐｔ／培譬ウェルの親和法
により精製したＸＭＭＰＳ−６０５単クローン抗体（１
μｇ／ｒｎｌ　）を室温で１時間、塗布抗原と反応さぜ
た。ＰＢＳ洗浄に続いて、１００μｔ／培養ワエルのヤ
ギ抗マウスＩｆＧ−パーオキシダーゼ結合体を添加し、
室温で１時間反応させた。最終洗浄後に２，２′−アジ
ノージ−（３−二チルーベア１チアゾリンースルホネー
ト）＋６１（ＡＢ７’Ｓ）（べ一リンカー・マンハイム
・バイオケミカルス、インディアナポリス、ＩＮ）基質
を添加した（１００μｔ／培養ウエル）。発色を１５分
分間性さぞ、この時点で４０５　ｒＬｍに３ける吸光度
を前記に従って記録した。
これらのアッセイの結果を表１３に示す。緑）農園およ
びシュードモナス・マルトフイリアのすべての菌株が４
０５　ｎｒｎで有意の吸光を示した（０．３７〜１．６
００．Ｄ、）。被験ダラム陰性菌の他の菌株は有意の反
応性を示さなかった。従って上記の単クローン抗体が反
応性であるリボ多糖類の抗原決定因子は緑膿菌ぢよびシ
ュードモナス・マルトフイリアのすべての菌株に共通で
あるが、他のダラム陰性菌およびグラム陽性菌上には存
在しないことが示される。
（Ｈ：ＩＡ） 吸光度 細菌　　　　　　４０５　ｎｍ 緑膿歯ＰＡＣ１７？　　　　　　　　　　　　　０．７
５０．Ｄ。
緑膿ｒＡＰＡＣ５５７Ｌ６００．Ｄ。
緑膿菌ＰＡＣ６０５Ｌ６０Ｃ）、Ｄ。
緑膿菌フィッシャータイプ１　　　　　　　　０．７３
０−Ｄ。
緑膿菌フィッシャータイプ２　　　　　　　　０．７６
０．Ｄ。
緑膿菌フィッシャータイプ３　　　　　　　　０．７５
０．Ｄ。
ＭＩａ［フィッシャータイプ４１・５２０．Ｄ。
緑膿菌フィッシャータイプ５１・５３０−Ｄ・緑膿菌フ
ィッシャータイ７”６　　　　　　　　０．４１０．Ｄ
。
緑膿菌フィッシャータイ７’７　　　　　　　　０．３
７０．Ｄ。
緑膿菌インターナショナルタイプ３　　　　　１．５７
０．Ｄ。
緑膿菌インターナショナルタイプ４１．５５０．Ｄ。
緑膿菌インターナショナルタイプ９　　　　　１．５３
０．Ｄ。
緑膿菌インターナショナルタイプ１１　　　　１．４７
０．Ｄ。
緑膿菌インターナショナルタイプ１２　　　　　Ｌ５４
０．Ｄ。
緑膿菌インターナショナルタイプ１３　　　　１．６０
　ｏ、ｆ）。
緑膿密インターナショナルタイプ１４　　　　１．５８
０Ｊ）。
緑膿菌インターナショナルタイプ１５　　　　１．５７
０．Ｄ。
シュードモナス・セｔ−、ｕシア　　　　　　　　　０
．０３０．Ｄ。
シュードモナス・ビラケラティ　　　　　　　０．０３
０．Ｄ。
シュードモナス・プチーダ　　　　　　　　　０．０３
０．Ｄ。
シュードモナス・マルトフイリア　　　　　　１，３４
０．Ｄ。
ｖルーｖ−ネーｙ−ミ不ンｐ　　Ｒ５９ｓ　　　　　　
　ｏ、ｏｚｏ、ｎ。
大腸菌Ｊ　５　　　　　　　　　　　　　　　　０．０
２０．Ｄ。
大腸菌０１４：ｆ７　　　　　　　　　　　　０．０１
０．Ｄ。
大腸菌０１４　：Ｒ３１０，０２０，Ｄ。
大腸１ｆｉｌｉ０８５　：　Ｒ９０，０００，Ｄ。
エンテロバクタ−・クロアシア　　　　　　　０．ＯＺ
　Ｏ，Ｄ。
セーｙ＋ア・マーセラセンス　　　　　　　　　０．　
ＯＯＯ，Ｄ。
肺炎杆菌　　　　　　　　　　　　　　０．０１０．Ｄ
。
表２に挙げた細菌からの精製リボ多糖類抽出液合計２４
種を用いて、抗ＰＡＣ６０５単クロ一ン抗体ＸＭＭＰＳ
−６０５の交叉反応性の程度を判定した。緑膿菌ＰＡＣ
６０５のｒ、ｐｓ、　　およびアシネトバクタ−・カル
コアセチカス（ＵＣＬＡ臨床単離菌体す７４７１）のＬ
ＰＳは文献発表の方法（ター−バーら、ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジ−（１９８３）１５５：８３１；参
考として引用する）に従って細菌外膜から抽出された。
緑膿菌フィッシャータイプ１〜７からのｆｌ夷ＬＰＳは
パーク・ディビス社（デトロイト、Ｍｌ）から入手嘔れ
、他の精製抗原はリスト・バイオケミカルス（カンイル
、ＣＡ）から購入された。
これらの１５製抗原を、トリエチルアミン０．５％を含
有アろ水に希釈して２５μ／／１となした。これらの抗
原１００μｔ／培養ウエルを培養ウニＡ・９６個ＥＸＡ
プレート（コスタ−、ケンブリッジ、ＭＡ、＋３５９０
）に塗布した。室温で一夜インキユペートしたのち、プ
レートをＰＥＳ中０．１％の試薬用ゼラチン（ディフコ
社、デトロイト、Ｍｌ）により３７℃で２時間ブロック
した。この工程は抗体がポリスチレン壁に非特異的に結
合するのを防止するために必須である。次いでプレート
をＰＢＳで１回洗浄した。
実施例１の指示に従って親和法によりＳ製した単クロー
ン抗体ＸＩＩＭＰＳ　−６０５をＰＥＳ中の０．１％の
ゼラチンに希釈して５μ＆／Ｍｌとなし、塗布抗原と共
に室温で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄したのち
、第２抗体（ヤギ抗マクスＩｆＧ−パーオキシダーゼ結
合体（カッイル、マルパーン、ＦＡ、す０６００−３１
６１））を反応フェルに添加し、室温で１時間反応させ
た。次いでプレートを再びＰＢＳで３回洗浄した。陽性
の反応はＡＢ’ｒ；（ベーリンガー・マンハイム・バイ
オケミカルズ、インディアナポリス、ＩＮ）の添加によ
り検出された。この基質はまず０．１Ｍクエン酸塩緩衝
液（ｐＨ＋。５）中のＡＢＴＳ２０１１４９／νの原液
を製造し、次いでこの溶液をクエン酸塩緩衝液中１：５
０に希釈し、これに３０％過酸化水素ｌ：１０００希釈
液を添加することにより調製された。
発色を１５分分間性させ、４０５　ｎｍにおける吸光度
をタイターチック・エリザ読取器（フロー・ラボズ、マ
クリーン、７Ａ）で読取った。これらのアッセイの結果
を表２に示す。これはＸＭＭＰＳ−６０５抗体が、広範
なダラム陰性菌からのＬＰＳに対する試験の結果、緑膿
菌およびシュードモナス・マルトフイリアからのＬＰＳ
のみに対して結合することを示している。緑膿菌のフィ
ッシャー株７種類すべて、およびＰＡＣ６０５からのＬ
ＰＥＩは吸光を示した（０．７８〜１．０６の範囲のＯ
，Ｄ、）。
他の被験ダラム陰性歯からのＬＰＳは有意の吸光度を示
さなかった。
これらのアッセイの結果を表１４に示す。そこに示すよ
うに、ＸＭＭＩ”；−６０５はすべてのフィッシャー菌
株群の緑膿菌に結合する。これは比較的高い吸光度によ
り示される。他の被験菌種からのＬＰＳ　（精製コア領
域ＬＰＳ調製物を含む）はいずれも有意の吸光を示さな
かった。
表　１４　酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＸＡ）によ
り測定したリポ多糖類（ＬＰＥＩ）吸光度 緑膿菌ＰＡＣ６０５”　　　　　　　　　　　０．７８
０．Ｄ。
緑膿菌フィッシャー１　　　　　　　　　　　１．０１
０．Ｄ。
緑１］１ｍフイツシ’ｒ−２１，０５０，Ｄ。
緑膿菌フィッシャー３　　　　　　　　　　　１．Ｑ　
６　Ｑ、Ｄ。
緑膿菌フィッシャー４　　　　　　　　　　　０．９５
０．Ｄ。
緑膿菌フィッシャー５　　　　　　　　　　　０．８６
０．Ｄ。
緑ａ菌フイ）’／−Ｙ−６０，８６０，Ｄ。
緑ｗＡ菌フイツシ’ｒ　−７０，９５０，Ｄ。
サルモネラ・ミ不ンタ・ワイルドタイプ　　　０．０２
０．Ｄ。
サルモネラ・ミネソタＲ６０（Ｒα）　”　　　　　０
．０２０．Ｄ。
傘 サルモネラ・ミネソタＲ３４５ＣＲｂ’）　　　　　　
０．０８０−Ｄ。
サルモネラ・ミネンタＲ５（ＲＣ）　”　　　　　　０
．０１０．Ｄ。
サルモネラ・ミネソタＲ７ＣＲｄ）”　　　　　　０．
０３０．Ｄ。
率 サルモネラ・ミネソタＲ５９５（Ｒｇ　）　　　　　０
．０１０．Ｄ。
大腸菌Ｊ５（ＲＣ）　　　　　　　　　　　　　　０．
０５υ、Ｄ。
大腸菌に２３５　　　　　　　　　　　　　　０．００
０．Ｄ。
大腸菌０１１：Ｂ４　　　　　　　　　　　０．０００
．Ｄ。
大腸菌０５５：Ｂ５　　　　　　　　　　　　０．００
０Ｊ）。
大腸菌０２６：Ｂ６　　　　　　　　　　　０．０００
Ｊ）。
大腸菌０１２７　：　Ｂ８　　　　　　　　　　０．Ｏ
ＯＯ，Ｄ。
大腸菌に１２　　　　　　　　　　　　　　　０．ＯＩ
Ｏ，Ｄ。
肺炎杆菌　　　　　　　　　　　　　　０．０４０．Ｄ
。
セラチア・マーセラセンス　　　　　　　　　０．０１
０．Ｄ。
アシネトバクタ−・カルコアセチカス　　　　０．００
０．Ｄ。
申　アッセイに用いたＬＰＳは〇−側鎖を表現しない変
異株から単離されたコア領域の調製物であった。
セイ 精製ＬＰＥ；　（１００μｆ／／Ｎ、　Ｐ＃ｌ　）を硝
酸セルロース膜（０，２０μｍ１ザートリウス、ヘイワ
ード、ＣＡ、÷１１３０７）１μｔの”ドツト”として
施し、数分間風乾した。次いで膜をＰＢＳ中の１．０％
試薬級ゼラチン中で室温において３０分間ブロックした
。迅速室温アッセイの残りの部分は下記のように行われ
た。すなわち抗原処理した膜を培養土清液（ＸＭＭＰ；
−６０５単クロ一ン抗体を含有する）に３０分間浸漬し
たのちＦＥＢ洗浄し：ヤギ抗マウスＩｆＧ−パーオキシ
ダーゼ結合体に３０分間浸漬し：次いでＰＢＳ洗浄し：
紫色の陽性の°ドツト０を発色さぜるための基質である
４−クロル−１−ナフトール（シグマ・ケミカル社、セ
ント・ルイス、Ｎｏ）に浸漬した。陽性反応は通常は５
分以内に生じた。基質の調製法は下記のとおりである。
すなわち４−クロル−１−ナフトールをメタノール中の
０．３％原１ｆｉ、ＣＷ／Ｖ）として調製し、欠いで０
−０１Ｍ０−０ｌに１＝５に希釈し、これに３０％過酸
化水素の１　：　１０００希釈液を添加した。
４＋（濃い色）〜１＋（薄い色）の尺度によりドツトを
陽性反応につき視覚的に採点した。表１５に提示したデ
ータにより示されるように、フィッシャー血清型の緑膿
歯すべてからのＬＰＳが陽性の反応（２＋または３＋）
を与え、ＸＭＭＰＳ−６０５抗体が結合したことを示し
たが、他の菌からのＬＰＳ試料は職別できる色を与えず
、ＸＭＭＰＳ−６０５抗体が結合しなかったことを示し
た。
表　１５　　′！ｆＩ製リボ多糖類へのＸＭＭＩＳ−６
０５緑膿菌ＰＡＣ６０５”　　　　　　　　　　　２＋
緑膿菌フイツシヤー１　　　　　　　　　３＋緑膿菌フ
イツシヤー２　　　　　　　　　３＋縁ｍ菌フィッシャ
ー３　　　　　　　　　３＋緑膿菌フイツシヤー４　　
　　　　　　　３＋緑ＰＪＡ−フィッシャー５　　　　
　　　　　３＋緑ｍ−フィッシャー６　　　　　　　　
　３＋緑膿菌フイツシヤー７　　　　　　　　　３＋サ
ルモ不う・ミネソタＥ６０（Ｒａ）”　　　　　−サル
モネラ・ミネノタＲ３４５（Ｒｂ）＊　　　　　−サル
モネラ・ミ不ンタＲ７（Ｒｄ）”　　　　　　−サルモ
ネラ・ミネソタＲ５９５（Ｒｇ）”大腸菌Ｊ　５　（Ｒ
ｅ）　　　　　　　　　　　　　−大腸菌０５５：Ｂ５
　　　　　　　　　　　−肺炎杆菌　　　　　　　　　
　　　　　　　−アシネトバクタ−・カルコアセチカス
　　　−拳　アッセイに用いたＬＰＳは〇−側鎖を発現
しない変異株から単離されたコア領域の調製物であった
。
５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルからニトロセルロースシート（ザ
ートリウス膜）への分離され細胞ｍ解された全菌体およ
びリボ多糖類成分の電気泳動による移行を夕９ビンらの
方法プロシーデングス・オブ・ナショナル・アカデミー
オブ・サイエンス・ニー・ニス・ニー（１９７９）７６
　：　４３０−４３５４により行った。トリス２５　ｒ
ｎＭ、グリシン１９ｒｎＭ（ｐＨ８，３）、２０％（Ｖ
／Ｖ　）メタノールおよび０．２％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを
含有するパイオーラド・トランスプロット電気泳動移行
用セル（バイオ−ラド、リッチセント、ＣＡ）にゲルを
入れた。ニトロセルロースシートはゲルカラシートへ（
７）　像Ｏ移行のためゲル上にアノードに向けて置かれ
た。電気泳動用の定電力電源（ファルマシア社、ビスカ
ットアワエイ、Ｎ、Ｊ、）を用いた電気移行を３００ｍ
Ａで１８時間行った。電気プロッティング後にニトロセ
ルロースを０．０ｌＭＩＪン酸塩緩衝化食塩液（ＰＢＳ
）中で室温において１時間洗浄した。ニトロセルロース
シートまたはストリッフヲ３　回洗浄した。次いでシー
トまたはストリップなＸＭＭＰｕｓ−６０５単クロ一ン
抗体と共にＸＭＭＰＳ−６０５抗体２０μＷ／ＵＣ０，
０１ｈｔ−ｐｓｓ中、ｐＨ７，２）の濃度でインキュベ
ートした。ニトロセルロースシートを１０分間ずつ２回
洗浄し、次いで１：４００ヤギ抗マウスＩｆＧ−パーオ
キシダーゼ結合体（カッイル・ラボラトリーズ、マルバ
ーン、ＦＡ）（Ｆｃ断片持異性）中で１時間インキュベ
ートＬ７’ｃ。ニトロセルロースシートを再び上記のよ
うに３回洗浄し、ニトロセルロースを基質（発色試薬）
４−クロル−１−ナフトールおよび過酸化水素に浸漬す
ることにより、結合したパーオキシダーゼ結合第２抗体
を検出した。
５ＤＳ−ＰＡＧＥに用いた標準品はチトクロームＣ（１
２，４泳動ＫＤ）：チトクロームＣ二景体（２４，８泳
動ＫＤ）：チトクロームＣ三量体（３７，２泳動ＫＤ）
：チトクロームＣ四量体（４９，６泳動ＫＤ）：および
チトクロームＣＨＣＸ（７４，４泳動ＫＤ）であった。
′ＷＪ１図はウェスターンイムノプロットによりＸＡｆ
ＭＰＳ　−６０５抗体と結合した緑膿菌全菌体抽出物の
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を示す。
試料は下記のとおりである。
１　　　　　フィッシャー１ ｚ　　　　　フィッシャー２ ３　　　　　フィッシャー３ ４　　　　フィッシャー４ ５　　　　　フィッシャー５ ６　　　　フィッシャー６ ７　　　　　ＰＡＣ６０５ 各試料につき細胞溶解物の低分子量成分に対する結合〔
約１２キロダルトン（ＫＤ）まで泳動゛〕が示された。
第２図はウェスターン・イムノプロットによる緑膿歯す
ポ多塘類とＸＭＭＰＳ−６０５抗体の結合物の５ＤＳ−
ＰＡＧＥ分析を示す。試料は下記のとおりである。
Ｉ　　　　　　ＰＡＣ６０５ＬＰＳ ２　　　　　フィッシャーＩ　　ＬＰ：！；３　　　　
　フィッシャー２　　ＬＰＳ４　　　　　フィッシャー
４　　ＬＰＳ第２図は全菌体溶解物を用いて得たものと
同様な結合パターンを示し、結合が１２ＫＤ領域の低分
子量成分に対して行われている。従って試験したすべて
のフィッシャー血ｆｆ＃型についてＸＭＭＰＳ−６０５
抗体が選択的に結合する共通のＬＰＳ成分があることが
わかる。第１図のレーン７２よび第２図のレーン１もＸ
ＭＭＰＳ−６０５抗体がフィッシャー株の成分と同様に
泳動するＰＡＣ６０５の成分に結合していることを示し
、これにより１２ＫＤ成分の抗原決定因子が〇−特異性
側鎖ではなくコアリポ多糖類中に存在することを示す。
ＰＡＣ６０５はＯ−特異性側鎖を発現しないからである
。
レムリの方法（ネイチャー（１９７０）　２２７：６８
０）の変法を用いてドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳
動を行った。スラブ（ｇｒａｂ）ゲルは３Ｍトリス−Ｈ
Ｃｌ（分離用緩衝液、ｐＨｓ、ｓ）中の１．６％ビス（
ｈｉｓ）および０．５　Ｍ　）リス−ＨＣ１（ｐＨ６，
８）中の４％アクリルアミド・スタッキング（ｓｔａｃ
ｋｉｎｇ）ゲルを含む１０〜２０％直線アクリルアミド
勾配からなっていた。
文塩液中に懸濁した洗浄生菌（１ｘ１０ｓｏ個／紅）、
および水中の精製リボ多糖類（１■／　ｍｅ　）を、ト
リス−ＨＣｌ　Ｏ，ＩＭ、　ＳＤＳ　２％（Ｗ／Ｖ）、
グリセロール１０％（Ｖ／Ｖ　）、２−メルカプトエタ
ノール１％（Ｖ／Ｖ　）、　　およヒプロムチモールブ
ルー０．０１％を含有する試料緩衝液等量と混合した。
混合物を１００℃の水浴中で１０分間加熱し、３０μｔ
の試料をスラブゲルに施した。電気泳動は３５ｍ４／ゲ
ルにおいてトリス−グリシン緩衝液（ｐＨｓ、ｓ）中で
、ゲルからトラッキング色素が排出されるまで行われた
。
サイ（Ｔａａｉ　）およびフラッシュの感受性銀染色法
（アナリテイ、バイオケミ、　（Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏ
ｅｈｅｒｎ（１９８２）１１９：１１５−１１９）を用
いてポリアクリルアミドゲル中のリボ多糖類を検出した
。電気泳動により分ｇ！された変性全菌体成分なモｌ７
−１＝イ（７）７ナリ、バイオケミ（Ａｎａｌ　、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ）（１９８１）１１７：３０７の銀染色法に
より染色した。
７椋類のフィッシャー皿ｆＷ型の緑膿菌すべてを、宿主
が細因感染症に対抗する特定の観点の免疫応答（たとえ
ば侵入菌体のオプソニン作用８よび食作用）に対してそ
れらが与える影響を判定するためにインビトロで試験し
た。すべての細菌を血液寒天上で一夜増殖させた。純度
に関する視覚検査ののち単ｇ体をブレインノ・−トイン
フユージョンフロス（ＥＥＬマイクロバイオロジー・シ
ステムズ、コツカイスピル、ＭＤ）に移シ、一定の条件
下で振とうしながら３７℃で４時間増殖させた。細菌な
バンクの緩衝塩類溶液（ＨＢＳ；）で２回洗浄し、次い
で濁り度を適宜なマツクファーランド標準液と比較する
ことにより菌体ｌＸｌ０’個／ａの濃度にした。
オブソニン食作用はペックマンＬＳ−２５０液体シンチ
レーション分光元度計（ベックマン・インスツルメンツ
社、フレルトン、ＣＡ）を用いて化学発光アッセイ法に
より測定された。化学発光は細菌を包み込んだのちの白
血球が放出する元である。この反応は暗所で、あらかじ
め暗順応させたポリプロピレン製シンチレーションバイ
アルを用いて行われた。バイアルにはＨＢＳＳ　　０．
９ｒＲｊ、ルミノール（２Ｘ　１０−’Ａｆ）　０．１
紅、３よび希釈したヒト全血０．０７５ｍが入れられた
。バックグラウンドは約１５分間平衡化され、約１５，
０００ＣＰＨに達した。
ヘパリン混合した血液は健康な供血者から得られた。血
液５−にデキストラン（６％）ｌゴを添加した。赤血球
を６０分間沈降させた。上層（好中球を含む）を１００
０　ＸＧで１０分間遠心分離した。残りの赤血球を溶解
させるためにイレットを低張食塩液（０，２２％）に３
０秒間浸漬した。
次いで等容積の１．５４％食塩液を添加して等張性金再
確豆した。好中球をＨｌｊＳ；に懸濁し、最終細胞濃度
をＺＸＩＯ’個／―に調整した。
ＸＭＭＩ＃−６０６抗体を用いて試験した各菌株につき
ＣＰＭ対経過時間（分）のグラフを作成した。表１６に
示した数値は各被験法についての最高ＣＰＭ値を示す。
厳島数値が得られた時間は菌株に応じて異なり、３０〜
８０分であった。これらのデータはフィッシャー１以外
のすべての血清型につき、ＨＥＳＳのみを含有する試料
ａよび混注したヒト血清のみを含有する試料に３いて得
られるものよりもＸＭＭＰＳ−６０５抗体の添加によっ
て食作用が高することを示す。
表１６　オプソニン食作用の′化学発光測定ＸＭＡｆＰ
Ｓ−６０５活性対緑膿菌 最高カウント×１０Ｓ 緑膿菌／’ＡＣ６０５３８３６１３５ 緑ｉ菌フイツシヤ一タイプ１３８３６３６緑Ｇｍフィッ
シャータイプ２　４５　　８５　　１７０緑膿菌フイツ
シヤータイプ３２２６０９８緑膿菌フイツシヤーメイブ
４　　Ｚ２　　３０　　　１２０緑膿菌フイツシヤータ
イプ５　３８　　８２　　１２０緑膿菌フイツシヤータ
イ７”６　３５　　４５　　１１０縁膿菌フイツシヤー
タイフ７　４０　　５０　　１３５ＨＥ：ＳＳ　＝”ン
クの緩衝化塩類溶液ＰＭＳ−プールしたヒト血清 ＸＭＭＰＥｉ　−６０５−ＭｏＡｂ　：　　濃度＝−２
μ＆／１１オブソニン作用３よび食作用により死滅した
菌体の水準を判定する確認法として、細菌致死率の直接
測定を行った。適宜な培地を入れた試験管に３、’ｔ：
ｒｍ　ｍ　９．　ｘ　１　ｎ”　４＆　／　ｍＪ！　９
上ｒド蘭体１．５Ｘ１０’個ｒｔｔｌ　（比率１：１０
）を接種した。試験管を３７℃で水浴中においてインキ
ュベートした。０分、６０分および１２０分で無菌水中
に希釈し、トリプチケースーンイ寒天（ｒＳＡ）平板上
に増殖するコロニー形成単位（ＣＦび）の数を、鏡検下
に計数することにより判定した。この結果から、化学発
光アッセイ法により示されるようにＸＭＭＰＳ　−６０
５抗体のオプソニン活性が確認される。これらの結果を
表１７にまとめる。
Ｈ０予防のためのＸＭＭＰ：ｌ−６０５単クロ一ン抗体
の使用 親和法により精製したＸＭＭＩＳ−６０５単クロ一ン抗
体１５０μｍを４週令のＣＤ−１雌マウス（チャールズ
・リバー・ブリーディング・ラボラトリーズ社、ウィル
ミントン、ＭＡ）に腹腔内注射した。生菌は下記により
調製された。緑膿菌の各菌ａｆプレインハートインフュ
ージョンプロス（ＢＢＬ・マイクロバイオロジー・シス
テムズ、コツカイスピル、ＭＤ）中で３７℃Ｋ＞いて−
夜増殖させた。菌体を無菌食塩液で２回洗浄し、次いで
菌体懸濁液の光学濃度を生菌数の吸光度に関する標準曲
線と比較することにより、約Ｉ　Ｘ　１０＠個／ｍｔ（
食塩液）に調整した。ＸＭＭＰＳ−６０５単クロ一ン抗
体を注射して約１８時間後に、はぼＬ　Ｄ　、ｏｏ斂の
緑膿菌体を被験動物および対照動物（同じプロトコール
に従い処理したが、ＸＭＭＰＳ−６０５を用いなかった
）に腹腔内注射した。あらかじめ行った用量応答試験に
よりＬＤ、６６を判定した。これは１００％のマウスを
死亡させる最小用量と定義される。生存数を４８時間目
に記録した。フィッシャー３および４を約ｌＸｌ０”個
／個体の量で接種された個体についての結果から、ＸＭ
ＭＰＳ−６０５抗体による前処理により細菌感染に対し
生存する能力が高められたことが示される。これらの結
果を表１８にまとめる。
実施例４゜ ハイブリドーマＸＭＭＰＳ−ＯＰＩ Ａ、ＸＭＭＰＳ−ＯＰ１ハイプリドーマの調裂パルプ／
Ｃマウス（チャールズ・リバー、ウイルメントン、ＭＡ
）を緑膿菌フィッシャータイプ１の煮沸菌体ｌＸｌ０”
個で免疫処理した。初回免疫処理ののち煮沸菌体ｌＸｌ
０’個を１か刃間隔で２か月間腹腔内注射することによ
りマウスをブースター処理した。
最終抗原ブースター処理の４日後に、免疫処理マウスか
ら膵臓細胞を無菌的に取出した。他に概説された処理法
（セント・グロス、ジエイ、イムノ、メン、　（Ｊ、　
ｌｍｍ５ｎｏ、　Ｍｏｔｈ−）（１９８０）　３５：１
）に従って、膵臓細胞５Ｘ１０’　個を同数の前記５Ｐ
２１０−ＡＱｌ　４と、ポリエチレングリコール４００
０（メルク・アンド・コ社、ローウェイ、　Ｎ、Ｊ、）
　　を用いて融合させた。ノ・イブリッド細胞を、９６
ウエルの培養プレート（コスタ−、ケンブリッジ、ＨＡ
※３５９６）中の、正常パルプ／Ｃ胸腺細胞のフィーダ
一層と共に予備インキュベートした培地（ＩＸＩＯ’個
／培養ウェル、融合の１日前）に乗せた。細胞は３７℃
で１０％ＣＯ１の雰囲気において下記の培地中で最初の
２週間培養された。ダルベツコの改良イーグル培地（グ
ルタミンを含む）、ならびにグルコース４．５？／ｌ（
ギプコ、サンタ・クララ、ＣＡ、す３２０−１９６５）
、ウシ給仕血清（１０％）（マイクロバイオロジカル・
アソシエーツ、ウォーカービル、ＭＤ）、ピルビン酸ナ
トリウム（１ｓＭ）（ギブコ、サンタ・クララ、ＣＡ、
÷３２０−１３６０）、ペニシリン（５０μ／ＷＩｔ）
・・・ストレプトマイシン（５０μ／ｓｇ）（ギプコ、
サンタ・クララ、ＣＡ１す６００−５０７０）、および
ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）
　［ヒボキサンチン（１０％Ｍ）、チミジン（１，６溝
Ｍ）を０．０４悔Ｍアミノプテリン（シグマ・ケミカル
社、セント・ルイス、ＭＯ）と合わせて用いることによ
り調製〕。定期的な維持のための培地（融合口２週間以
後）は、アミノプテリンを培地に含まない（ＨＴ培地）
点を除いて上記と同じであった。
融合後２週から４週まで、ハイブリッド細胞の培養物を
ＥＩＡにより＠ｐＬＰｓへの抗体結合性を試験した。反
復試験に際して陽性であった培養物を次いで限界希釈法
によりクローニングした。
すなわち細胞を培養ウェル９６個の組織培養プレート（
コスタ−、ケンブリッジ、ＨＡ、す３５９６）中で各培
養ウェル当たり細胞１０〜１個の種々の希釈度で培養し
た。１個のコロニーのみを含む培養ウェルを鏡検により
確認し、次いでＥＸＡにより抗フィッシャータイプｌ活
性について試験した。
陽性のクローンを培養ウェル２４個の組織培養プレート
（コスタ−、ケンブリッジ、ＨＡ、す３５２４）上に拡
げ、再クローニングし、同じ方法で再試験した。ＸＭＭ
ＰＳ−ＯＰｌ　と表示されるクローンが持続的に単クロ
ーン抗体を分泌することが見出された。標準法による放
射免疫拡散法およびＥＸＡにより、この単クローン抗体
は免疫グロブリンのＩｇＧ１群のものであると判定され
た。
パルプ／Ｃマウス（チャールズ・リバー）を用いてハイ
ブリドーマを腹腔内培養した。約３×１０６個のハイプ
リドーマ細胞を、下記のように前処理したマウス、すな
わち１週間前にプリスタン（アルドリッチ・ケミカル社
、ミルクオーキー、Ｗｚ）ｏ、ｓ−を腹腔内注射したマ
ウスに、腹腔内注入した。得られた腹水（ハイブリドー
マ注入の１１−１５日後に採取）は放射免疫拡散法（メ
ロイ、放射免疫拡散、スプリングフィールド、ＶＡ。
プレート÷！−３０４）により測定して平均５〜２０η
／−の抗体を含有していた。
実施例５゜ ハイプリドーマＸＭＭＰＳ−ＯＰ２ バルブ／Ｃマウス（チャールズ・リバー、ウイルメント
ン、ＨＡ）を緑膿菌フィッシャータイプ２の煮沸菌体ｌ
Ｘｌ０”個で免疫処理した。初回免疫処理ののち煮沸菌
体ｌＸｌ０”個を１か刃間隔で２か月間腹腔内注射する
ことによりマウスをブースター処理した。
最終抗原ブースター処理の４日後に、免疫処理マウスか
ら膵臓細胞を無菌的に取出した。他に概説された処理法
（セント・グロス、ジエイ、イムノ、メソ、　（、ｒ、
　ｌｍｍ５ｓｏ、Ｍｍｔｈ、）　（１９８０）　３５＝
１）に従って、膵臓細胞５Ｘ１０’個を同数の前記Ｐ６
３Ａ、　８．６５３と、ポリエチレングリコール４００
０（メルク・アンド・コ社、ローウェイ、Ｎ、Ｊ、）を
用いて融合させた。ハイブリッド細胞を、９６ウエルの
培養プレート（コスタ−、ケンブリッジ、ＭＡす３５９
６）中の、正常バルブ／Ｃ胸腺細胞のフィーダ一層と共
に予備インキュベートシた培地（ＩＸＩＯ’個／培養ウ
ェル、融合の１日前）Ｋ乗せた。細胞は３７℃で１０％
ＣＯ２の雰囲気において下記の培地中で最初の２週間培
養された。ダルベツコの改良イーグル培地（グルタミン
を含む）、ならびにグルコース４．５ｔ／ｌ（ギプコ、
サンタ・クララ、ＣＡ、す３２〇−１９６５）、ウシ給
仕血清（１０％）（マイクロバイオロジカル・アソシエ
ーツ、ウォーカービル、ＭＤ）、ピルビン酸ナトリウム
（１ｓＭ）（ギプコ、サンタ・クララ、ＣＡ、す３２０
−１３６０）、ペニシリン（５０μ／ｍ）・・・ストレ
フトマイシン（５０μ／−）（ギブコ、サンタ・クララ
、ＣＡ。
ナ６００−５０７０）、およびヒボキサンチン−アミノ
プテリン−チミジン（ＳＡＴ）（ヒボキサンチン（１０
惰Ｍ）、チミジン（１，６％Ｍ）を０．０４ｍＭアミノ
プテリン（シグマ・ケミカル社、セント・ルイス、Ｎｏ
）と合わせて用いることＫより調製〕。定期的な維持の
ための培地（融合日２週間以後）は、アミノプテリンを
培地に含まない（ＥＴ培地）点を除いて上記と同じであ
った。
融合後２週から４週まで、ハイブリッド細胞の培養物を
ＥＸＡにより精製ＬＰＳへの抗体結合性を試験した。反
復試験に際して陽性であった培養物を次いで限界希釈法
によりクローニングした。
すなわち細胞を培養ウェル９６個の組織培養プレート（
コスタ−、ケンブリッジ、ＨＡ、す３５９６）中で各培
養ウェル尚たり細胞１０〜１個の種々の希釈度で培養し
た。１個の壬ロニーのみを含む培養ウェルを鏡検により
確認し、次いでＥＩＡＩＩＣより抗体活性について試験
した。ｉ性のクローンを培養ウェル２４個の組織培養プ
レート（コスタ−、ケンブリッジ、ＨＡ、す３５２４）
上に拡げ、再クローニングし、同じ方法で再試験した。
ＸＭＭＰＳ−ＯＦ２と表示されるクローンが持続的に単
クローン抗体を分泌することが見出された。標準法によ
る放射免疫拡散法およびＥＩＡＩＣより、この単クロー
ン抗体は免疫グロブリンのＩ（１Ｍ群のものであると判
定された。
パルプ／ｅマウス（チャールズ・リバー）ヲ用いてハイ
プリドーマを腹腔内培養した。約３×１０６個のハイプ
リドーマ細胞を、下記のように前処理したマウス、すな
わち１週間前にプリスタン（アルドリッチ・ケミカル社
、ミルクオーキー、ｗＩ）ｏ、ｓ−を腹腔内注射したマ
ウスに、腹腔内注入した。得られた腹水（ハイプリドー
マ注入の１１〜１５日後に採取）は放射免疫拡散法（メ
四イ、放射免疫拡散、スプリングフィールド、ＶＡ。
プレートナＪ−３０４）Ｋより測定して平均２１１！９
／ｄの抗体を含有していた。
実施例６゜ ハイプリドーマＸＭＭＰＦＩ−ＯＦ３ パルプ／ｅマウス（チャールズ・リバー、ウイルミント
ン、ＨＡ）を緑膿菌フィッシャータイプ３の煮沸菌体１
×１０ａ個で免疫処理した。初回免疫処理ののち煮沸菌
体ｌＸｌ０”個を１か刃間隔で２か月間腹腔内注射する
ことによりマウスをブースター処理した。
最終抗原ブースター処理の４日後に１免疫処理マウスか
ら膵臓細胞を無菌的に散出した。他に概説された処理法
（セント・グロス、ジエイ、イムノ、メソ、　（Ｊ、　
Ｉｍｍｕｎｅ、　Ｍｏｔｈ）　（１９８０）３５：１）
Ｋ従って、膵臓細胞５Ｘ１０’個を同数の前記５Ｐ２１
０−Ａｆ　１４と、ポリエチレングリ：７−ル４０００
（メルク・アンド・コ社、ローウェイ、Ｎ、Ｊ、）を用
いて融合させた。７〜イブリツド細胞を、培養ウェル９
６個の培養プレート（コスタ−、ケンブリッジ、ＨＡす
３５９６）中の、正常パルプ／Ｃ胸腺細胞のフィーダ一
層と共に予備インキュベートした培地（１ｘｌＯ’個／
培養ウェル、融合の１日前）Ｋ乗せた。細胞は３７℃で
１０％ＣＯ７の雰囲気において下記の培地中で最初の２
週間培養された。ダルベツコの改良イーグル培地（グル
タミンを含む）、ならび忙グルコース４．５１？／ｌｃ
キップ、サンタ・クラ５．ＣＡ、４３２０−１９６５）
、ウシ給仕血清（１０％）（マイクロバイオロジカル・
アンシェーツ、ウォーカービル、ＭＤ）、ピルビン酸ナ
トリウム（１ｍＭ）（ギプコ、サンタ・クララ、ＣＡ、
φ３２０−１３６０）、ペニシリン（５０μ／−）・・
・ストレプトマイシン（５０μ／ｄ）（ギプコ、サンタ
・クララ、ＣＡ、＄６００−５０７０）、およヒヒポキ
サンチンーアミノプテリンーチミジン（ＨＡＴ）（ヒポ
＃ｆンチン（１０ｓ＆　）、チミジン（Ｌ６ｓＭ）を０
．０４５Ｍアミノプテリン（シグマ・ケミカル社、セン
ト・ルイス、ＭＯ）と合わせて用いることにより調製〕
。定期的な維持のための培地（融合日２週間以後）は、
アミノプテリンを培地に含まない（ＥＴ培地）点を除い
て上記と同じであった。
融合後２週から４週まで、ハイブリッド細胞の培養物を
ＥＸＡにより精製ＬＰｓへの抗体結合性を試験した。反
復試験に際して陽性であった培養物を次いで限界希釈法
によりクローニングした。
すなわち細胞を培養ウェル９６個の組織培養プレート（
コスタ−、ケンブリッジ、ＨＡ、＋３５９６）中で各培
養フェル轟たり細胞１０〜１個の種々の希釈度で培養し
た。１個のコロニーのみを含む培養ウェルを鏡検により
確認し、次いでＥＸＡにより抗体活性について試験した
。陽性のクローンを培養ウェル２４個の組織培養プレー
ト（コスタ−、ケンブリッジ、ＨＡ、す３５２４）上（
拡げ、再クローニングし、同じ方法で再試験した。ＸＭ
ＭＰＳ−ＯＦ２と表示されるクローンが持続的に単クロ
ーン抗体を分泌することが見出された。標準法による放
射免疫拡散法およびＥＸＡにより、この単クローン抗体
は免疫グロブリンの１９Ｍ群のものであると判定された
。
パル７’／ａマウス（チャールズ・リバー）ヲ用いてハ
イプリドーマを腹腔内培養した。約３Ｘ１０’個のハイ
プリドーマ細胞を、下記のように前処理したマウス、す
なわち１週間前にプリスタン（アルドリッチ・ケミカル
社、ミルクオーキー、Ｗｌ）（１５−を腹腔的注射した
マウスに、腹腔内注入した。得られた腹水（ハイプリド
ーマ注入の１１〜１５日後に採取）は放射免疫拡散法（
メロイ、放射免疫拡散、スプリングフィールド、７Ａ。
プレート÷Ｊ−３０４）により測定して平均２ＩＲ９／
−の抗体を含有していた。
実施例７゜ ハイブリドーマＸＭＭＰＳ−ＯＰ４ パルプ／Ｃマウス（チャールズ・リバー、ウィルメント
ン、ＭＡ）を緑膿菌フィッシャータイプ４の煮沸菌体ｌ
Ｘｌ０”個で免疫処理した。初回免疫処理ののち煮沸菌
体Ｉ　Ｘ　１０’個を１か刃間隔で２か月間腹腔内注射
することによりマウスをブースター処理した。
最終抗原ブースター処理の４日後（、免疫処理マウスか
ら膵臓細胞を無菌的に取出した。他に、概説された処理
法（セント・グロス、ジエイ、イムノ、メン、　（Ｊ、
　Ｉｍｍ＊ｎｏ、Ｍｍｔｈ、）（１９８θ）３５：１）
に従って、膵臓細胞５Ｘ１０’個を同数の前記ＳＰ２１
０−Ａｇ１４と、ポリエチレングリコール４０００　（
メルク・アンド・コ社、ローウェイ、Ｎ、Ｊ、）　　を
用いて融合させた。ハイブリッド細胞を、９６ウエルの
培養プレート（コスタ−、ケンブリッジ、ＨＡ十３５９
６）中の、正常バルブ／Ｇ胸腺細胞のフィーダ一層と共
に予備インキュベートした培地（ｌ×１０Ｓ個／培養ウ
ェル、融合の１日前）Ｋ乗せた。細胞は３７℃でｌｏ％
ＣＯ１の雰囲気において下記の培地中で最初の２週間培
養された。ダルベツコの改良（−ｆｋ培地（グルタミン
を含む）、ならびにグルコース４．５ｆ／ｌｃ４ブコ、
’ｒ７Ｊｌ　−り５５　、ＣＡ、＄３２０−１９６５）
、ウシ給仕血清（１０％）（マイクロバイオロジカル・
アンシェーツ、ウォーカービｋ、ＭＤ）　、ピルビン酸
ナトリウム（１ｍＭ）（ギプコ、サンタ・クララ、ＣＡ
、す３２ｏ−１３６０）、ペニシリン（５（Ｊμ／−）
・・・ストレプトマイシン（５０μ／ｄ）（ギプコ、サ
ンタ・クララ、ＣＡ、＋６００−５０７０）、およびヒ
ポキサンチンーアミノプテリンーチミジン（ＨＡＴ）〔
ヒポ＃ｆンチ：ｙ　（１０ｍＭ　）、チミジン（１，６
惧Ｍ）を０．０４悔Ｍアミノプテリン（シグマ・ケミカ
ル社、セント・ルイス、ＭＯ）と合わせて用いることに
より調友〕。定期的な維持のための培地（融合日２週間
以後）は、アミノプテリンを培地に含まない（ＨＴ培地
）点を除いて上記と同じであった。
融合後２週から４週まで、ハイブリッド細胞の培養物を
ＥＩＡＫより精製ＬＰＳへの抗体結合性を試験した。反
復試験に際して陽性であった培養物を次いで限界希釈法
によりクローニングした。
すなわち細胞を培養ウェル９６個の組織培養プレート（
コスタ−、ケンブリッジ、ＭＡ、＋３５９６）中で各培
養ウェル当たり細胞１０−１個の種々の希釈度で培養し
た。１個のコロニーのみを含む培養ウェルを鏡検により
確認し、次いでＥＸＡにより抗体活性について試験した
。陽性のクローンを培養ウェル２４個の組織培養プレー
ト（コスタ−、ケンブリッジ、ＨＡ、す３５２４）上に
拡げ、再クローニングし、同じ方法で再試験した。
ＸＭＭＰＳ−ＯＦ２と表示されるクローンが持続的に単
クローン抗体を分泌することが見出された。
標準法による放射免疫拡散法およびＥＩＡＫより、この
単クローン抗体は免疫グロブリンの１ｇＭ群のものであ
ると判定された。
バルブ／Ｃマウス（チャールズ・リバー）ヲ用いてハイ
ブリドーマを腹腔内培養した。約３×１０６個のハイブ
リ　ドーマ細胞を、下記のように前処理したマウス、す
なわち１週間前にブリスタン（アルドリッチ・ケミカル
社、ミルウォーキー、Ｗｌ）０．５ｄを腹腔内注射した
マウスに、腹腔内注入した。得られた腹水（ハイブリド
ーマ注入の１１〜１５日後に採堆）は放射免疫拡散法（
メロイ、放射免疫拡散、スプリングフィールド、ＶＡ。
プレートナＪ−３０４）Ｋより測定して平均２η／−の
抗体を含有していた。
実施例８゜ ハイプリドー−ｒＸＭＭＰ！１−ＯＦＴＡ、ＸＭＭＰＳ
−ＯＦＴハイプリドーマの調装バルブ１０マウス（チャ
ールズ・リバー、ウィルミントン、ＭＡ）を緑膿菌フィ
ッシャータイプ７の煮沸菌体ｌＸｌ０’個で免疫処理し
た。初回免疫処理ののち煮沸菌体ＩＸＩθ魯個を１か刃
間隔で２か月間腹腔内注射することによりマウスをブー
スター処理した。
最終抗原ブースター処理の４日後に、免疫処理マウスか
ら膵臓細胞を無菌的に取出した。他に概説された処理法
（セント・グロス、ジェイ、イムノ・メソ、　（Ｊ、　
Ｉｍｔｎｓｎｏ、　ｈｈｔル、）（１９８０）３５：１
）に従って、膵臓細胞５Ｘ１０’個を同数の前記！１Ｐ
２１０−Ａｆ１４と、ポリエチレングリコール４０００
　（メルク・アンド・コ社、ローウェイ、Ｎ、Ｊ、）を
用いて融合させた。ハイブリッド細胞を、培養ウェル９
６個の培養プレート（コスタ−、ケンブリッジ、ＭＡ＋
３５９６）中の、正常パルプ／Ｃ胸腺細胞のフィーダ一
層と共に予備インキュベートした培地（ＩＸＩＵ’個／
培養ウェル、融合の１日前）に乗せた。細胞は３７℃で
１０％ＣＯ７の雰囲気において下記の培地中で最初の２
週間培養された。ダルベツコの改良イーグル培地（グル
タミンを含む）、ならびにグルコース４．５２／ｌ（ギ
プコ、サンタ・クララ、ＣＡ、す３２０−１９６５）、
ウシ給仕血清（１０％）（マイクロバイオロジカルーア
ンシエーツ、ウォーカービル、ＭＤ）、ピルビン酸ナト
リウム（１ｓ＆）（ギブコ、サンタ・クララ、ＣＡ、◆
３２〇−１３６０）、ペニシリン（５０μ／１１ｄ）・
・・ストレプトマイシン（５０μ／ｍ）（ギプコ、サン
タ・クララ、ＣＡ、す６００−５０７０）、およびヒポ
キサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）〔ヒ
ポキサンチン（１０悟Ｍ）、チミジン（１，６ｓＭ）を
０．０４惰Ｍアミノプテリン（シグマ・ケミカル社、セ
ント・ルイス、ＭＯ）と合わせて用いることによりｖ４
１Ｍ）。定期的な維持のための培地（融合日２週間以後
）は、アミノプテリンを培地に含まない（ＨＴ培地）点
を除いて上記と同じであった。
融合後２週から４週まで、ハイブリッド細胞の培養物を
ＥＸＡにより精製ＬＰｓへの抗体結合性を試験した。反
復試験に際して陽性であった培養物を次いで限界希釈法
によりクローニングした。
すなわち細胞を培養ウェル９６個の組織培養プレート（
コスタ−、ケンブリッジ、ＨＡ％＋３５９６）中で各培
養ウェル当たり細胞１０〜１個の謹々の希釈度で培養し
た。１個のコロニーのみを含む培養ウェルを鏡検により
確認し、次いでＥＸＡにより抗体活性について試験した
。陽性のクローンを培養ウェル２４個の組織培養プレー
ト（コスタ−、ケンブリッジ、ＭＡ１◆３５２４）上に
拡げ、再クローニングし、同じ方法で再試験した。
ＸＭＭＰＳ−ＯＦ２と表示されるクローンが持続的に単
クローン抗体を分泌することが見出された。標準法によ
る放射免疫拡散法およびＥＸＡにより、この単クローン
抗体は免疫グロブリンのＩｇＧ群のものであると判定さ
れた。
パルプ／６マウス（チャールズ・リバー）ｋ用いてハイ
プリドーマを腹腔内培養した。約３×１０＠個のハイプ
リドーマ細胞を、下記のように前処理したマウス、すな
わち１週間前にプリスタン（アルドリッチ・ケミカル社
、ミルウオーキー、ＷＩ）０．５−を腹腔内注射したマ
ウスに、腹腔内注入した。得られた腹水（ハイプリドー
マ注入の１１〜１５日後に採取）は放射免疫拡散法（メ
ロイ、放射免疫拡散、スプリングフィールド、ＶＡ、プ
レートφＪ−３０４）により測定して平均５〜１ＯＩｋ
ｙ／−の抗体を含有していた。
実施例９゜ 抗緑膿菌フィッシャータイプＭｏＡｂのイムノドツト血
清学的検査 抗原を０．２０μ惰硝醸セルロース膜　（ザートリウス
）に１μｔの１ドツト”として施し、５分間風乾した（
用いた濃度はＰＢＳ中の精Ｉ！！Ｌ　Ｐ　８１００μｆ
／−であった）。抗原スポットした膜を次いでゼラチン
（ディフコ、デトロイト、ＭＩ）の１％溶液により室温
で３０分間ブロックした。速やかに（１分間ずつ２回）
洗浄したのち、適宜な抗緑膿菌ＭｏＡｂを膜と共に室温
で３０分間インキュベートした（Ｊ１０Ａ＆はこのアッ
セイにおいては約２〜１０μが−の組織培養液として用
いた）。膜を速やかにＰＢＳで３回洗浄し、次いでヤギ
抗マウスＩｇ−パーオキシダーゼ結合体（適宜抗マウス
ＩｇＭまたはＩｇσ）（カッペル、マルバーン、ＦＡ）
と共に室温で３０分間インキュベートした。膜をＰＥＳ
で３〜４回洗浄したのち、基質（４−クロル−１−ナフ
トール、シグマ・ケミカル社、セントルイス、ＭＯ）を
膜と共に室温でインキュベートした。陽性の反応は通常
は紫色のドツトとして２〜５分間以内に現われ、通常は
４＋（きわめて強い）ないし１＋（弱い）としてグレー
ド評価された。結果を表１９Ｋまとめる。
実施例１０゜ ＭｏＡｂ結合のまとめ 下記の表は本発明のＭｏ　Ａ　ｂの結合特性をまとめた
ものを示す。この表ではＭ　ａ　Ａ　ｂをそれらの既知
抗原によって表わし、エピトープ（大部分がまだその特
性が明らかにされていない）によっては表わさなかった
。
実施例１１゜ 局所性細菌感染症の像形成 感染細菌の各菌株に共通である抗原決定因子と選択的に
反応する単クローン抗体を用いて、局所性細菌感染症（
特にダラム陰性菌によって起こるもの）の位置および程
度を、当技術分野で周知の方法により判定した。この方
法はたとえばラルソンらのジャーナル・オブ・クリニカ
ル・インベステイゲーション（１９８３）７２：ｚｌｏ
ｌに記載されており、これを参考として引用する。単ク
ローン抗体は好ましくは放射性ヨウ素化により、もしく
は当技術分野で周知の他の放射性標識法、たとえばジエ
チレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）などのキレー
ト化剤を用いるキレート化法により放射性標識さｎるか
；または他の方法で、たとえば常磁性金もつ試薬により
、化学発光性基質により、もしくは酵素反応の成分によ
り標識される。放射性標識された単クローン抗体を精製
し、薬剤学的用途のために配合した。キャリヤー、たと
えばリン酸塩緩衝化食塩液中の標識単クローン抗体溶液
を宿主に静脈内注射した。適量は１００μｇないし５０
■であった。抗体がこれと反応性の抗原決定因子をもつ
菌体の濃縮された身体領域へ移動するための時間を置い
た。特定の組織内におけるラジオアイソトープの濃度は
当技術分野で周知の全身像形成法により（たとえばレイ
ンスノイリーら、ランセット、１９８３年１０月２２日
、９３４頁：これを参考として引用する）、または生検
組織もしくは抽出した体液をシンチレーション計数計に
より評価することによって測定され、または図形化する
ことができる。非放射性標識を用いる場合、他の適切な
監視手段、たとえば核磁気共鳴の検出器、または分元元
度計を用いる。高放射線水準の領域は局所性細菌感染症
の存在を示す。第３図は”’ＲＲｘｕｔｐｓ−ｏｐｌ　
ｕｏＡｂを用いたマウスにおける緑膿菌感染の像形成を
示す。“ホットスポット°は感染の局所領域を示す。
実施例１２゜ 細菌感染の治療処置 細菌感染を伴うと判定された宿主を全菌株に共通の抗原
決定因子と反応性の単クローン抗体で治療した。単クロ
ーン抗体は生理学的に受容できるキャリヤー液、たとえ
ばリン酸塩緩衝化食塩液中に３いて、静脈内、筋肉内、
腹腔内などに投与された。用量は宿主の体重によって決
定され、好ましくは約０．１〜約４０■／に９（宿主の
体重〕、通常は約１〜約ｌＯダ／に９（宿主の体重）で
ある。
あるいは用量は残留感染症の程度を、たとえば定量的に
標準化され九ＥＩＡ放射線像形成その他の方法により評
価することによって確ニされる。感染症から回復する宿
主の能力を高めるために、処置は必要に応じ時間を置い
て反復される。
実施例１３゜ 診断用ＥＸＡ 不発明の準クローン抗体またはそれらの機能均等物を標
準法および周知の方法によるイムノアッセイに用いた（
たとえば免疫診断における方法、Ｗ、２版、ローズおよ
びビガツツイ編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、
１９８０年）。この種のアッセイはたとえば直接型（抗
原と反応性の標識第１抗体）、間接型（第１抗体と反応
性の標識第２抗体）、競合型（たとえば標識抗原の添加
）、またはサンドインチ型（標識抗体および非標識抗体
）、ならびに当技術分野で周知の他の型である。
これらの−形暢においては、細菌感染の疑われる患者か
らの組織摘出物を不溶性マトリックスまたは固体支持体
（たとえばセルロースス）　ＩＪツブ、アガロースその
他の粒子）に施し、これにより菌体−支持体複合体を調
製した。あるいは支持体に抗体が付着しており、これに
より細菌を溶液から支持体へ付７ｆ嘔ぞることもできる
。欠いて支持体を好ましくはＰＢＳで洗浄して未結合物
質を除去した。
好ましい形態に８いては、細菌が付着した固体支持体を
、ＸＭＭＰＳ−６０５抗体、または緑膿菌に特異的であ
り、細菌感染の原因となる可能性のある他のダラム陰性
菌とは反応性でない他の単クローン抗体を富有する溶液
に浸漬した。この種の溶液には組織抽出液、血清および
尿が宮まれる。
単クローン抗体を支持体複合体と反応させ、次いでこの
複合体を洗浄して未結合の単クローン抗体を除去した。
次いで、この単クローン抗体と反応性の標識抗体、たと
えばヤギ抗マウスＩｆＧを官有する溶液に浸漬する。こ
の抗体を好ましくはラジオアイソトープ（たとえば１！
ｌＩ）で、またはより好ましくは酵素反応の成分（たと
えばパーオキシダーゼ〕で標識するが、化学発光性基質
で標識してもよい。支持体を再び洗浄して未結合抗体を
除去した。上記標識に適した観察手段（たとえばシンナ
レーション計数計または分光光度１ｔｌ−）を用いて、
支持体と複合体を形成した標識の存在を判定した。これ
が組ｍ抽出液中に緑膿菌またはシュードモナス・マルト
フイリアが存在すること金示す。
動物白米の解散を分析するために用いるｔよか、四球な
方法を用いて、緑１−ηまたはシュードモナス・マルト
フイリアの混入が有害となると思われる池の物体上また
は他の溶液中のこれらの細菌の存在を検出した。この種
の物体の例には侵入処置に使用する医療器具、呼吸用換
気装置、噴霧式加湿器、口内体温計、ベットサイドウォ
ーターデカンタ−１およびジェット機燃料が含１れる。
実施例１４゜ パネルＥＸＡ 不発明の単クローン抗体は、宿主における細菌感染の性
質を明らかにするためのＥＩＡパネル実施用キットの形
で供給される。実施例１３の場合のように１回のＥＸＡ
を実施するために個々のＭｏＡｂを用いることができる
が、ＭｏＡｂのパネルを用いる複数回のＨ：ＩＡ　Ｋよ
りグラム陰性菌およびグラム陽性菌の特性解明を含めて
感染原因細菌を広範に解明することができる。
実施例１５゜ 微生物内毒素の定量 本発明のＭｏＡｂ′ｆｔ体液、身体の分泌物および抽出
物に８いて、あるいは薬物、診断薬、または診断薬、治
療薬などの製造に際して得られる液状中間体に２いて、
微生物内ｍ素の定量法に用いた。
内毒素たとえばＸＭＭＥＮ−ＯＥＳ上の特異的な独特の
決定因子に対して結合特異性をもつＩｙＭ・ＭｏＡｂを
固体表面に吸着嘔ぜた。過剰の吸着していない物質を除
去したのち、固体表面に潜在する付加的な非特異性結合
部位を適宜なブロッキング剤（たとえばアルブミン）の
添加によりブロックした。未結合アルブミンを単純な洗
浄操作により除去した。活性化された表面を種々の濃度
の被験試料に、１〜２４時間の範囲の種々の期間、４〜
３７℃の範囲の種々のインキュベーション温度下に置い
た。反応しなかったかまたは消費された被験試料の除去
は、標準的な生化学的溶液（たとえば緩街化食塩液）を
用いた単純な洗浄操作により行われた。ＶＬ験溶液中の
同毒素の検出２よび定量は、検出プローブまたは結合パ
ートナ−１すなわちＩｆＧ亜群に属し、内毒素の特異的
なかつ独特の決定因子（Ｉ　ｙＭ−Ａｆ　ｏ　Ａ　ｂは
これに結合しない）に対し結合特異性をもち、かつこの
系に３いて固体表面に吸着した１９Ｍにより有意の影響
を受けない第２のＭ　ｏ　Ａ　ｂを添加することにより
行われた。
定量は被験試料に粘合した検出プローブの量と、一定量
の内毒素標準物質に結合した検出プローブの盆との関係
を求めることにより行われた。標準物質２よび被験試料
に結合した検出プローブの量の評価は種々の方法で行わ
れた。たとえば（α］　プローブの放射性標識付け、な
らびに結合した放射能の測定、＋６１　　プローブの酵
素標識付け、ならびに標準物質および被験試料に結合し
た一定量のプローブに付随する酵素活性の測定、（ｃ）
　　一定の特異的波長で発光する物質（たとえばフルオ
レセイン）をプローブ（直接に結合させ、標準物質８よ
び被験試料によるこれらの発光を定量し、比較する方法
などである。定量は、系内に特異性の高い第２の標準指
示物質（ラジオアイソトープ、酵素またはフルオロクロ
ムで標識てれたアビジン）を取込与つる物質（たとえば
ビオチン）で検出プローブを標識することによっても行
われた。
この系の実施態様においては、マウスＩ２　と特異的に
反応しつる、放射性標識、酵素標識またはフルオロクロ
ム標識された抗体からなる第２の特異性指示薬を用いて
、内毒素を定量することができた。
ＩｆＭ単クツクローン抗体体表面に最初に吸着させるこ
とに対する利点は、１９Ｍ群に属する抗体に伴う高い結
合活性に白米する。これにより、アッセイ過程で最初の
結合液から失われる可能性のある内毒素の量が少なくな
る。
本発明は細菌感染症の診断、治療および予防に肩用な汎
反応性ＭｏＡｂを提供する。本発明はグラム陰性菌内毒
素を遮断し、これによりそれがグラム陰性菌に感染した
宿主に与える有害な作用を少なくするのに特に有用であ
る。
本発明をより明確に理解するために図面２よび実施例に
よりある程度詳細に記述したが、特許請求の範囲内にお
いて一定の変更および修正を行いうることは明らかであ
ろう。
【図面の簡単な説明】
第１図３よび第２図はＸＭＭＰＳ−６０５抗体とそれぞ
れ緑膿菌の全菌体およびリポ多糖との結合物のドデシル
硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析
を示す（実施例３、Ｅ）。 第３図は１１５（標識抗体を用いたマクスにおける局所
性緑膿歯感染の像形成を示す（実施例１１）。 図面の浄あ）ｊ１工に変更なし） 第１図 第２図 し−ン　　　ｌ　　　　２　　　３　　　４第３図

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）グラム陰性菌およびグラム陽性菌に存在するエピ
    トープに結合する単クローン抗体またはその反応性断片
    。
  2. （２）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９０８３をもつハイブリド
    ーマ細胞系ＸＭＭＥＮ−Ｊ５Ｄ。
  3. （３）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９０８１をもつハイブリド
    ーマ細胞系ＸＭＭＥＮ−ＯＥ５。
  4. （４）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９０８２をもつハイブリド
    ーマ細胞系ＸＭＭＥＮ−ＬＹ１。
  5. （５）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ８９０９をもつハイブリド
    ーマ細胞系ＸＭＭＰＳ−６０５。
  6. （６）ＸＭＭＥＮ−Ｊ５Ｄ、ＸＭＭＥＮ−ＯＥ５、ＸＭ
    ＭＥＮ−ＬＹ１、およびＸＭＭＰＳ−６０５よりなる群
    から選ばれる細胞系により産生される単クローン抗体ま
    たはその機能的均等物。
  7. （７）細菌細胞を含む疑いのある溶液中の該細胞の存在
    を検出するための診断法であって、 ａ）該溶液中の細胞を固体支持体に付着させ；ｂ）細胞
    が付着した固体支持体を特許請求の範囲第６項に記載し
    た標識単クローン抗体と接触させ；そして ｃ）こうして接触させた固体支持体をその標識抗体の存
    在につき観察する； 工程からなる方法。
  8. （８）細菌細胞を含む疑いのある溶液中の細菌細胞の存
    在を検出するための診断法であって、 ａ）該溶液中の細胞を固体支持体に付着させ；ｂ）細胞
    が付着した固体支持体を特許請求の範囲第６項に記載の
    単クローン抗体と接触させ；ｃ）こうして接触させた固
    体支持体を、単クローン抗体と反応性の標識された結合
    パートナーに暴露し；そして ｄ）こうして暴露された固体支持体をその標識された結
    合パートナーの存在につき観察する；工程からなる方法
    。
  9. （９）哺乳動物の体内における細菌による局所感染の検
    出法であって、 ａ）哺乳動物に特許請求の範囲第６項に記載の標識単ク
    ローン抗体を投与し； ｂ）標識単クローン抗体を局所感染部位に蓄積させ；そ
    して ｃ）動物体を観察し、これにより局所感染部位を判定す
    る； 工程からなる方法。
  10. （１０）ＸＭＭＥＮ−Ｊ５Ｄ、ＸＭＭＥＮ−ＯＥ５、Ｘ
    ＭＭＥＮ−ＬＹ１、およびＸＭＭＰＳ−６０５よりなる
    群から選ばれる細胞系により産生される標識単クローン
    抗体またはその標識された機能均等物を含んでなる、特
    許請求の範囲第８項に記載の方法に使用するためのキッ
    ト。
  11. （１１）細菌細胞に感染した哺乳動物の治療法であって
    、該哺乳動物に治療上有効な量の、特許請求の範囲第６
    項に記載の単クローン抗体を投与し、これにより感染を
    軽減することよりなる方法。
  12. （１２）細菌感染の危険性がある哺乳動物の予防処置法
    であって、該哺乳動物に予防上有効な量の、特許請求の
    範囲第６項に記載の単クローン抗体を投与し、これによ
    り感染の危険性を減少させる方法。
  13. （１３）微生物内毒素を含有する疑いのある被験液中の
    微生物内毒素の検出法であって、 ａ）微生物内毒素上の特異的かつ独特の決定因子に対す
    る結合特異性をもつ単クローン抗体を固体表面に吸着さ
    せ、 ｂ）被験溶液を該固体表面と接触させ； ｃ）こうして接触させた表面を、単クローン抗体が結合
    するものと異なる内毒素決定因子に結合する標識された
    結合パートナーに暴露し；そしてｄ）こうして暴露され
    た固体表面をその標識された結合パートナーの存在につ
    き観察する；工程からなる方法。
  14. （１４）ＸＭＭＥＮ−Ｊ５Ｄ、ＸＭＭＥＮ−ＯＥ５、Ｘ
    ＭＭＥＮ−ＬＹ１、およびＸＭＭＰＳ−６０５よりなる
    群から選ばれる細胞系により産生される単クローン抗体
    またはその機能均等物を含んでなる、特許請求の範囲第
    ９項、第１１項、第１２項または第１３項に記載の方法
    に使用するためのキット。
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