KR910002427B1

KR910002427B1 - 단일클론 항체의 제조방법 및 이를 함유한 약학 조성물

Info

Publication number: KR910002427B1
Application number: KR1019860008128A
Authority: KR
Inventors: 에스 영 로웰; 알람 수잔
Original assignee: 더 리젠쯔 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아; 로저 지. 디젤
Priority date: 1985-09-27
Filing date: 1986-09-27
Publication date: 1991-04-22
Also published as: US4918163A; JPS62228295A; EP0217527A2; IE862546L; DE3686931T2; NZ217283A; DE3686931D1; AU606581B2; JP2539797B2; IE59685B1; ES2004340A6; KR870003195A; US5484591A; IL79719A0; IL79719A; PH26525A; AU6323686A; EP0217527A3; EP0217527B1; US4918163B1

Abstract

내용 없음.

Description

단일클론 항체의 제조방법 및 이를 함유한 약학 조성물

제1도는 Westem 면역 블러트 방법에 의해 XMMPS-605와 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 총 세포 추출물의 결합을 나트륨 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분석한 결과를 나타낸 것이며,

제2도는 Western 면역 블러트 방법에 의해 XMMPS-605와 P. aeruginosa의 리포폴리사카라이드(LPS)의 결합을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 것이며,

제3도는¹²⁵I 라벨된 XMMPS-OP1 MoAb를 사용했을 때 쥐에 있어서의 P. aeruginosa 감염 이미지를 나타낸 것이다.

본 발명은 감염질환 특히 그램 네가티브 박테리아(세균)에 의해 유발된 감염질환의 예방 진단 및 치료에 관한 것이다.

박테리아성 패혈증 및 이와 연관된 패혈증 쇼크는 특정한 유형의 외과수술, 복부외상 및 이식치료 또는기타 질환의 중상들과 관련된 면역억제로 인해 유발된 강염질환으로 야기되는 생명을 위협하는 흔한 증상이다. 매년 미국에서만도 70만명 이상의 환자가 패혈증 쇼크를 유발하는 박테리아성 감염질환으로 고통받고있는 것으로 추정된다. 이들중에서 16만명은 실제로 패혈증 쇼크를 일으켜 매년 5만명이 죽는 것으로 나타났다.

그램 네가티브 박테리아 감염질환은 현대의학에서 접하게 되는 가장 심각한 감염질환 문제에 해당되고 있다. 20년전에 병원에서 발견되는 대부분의 패혈증은 스타필로코커스(Staphlococcus) 및 스트렙토코커스(Streptococcus) 같은 보다 급성적인 그램 포지티보 박테리아 병원균에 의한 것들 이었다. 이와는 반대로, 최근들어서는 그램 네가티브 박테리아, 예를 들면 대장균(E. coli) 및 녹농균(P. aeruginosa)에 의한 감염질환이 증가되고 있다.

미국에서는 매년 병원에서 얻게되는 그램 네가티브 박테리아 감염질환이 20만건에 이르고 있으며, 이것은 전체 사망률의 20-60%를 차지하고 있다. 이들 병원에서 감염되는 감염질한 대부분이 그램 네가티브 세균인대장군(E. coli)(그램 네가티브 패혈증을 앓고 있는 환자에서 분리된 가장 보편적인 병원균)에 의한 것들이며, 그 다음이 폐렴균(Klebsiella pneumoniae) 및 녹농균(P. aeruginosa)에 의래 유발된 것들이다.

그램 네가티브 패혈증은 그램 네가티브 간상균과 뒤이은 내독소의 전신성 내습에 의해 초래되는 질환증상이다. 이 병의 심각성은 일시적인 자기한정성으로부터 종종 기관파손 및 쇼크가 수반되어 생명을 위협하는 균혈증 전격성 질환에 이르기까지 다양하다. 이 질환은 극소 감염 부위에 침입되어 유발되는 경우가 빈번하고, 또는 외상, 창상, 궤양증 또는 위장 폐색증으로 인해 일어날 수도 있다. 그램 네가티브 폐혈증의 증상으로서는 발열, 오하느 폐동맥 파손 및 패혈성 쇼크(심한 저혈압증상) 등을 들 수 있다.

그램 네가티브 감염질환은 특히 항암 화학요법 및 면역억제 치료를 받는 환자들에게서 흔히 볼 수 있다. 그와 같은 면역-장애 숙주들에게서 발병되는 감염질환은 많은 항생제들에 대해 내성을 나타내거나 또는 장기간의 감염 경로로 인해 내성을 나타내게 되므로 통상적인 치료를 어렵게 만든다. 세포 독성 및 면역억제 요법의 끊임없는 이용 증가 및 광범위한 항생제 사용으로 인한 약제 내성을 갖는 박테리아의 자연적인 대두로 인하여 그램 네가티브 박테리아가 주된 임상증상을 유발하는 병원균으로 작용하게 되었다.

다행스럽게도, 10년전부터 미국 및 독일의 연구진들은 많은 다양한 박테리아종의 그램 네가티브 내독소가 "일반적인 코어 구조"를 지니고 있다는 것을 입증한 바 있다. 즉 수많은 감염성 그램 네가티브 세균은 개개의 캡슐과 표면 폴리사카라이드를 함유하고 있으며, 동시에 다양한 그램 네가티브 박테리아종과 이들의 내독소에 걸쳐서 광범위하게 공유하고 있는 코어 리포폴리사카라이드(LPS) 구조가 존재한다.

상기 코어 구조는 "리피드 A"로 밝혀진 물질을 함유하며, 이 물질은 실험동물에 있어 발열, 보체 및 응괴성계의 활성화, 저혈압, 치사를 수반하는 "내독소"의 생물학적 특성들 모두에 관여한다. 그러므로 이 코어 구조 또는 LPS 구조는 적어도 두가지 이유에서; 즉 그램 네가티브 박테리아종내에의 보존 및 내독성 유발에 관여한다는 점에서 중요하다. 항생제 요법은 대부분 그램 네가티브 패혈증, 특히 녹농균에 대하여서만 국부적으로 최적효과를 발휘(항생제들은 단지 박테리아를 처리하는데만 유효할 뿐이며, 세균성 내독소의 작용을 저지시키지는 못한다)하기 때문에 이들 감염질환을 예방 및 억제하기 위한 면역학적 방법에 대한 관심이 증가되어 왔다. 면역요법은 감염성 박테리아 세포의 옵소닌작용 및 식작용을 증진시키거나 또는 LPS의 생물학적 작용을 중화시킴으로써 박테리아의 독성 작용에 대한 숙주의 자연적인 방어기능이 발휘될 수 있도록 면역글로불린(항체 또는 이것의 활성단편)을 투여하는 것을 뜻한다. 코어 구조 또는 리피드 A, 즉 LPS와 결합하는 항체 또는 그의 단편은 수많은 그램 네가티브 대독소와의 광범위한 반응성을 지닌다.

스무드(smooth) 그램 네가티브 박테리아의 O-특이 측쇄상에 존재하는 에피토프 또는 항원 결정 인자와 반응하는 항체는 제한된 범위내에서만 면역요법에 이용된다. 왜냐하면 이들은 상보성 또는 교차 반응성을 갖는 항원 결정인자를 지닌 박테리아 균주들에 대해서만 효과적으로 작용하기 때문이다. 그와 같은 균주-특이적 항체는 극히 제한된 용도만을 지닌다. 모든 균주의 코어 올리고사카라이드 및 리피드 A가 항원 결정 인자를 공유한다고 추론되는 반면, 슈도모나스(Pseudomouas)내의 이들 부위와 반응하는 단일클론 항체를 생산하여 이용하려는 예전의 몇몇 시도가 크게 성공을 거두지 못하였다.

임상적으로 중요한 대부분의 그램 네가티브 병원균과 잘 결합하는 면역 글로불린은 면역요법을 성공으로 이끄는데 있어서 필수적이다. 혈류 감염의 5-15%를 차지하는 녹농균(P. aeruginosa)은 적어도 16가지의 다양한 혈청형(O-항원형)을 지닌다. 크렙시엘라(Klebsiella)는 80가지 이상의 캡슐형태를 지니며, 훨씬 더 보편적인 대장균(E. coli)은 130가지 이상의 혈청형을 지니고 있다.

균혈증을 앓고 있는 환자들에게서는, 종종, 수일이 소요되는 세균학적 결과가 얻어질 때까지는 박테리아 감염 종류에 대하여 확인할 수 있는 특이한 진단법이 없다. 치료는 중요한 처음 발병된지 24-48시간 동안에 환자의 상태가 급속히 악화되는 것을 방지할 수 있도록 실험적인 진단을 근거로하여 실시된다.

그러므로 그램 네가티브 박테리아의 모든 중요한 병원성 균주상에 존재하는 에피토프 또는 항원 결정 인자와 반응하는 단일클론 항체(MoAb), 또는 그의 활성 단편을 생산하여 세균 감염의 진단, 예방, 억제 및 그램 네가티브 세균 종에 의해 유발되는 내독소균을 중화시키고자 하는 요구가 오랜동안 대두되어 왔다. 또한 일반적으로 세균 감염의 진단, 치료 및 예방에 유용한 그램 포지티브 박테리아와 교차 반응하는 MoAb를 얻는 것도 유리하다는 것이 밝혀졌다.

과학 및 특허문헌을 살펴보면, 세균 감염질환과 관련지어 광범위한 연구가 수행되어 왔으며, 그들중 대부분이 그램 네가티브 박테리아 내독소에 기인한 패혈증을 다루고 있다. 다음은 관련된 논문 및 특허공보 목록, 및 각각에 대한 간단한 설명을 기술한 것이다.

EP 0 101 039 A2-(1984년 2월 22일 공고)-녹동균(Pseudomonas aeruginosa)에 대한 단일클론 항체와 이것을 진단 및 치료에 이용하는 방법 ;

WO 84/04458-1984년 11월 22일 공고-내독소 코어와 발응하는 MoAb ;

WO 85/01659-1985년 4월 25일 공고-그램 네가티브 박테리아의 내독소에 대한 MoAb ;

EP 0 163 493-1985년 4월 12일 공고-녹농균(P. aeruginosa) 감염을 치료 또는 예방하는데 유용한 리포폴리사카라이드의 혈청형 결정 인자에 대하여 특이성을 나타내며 그램 네가티브 박테리아에 대항하는 인체 MoAbs ; 화인골드(Feingold), 등[Arch. Int. Med(1965) 116 : 326-28]이 환자의 그램 네가티브 패혈증을 효과적으로 치료하기 위한 목적으로 그램 네가티브 감염질환을 앓는 환자로부터 얻은 폴리클론 항혈청의 이용 ; 아베(Abe) 등[Jpn. J. Exp Med(1975) 45, 355-59] P. aeruginosa 내독소에 의한 쥐의 면역 반응에서 생산된다-클론 항혈청의 사용 ;

아피셀라(Apicella), 등[Infect. Immun(1984) 34 : 751-56]-단일클론 항체를 사용하여 Neisseriagonorrhorae와 N. meningitidis로부터 리포폴리사카라이드를 분석하는 방법 ;

자이글러(Zeigler), 등[N. Eug. J. Med(1982) 307 : 1225-30]-건강한 공혈자에게 열로 사멸시킨 E. coli J5 변이체를 사용하여 왁찐 주사해서 생산된 인체 항혈청으로 그램 네가티브 균혈증 환자를 치료하는 더블-블라인드 실험결과를 보고 ;

핸코크(Hancock), 등[Infect. Immun(1982) 37 : 166-71]-Pseudomonas aeruginosa 외부 맴브레인 항원에 대해 특이적인 MoAb에 관해 교시 ;

히어나우스(Hiernau) 등[Eur. J. Immunology(1982) 12 : 797-803]-E. coli 0113 리포폴리사카라이드(LPS)에 대해 특이적인 MoAb에 관해 기술 ;

마치(Machie), 등[J. Immunol(1982) 129 : 829-32]-서로 다른종의 그램 네카티브 박테리아를 결합하는 MoAb에 관해 기술 ;

영(Young) 등[C1in. Res(1982) 30 : 522A]-면역원으로서 S. minnesta RS-95 LPS를 사용하여 생산된 MoAb에 관해 기술 ;

폴래크(Pollack), 등[J. Clin. Invest.(1983) 72 : 1874-81]-E. coil 내독소 코어에 대한 항체를 다량순환시킴으로써, P. aeruginosa 패혈증을 앓고 있는 환자의 생존율이 증가 되었음을 기술 ;

사와다(Sawada), 등[J. Infect. Dis(1984) 150 : 570-76]-리포폴리사카라이드와 외부 맴브레인 단백질에 대한 MoAb를 수동 전달함으로써 P. aeruginosa로 인한 감염증에 대하여 마우스를 보호하는 것에 관해기술 ;

하기의 세가지 관련 초록은 항세균제와 화학요법에 관한 제24차 과학모임(1984)의 초록(P104)에 포함어 있는 것들이다 : 1) 블랙(Black)과 캐논(Cannon)의 "병원성 나이세리아속(Neisseria) 항원(H8Ag)에 대한 단일클론 항체가 쥐에 있어서 수막염 균혈증(ME)을 방어한다" ; 2) 윌리엄(Williams) 등 녹농균"(Pseudomonas aeruginosa(PA))의 포린 단백질(Porin Protein) F에 대한, 전신 반응성 단일클론 항체(MCA) ; 쥐에 있어서 수동 면역요법"; 3) 김(Kim) 등 "E. coli에 대한 단일클론 항체의 방어 메카니즘에 관한 연구" 등 ;

무타리아(Mutharia) 등[Infect. Immun(Sept. 1984) 45 : 631-36]은 지질 A 와 결합하는 것으로 추정되는 상이한 종의 그램 네가티브 박테리아와 교차 반응하지만 그램 포지티브 박테리아와는 반응하지 않는 MoAb에 관해 기술하고 있다 ;

넬스(Ne1les)와 니스완디(Niswander)[Infect. Immun(Dec. 1984) 46 : 677-81]는 스무드 페노타입(Smooth Phenotype) 및 러프 페노타잎(rough Phenotype)인 그램 네가티브 박테리아로부터 유래된 리포폴리사카라이드를 결합하는 E. coli 0111 : B4의 J5 변이체에서 유도된 리포폴리사카라이드와 반응하는 쥐의 두가지 단일클론 항체에 관해 기술하고 있다 ;

영(Young) 등[Clin. Res.(1984) 32:518A]은 장대균과 박테리아 내독소의 글리코지질의 "코어"에 대해 지시된 MoAb에 관해 기술하고 있다 ;

영 엘. 에스(Young L. S.) Clin Res.(1984)는 그램 네가티브 세균의 리포폴리사카라이드 항원에 대한 MoAb의 작용 활성에 관해 기술하고 있다 ;

영 엘. 에스(Young L. S.)[Principles and Practicl of Infetious Disease(1985) John Wiley and Sons, N. Y., N. Y, 425-75]는 그램 네가티브 패혈증에 관해 기술하고 있다.

새도프(Sadoff) 등[Antibiot. Chemother(1985) 36 : 114-46]은 녹농균(P. aeruginosa) 리포폴리사카라이드에 대해 작용하는 쥐의 단일클론 항체의 특징을 기술하고 있다.

텡(Teng) 등은[Proc. Nat. Sci. USA(March 1985) 82 : 1790-94] 그램 네가티브 균혈증 및 내독균중에 대하여 인체 단일클론 IgM 항체를 사용함으로서 쥐를 방어하는 방법에 관해 기술하고 있다. 이 MoAb는 그램 포지티브 감염질환에 대해 영향력 있는 방어를 나타내지 않았다 :

길리오티(Giglliotti)와 쉐네프(Shenep)[J. Infect. Dis.(June 1985) 151 : 1005-11]는 E. coli 0111 : B4 또는 K1 : 07의 스무드 균주 그 자체를 결합하지는 않지만 E. coli 러프 변이체 J5의 LPS를 결합하는 MoAb에 관해 기술하고 있다.

피터스(Peters) 등은[Infect. Immun(Nov. 1985) 50 : 459-66] 장내균과의 일반적인 항원과 E. coli 리포폴리사카라이드 외부 코어에 대한 MoAb를 기술하면서 최소한 부분적으로 4-N-아세틸글루코사민이 존재하는 것으로 추정되는 공유된 항원성 결정 인자를 기술하고 있다.

던(Dunn) 등[Surgery(August 1985) 98 : 283-90]은 면역원으로서 E. coli 스무드 균주 0111 : B4를 사용하며 균주 특이적으로 결합하는 MoAb를 제조하는 방법 및 면역원으로서 E. coli 러프 변이체 J5를 사용하여 그램 네가티브 박테리아 교차반응 MoAb를 제조하는 방법에 관해 기술하고 있다. 이들 MoAb는 그램 포지티브 박테리아와 반응하지 않았다 ;

던(Dunn) 등[Arch. Surg(Jan 1986) 121 : 58-62]은 쥐의 단열클론 IgG 항체를 사용하여 다양한 그램 네가티브 균과의 반응력과 식작용의 촉진을 입증하고 실험적인 그램 네가티브 패혈증시에 방어를 제공하는 그램 네가티브 패혈증의 면역요법에 관해 보고하고 있다. 또한 이 MoAb는 시험된 그램 포지티브 박테리아 와는 반응성이 없었다.

마이너(Miner) 등[Infect . Immune.(ApriI 1986) 52 : 56-62]은 E. coli J5에 대한 쥐의 MoAb의 특성화에 관해 기술하고 있다.

본 발명은 통상적으로 그램 네가티브 박테리아의 내독소 코어와 결합된 리포폴리사카라이드상에 존재하는 에피토프와 결합하며, 다양한 종의 그램 네가티브 박테리아와 광범위한 교차 반응성을 나타내고, 내독소를 효과적으로 중화시키는 단일클론 항체(MoAbs)를 생산하는 신규한 하이브리도마 셀라인(세포주)에 관한 것이다. 상술한 MoAb중 적어도 1종(XMMEN-J5D)은 또한 그램 포지티브 박테리아상에도 존재하는 에피토프와 결합한다. 세포 배양물중에서 무한 증식할 수 있는 능력을 지진 영구증식성 세포인 골수종 세포, 그리고 면역 세포 숙주를 그램 네가티브 박테리아 제제로 면역시킴으로써 얻어진 작동자인 면역세포를 융합시킴으로써 하이브리도마가 제조된다. 리포폴리사카라이드에 대한 단일클론 항체를 생산하는 몇가지 개별적인 하이브리도마 셀라인이 발표된 바 있으나, 본 발명은 종래 기술에 리포폴리사카라이드-결합 에피토프들에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마의 전체군을 추가한다.

본 발명의 하이브리도마 셀라인에 의해 생산된 단일클론 항체는 세균 감염질환의 검진, 그램 네가티브 박테리아에 의해 유발되는 감염질환 및 세균 내독소증의 치료 및 예방에 유용하다.

본 발명은 통상적으로 그램 네가티브 박테리아와 결합되어 있는 리포폴리사카라이드(LPS)상에 존재하는 하나 또는 그 이상의 에피토프와 결합하는 단일클론 항체(MoAbs)를 생산할 수 있는 특정한 하이브리드 세포와, 이들의 기능적 등가물을 포함한다. 또한 본 발명은 박테리아 감염질환의 검진, 치료 및 예방에 상기 화합물들을 사용하는 방법도 제공한다.

하이브리도마 생성과 단일클론 항체 생산은 종래 기술에 공지되어 있는 많은 다양한 기술들을 이용하여 실시할 수 있다. 기본적으로 이러한 공정은 먼저 생체내 또는 시험관내에서 항원으로 미리 자극을 가한 포유동물의 비장으로부터 면역 세포를 얻는 단계를 포함한다. 이어서 이들 세포들은 세포 배양물중에서 무한증식하여 영구적으로 면역 글로불린을 분비하는 셀라인을 생성하는 형질전환된 세포 또는 골수종 세포와 같은 세포에 융합시킨다. 생성된 융합 세포 또는 하이브리도마를 배양하며, 형성된 콜로니에 대하여 목적하는 단일클론 항체 생산여부를 스크리닝 한다. 이러한 항체를 생산하는 콜로니를 클로닝시켜 생체내에서 또는 시험관내에서 배양하여 항체를 대량으로 생산한다(이러한 세포를 융합시키는 이론적인 기초 및 실제적인 방법론은 Kohler and Mikstein, Nature(1975) 256 : 495에 기술되어 있다-참고). 이러한 방법들에 관하여서는 이하에서 보다 상세히 설명하고자 하며, 아울러 본 발명이 속하는 당해 기술분야에 숙련된 이들에게 있어서 본 발명의 범주를 벗어나지 않는 한도내에서 이들 기술을 변형 및 보완하는 것이 가능하다는 것을 밝혀두는 바이다.

포유동물의 임파구는 생체내에서 이 동물을 면역시키서나 또는 시험관내에서 그램 네가티브 박테리아의 전체 세포 또는 세포 추출물 또는 유리 리포폴리사카라이드와 접촉시켜 면역시킨다. 충분한 항체역가를 얻기 위해서, 2,3주 간격으로 필요한만큼 반복한다. 세포 또는 세포 추출물을 적합한 용제 또는 보조제와 혼합한다. 최종항원 추가 접종 후, 동물을 죽인뒤, 비장세포를 분리한다.

포유동물의 골수종 세포와의 융합처리 또는 세포 배양물중에서 무한 증식할 수 있는 다른 파트너와의 융합처리는, 예컨데 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 기타 융합 제제를 사용하여 공지의 표준기술로 수행할 수 있다(Milstein과 Kohler, Eur. J. Immuno1(1976) 6 : 5l1-참고). 이 영구중식성 세포주는 쥐에게서 얻는것이 바람직하나, 집쥐 및 인간(이들로만 제한되지 않음)을 포함한 기타 다른 포유동물 종의 세포에서도 얻을 수 있으며, 상기 영구 세포주는 우수한 융합능을 갖도록 하고 또한 성장을 촉진시킬 수 있도록 특정한 영양소의 이용에 필수적인 효소가 결핍되도록 하여 선택된다. 이러한 많은 셀라인들이 당해 기술분야에 숙련된 이들에게 공지되어 있으며 다른 것들도 서술되어 있다. 결핍효소로서는 티미딘 키나제(TK) 또는 히포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT)를 예시할 수 있다. 이들 효소 결핍으로부터, 예컨대 히포크산틴-아미노프테린-티미딘 배지(HAT)상에서 성장할 수 있는 융합 세포를 선택할 수 있게 된다. 면역 글로불린을 분비하지 않는 세포주로부터 유도된 영구증식성 융합 파트너를 이용하는 것이 바람직하다.

개별적인 융합 세포들을 개별적인 조직 배양 웰에서 성장시킨다. 방사선을 쪼인 흉선 세포 또는 다른 세포와 같은 피더 세포(Feeder cel1)를 사용하여 이들 세포의 생존력을 증가시킨다. 개개의 웰로부터 하이브리도마 배양 상청액을 취하여 당해 기술분야분야에 공지되어 있는 효소-결합 면역분석(EIA) 및 면역도트(immunodot) 분석법과 같은 다른 적당한 검출 방법들을 이용하여 정제된 리포폴리사카라이드 또는 전체 그램 네가티브 박테리아와 항체의 결합을 분석한다. 전자의 경우 배양 상청액을 리포폴리사카라이드로 피복된 반응 웰상에 넣는다. 배양 후, 이 반응 웰을 세척하고, 항-LPS 항체와 반응하는 라벨된(labelled) 항체를 통하여 항원에 결합되어 있는 잔류 항체들을 검출한다. 적합한 라벨로서는 방사성 동위체, 발광성 기질인 형광제, 효소 라벨의 성분을 들 수 있다.

면역 도트 분석 방법은 항-LPS 항체를 형질발현하는 클론을 선별하는데도 또한 이용된다(Towbin, et al., Immnol, Method(1984) 72 : 313-참고). 정제된 LPS를 "도트(점)"로 세룰로오스 니트레이트 맴브레인에 가한 후 건조시킨다. 젤라틴 용액중에서 블로킹 처리한 후, 맴브레인을 배양 상청액, 항-쥐의 Ig-퍼옥시다제 콘쥬게이트 용액 및 4-클로로-1-나프탈 용액에 순서대로 침지시키면서, 인산염 완충식염수(PBS)로 사이사이에 세척한다. 반응성 면역 글로불린을 형질발현하는 클론이 착색된 점상태로 나타난다.

당해 기술분야에 공지된 기타 다른 스크리닝 시스템을 이용할 수도 있다.

생쥐의 복강내에 클론을 주입한 뒤, 복수액을 취하여 하이브리도마가 분비하는 단일클론 항체를 대량으로 생산한다. 상기 생쥐는, 바람직하게는 프리스탄(pristane) 또는 다른 종양 촉진제로 프라임 처리 되었으며 화학적으로 또는 방사선을 조사하여 면역 억제시킨, 쥐는 뉴질랜드 블랙 또는 Balb/c계 같은 여러계일 수 있다. 생쥐로부터 복수액을 수거하여, 그로부터, 예컨대 CM 세파로즈 컬럼 또는 기타 다른 크로마토그래피 장치를 이용하여 단일클론 항체를 정제한다. 이리하여 높은 역가의 항체들이 회수된다. 또는, 관류 배양 또는 현탁 배양중 한 방법을 이용하여 배치식 또는 연속식 배양공정 등 다양한 방법으로 시험관내에서 하이브리도마를 배양한 후, 배양배지 또는 상청액으로부터 단일클론 항체를 회수한다.

이렇게 하여 생산된 단일클론 항체는 많은 진단 및 치료 용도를 갖게 된다. 이들은 조직들 또는 기타 다른 인체-유래 성분들의 체액 또는 액체에 대하여 표준 면역 분석 프로토콜을 수행함으로써 일반적으로 포유동물내에서 박테리아 또는 그램 네가티브 박테리아의 존재 여부를 시험하기 위한 시험관내 진단제로서 사용된다. 또한, 의료기구, 식료품 또는 물과 같이 박테리아에 의해 오염될 경우 유해한 무생물 추출물을 시험할 수도 있다. 이와 같은 분석에서는 방사선 면역분석, EIA 또는 화학발광 방식을 이용할 수 있다. 한가지 분석법을 예로 들자면, 체액을 본 발명의 항체와 접촉시킨 후, 라벨된 두번째 항체를 이용하여 항체들이 결합되는 박테리아의 존재를 검출한다. 또는, 면역분석법 또는 "샌드위치" 타잎의 분석법을 실시할 수도 있다. 이러한 역사가 깊은 화학적 방법은 당해 기술분야에 주지되어 있으며 ; 예컨대 메쏘즈 인 이뮤노다이아그노시스[Meghods in Immunodiagnnosis, 제2판, 로즈 비가찌(Rose and Bigazzi) 등, 존 윌리 앤드 썬즈, 1980 참고로 본 명세서내에서도 인용함] 및 [캄펠(Campbell) 등, 메쏘즈 오브 이뮤놀로지 Methods of Immunology 더블유. 에이. 벤자민 인코오포레이티드, 1964]에 프로토콜이 발표되어 있다.

본 발명의 단일클론 항체는 또한 국소 박테리아 감염부위, 예를 들면 연조직의 농양 또는 낭포와 뼈의 골수염을 생체내에서 검출하는데 이용될 수도 있다. 예를 들면, 라벨된 항체를 박테리아가 감염된 것으로 추정되는 포유동물에 투여한다. 항체는 포유동물내에 존재하는 박테리아와 선택적으로 결합함으로써 감염부위에 라벨을 집중하게 한다. 이와 같은 용도로 사용하기에 적당한 라벨로서는¹²⁵요오드,¹³¹요오드,⁹⁹테크네튬,¹¹¹인듐과 같은 방사성 동위체를 들 수 있으며, 이들은 표준 방사선 사진 기술을 이용하여 검출할 수 있다. 또는, 단일클론 항체를 강자성 대조제(contrast agents)로 라벨링시키고, 이어서 NMR을 이용하여 검출할 수도 있다. 따라서, 라벨된 항체는 검출가능한 박테리아 농양의 상을 나타낸다. 마찬가지로, 이들 단일클론 항체는, 체액, 분비물 및 추출물 뿐만 아니라 약제, 진단제 또는 진단 및 치료제 제조시에 생산된 액체 중간물질 등에 존재하는 세균성 내독소의 검출 및 이들의 양을 측정하는 방법에도 사용될 수 있다.

단일클론 항-LPS 항체는 환자에게 있어서 그램 네가티브 박테리아 감염 위험성을 예방하기 위한 목적으로도 사용된다. 이들 단일클론 항체를 효과적인 튜여량으로 투여하면 특정 병원균에 대항하여 방어할 수 있는 신체의 잠재적인 기능을 강화시킴으로써 감염 위험성을 경감시켜준다.

본 발명의 단일클론 항체는 강력한 치사성 세균 감염질환 및 패혈증 쇼크를 치료하기 위한 요법에서도 사용된다. 이때, 항체는 단독으로 또는 항생제와 함께 생리학적으로 허용되는 용액중에 용해시켜 정맥내 또는 근육내로 투여된다. 본 발명에 따른 단일클론 항체의 결합특성에 영향을 끼칠우려도 있으나, 보관 및 선적목적으로 이들 제제를 동결건조시킨 후, 투여하기 전에 환원시킬 수도 있다.

단일클론 항체는 리포폴리사카라이드에 대한 특이한 친화력을 가지므로, 이들은 항생제 치료가 소용없는 그램 네가티브 감염질환과 관련된 패혈증 쇼크와 같이 내독소중에 기인된 생명을 위협하는 증상들을 선택적으로 치료하는데 사용된다. 이들 여러가지 단일클론 항체들을 사용한 치료의 효능은 일부 박테리아들의 세포벽에 항체가 결합함으로써, 박테리아의 옵소닌 작용 및 식작용을 촉진시키는 것에 기인된다. 그러므로 단일클론 항체는 박테리아 감염질환의 독성 작용을 없애는 것을 돕는다.

상술한 내용은 인체를 대상으로 하여 본 발명의 유용성을 설명한 것이 당해 기술분야에 숙련된 이들이라면 수의학적 용도로서의 본 발명의 고유한 유용성도 용이하게 이해될 것이다.

전술한 모든 진단, 예방 및 치료용도로 단일클론 항체 및 기타 다른 필요한 시약들 및 알맞은 기구 및 부속품들이 용이하게 입수할 수 있고, 아울러 간편하게 사용될 수 있도록 키트 형태로 제공된다.

이하에는 실시예들을 기술하여 본 발명을 예시하고자 하며, 단 본 발명이 이들 실시예들로만 제한되지는 않는다는 것을 밝혀두는 바이다.

실험

[실시예 1]

하이브리도마 XMMEN-OE5, XMMEN-LY1, XMMEN-LY2

A. 하이브리도마 제조

Balb/c 쥐(Char1es Rivers, Wilmington, MA) 를 E. coli J5-Salmonella minnesota R595중 하나의 가열세포 1×10⁸로 면역시켰다. 균주 E. coli 0111의 변이체인 J5의 LPS, S. minnesota의 Re 변이체인 R595의 LPS, 이들 둘 모두는 외부의 O-특이 측쇄가 결핍된 것으로서 단지, 코어 LPS(지질 A와 코어 올리고 사카라이드)만으로 구성되어 있다. 일차면역화 처리 후, 1달 간격으로 O-특이 측쇄가 결핍된 가열세포 1x10⁸을 복강내로 주입한다(본 실시예는 R595 면역원으로부터 생성된 XMMEN-LY1과 XMMEN-LY2 보다는 E. coli 면역원으로부터 생성된 XMMEN-OE5에 촛점을 맞춘 것이다. 박테리아 공격에 대한 XMMEN-OE5, XMMEN-LYl, XMMEN-LY2에 의해 생산된 MoAb의 예방 효과에 대한 자료가 제공된다).

최종 항원 추가 접종 후 4일 뒤에 면역된 쥐로부터 비장세포를 무균적으로 분리하였다. 일반적인 과정(St. Groth, J. Immuno. Meth.(1980) 35 : 1-참고)에 따라 5×10⁷비장세포를 폴리에틸렌글리콜 4000(Merch. and co., Inc., Rahway, NJ)을 사용하여 Balb/c에서 얻어진 비분비성 쥐 골수증 세포수P63Ag8.653(American Type Culture Collection, Rockville, MD) 과 융합시켰다. 정상적인 Balb/c 흉선세포의 피더층과 함께 예비 배양되었던 배지상에서 96-웰 배양판(Costar, Cambridge, MA #3596)내에(융합 하루전 웰당 1×10⁵세포수) 하이브리드 세포를 가했다. 37℃,10%의 CO₂대기중에서 세포들은 하기배지중에서 처음 이주일간 배양되었다 ; 글리타민, 4.5g/1의 글루코스(Gibco, Santa Clara, CA, #320-1965), 송아지 태아 혈청(10%)(Microbiological Associates, Walkerville, MD), 나트륨 피루베이트(lmM)(Gibco, Santa Clara, CA, #320-1360), 페니실린(50μ/ml)-스트렙토마이신(50μ/ml)(Gibco, Santa Clara, CA, #600-5070)와 히포크산틴(10mM) 및 티미딘(1.6mM)을 0.04mM 아미노프테린(Sigma Chemica1 Co., St. Louis, MO)과 합해서 사용함으로써 제조된 히포크산틴-아미노프테린-티미딘(HAT)를 함유하는 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지에 정상적으로 방치시킨(융합일로부터 2주 방치) 배지는 상기와 동일하였지만 단 배지내에 아미노프테린을 함유하고 있지 않았다(HT 배지).

EIA 및 면역도트 분섭법을 사용하여 융합 후 2-4주 사이의 하이브리드 세포 배양물에 대해 정제된 LPS에 결합하는 항체에 대한 시험을 실시하였다. 반복된 시험에서 양성을 나타낸 배양물들을 제한 희석 기법으로 클로닝시켰다. 간단히 96-웰 조직 배양판(Costar, Cambridge, MA, #3596)중의 웰 하나당 10-1 세포수 사이로 희석율을 변화시키면서 세포를 배양하였다. 단지 콜로니 하나만을 포함하는 웰이 현미경 검사에 의해 확인되었으며 그후 EIA를 사용하여 항-J5 또는 항-R595의 활성도를 시험하였다. 양성 클론을 24-웰 조직 배양판(Costar, Cambridge, MA #3524)상에 확산시키고 재클론하여 상기와 똑같은 방법으로 재시험하였다. XMMEN-OE5, XMMEN-LY1 및 XMMEN-LY2로 명명된 세개의 클론이 단일클론 항체를 안정하게 분비하는 것으로 나타났다 : 이 단일클론 항체는 표준 방법을 이용한 방사 면역 확산법 및 EIA에의해 분석한 결과 면역 글로불린류 IgM이라는 것이 밝혀졌다. 하이브리도마 XMMEN-OE5와 MMEN-LY1은 American Type Culture collection(A.T.C.C.), 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, USA애 기탁되어 있다. 기탁은 1986년 4월 24일자로 이루어졌으며 그 기탁번호는 각각 HB 9081과 HB 9082이다. 또한 하이브리도마 XMMEN-OE5와 XMMEN-LY1은 한국종균협회에 1987년 3월 25일자로 수탁번호 제10342호 및 제10343호로 기탁 완료되었다.

복강내에서 하이브리도마를 배양하기 위해서 Balb/c 쥐(Charles River)를 사용하였다. 0.5ml의 프리스탄(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)을 일주일전에 복강내 주사하여 예비 처리시킨 쥐에 3×10⁶하이브리도마 세포를 다시 복강내로 주사하였다. 하이브리도마를 주사한 후 11-15일간 수거된 복수액을 방사-면역확산법 (Meloy, Radial Immunodiffusion, Springfield, VA, Plate # J-304)에 의해 측정한 결과 평균 2mg/ml의 항체를 포함하고 있었다. 복수액중의 항체를 본 기술분야에 공지된 방법으로 CM 세파로즈컬럼(Phamacia, Inc., Piscataway, NJ)을 사용하여 고속 이온교환 크로마토그래피시켜 정제하였다.

다량의 글루코스를 함유한 조직 배양 배지(DMEM 0.45% 글루코스, 2mM 글루타민, 2mM 피루베이트)를 사용하여 세포주를 시험관내에서 1.5

통상적인 물질환경 제어장치(Chemostat)내에서 배양하였다. 희석 속도가 시간당 0.02

인 정체상태(Steady State) 조건을 유지시켰을 때 세포 농도는 5-6×10⁵ml이며 84%의 생존률을 나타내었고 MoAb 농도는 25μg/ml이며, 부피당 생산력은 시간당 0.63μg MoAb 비생산력은 30μg MoAb/10⁶세포/일(日)이었다.

B. XMMEN-OE5 MoAb 효소 면역분석(ElA) 억제작용

1. 항원으로 피복된 EIA 플레이트의 제조 : E. coli J5 리포폴리사카라이드(List Biologicals, Campbel1, CA)를 0.01PBS(pH 7.4)중에 20μg/ml로 희석하였다. 이 용액 100μ

를 EIA 반응 플레이트(Gilford Diagnostics, Oberlin, OH)의 각 웰에 가한 뒤 실온(RT)에서 밤새도록 배양하였다. 다음날 플레이트를 PBS로 2회 세척한 뒤 2% 소의 혈청 알부민(Sigma Chemical Co., St, Louis, Mo)을 웰당 150μ

씩 가하여 블록킹 처리하고 이 용액을 실온에서 밤새도록 배양하였다. 다음날 플레이트를 PBS로 2회 세척한 뒤 즉시 사용하거나 또는 4℃에 보관하였다.

2. 억제작용분석 : 정제된 XMMEN-OE5 단일클론 항체를 0.0lM PBS중에 2μg/ml로 희석한 뒤 정제된 항원(E. coli J5 리포폴리사카라이드(LPS), 살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota) R595 LPS, 살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota) R595 지질 A, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) Fisher type 1LPS ; 이 모두는 List Biologicals, Campbell, CA에서 시판) 일정량과 혼합시켰다. 항제-항원 혼합물을 실온에서 밤새도록 배양하였다.

다음날, 여러가지의 항체-항원 혼합물 100μ

를 E. coli J5 LPS로 피복된 EIA 웰에 가한 뒤 실온에서 1시간동안 반응시키고, PBS로 2회 세척하였다. 다음에 염소의 항-마우스 IgM-퍼록시다제 콘쥬게이트(Cappel, Malvern, PA) 100μ

/웰을 첨가하고, 또한 실온에서 1시간동안 반응시켰다. PBS로 최종적으로 3회 세척한 뒤 효소 기질(ABTS, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)을 @100μ

/웰로 가하고 이것을 RT에서 45분간 반응시켰다. 효소반응은 l0mM 나트륨 아지드를 100μ

/웰로 첨가함으로써 중지되었다.

Gilford Manual EIA 판독기를 이용하여 405nm에서의 흡광도를 기록하였다. 결과는 표(1)에 요약했다.

효소 면역분석법(EIA)으로 측정된 고체상 J5 LPS에 대한 XMMEN-OE5 단일클론 항체의 결합 억제작용

[표 1]

C. XMMEN-OE5 MoAb의 면역도트 혈청 테스트

항원을 1μ1 "도트"상태로 0.20μm 셀룰로오스 니트 레이트 맴브레인(Sartorius)에 적용시킨 뒤 5분간 공기중에서 건조시켰다(사용된 농도는 다음과 같다 : 정제된 LPS에 대해 PBS중의 100μg/ml, 가열된 세포 제제에 대해 1×10⁸세포/ml).

항원이 스포트된 맴브레인을 젤라틴(Difco, Detroit, MI) 1% 용액(wt/vol PBS)으로 실온에서 30분동안 블록킹 처리했다. 급속히 세척(1분간 2회)한후, XMMEN-OE5 항체(PBS중의 2-5μg/ml)를 30분간 RT에서 상기 맴브레인과 함께 배양하였다. 맴브레인을 PBS도 3회 급속히 세척한 뒤 염소의 항-쥐 IgM-퍼록시다제 콘쥬게이트(Cappel, Malvern, PA)와 함께 30분간 실온에서 배양하였다. PBS로 상기 맴브레인을 3-4회 세척한후, 기질 (4-클로로-1-나프톨, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)을 상기 맴브레인과 함께 RT에서 배양하였다. 2-5분 이내에 양성 반응은 자주색 도트를 나타내었으며 이것은 육안으로 볼때 4+(색상이 매우 선명함) 내지 1+(흐림)의 등급을 나타내었다. 결과는 표 (2)에 요약하였다.

XMMEN-OE5 단일클론 항체 면역도트 혈청 테스트

[표 2]

D. XMMEN-OE5 MoAb의 슬라이드 응집 반응

100μl의 XMMEN-OE5 단일 클론항체(PBS중의 0.5mg/ml)를 동부피의 살아 있는 박테리아 세포(약1×10⁹/ml)와 유리 슬라이드 상에서 혼합시켰다. 양성 응집반응은 15분내에 육안으로 등급을 표시할때 강(4+) 내지 약(1+)으로 나타났다. 결과는 표(3)에 요약하였다.

XMMEN-OE5 단일 클론 항체 슬라이드 응집반응

[표 3]

E. 생체내에서 XMMEN-OE5 MoAb의 효능

1. 생체내 실험 모델에 관한 설명 :

모든 생체내 효능 실험 연구에 있어서 생후 4-6주령의 평균 20g의 체중 지닌 암컷 CD-1 쥐가 CharlesRiver Breeding Laboratories에서 구입하여 사용되었다. 다양한 시간 간격에서 XMMEN-OE5 항체를 여러가지 투여량으로 복강내 주사하였다. 공격균은 하기한 것중 하나로 구성되어 있다.

- Fisher 혈청형 2인 UCLA Medical Center의 환자로 부터 분리된 Fisher 혈청형 2, 혈청내성균인(Pseudomonas aeruginosa) 균주 3632.

- Buffalo children's Hospital의 Dr. Erwin Neter로 부터 구입한 혈청 민감성 균주로 특징지워진 E.coli 혈청 그룹 014K7. 이 균주는 인체의 그램 네가티브 감염 질환에서 분리된 가장 일반적인 장내균과 세균이다.

- UCLA Medical Center의 환자로 부터 분리된 혈청 내성이 있으며 피낭된 균인 E.coli 04K12.

- Atlanta, Georgia의 the Centers for Disease Control에서 구입한 혈청 내성균인 E.coli 085H9.

상기 연구를 위해 박테리아는 변형되지도 않았으며 또한 쥐의 공격용으로 쥐내에 존재하지 않는 것이다. 박테리아 접종물을 제조하기 위해서 균을 트립티케이스 콩 아가 플레이트(trypticase soyagar plate)내에서l6-18시간 동안 배양하였다. 그후 면봉이 끝에 달린 애플리케이터를 사용하여 부드럽게 세척함으로써 박테리아 콜로니를 수거한 후 원심분리하고, 재현탁시킨 뒤 최종적으로 세번더 세척하였다. 박테리아 저장 용액은 MacFarland-1의 광학밀도를 갖는 현탁액으로 부터 제조되었다. 식염수로 10배로 희석한 희석액들을 아가 플레이트 상에 접종시켜 현탁액중의 균의 양을 측정하였다.

이들 희석액의 표본 샘플(O.1ml)을 동물에 접종시켜 치사율을 측정하였다. 개별적인 공격 실험을 통하여 쥐에 일정한 치사 효과를 일으키는 균의 최저량-LD₁₀₀을 측정할 수 있다. 각각의 그램 네가티브 균에 대한 LD₁₀₀투여량은 후술되는 연구에 사용하였다.

2. 박테리아 공격에 대한 예방

항체 방어에 대한 일련의 연구에서, 4가지의 그램 네가티브중 하나를 LD₁₀₀투여량으로 가해 공격을 개시하기 전에 XMMEN-OE5, XMMEN-LY1 및 XMMEN-LY2를 쥐에 4-18시간의 간격을 두고 투여하였다. 이 연구 결과는 표(4) 및 (5)에 나타내었는데 이것은 4개의 공격용 미생물중 3개에 대하여 항체가 상당한 방어능을 제공했음을 입증해 주고 있다. 이 연구 내용을 요약하면 다음과 같다.

1) 처리 : 공격 처리 하기 48시간 및 24시간 전에 XMMEN-OE5 400μg(20mg/kg)을 복강내 투여한다. 공격처리 : 쥐 1마리당 5×10⁸세포의 양으로 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 균주 3632를 복강내 주사한다.

결과 : 48시간이 경과했을 대 대조용 식염수를 투여 받은 쥐 4마리중 1마리가 생존하였으며 XMMEN-OE5를 투여 받은 쥐 4마리는 모두 생존하였다.

2) 처리 : 공격처리 하기 2시간 전에 XMMEN-OE5 800μg(40mg/kg)을 복강내 주사한다. 공격처리 : 쥐 1마리당 5×10⁸세포의 투여량으로 E. coli 균주 014K7을 복강내 주사한다.

결과 : 48시간 경과후에 대조용 식염수를 투여 받은 동물 4마리는 모두 죽은 것에 비해 XMMEN-OE5를 투여 받은 쥐는 8마리중 7마리가 생존하였다.

3) 처리 : 공격 처리 하기 48시간 및 24시간 전에 XMMEN-OE5 400μg(200mg/kg)을 복강내로 투여한다.

공격처리 : E. coli 균주 085 : H9를 쥐 1마리당 5×10⁷세포의 양으로 주사

결과 : 48시간 경과후 대조용 식염수를 투여 받은 쥐 12마리중 4마리가 생존한데 비해 XMMEN-OE5를 투여 받은 쥐 12마리중 5마리가 생존하였다.

4) 처리 : 공격 처리 하기 4시간 전에 XMMEN-OE5 400μg(20mg/kg)을 복강내로 투여하였다.

공격 처리 : 쥐 l마리당 5×10⁷세포의 양으로 E. coli 균주 04 : Kl2를 복강내로 투여한다.

결과 : 48시간 경과후에 대조용 식염수를 투여 받은 쥐 5마리중 1마리가 생존한 것에 비해 XMMEN-OE5를 투여받은 쥐 5마리중 5마리가 모두 생존하였다.

요약하자면 본 연구는 공격용 균 4개중 3개-녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 균주 3672, E.coli 균주 014K7와 E.coli 균주 04K12--에 대하여 쥐를 XMMEN-OE5 항체로 처리한 결과 상당한 방어 기작이 제공되었음을 알수 있다. 본 실험에서 E.coli 균주 085H9에 대해서는 방어능이 관찰되지 않았다.

[표 4]

CD-1 쥐(암컷, 체중 22g)에 컬럼 정제한 항-코어 내독소 단일 항체인 XMMEN-LY1 또는 XMMEN-LY2중 하나를 0.4mg씩 하루에 1번 주사하였다. 대조용 동물에는 식염수(0.2ml)을 하루에 2회투여하였다. 상기 쥐에 박테리아 LD₁₀₀투여량을 복강내 주사하였다. 감염이 일어난지 48시간 후에 생존수를 기록하였다.

CD-1 쥐를 살아 있는 박테리아로 공격했을 때 단일 클론 항체를 사용한 방어 기작

[표 5]

3. 내독소 공격에 대한 예방 :

박테리아 내독소를 중화시키는 XMMEN-OE5항체의 능력이 상기와 같이 똑같은 동물 모델을 사용하여 입증되었다. 중화 연구를 시행하기 위해서 J5.E.coli 변이 균주 0111에서 얻은 정제된 내독소를 List Laboratories, Campbell, CA에서 구입하였다. 쥐에 있어서 대독소 LD₅₀값은 쥐 l마리당 0.25mg이었으며 LD₁₀₀은 쥐 1마리당 0.50mg이었다.

내독소로 공격처리 하기 24시간전에 쥐에게 800μg(40mg/kg)의 XMMEN-OE5를 복강내로 투여하고 다른 쥐에게는 복강내로 대조용 식염수를 투여하였다. 표(5)에서 알수 있는 바와같이 그 결과는 LD₅₀내독소의 공격에 대해 항체로 처리된 쥐 17마리중 12마리(71%)가 생존한 반면 대조용 쥐는 17마리중 7마리(41%)가 생존하였고, LD₁₀₀내독소 공격에 대해서는 항체 처리된 쥐 17마리중 5마리(29%)가 생존하였고 대조용 쥐는 17마리중 3마리(18%)가 생존했다는 것이 나타났다. 이 결과는 수동 방어 기작 연구에 있어LD₅₀내독소 공격후 XMMEN-OE5가 생존율을 상당히 증가시켰다는 것을 나타내 주고 있다. 또한 이러한 방어 효과는 투여된 공격용 내독소의 양에 따른다는 것도 알았다. 결과는 표(6)에 나타내었다.

[표 6]

4. 보조제 치표법 연구

감염 개시후 쥐에 투여된 항생제 요법을 함께 사용했을 때의 XMMEN-OE5의 치료 효능을 측정하기 위해 하기의 실험이 수행되었다.

a) 시험 연구

예비 연구에서 암컷 CD-1 쥐에게 Pseudomonas aeruginosa 균주 3632(1.6×10⁸세포/쥐)를 감염시켰다. 공격 처리 직후 항생제를 항내독소 항체와 함께 또는 단독으로 근육내로 쥐에 투여하였다. 항생제는 단일 용량으로 아마카신(1.56mg/쥐), 세포 페라존(12.5mg/쥐)로 구성되어 있었다. 공격 3시간후에 XMMEN-OE5 0.4mg(20mg/kg) 또는 대조용으로 수를 쥐에 정맥내 주사하였다. 이 연구 결과 항내 독소 항체와 함께 항생제를 투여 받은 쥐 15마리중 11마리가 생존한데 비해 항생제를 단독으로 투여 받은 쥐 15마리는 5마리가 생존하였다(P=0.02(Fisher의 테스트에 의한 값)).

b) 확장된 치료법 연구

치료법 연구는 추가의 그램 네가티브 감염 질환을 함께 연구하였다. 전술한 연구에서 처럼 암컷 CD-1쥐에 살아 있는 그램 네가티브 박테리아 LD₁₀₀의 양을 주사하였다. 접종후 두시간 후에 항생제 또는 대조용 식염수를 근육내로 주사하였다. 4가지의 박테리아 균주는 항생제에 대한 민감도가 다르므로, 하기한 계산된 항생제 투여량을 사용하였다(단위 : mg/쥐) :

그램 네가티브 균으로 접종한 후 4시간째와 항생제로 처리한 후 두시간째에 쥐에 XMMEN-OE5 항체 또는 대조용 식염수를 정맥 주사 하였다. 상술된 4개의 그램 네가티브균에 대해 모두 다섯 그룹의 쥐에게 다음과 같은 일련의 처리를 하였다. 치사에 대한 평가는 초기의 접종후 48시간후에 이루어졌다.

그룹 1 : 박테리아 LD₁₀₀+(항생제+XMMEN-OE5 항체 300μg의 조합물)

그룹 2 : 박테리아 LD₁₀₀×(항생제+XMMEN-OE5 항체 75μg 조합물)

그룹 3 : 박테리아 LD₁₀₀+식염수+XMMEN-OE5+항체 300μg

그룹 4 : 박테리아 LD₁₀₀+(항생제+식염수 조합물)

그룹 5 : 박테리아 LD₁₀₀+식염수+식염수.

c) 확장 연구 결과

효능 연구에 사용된 250마리의 쥐, 잡쥐 또는 기니아 피그등 어느 것도 타격을 주는 독성이 나타나지 않았으며 또한 인간이외의 영장 동물도 상기 독성 연구에서 처럼 처리되었을때 독성이 나타나지 않았다.

내독소로 피복된 웰에 결합한 다량의 XMMEN-OE5 항체에 대한 효능 실험이 EIA에 의해 성공적으로 입증되었다. 표(7)에 요약되어 있는 이 연구 내용은 항생제 단독으로 투여된 것과 비교하였을 때 XMMEN-OE5 다량+항생제를 함께 투여받은 쥐의 수명이 증가되었다는 것을 나타내고 있다.

[표 7]

테스트된 그램 네가티브 균 4개중에서 E.coli 0l4K7에 대해 최소의 효능이 관찰되었다. 한편, 300㎍의 XMMEN-OE5+항생제 조합물의 치료법은 나머지 3개 균중-Pseudomonas aeruginosa 3632, E.coli 08H59 또는 E.coli 04K12-어느 하나에 의한 공격을 실시했을 때 높은 생존율을 나타내었다(표 6참고).

5. 효능 실험의 요약

본 실험에 사용된 동물 모델에 있어 여러가지 변수에도 불구하고 XMMEN-OE5는 1) 여러가지 그램 네가티브 균에 대한 방어를 제공하며 ; 2) 투여량 의존적인 방식으로 정제된 내독소의 치사량을 중화하고 ; 3) 확립된 그램 네가티브 감염질환의 치료시에 통상의 항생제에 대한 보조제로서 적절한 효능을 갖음을 알 수 있다.

[표 8]

F. I 기 : 임상 실험

하이브리도마 XMMEN-OE5에 의해 생산된 단일 클론 항체의 I기 임상실험에서 얻어진 데이터를 다음과 같이 보고한다.

1. 처음 환자 F.R.은 그램 네가티브 패혈증으로 추정되는 60살 남자였다. 그는 정맥내로 1시간 동안 XMMEN-OE5 0.1mg/kg(총 투여량 8.5mg)을 투여 받았다. 부작용은 없었다. 혈액 배양물은 이 환자가 그램 네가티브 균혈증에 걸리지는 않았지만 토루로프시아(Torulopsia)에 의한 진균이 일으키는 병에 걸렸음을 알려 주었다. 진균성 농양을 외과 수술로 제거하고 항체를 투여한지 3주일후부터 그는 정상 상태가 되었다.

2. 두번째 환자 T.G.는 그램 네가티브 균혈증과 신우산염으로 인한 요관장애로 진단된 57살 여성이었다. 이 여성은 신루설치술 대치외과 수술을 받은후 1시간 반동안 정맥내로 XMMEN-OE5 0.5mg/kg(총투여량 36mg)을 투여받았다. 아무런 부작용도 없었고 열이 빨리 내렸으며 투여된지 12시간이 지난 후에는 열이 없었다. 이렇게 열이 빨리 내린 것은 항체의 투여 때문이었다.

3. 세번째 환자 K.S.는 불안정한 앙기나(angina)에 의한 관동맥 질환을 심하게 앓고 있는 60세의 여성이었다. 그녀는 심한 콩팥 장애의 과도한 에피소드 합병증 때문에 관동맥 외과 수술을 받았다. 수술후 열이 39℃가 올랐으며 그녀의 혈액으로 부터 아신토 박터(Acinetobacter)가 배양되었다. 항생제를 투여하고 수술후 10일뒤에 1시간 30분 동안 XMMEN-OE5 0.5mg/㎏ (총 투여량 약 42mg)을 정맥내로 투여하였다. 항생제 및 항-내독소 항체 처리후 혈액 배양물은 음성 상태가 되었고 이 여성의 상태는 호전되었다. 항체투여 1주일 후부터 이 환자는 안정된 상태가 되었다.

4. 네번째 환자 S.D.는 60살된 여성 환자로서 밝혀지지 않은 병인에 의한 지속적인 그램 네가티브 균혈증(Klebsiella)을 앓고 있었다. 감염원에 대한 광범위한 연구 결과 별 증거는 없었지만 대부분 신우신염으로 인한 뇨장애가 나타났다. 병원에 입원한지 삼일째 되는 날 항생제 치료에도 불구하고 이 환자의 혈액 배양물은 다시 크렙시엘라(Klebsiella)균이 자라고 있음을 나타냈다. 체온은 40℃(104.5°F)까지 올랐다. 임상상태를 개선시키기 위한 시도로서 농양을 찾아내기 위해 그녀의 몸에 비상 CT 스캔을 실시하였지만 농양 또는 다른 감염부위는 발견되지 않았다. 이 환자를 2시간 30분 동안 정맥내 주사로 XMMEN-OE5 단일클론 항체 2mg/㎏(총 투여량 157mg)을 투여하였다. 투여 12시간후 그녀의 체온은 약 37℃ 이하로 내려 갔으며 임상 상태 또한 현저히 개선되었다. 혈액 배양물을 반복 배양하여 그램 네가티브 균이 자라도록했다. 계속된 그램 네가티브 패혈증에도 불구하고 단일클론 항체 투여이후 그녀의 임상 상태는 현저히 개선되었다. 항생제 치료법은 다른 약과의 조합물로 대체한 후 이 환자의 혈액 배양물은 음성 상태가 되었다. 항생치료 4일후 그녀의 상태가 호전되었다.

[실시예 II]

- 하이브리도마 XMMEN-J5D

A. XMMEN-J5D 하이브리도마의 제조

골수종 세포주 P63Ag8.653 대신 골수종 세포주 SP2/0-Ag14를 사용한 것을 제외하고는 상기와 똑같은 하이브리도마 프로트콜을 사용하여 XMMEN-J5D라 명명되는 두번째 클론을 생산하였다. 이 클론은 전술한 기법에 의해 면역 글로불린 준부류 IgG2a로 측정되는 단일클론 항체를 안정하게 분비하는 것으로 밝혀졌다. 하이브리도마 XMMEN-J5D는 1986년 4월 24일자로 ATCC에 기탁되었으며 기탁번호는 HB9083이었다. 또한 이 하이브리도마 XMMEN-J5D는 1987년 3월 25일자로 한국종균협회에 수탁번호 제 10344호로 기탁되었다.

B. EIA에 의해 측정된 XMMEN-J5D MoAb 결합활성

1. 모든 박테리아에 대한 MoAb 결합성의 검출

살아있는 박테리아를 정상 식염수 1ml 당 1.5×1O⁸으로 조절하였다. 밑바닥이 편편한 모양인 폴리비닐플레이트를 웰당 상기 현탁액 50μl씩으로 피복한 뒤 30분 동안 2000×g에서 원심분리하였다. 펠릿화된 세포에 0.25% 글루타르알데하이드/PBS 150μl/웰을 가함으로써 15분 동안 실온에서 고정시켰다. 상청액을 딸아버리고 플레이트를 PBS로 세척한 뒤 0.1% 젤라닌/PBS 150μl/웰을 가함으로써 밤새도록 블록화 처리했다.

플레이트를 다시 세척한 뒤 친화 정제된 XMMEN-J5D MoAb(1μg/ml) 100μ1 /웰을 피복된 항원과 1시간 동안 실온에서 반응시켰다.

세척후 염소의 항-마우스 IgG 퍼록시다제 콘쥬게이트(100μl/웰)를 1시간 동안 RT에서 반응시켰다. 최종 세척후 ABTS 기질(100μl/웰)을 가하여 RT에서 45분간 반응시켰다. Titertek ELISA 판독기(FlowLabs, McLean VA)를 사용하여 405nm에서의 흡광도를 기록했다.

결과는 표(9)에 요약했다.

박테리아에 대한 XMMEN-J5D McAb결합도의 효소 결합면역 흡착분석법(EIA)

[표 9]

* 명확히 양성인 백그라운드 위

2. 리포폴리사카라이드(LPS)와 결합하는 MoAb의 검출

정제된 항원 제제를 0.05% 트리에틸아민/H₂O 또는 0.05M MgCl₂/PBS중 하나에 25μg/ml 희석시켜 용해되는지 안되는지 여부를 살펴본다. 이들 항원 100μl/웰을 96-웰인 밑바닥이 편편한 모양의 플리스티렌 EIA 플레이트상에 피복시켰다. RT에서 밤새도록 배양한 후 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 0.01M PBS중에서 0.10% 젤라틴으로 블록화처리하고 0.01M PBS로 세척하였다.

친화 정제된 XMMEN-J5D MoAb를 0.10%, 젤라틴/PBS중에서 10μg/ml로 희석한 뒤 1시간 동안 RT에서 피복된 항원과 반응시켰다. 플레이트를 세척한 뒤 염소의 항-마우스 IgG-퍼록시다제콘쥬게이드 100μl/웰을 1시간 동안 RT에서 상기 항원과 함께 배양시켰다. 세척후, 기질인 2,2'-아지노-디-(3-아릴-벤즈티아졸린 설포네이트(6))(ABTS) 100μl/웰을 첨가하면 양성 반응이 검출되었다. 칼러 현상이 45분간 진행되었다. 405nm에서 광학밀도(C.D.)가 기록되었다.

결과는 표(l0)에 요약되어 있다.

리포폴리사카라이드(LPS)에 대한 XMMEN-J5D 결합 활성도

[표 10]

C. XMMEN-J5D MoAb 면역 도트 혈청 테스트

항원을 1μl"도트"상태로 0.20μm 셀룰로오스 니트레이트 맴보레인(Sartorius)에 가한 뒤 5분간 공기중에서 건조시켰다 (사용된 농도는 PBS중에서 100μg/ml 정제된 LPS). 항원이 스포트된 맴브레인을 젤라틴(Difco, Detroit. MI) 1% 용액(wt/PBS부피)으로 30분간 실온에서 블록화 처리했다. 급속한 세척(1분간2회) 후 XMMEN-J5D(PBS중의 2-5μg/ml)를 RT에서 30분간 맴브레인과 함께 배양시켰다.

맴브레인을 PBS로 3회 급속히 세척한 뒤 염소의 항-쥐 IgG-퍼록시다제 콘쥬게이트(Cappel,Malvern,PA)와 함께 30분간 RT에서 배양시켰다. PBS로 맴브레인을 3-4회 세척한 후 기질(4-클로로-l-나프톨, Sigma Chemical Co., St, Louis,MO)을 실온에서 맴브레인과 함께 배양하였다. 양성 반응은 2-5분이내에 자주색 도트상태로 나타났으며 이것은 육안 관찰시 4+(매우 젼명함) -1+(흐릿함)으로 등급이 매겨졌다.

결과는 표(11)에 요약했다.

정제된 LPS와의 XMMEN-J5D 면역도트 혈청 테스트

[표 11]

녹농균(Pseudomonas aeruginosa) PAC 605 LPS와 아시네도박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) LPS를 Darveau et al., J.Bacte.(l983) 155 : 831에 제시된 방법에 따라 정제하있다. 기타 다른 모든 LPS 제제는 List Biologicals, Campbell, CA에서 구입한 것이다.

E. 생체내에서 XMMEN-J5D MoAbs의 효능

1. 공격실험:살아 있는 박테리아를 복강내로 공격하기 24시간전에 단일 클로 항체 150μg을 복강내로 CD-1 암컷 쥐에 주사하였다.

결과는 표(12)에 나타나 있다.

공격실험요약

[표 12]

* (3632 균주)

[실시예 III]

하이 브리도마 XMMPS-605

A. XMMPS-605 하이브리도마의 제조

뉴질 랜드산 흑쥐 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) 를 완전 프로인드 보조제 (Difco Laboratories, Detroit, MI)중에서 포르말린으로 죽인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 균주 PAC 605 1×10⁸세포로 면역시켰다. 균주 PAC 1R의 박테리오 파지 내성 변이주인 PAC 605의 LPS는 의부 O-특이 측쇄가 부족하며, 나트륨도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 분석(Meado et al., J. of General Microbiology(1984)130 : 631-644)에 의해 나타난 것처럼 코어 LPS(지질 A와 코어 올리고 사카라이드)로만 구성되어 있다. 일차 면역후, 이 쥐에 0-특이 측쇄가 부족한 포르말린으로 죽인 P. aeruginosa 세포 1×10⁸을 1달 간격으로 복강내 추가 접종하였다.

최종 항원을 추가접종한지 4일뒤에 면역된 쥐로부터 비장 세포를 무균적으로 분리하였다. St. Groth, J.Immuno, Meth.(1908)35 : 1)에 기술된 일반적인 방법에 따라 5×10⁷비장세포를 같은 수의 Balb/c 유래의 비분비성 쥐 골수종 세포주 SP2/0-AGl4와 폴리에틸렌 글리콜 4000(American Type. Culture Collection, Rockville, ND)을 사용하여 융합시꼈다. 하이브리드 세포를 뉴질랜드 흑쥐 흉선 세포의 피더층과 함께 예비 배향시킨 배지상에서 96-웰 배양판중에 (웰당 l×10⁵셀, 융합하기 하루전)(Costar,Cambridge,MA,#3596)에 가했다. 10% CO₂대기와 37℃에서 처음 2주간 하기의 성분으로 구성되어 있는 배지중에서 세포를 배양하였다 ; 글루타민, 글루코스 4.5g/1(Gibco,Santa Clara,CA,#320-1965), Fetal 송아지혈청(10%)(Microbiological Associates,Walkerville,MD), 나트륨 피루베이트(1mM)(Gibco.Santa Clara, CA,#320-1360) 페니실린(50μ/ml)-스트렙토마이신(50μ/ml)(Gibco,Santa Clara,.CA,#600-5070), 히포크산틴-아미노프테린-티미딘(HAT) [0.04mM 아미노프테린(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)와 1.0%의 v/v(100X) 히포크산틴-티미딘 보충제(Microbiological Associates, Walherville,MD,#17-782A)를 혼합해 제조된 것] 등으로 구성된 Dulbecco's의 변형된 Eagle배지. 방치기간(융합이 일어난지 2주일이 지났을때) 동안 배지는 아미노프테린을 배지에서 제외시킨 것 외에는 상기와 동일하였다(HT 배지).

융합후 2-4주 사이에, 하이브리드 세포 배양물에서 EIA(실시예에 기술된 것)와 면역도트 분석법(실시예 Ⅶ에 기술)을 이용하여 P aeruginosa에서 정제된 LPS에 결합하는 항체에 대한 시험을 실시하였다. 반복된 테스트를 통해 양성으로 나타난 배양물을 한계 희석기법으로 클론화하였다. 96-웰 조직 배양 플레이트(Costar,Cambridge,MA,#3596)중에서 웰 당 10-1개로 세포를 변화시키면서 변화된 희석도로 세포들을 배양하였다. 오직하나의 콜로니를 포함한 웰을 현미경으로 검사한 뒤 EIA에 의해 항-PAC 605 시험을 시행하였다. 양성 클론을 24-웰 조직 배양 플레이트에 확산시킨 뒤 상기와 동일한 방법으로 재클론화하고 재시험하였다. 단일클론 항체를 안정하게 분비하는 단일클론을 XMMPS-605로 명명하였다 ; 이 단일클론 항체는 방사 면역 확산과 방사면역 분석법에 의해 면역글로불린 부류인 IgG₂B인 것으로 나타났다.

뉴질랜드 산 흑쥐(Jackson Laboratories, Bar Harbor,ME)를 사용하여 하이브리도마를 복강내에서 배양하였다. 약 3×1O⁶하이브리도마 세포를 다음과 같이 사전 처리시킨 쥐에 복강내 주사하였다 ; 1) 일주일전에 0.5ml의 프리스탄(Aldrich Chemical Co., Milwaukee,WI)을 복강내주사, 2) 하루전에 2mg의 시클로포스파미드(Adria Laboratorier, Columbus,OH)를 복강내 주사하였다. 하이브리도마를 주사한 후 11-15일간에 수집한 복수액은 항-PAC 605 항체인 XMMPS-605를 평균 5mg/ml로 포함하고 있었다. 이것은 "쥐면역 글로불린의 양을 측정하는 면역 확산 플레이트"라는 표제로 기술된 Meloy 지침서에 기술된 방법으로 실시된 방사 면역확산(Meloy, Radial Immunodiffusion, Springfield, VA Plate #J-307) 법으로 측정되었다.

복수액중의 항체는 Ey, Immunochemistry(1978) 15 : 429-436에 기술된 공지방법에 의해 단백질-A 세파로즈 C1-4B 컬럼(Phannacia, Inc., Piscataway, NJ)을 사용해 정제시킨다. 면역글로불린 준부류(IgG₂B)의 정량은 퍼록시다제(Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AC)에 콘쥬게이션된 준부류의 특이 항체를 사용하여 면역 도트 분석법으로 얻어졌다.

하이브리도마 XMMPS-605은 1985년 9월 26일자로 A.T.C.C.에 기탁되었다. 기탁번호는 A.T.C.C. No, HB 8909이다. 이 하이브리도마 XMMPS-605는 1987년 3월 25일자로 한국종균협회에 수탁번호 제10345호로 기탁되었다.

B. 모든 박테리아를 이용한 효소 결합된 면역분석법(ElA)

30개의 그램 네가티브 박테리아 균주를 XMMPS-605 단일클론 항체의 교차 반응 정도를 측정하기 위해 시험했다. 이 균주의 제공원은 다음과 같다 ; l) 살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota R 595 화학형 RE 균주 KNV는 Dr, Otto Westphal (Max Planck Institute fur Immunobiologie, Freiburg, Federal Republic of West Germany)에서 구입 ; 2) 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) E.coli 혈청형 055 ; 55와 026 ; B6의 국제 타입은 American Type Culture Collection(A.T.C.C.)에서 구입 ; 3) 녹농균(Paeruginosa) PAC 1R, PAC 557, PAC 605는 Pauline Meadow, (Univesity College at London)에서 구입 ; 4) P aeruginosa Fisher 타입 1-7은 Dr.Matthew Pollack(Uniformed Services University,Bethesda,MD)에게서 구입 ; 5) E.coli 014 : K7은 Dr.Erwin Neter와 Dr.H.Y.Whang(Children's Hospital of Buffalo, New York)에서 구입 ; 6) E.coli 085 : H9는 the center for Disease Control(Atlanta,GA)에서 구입 ; 7) E.coli J5 러프 (조조) 변이주는 Dr. Abraham Braude(University of California San Diego)에서 구입 ; 8) 나머지 균주는 UCLA Medical Center에서 임상적으로 분리해낸 #7711, #3632, #4194 균주이다.

상기 박테리아들을 트립티케이스 콩아가(TSA) 플레이트상에서 첫번째로 배양하였다. 박테리아 세포들을 수거한 뒤 농도를 식염수중에서 1.5×l0⁸세포/ml로 조정하였다. 농도는 570nm에서 박테리아 현탁액에 대한 흡광도(광학적 밀도)를 측정함으로써 결정하였다. 상기 현탁액 50μl를 편편한 밑바닥을 지닌 폴리비닐플레이트(Falcon Labware, Oxnard, CA, #39l2)의 웰상에 피복시킨 뒤 30분간 2000×G에서 원심분리하고, 0.25% -글루타르알데하이드/포스페이트 완충 식염수(PBS) 0.0lM pH 7.4를 l50μl/웰로 첨가하여 펠릿화된 셀을 15분간 실온에서 고정시켰다. 상청액을 딸아버리고 플레이트를 PBS로 세척한뒤 0.1%젤라틴/PBS를 사용해 실온에서 밤새도록 블로킹 처리하였다.

나머지 분석은 LPS(실시예 III)를 사용하여 EIA에 대한 것과 동일하게 실시되었다. 플레이트를 세척한 뒤 친화 정제된 XMMPS-605 단일클론 항체(1㎍/ml) 100μl/웰의 피복된 항원과 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS로 세척한뒤 100μl/웰의 염소의 항 -쥐 IgG-퍼록시다제 콘쥬게이트를 가하여, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 최종 세척후, 2,2'아지노-디(3-아틸-벤즈티아졸린-설포네이트)(6)(ABTS)(Boehringer Mannheim Biochemicals,Indianapolis IN)인 기질을 가하였다.(100μl/웰) . 칼라전개는 15분간 수행하고 전술한대로 405nm에서의 흡광도가 기록되었다.

이 분석 결과는 표(13)에 나타내었다. Pseudomonas aeruginosa와 P.maltophilia의 모든 균주는 405nm에서 상당한 흡광도를 나타내었다(0.37 내지 1.60 O.D.). 시험된 그램네가티브 박테리아 균주중에서 반응력을 나타내는 것은 아무것도 없었다. 단일 클론 항체와 반응하는 리포폴리사카라이드의 항원 결정인자는 P aeruginosa 및 P.maltophilia의 모든 균주에 공통되는 것으로 나타났지만 이것은 다른 그램 네가티브 및 그램 포지티브 박테리아 상에서는 존재하지 않았다.

모든 박테리아에 대한 XMMPS-605 결합강도의 효소 결합면역 흡수 분석법(EIA)

[표 13]

C. 정제된 리포폴리사카라이드(LPS)를 사용한 효소-결합면역 흡수분석법(EIA)

표(2)상에 기재된 박테리아로부터 얻어진 서로 다른 24가지의 정제된 리포폴리사카라이드 추출물을 항-PAC 605 단일클론 항체인 XMMPS-605의 교차 반응성 정도를 측정하기 위해서 사용하였다. P.aeruginosa PAC 605의 LPS와 Acinetobacter calcoaceticus(UCLA 임상분리물 #7471)의 LPS는 Darveau, et al., Jour. of Bacteriology(1983) 155 : 83l에 기술된 공지 방법에 따라 박테리아 외부 맴브레인으로부터 추출된 것이었다. P. aeruginosa Fisher types 1-7의 정제된 LPS는 Parke-Davis ＆ Co.(Detroit MI)에서 구입한 것이었으며 나머지 정제된 항원은 List Biologicals(Campbell, CA)에서 구입한 것이었다. 이들 정제된 항원 제제들은 0.5% 트리에틸아민이 함유된 물중에 25㎍/ml로 희석시켰다. 이 항원 100μl/웰을 96-웰 EIA 플레이트(Costar, Cambridge, MA, #3590)상에 피복시켰다. 실온에서 밤새도록배양한 후 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 PBS중의 0.l% 시약 등급 젤라틴(Difco, Inc., Detroit, MI)으로 블록킹 처리했다. 이 단계는 폴리스티렌 웰에 항체가 비특이적으로 결합하는 것을 방지하기 위해 필수적인 것이다. 그후 플레이트를 PBS로 1회 세척한다.

실시예 (I)에서 기술한 바와 같이 친화 정제된 단일클론 항체 XMMPS-605를 0.1% 젤라틴/PBS중에 5㎍/ml로 희석시킨뒤 피복된 항원과 실온에서 1시간동안 반응시켰다. PBS로 3회 세척한 후, 100μl의 두번째 항체(염소의 항-쥐 IgG-퍼록시다제 접합체, (Cappel, Malvern, PA, #0600-316l)를 반응 웰에 가한 뒤 실온에서 1시간동안 반응시켰다. 플레이트를 PBS로 다시 3회 세척하였다. 양성 반응은 ABTS(Boehringer Mannheim Biochemicals, Insianapolis, IN)를 가하여 검출하였다. 이 기질은 0.lM시트레이트 완충액(pH 4.5)중의 20mg/ml ABTS 저장 용액을 만듦으로서 제조되었다. 용액을 시트레이트 완충액중에서 1:50으로 희석시키고 그것을 30% 과산화수소에 l : 100희석 배수로 가하였다. 칼러 전개는 15분간 진행시키고 흡광도는 Titertek Elisa 판독기(Flow Labs, McLean, VA)를 사용하여 450nm에서 기록되었다. 분석 결과는 표(2)에 나타내었다. 상기 결과는 광범위한 그램 네가티브 박테리아에서 얻은 LPS에 대해 시험을 실시한 후 P aeruginosa 및 P.maltophlia로부터 얻은 LPS에만 XMMPS-605 항체가 결합한다는 것을 나타내주고 있다. Pseudomonas aeruginosa의 fisher 균주 7개 모두 및 PAC 605의 LPS는 흡광도(0.78 내지 1.06 O.D. 범위)를 나타내었다. 시험된 나머지 그램 네가티브 박테리아로부터 얻어진 LPS중 어느 하나도 흡광도를 나타내지 않았다.

분석 결과는 표(l4)에 나타내었다. 여기서 XMMPS-605는 비교적 높은 흡광도가 알려주듯이 모든 Fisher그룹을 대표하는 모든 P aeruginosa에 결합한다는 것을 알 수 있다. 시험된 다른 종의 LPS(정제된 코어 부위 LPS 제제포함)중 어느 하나도 높은 흡광도를 나타내지 않았다.

EIA에 의해 측정된 LPS에 대한 XMMPS-605의 결합 활성도

[표 14]

* 분석에 사용된 LPS는 O-측쇄를 형질발현하지 않는 변이주에서 추출한 코어 부위의 제제물이다.

D. 정제된 리포폴리사카라이드(LPS)에 대한 결합성의 면역 도트 분석법

정제된 LPS(100㎍/ml, PBS)를 1μl의 "도트"로 셀룰로오스니트 레이트 멤브레인(0.20μm, Sartorius, Hayward, CA, #11307)에 가한뒤 수분간 공기중에서 건조시켰다. 그후 멤브레인을 실온에서 30분간 1.0%시약 등급 젤라틴/PBS중에서 블록킹처리했다. 남은 실온 분석법은 다음과 같이 수행하였다 : 배양 상청액(XMMPS-605 단일클론 항체 함유)중에 항원 처리된 멤브레인을 30분간 침지시킨후 PBS로 세척한다 : 염소의 항-쥐 IgG-퍼록시다제 콘쥬게이트중에 30분간 침지한 후 PBS로 세척한다 : 기질인 4-클로로-l-나프톨(Sigma Chemical Co., St. Louis,MO)중에 침지시켜 자주색의 양성도트로 색깔이 전개되는지 관찰한다. 양성 반응은 통상 5분 이내에 발생한다. 기질의 제조 : 4-클로로-1-나프톨이 메탄올중의 0.3%저장용액(w/v) 상태로 제조된 후 0.0lM PBS중에서 1 : 5로 희석된다. 여기에 30% 과산화수소 1 : 1000희석액을 가한다.

양성 반응에 대해서는 도트를 강한 색상(4+)로부터 흐린 색상(1+)으로 등급을 표시하여 기록하였다. 표(15)에 기술된 데이타에 나타단 것처럼 P aeruginosa의 모든 Fisher 혈청형에서 얻은 LPS는 XMMPS-605에 의한 결합을 나타내는 양성 반응(2+ 또는 3+)을 나타낸 반면 다른 박테리아의 LPS는 식별하기 곤란한 색상을 나타냄으로써 그 어떤 것도 XMMPS-605와 결합하지 않는 것으로 밝혀겼다.

정제된 LPS에 결합하는 XMMPS-605의 면역도트 분석법

[표 15]

E. 전기 영동 전이 및 Western 면역 블로팅법

리포폴리사카라이드(KPS)성분 및 분리 용해된 세포 성분을 SDS-PAGE 겔로부터 니트로 셀룰로오스시이트(Sartorius membranses)로 전기 영동에 의한 전이를 시키는 방법은 Towbin et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.(1979) 76 : 430-4354에 교시된 방법에 의해 실시되었다. 상기 겔은 25mM 트리스, 19mM 글리신(pH 8.3), 20%v/v 메탄올, 0.2% w/v/SDS를 포함하는 Bio-Rad 트랜스 블로트 전기 영동전이 겔(Bio-Rad, Richmond, CA)내 위치시켰다. 니크로 셀루로오스 시이트를 음극을 향하여 겔상에 위치시켜 이미지를 겔로부터 시이트로 전이시켰다. 전기 영동 일정압 공급장치(Pharmacia, Inc., Piscatway, NJ)를 사용한 전기 전이법은 18시간 동안 300mA하에서 시행되었다. 전기 버팅(electrobot-ting)시킨 후, 니트로셀룰로오스를 실온에서 1시간 동안 0.0lM 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하였다. 니트로셀룰로오스 시이트 또는 스트립을 3회 세척하였다. 다음에 시이트 또는 스트립을 pH 7.2의 0.0lM PBS중에 20㎍ XMMPS-605/ml의 농도로 XMMPS-605 단일 클론 항체와 함께 1시간 동안 배양하였다. 니트로 셀룰로오스 시이트를 각각 10분간 2회 세척한 뒤 l시간 동안 1 : 400의 염소 항-쥐 IgG-퍼록시다제 콘쥬게이트(Cappel Laboratories Malvern, PA)(FC 분체특이적)중에서 배양하였다. 니트로셀룰로오스 시이트를 상술된 것처럼 3회 다시 세척한 뒤 니트로 셀룰로오스를 기질-색상-시약인 4-클로로-1-나프톨 및 과산화수소에 침지시켜 퍼록시다제와 콘주게이션된 결합된 항체를 검출하였다.

SDS-PAGE에 사용된 표준물질은 다음과 같다 : 치토크롬 C(l2.4이동 KD) ; 치토크롬 C 다이머(24.8이동 KD) ; 치토크롬 C 트리머(37.2이동 KD) ; 치토크롬 C 테트라머(49.6이동 KD) ; 치토크롬 C HCX(74.4이동 KD). 결합된 성분의 분자량은 상기 표준물질에 대해 상대적인 것으로 결정되었다.

제1도에 웨스턴 면역 블러트에 의해 XMMPS-605와 결합한 Pseudomonas aeruginosa의 총 세포 추출물을 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)으로 분석한 것이다. 샘플은다음과 같다 :

각 샘플에 있어서, 결합성은 약 12킬로달톤(KD)이 이동된 저분자량의 세포 용해물에 대해 관찰되었다. 제2도는 웨스턴 면역 블러트에 의해 XMMPS-605와 결합된 P. aeruginosa를 SDS-PAGE 분석한 결과를 나타낸 것이다. 샘플은 다음과 같다 :

제2도는 결합 패턴이 12KD 영역내의 저분자량 성분에 결합한다는 총세포 용해물에 대해서 얻어진 것과 유사함을 나타낸다. 그러므로 XMMPS-605는 시험된 모든 Fisher 혈청형에 대해 공통된 LPS 성분에 선택적으로 결합한다. 제1도의 레인 7과 제2도의 레인 1은 Fisher 균주의 성분과 동일하게 이동된 PAC 605 성분에 XMMPS-605가 결합함을 나타내준 것으로서 12KD 성분의 항원결정인자가 O-특이 측쇄보다는 코어 리포폴리사카라이드 내에 존재한다는 것을 알려준다. 왜냐하면 PAC 605는 O-특이 측쇄를 형질발현하지 않기 때문이다.

F. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)과 실버염색법(silver staining)

Laemmli, Nature(l970) 227 : 680의 방법을 약간 변형한 방법을 사용하여 나트륨 도데실 설페이트 겔 전기영동을 실시하였다. 겔은 10-20% 선형 아크릴아미드 그래디언트와 3M의 트리스-HCl 용해용 완충액(pH 8.8)중의 1.6% 비스와 pH 6.8의 0.5M 트리스-HCl중의 4% 아크릴 아미드 스택킹(stacking)겔로 구성되어 있다.

식염수에 현탁시킨 세척된 살아있는 박테리아(l×1O¹⁰세포/ml)와 물중의 정제된 리포폴리사카라이드 샘플(1㎎/ml)을 0.1M 트리스-HCl, 2% w/v SDS, 10%v/v 글리세롤, 1%v/v 2-메르캅토 에탄올 및 0.01% 브로모페놀블루를 함유하는 같은 부의 샘플 완충액과 혼합시켰다. 혼합물을 100℃ 수욕중에서 10분간 가열시킨 뒤 30마이크로리터의 샘플을 상기 슬램 겔에 적용시켰다. 전기영동은 트래킹(tracking) 염료가 겔에서 배출될때까지 트리스-글리신 완충액(pH 8.8)중에서 겔당 35mA에서 실시되었다.

Tsai와 Frasch, Analyt. Biochem. (l982) 119 : 115-119의 민감성 실버염색 방법은 폴리아크릴아미드겔중의 LPS를 검출하는데 사용되었다. Morrissey, Anal. Biochem. (1981) 117 : 307의 실버 염색 방법에 따라 전기 영동적으로 용해 변성된 전체 세포 성분을 염색시켰다.

G. 항체 존재하에 박테리아의 향상된 옵소닌 식작용

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 Fisher 혈청형 7가지를 시험관내에서 숙주가 침입세포의 옵소신 작용 및 식세포 작용과 같은 박테리아 감염에 대항하는 면역 반응을 일으키는 효과를 측정하기 위해 시험하였다. 모든 박테리아를 혈액 아가상에서 밤새도록 배양하였다. 순도를 육안 체크한 후 분리물을 브레인 하트 인퓨젼 브로쓰(Brain Heart Infusion Broth) (BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD)로 전이시킨 뒤 37℃에서 4시간 동안 일정하게 진탕시키면서 생장시켰다. 박테리아를 행크의 평형염 용액(Hanks Balanced Salt Soltuion)(HBSS)으로 2회 세척한뒤 혼탁도를 McFarland 표준물질과 비교하여 농도를 1×1O⁸균/ml가 되도록 조절하였다.

옵소닌 식작용은 Beckman LS-250 액체 신틸레이숀 스펙트로포토미터(Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA)를 사용하여 화학 루미네센스 분석법으로 측정하였다. 화학 루미네센스는 백혈구가 박테리아를 포식한 후 방출하는 광이다. 반응은 종래의 어두운 곳에서 사용되는 폴리프로필렌 신틸레이숀 바이알을 사용하여 어둠속에서 수행되었다. 이 바이알은 0.9ml의 HBSS, 0.1ml의 루미놀(2×10^-5M)과 0.075ml의 희석된 인체 혈액을 포함하고 있다. 백그라운드가 15,000CPM에 도발하도록 15분간 평형시켰다.

건강한 공혈자에서 헤파린 처리한 혈액을 추출하였다. 혈액 5ml에 덱스트란(6%) 1ml를 가하였다. 적혈구를 60분간 침강시켰다. 호중구를 함유한 상층을 1000×G로 10분간 원심 분리시켰다. 전여의 적혈구를 요해시키기 위해 펠릿을 30초간 고장액 식염수(0.22%)에 노출시켰다. 그후 동부피의 1.54%의 식염수를 가해 등장성을 복원시켰다. 호중구를 HBSS중에 현탁시키고 최종 세포 현탁액을 2×10⁶세포/ml로 조절하였다.

XMMPS-605를 사용해 각 균주를 시험하여 경과된 시간(분)에 대한 분당 카운트(counts)(CPM)의 그래프를 만들었다. 표(16)의 수치는 테스트된 각 균주의 최대 CPM 값을 나타낸 것이다. 최대 카운트가 발생된 시간이 균주에 따라 30-80분 범위로 다양하다. 이 데이터는 Fisher 1을 제외한 모든 혈청형에서 식작용이 XMMPS-605가 첨가됨으로써 향상되었는데 이것은 HBSS만 함유한 대조용 샘플 및 혼주된 인체 혈청만 함유한 샘플에서 얻어진 것보다 더 높은 것이었다.

옵소닌 식작용의 화학루미넨스 측정

Pseudomonas aeruginosa에 대한 XMMPS-605 활성도

[표 16]

HBSS=Hank의 평형 염용액

PHS=혼주된 인제혈청

XMMPS-605 MoAb : 농도=2㎍/ml

옵소닌 작용과 식작용으로 인한 세포 사멸의 레벨을 측정하는 방법으로서 박테리아 치사율을 직접 측정하는 방법을 사용하였다. 적당한 배지를 함유한 테스트 튜브를 2×10⁶다형핵 세포/ml와 1.5×10⁷박테리아/ml(비 : 1 : 10)으로 접종시켰다. 튜브를 수욕중 37℃에서 배양하였다. 0분, 60분, 120분에 희석액을 멸균수를 사용해 만들고 트립티케이스콩 아가(TSA) 플레이트상에 배양한 콜로니 형성 유니트(CFU)수는 현미경에 의해 측정되었다. 그 결과 화학 루미넨스 분석법에서 입증된 바와 같은 XMMPS-605의 옵소닌 작용이 확인되었다. 그 결과는 표 17에 요약했다.

Pseudomonas aeruginosa에 대한 PCB5 MoAb 활성도

[표 17]

* 37℃ 수욕에서 60분간 배양된 튜브상에서 계수된 박테리아수.

PHS=혼주된 인체 혈청

XMMPS-605 : 농도=2㎍/ml

H. 예방을 위한 XMMPS-605 단일 클론 항체의 사용방법

친화정제된 XMMPS-605 단일 클론 항체 150㎍을 4주령의 CD-1 암컷 쥐(Charles River Breeding Labs, Inc., Wilmington, MA)의 복강내로 주사하였다. 살아있는 박테리아를 다음과 같이 제조하였다 : P. aeruginosa 균주를 37℃에서 밤새도록 브레인 하트 인퓨젼 브로쓰(BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD)중에서 배양하였다. 멸균한 식염수로 박테리아 세포를 2회 세척한뒤 세포 현탁액의 광학밀도와 생균수에 대한 흡광도와 관련된 표준 곡선을 비교하여, 세포농도를 1×10⁹세포/ml 식염수가 되도록 조절했다. XMMPS-605의 단일크론 항체를 주사한지 18시간 후에 Psendomonas aeruginosa 세포의 LD₁₀₀투여량을 실험용 쥐와 대조용 쥐(XMMPS-605 단일 항체를 사용하지 않은 것외에는 실험용 쥐와 동일한 프로토콜을 실시함)의 복강내에 주사하였다. 전술한 투여량-반응 연구는 쥐 100%를 죽일 수 있는 최저 투여량 LD₁₀₀을 정의하였다. 생존수가 48시간 후에 기록되었다. 약 1×10⁸세포/쥐(1마리)의 양으로 Fisher 3과 4를 접종받은 쥐에 대한 XMMPS-605의 사전처리가 박테리아 감염질환에 대해 향상된 생존능력을 발휘하였다는 것을 나타내었다. 결과는 표 (18)에 요약하였다.

동물연구

XMMPS-605를 사용한 Pseudomonas aeruginosa 감염의 예방 처리

[표 18]

[실시예Ⅳ]

하이브리도마 XMMPS-0P1

A. XMMPS-OP1 하이브리도마의 제조

Balb/c 쥐(Charles Rivers, Wilmington, MA)를 P. aeruginosa Fisher 유형 1의 1×10⁸가열 세포로 면역시켰다. 일차 면역후, 쥐에 l달 간격으로 2달동안 1×10⁸가열 세포를 복강내 주사하여 추가 항원 접종을 실시했다.

최종 항원 추가 접종한 후 4일 뒤에 면역된 쥐로부터 비장 세포를 무균적으로 분리하였다. St. Groth, J.Immuno. Meth. (1980) 35 : 1에 교시된 일반적인 방법에 따라 폴리 에틸렌 글리콜 4000(Merck and Co., Inc., Rahway, NJ)을 사용하여 5×10⁷비장세포를 같은 수의 SP2/O-Ag14와 융합시켰다. 하이브리드 세포는 Balb/c 흉선 세포의 피더층과 함께 예비 배양된 배지(웰 하나당 1×10⁵세포, 융합하기 하루전)상에서 96-웰 배양 플레이트(Costar, Cambridge, MA #3596)중에 위치시켰다. 세포를 37℃, 10% CO₂대기하에 하기의 배지중에서 2주간 배양하였다 : Dulbecco의 변형된 Eagle 배지에 4.5g/l의 글루코스와 그루타민(Gibco, Santa Clara, CA #320-1965), 송아지혈청(l0%)(Microbiological Associates, Walkerville, MD), 나트륨 피루베이트(1mM)(Gibco, Santa Clara, CA, #320-1360) 페니실린(50μ/ml)-스트렙토마이신(50μ/ml)(Gibco, Sana Clara, CA, #600-5070), 0.04mM 아미노프테린(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)과 혼합된 히포크산틴(l0mM)과 티미딘(l.6mM)을 사용하여 제조된 히포크산틴-아미노프테린-티미딘(HAT)에 보충되어 있다. 정상의 항상성 유지를 위한 배지(융합후 2주 경과후 배지)는 상기와 동일한 구성을 지니고 있었지만 아미노 프테린을 배지내에 포함하고 있지 않았다(HT배지).

융합 후 2-4주 사이에, 하이브리드 세포의 배양물은 EIA 방법으로 정제된 LPS에 결합하는 항체에 대한 시험에 사용되었다. 반복된 시험에서 양성으로 나타난 배양물을 제한 희석 기법을 사용하여 클론화시켰다. 간단히 설명하면 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트(Costar, Cambridge, MA, #3596)중에서 웰 하나당10-1 세포 사이의 농도로 배양하였다. 하나의 콜로니만을 포함하는 웰이 현미경 검사에 의해 확인된 후 EIA법에 의행 항-Fisher 유형 l활성에 대해 시험되었다. 양성 클론을 24-웰 조직 배양 플레이트(Costar, Cambridge, MA #3524)상에 확산시킨 뒤 상기와 똑같은 방법으로 재클로닝한 뒤 재시험하였다. XMMPS-0P1 이하 명명된 클론은 안정하게 단일 클론 항체를 분비하는 것으로 밝혀졌다 ; 단일 클론항체는 표준 방법을 사용한 방사 면역 확산 및 EIA에 의해 면역 글로블린 IgG1 부류인 것으로 결정되었다.

Balb/c 쥐(Charles River)를 사용하여 하이브리도마를 복강내에서 배양하였다. 약 3×10⁶하이브리도마 세포를 다음과 같이 예비처리한 쥐에 복강내 주사하였다. 일주일 전에 복강내로 0.5ml 프리스탄(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)을 주사하여 예비 처리하였다. 하이브리도마를 주사한 후 11-15일간 수거된 복수액은 방사-면역 확산법(Meloy, Radial Immunodiffusion, Springfield, VA, Plate #J-304)으로 측정한 결과 평균 5-20mg/ml 항체를 포함하고 있다.

Ey, Immunochemistry(1978)15 : 429-436에 기술된 방법에 의해 단백질 A 세파로즈 Cl-48컬럼(Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ)을 사용하여 복수액중의 항체를 정제하였다. 면역 글로불린 준 부류(IgG1)의 정량은 토끼의 항-쥐부류 항체(Miles Lahs, Naperville, IL)와 퍼록시다제(Cappel, Malvern, PA)에 콘쥬게이션된 항-토끼 Ig를 사용하여 EIA법으로 수행되었다.

[실시예 V]

하이브리도마 XMMPS-OP2

A. XMMPS-OP2 하이브리도마의 제조

Balb/c 쥐(Charles Rivers, Wilmington, MA)를 P. aeruginosa Fisher 유형 2의 1×10⁸가열 세포를 복강내 주사하여 추가 항원 접종을 실시하였다.

최종 항원을 추가접종 한 후 4일 뒤에 면역된 쥐의 비장 세포를 무균적으로 분리하였다. St. Groth, J. Immuno. Meth.(1980) 35 : 1에 기술된 방식에 따라 폴리에틸렌 글리콜 4000(Merck and Co., Inc., Rahway, NJ)을 사용하여 5×10⁷비장세포를 같은 수의 P63Ag8.653과 융합시켰다. 정상적인 Balb/c 흉선세포의 피더층과함께 예비 배양한 배지(웰 하나당 1×10⁵셀, 융합하기 하루전)상에서 96-웰 배양 플레이트(Costar, Cambridge, MA #3596)중에 하이브리드 세포를 위치시켰다. 다음의 조성을 지니고 있는 배지중에서 37℃, 10% CO₂분위기하에 세포는 배양하였다 : Dulbecco 변형된 Eagle 배지에 4.5g/l의 글루코스와 글루타민(Gibco, Santa Clara, CA, #320-1965) 송아지의 혈청(10%)(Microbiological Associates, Walkerville, MD), 나트륨 피루베이트(1mM)(Gibco, Santa Clara, CA, #320-1360) 페니실린(50μ/ml)-스트렙토마이신(50μ/ml)(Gibco, Santa Clara, Ca, #600-5070), 0.04mM 아미노 프테린(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)과 혼합된 히포크산틴(10mM) 및 티미딘(1.6mM)을 사용하여 제조된 히포크산틴-아미노프테린-티미딘(HAT)등이 보충되어 있다. 정상의 항상성-유지용 배지(용합후 2주 지난)는 상기와 동일한 구성을 지니고 있었지만 아미노 프테린을 배지내에 지니고 있지 않았다(HT 배지).

융합 후 2∼4주 사이에, 하이브리드 세포 배양물은 EIA 방법에 의해 정제된 LPS에 결합하는 항체에 대한 시험에 사용되었다. 반복된 시험시에 양성으로 나타난 배양물을 제한 희석 기법을 사용하여 클론화시켰다. 96-웰 조직 배양 플레이트(Costar, Cambridge, MA, #3596)중에서 웰 하나당 10-1 세포의 농도로 세포를 배양하였다. 하나의 콜로니만을 포함하는 웰은 현미경 검사에 의해 확인된 후 EIA 법으로 항-활성도에 대해 시험되었다. 양성 클론을 24-웰 조직 배양 플레이트(Costar, Cambridge, MA #3524)상에 확산시킨 뒤 상기와 똑같은 방법으로 재클론화한뒤 재테스트 하였다. XMMPS-OP2라 명명된 클론은 단일클론 항체를 안정하게 분비하는 것으로 밝혀졌다 : 단일 클론 항체는 표준방법을 사용한 방사면역 확산법 및 EIA법에 의해 면역 글로블린 IgM 부류인 것으로 확인되었다.

Balb/c 쥐(Charles River)를 사용하여 하이브리도마를 복강내에서 배양하였다. 일주일전에 복강내로 0.5ml 프리스탄(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)을 주사해 예비 처리한 쥐에 3×10⁶하이브리도마 세포를 복강내로 주사하였다. 하이브리도마를 주입한 후 11-15일간 수거된 복수액을 방사-면역 확산법(Meloy, Padial Immunodiffusion, Springfield, VA, Plate #J304)으로 측정한 결과 평균 2mg/ml 항체를 포함하였다.

[실시예 Vl]

하이브리도마 XMMPS-OP3

A. XMMPS-OP3 하이브리도마의 제조

Balb/c 쥐(Charles Rivers, Wilmington, MA)를 P. aeruginosa Fisher 유형 3의 1×10⁸가열된 세포로 면역시켰다. 일차 면역후, 쥐에 1달 간격으로 2달 동안 1×10⁸가열세포를 복강내 주사하여 추가항원 접종을 실시하였다.

항원을 마지막으로 추가 접종한지 4일 뒤에 면역된 쥐로부터 비장세포를 무균적으로 분리하였다. St. Groth, J.Immuno, Meth. (1980) 35 : 1에 교시된 일반적인 방법에 따라 폴리에틸렌 글리콜 400(Merck and Co., Inc., Rahway, NJ)을 사용하여 5×l0⁷비장세포를 같은 수의 SP2/O-Ag14와 융합시켰다. Balb/c 흉선 세포의 피더층과 함께 사전 배양된 배지(웰 하나당 1×10⁵셀, 융합하기 하루전)상의 96-웰배양 플레이트(Costar, Cambridge, #3596)에 하이브리드 세포를 위치시켰다. 세포를 37℃ , l0% CO₂대기하의 하기의 배지 중에서 2주간 배양되었다 : Dulbecco의 변형된 Eagle 배지는 4.5g/1의 글루타민과 글루코스(Gibco, Santa Clara, CA, #320-1965), 송아지의 혈청(l0%)(Microbiological Associates, Walkerville, MD), 나트륨 피루베이트(1mM)(Gibco, Santa Clara, CA, #320-1360) 페니실린(50μ/ml)-스트렙토마이신(50μ/ml)(Gibco, Santa Clara, CA, #600-5070), 0.04mM 아미노 프테린(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)와 혼합된 히포크산틴(10mM) 티미딘(1.6mM)을 사용하여 제조된 히포크산틴-아미노프테린-티미딘(HAT)등으로 구성되어 있다. 정상의 항상성 유지용 배지 (융합후 이주 지난)는 상기와 동일한 구성을 지니고 있었지만 아미노프테린을 배지내에 지니고 있지 않았다(HT 배지).

융합 후 2-4주 사이에, 하이브리드 세포 배양물은 ElA 방법에 의해 정제된 LPS에 결합하는 항체에 대한 시험을 실시하는데 사용되었다. 반복된 시험에서 양성으로 나타난 배양물을 제한 희석기법을 사용하여 클론화 시켰다. 96-웰 조직 배양 플레이트(Costar, Cambridge, MA, #3596)중에서 웰 하나당 10-1 세포의 농도로 세포를 배양하였다. 하나의 콜로니만을 포함하는 웰을 현미경 검사에 의해 확인하고, EIA 방법에 의해 항-활성도를 시험하였다. 양성 클론을 24-웰 조직 배양 플레이트(Costar, Cambridge, MA #3524)상에 확산시킨 뒤 상기와 똑같은 방법으로 재클론한 뒤 재테스트 하였다. XMMPS-OP3이라 명명된 클론은 단일 클론 항체를 안정하게 분비하는 것으로 밝혀졌다 ; 단일 클론항체는 방사면역확산법 및 EIA법에 의해 면역글로블린 IgM 부류인 것으로 확인되었다.

Balb/c 쥐(Charles River)를 사용하여 하이브리도마를 복강내에서 배양하였다. 일주일 전에 복강내로 0.5ml 프리스탄(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)를 주사하여 사전 처리된 쥐에 3×10⁶하이브리도마 세포를 복강내로 주사하였다. 하이브리도마를 주입한 후 11-15일간 수거된 복수액은 방사-면역 확산법(Meloy, Radial Immunodiffusion, Springfield, VA, Plate#J-304)으로 분석한 결과 평균2㎎/ml 항체를 포함하였다.

[실시예 Ⅶ]

하이브리도마 XMMPS-OP4

A. XMMPS-OP4 하이브리도마의 제조

Balb/c 쥐(Charles Rivers, Wilmington, MA) P. aeruginosa Fisher 유형 4의 1×10⁸가열된 세포로 면역시켰다. 일차 면역후, 쥐에 1달 간격으로 2달동안 1×10⁸가열세포를 복강내 주사하였다.

최종 항원을 추가 접종한지 4일뒤에 면역된 쥐로부터 비장세포를 무균적으로 분리하였다. St.Groth, J.Immuno. Meth.(l980) 35 : 1에 교시된 일반적인 방법에 따라 폴리에틸렌 글리콜 4000(Merck and Co., Inc., Rahway, NJ)을 사용하여 5×10⁷비장세포를 SP2/O-Ag14와 융합시켰다. Balb/c 흉선 세포의 피더층과 함께 예비 배양된 배지(웰 하나당 1×10⁵세포, 융합하기 하루전)상의 96-웰 배양 플레이트(Costar, Cambridge, MA #3596)에 하이브리드 세포를 위치시켰다. 세포를 37℃, l0% CO₂대기, 하기의 배지중에서 2주간 배양하였다. Dulbecco 변형 Eagle 배지에 4.5g/1의 글루타민과 글루코스(Gibco, Santa Clara, CA, #320 -1965), 송아지 태아 혈청(l0%) (Microbiological Associates, Walkerville, MD), 나트륨 피루베이트(14mM)(Gibco, Santa Clara, CA, #320-1360), 페니실린(50μ/ml)-스트렙토마이신(50μ/ml)(Gibco, Santa Clara, CA, #600-5070), 0.04mM 아미노프테린(Sigma Chemical Co., Louis, MO)과 혼합된 히포크산틴(10mM) 티미딘(l.6mM)을 사용하여 제조된 히포크산틴-아미노프테린-티미딘(HAT)이 보충되어 있다. 정상의 항상성 유지용(융합후 이주 지난)배지는 상기와 동일한 구성을 지니고 있었지만 아미노 프테린을 배지내에 지니고 있지 않았다(HT 배지).

융합후 2-4주 사이에, 하이브리드 세포배양물은 EIA 방법에 의해 정제된 LPS에 결합하는 항체에 대한 시험에 사용되었다. 반복된 시험에서 양성으로 나타난 배양물 제한 희석기술법을 사용하여 클론화시켰다. 96-웰 조직 배양 플레이트(Costar, Cambridge, MA, #3596)중에서 웰 하나당 l0-1 세포의 농도로 세포를 배양하였다.하나의 콜로니만을 함유하는 웰을 현미경 검사에 의해 확인하고 EIA 방법에 의해 항-활성도를 시험하였다. 양성클론을 24-웰 조직 배양 플레이드(Costar, Cambridge, MA #3524) 상에 확산시킨 뒤 상기와 똑같은 방법으로 재클론하고 재테스트 하였다. XMMPS-OP4라 명명된 클론은 단일클론 항체를 안정하게 분비하는 것으로 밝혀졌다 ; 단일클론 항체는 방사 면역 확산법 및 EIA법에 의해 면역 글로블린 IgM 부류인 것으로 결정되었다.

Balb/c 쥐(Charles River)를 사용하여 하이브리도마를 복강내에서 배양하였다. 일주일전에 복강내로 0.5ml 프리스탄(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)을 주사해 사전 처리된 쥐에 3×10⁶하이브리도마 세포를 복강내로 주사하였다. 하이브리도마를 주입한 후 11-15일간 수거된 복수액은 방사-면역 확산법(Meloy, Radial Immunodiffusion, Springfield, VA, Plate #J-304) 으로 분석한 결과 평균 2㎎/ml 항체를 포함하였다.

[실시예 Ⅷ]

하이브리도마 XMMPS-OP7

A. XMMPS-OP7 하이브리도마의 제조

Balb/c 쥐(Charles Rivers, Wilmington, MA)를 P. aeruginosa Fisher 유형 7의 l×10⁸가열 세포로 면역시켰다. 일차 면역후, 쥐에 1달 간격으로 2달 동안 1×l0⁸가열 세포를 복강내 주사하였다.

최종 항원을 추가 접종한지 4일 뒤에 면역된 쥐로 부터 비장세포를 무균적으로 분리하였다. St. Groth, J.Immuno. Meth(l980) 35 : 1에 교시된 일반적인 방법에 따라 폴리에틸렌글리콜 4000(Merck and Co., Inc., Rahway. NJ)을 사용하여 5×l0⁷비장세포를 SP2/O-Ag14와 융합시켰다. Balb/c 흉선 세포의 피더층과 함께 사전 배양된 배지(웰 하나당 1×10⁵셀, 융합하기 하루전)상의 96-웰 배양 플레이트(Costar, Cambridge, MA #3596)상에 하이브리드 세포를 위치시켰다. 세포를 37℃, 10% CO₂대기, 하기의 배지중에서 2주간 배양하였다 : Dulbecco 변형 Eagle 배지는 4.5g/l의 글루타민과 글루코스(Gibco, Santa Clara, CA, #320-1965) Feta1 소의 혈청(10%) (Microbiological Associates, Walkerville, MD), 나트륨 피루베이트(1mM) (Gibco, Santa Clara, CA, #320-1360), 페니실린(50μ/ml) -스트렙토마이신(50μ/ml) (Gibco, Santa Clara, CA, #600-5070), 0.04mM 아미노 프테린(sigma Chemical Co., ST. Louis, MO)와 혼합된 히포크산틴(10mM) 티미딘(1.6mM)을 사용하여 제조된 히포크산틴-아미노프테린-티미딘(HAT)로 구성되어 있다. 정상의 항상성 유지를 위한(융합후 이주간 지난) 배지는 상기와 동일한 구성을 지니고 있었지만 아미노 프테린을 배지내에 지니고 있지 않았다(HT 배지).

융합 후 2-4주 사이에, 하이브리드 세포 배양물은 EIA 방법에 의해 정제된 LPS에 결합하는 항체에 대한 시험에 사용하였다. 반복된 시험에서 양성으로 나타난 배양물을 제한 희석 기법을 사용하여 클론화 시켰다. 96-웰 조직 배양 플레이트(Costar, Cambridge, MA, #3596)중에서 웰 하나당 10-1 세포의 농도로 세포를 배양하였다. 하나의 콜로니만을 포함하는 웰은 현미경 검사에 의해 확인되고 EIA에 의해 항-활성도가 시험되었다. 양성 클론을 24-웰 조직 배양 플레이트(Costar, Cambridge, MA #3524)상에 확산시킨뒤 상기와 똑같은 방법으로 재클론한뒤 재테스트하였다. XMMPS-OP7이라 명명된 클론은 단일클론 항체를 안정하게 분비하는 것으로 밝혀졌다 ; 단일클론 항체는 방사면역 확산법 및 EIA법에 의해 면역 글로불린 IgG 부류인 겻으로 결정되었다.

Balb/c 쥐(Charles River)를 사용하여 하이브리도마를 복강내에서 배양하였다. 0.5ml 프리스탄(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)을 일주일전에 복강내 주사하여 사전 처리된 쥐에 3×10⁶하이브리도마 세포를 복강내로 주사하였다. 하이브리도마를 주사한 후 11-15일간 수거된 산출된 복수액을 방사-면역 확산법(Meloy, Radial Immunodiffusion, Springfield, VA, Plate #J-304)으로 분석한 결과 평균 5-10mg/ml 항체를 포함하였다.

[실시예 IX]

항-P. AERUGINOSA FISHER

유형 MoAbs의 면역 도트 혈청 테스트

항원을 1μl "도트" 상태로 0.2μm 셀룰로오스 니트레이트 멤브레인(Sartorius)에 가한 뒤 5분간 공기중에서 건조시켰다(사용된 농도는 PBS중의 100μg/ml 정제된 LPS였다). 항원이 스포트된 멤버레인을 젤라틴(Difco, Detroit, MI) 1% 용액(wt/vol PBS)으로 RT에서 30분간 블록킹 처리하였다. 급속한 세척(1분씩, 2회) 후, 적합한 항-Pseudomonas aeruginosa MoAb는 RT에서 30분간 멤브레인과 함께 배양되었다.(MoAb는 조직배양 상청액 상태로 2-10μg/ml의 양으로 사용되었다). 멤브레인을 PBS로 3회 급속히 세척한 뒤 염소의 항-쥐 퍼록시다제 콘쥬게이트(안티-마우스 IgM 또는 IgG)(Cappel, Malvern, PA)와 함께 30분간 RT에서 배양되었다. PBS로 멤브레인을 3-4회 세척한 후 기질(4-클로로-1-나프톨, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)을 RT에서 멤브레인과 함께 배양시켰다. 양성 반응이 2-5분이내에 자주색 도트로 나타났으며 4+(매우 선명함) 내지 1+(매우 흐릿함)으로 등급히 매겨졌다. 결과는 표(19)에 요약하였다.

정제된 LPS를 사용한 항-Pseudomonas MoAbs의 면역 도트 혈청 테스트

항원*

[표 19]

* Pseudomonas aeruginosa Fisher 유형 1-7에서 얻어진 정제된 LPS(Parke-Davis ＆ Co., (Detroit, MI))에서 구입됨.

[실시예 X]

MoAb 결합에 관한 요약

하기의 표는 본 발명의 MoAbs의 결합특성을 요약한 것이다. 이 표는 에피도프에 의해서가 아닌 이미 알려진 항원에 의한 MoAbs의 특성을 나타낸 것이다.

MoAb 결합특성 요약

항원

[표 20]

[실시예 XI]

국부 박테리아 감염상(imaging)

국부 박테리아 감염 질환의 부위 및 정도, 특히 그램네가티브 박테리아가 일으킨 감염질환의 정도를 알아내기 위해 Larson, et a1., Journal of Clinical Investigation(1983) 72 : 2101에 교시된 방법에 따라 감염성 박테리아 균주에 공통된 항원성 결정인자와 선택적으로 반응하는 단일클론 항체를 사용하였다. 단일클론 항체를 방사 요오드화 반응 또는 공지된 방사 라벨링 반응에 의해 방사 라벨시켰다. 즉 상기 공지된 방사 라벨링 반응은 디에틸렌트리아민펜타-아세트산(DTPA) 같은 킬레이트제를 사용한 킬레이트화 반응 ; 또는 강자성 특성을 지닌 반응제, 화학 루미네센스 기질, 또는 효소반응 성분을 사용하여 항체를 라벨하는 방법이다. 방사 라벨된 단일클론성 항체를 정제하여 약제를 제형화하였다. 담체, 예를 들면 인산염이 완충된 식염수중의 라벨된 단일클론 항체용액을 숙주내에 정맥내 주사하였다. 적당한 투여량은 100㎍-50㎎이었다. 시간은 항체와 반응하는 항원성 결정인자를 지닌 세포 농축물을 포함하는 체내 부위로 항체가 이동하는데 걸린 시간이다. 어떤 조직에 있어 방사성 동위체의 농도는 Rainsbury, et al., Lancet October 22, 1983에 교시된 조직 이미지 기법에 따라 결정될 수 있거나 또는 신틸레이숀 카운터를 사용하여 추출된 체액 또는 부검조직을 평가함으로서 결정될 수 있다. 비 방사활성 라벨이 사용되는 경우 다른 적절한 감시장치가 사용될 수 있다. 그와 같은 감시 장치로는 핵자기 공명측정기 또는 분광광도계등이 사용될 수 있다. 높은 방사 라벨 부위는 국부 박테리아 감염질환의 존재를 나타낸다.. 제3도는¹²⁵I로 라벨된 XMMPS-OP1MoAb를 사용하여 쥐의 P.aeruginosa 감열질환의 이미지를 나타낸 것이다. "핫 스포트"는 감염 질환의 국소 부위를 나타낸다.

[실시예 XII]

박테리아 감염질환의 치료법

박테리아 감염질환을 갖고 있는 것으로 알려진 숙주는 모든 박테리아 균주에 공통되는 항원성 결정인자와 반응하는 단일클론 항체로 치료된다. 단일클론 항체를 인산염이 완충된 식염수 같은 약리적 허용 담체 용액중에 정맥내로, 근육내로, 복강내로 또는 이와 비슷한 경로로 투여한다. 용량은 숙주의 체중에 따르는데 약 0.1㎎/㎏-40㎎/㎏ 체중 범위가 바람직하며, 바람직하게는 약 1㎎/㎏-10㎎/㎏ 체중이다. 대안으로서 투여량은 나머지 감염정도를 평가하거나, 또는 정량적으로 표준화된 EIA 방사 이미지법 또는 기타 방법에 의해 알 수 있다. 치료는 필요한 만큼의 시간간격을 두고 반복하여 감염으로부터 회복되는 숙주 능력을 증진시키도록 실시된다.

[실시예ⅩⅢ]

진단 EIA법

본 발명의 단일클론 항체나 또는 이것의 기능적 등가물을 표준 및 공지방법을 사용한 면역 분석법에 이용한다(Methods in Immunodiagnosis, 2nd Edition, Rose and Bigazzi, eds., John Wiley and Sons, 1980) 이러한 분석은 직접 방식(항원과 반응하는 라벨된 일차항체), 간접방식(일차항체와 반응하는 라벨된 이차항체), 경쟁방식(라벨된 항원의 첨가), 또는 샌드위치 방식(라벨된 항체와 라벨되지 않은 항체둘 모두), 종래 기술분야에 공지된 기타 방법일 수 있다.

구체적 예로는 박테리아 감염증으로 추정되는 환자에게서 얻은 조직 추출물을 비용해성 매트릭스 또는 고체기질, 예를 들면 셀룰로오스 스트립, 아가로즈 또는 기타 입자에 적용하여 박테리아-기질 복합체를 제조한다. 대안으로서 기질을 항체에 결합시켜 기질상의 용액으로부터 박테리아의 결합이 실시되도록 한다. 기질을 PBS로 세척한뒤 결합되지 않은 물질을 제거한다.

바람직한 예로는 박테리아가 결합된 고체 기질을 XMMPS-605 용액에 노출시키거나 또는 박테리아 감염 질환을 일으키는 반응제인 그램 네가티브 박테리아와는 반응하지 않지만 P.aeruginosa에 특이한 다른 단일클론 항체에 노출시킨다. 이러한 용액은 조직 추출물, 혈청 및 소변을 포함한다. 단일클론 항체를 기질 복합체와 반응시킨뒤 복합체를 세척하여 비결합된 단일클론 항체를 제거한다. 기질 복합체를 염소의 항-쥐IgG 같은 단일클론 항체와 반응하는 라벨된 항체를 지닌 용액에 노출시킨다. 이 항체를 방사 동위체,¹³¹I로 라벨하거나 또는 퍼록시다제 같은 효소반응 성분으로 라벨시키거나 또는 화학루미네센스 기질로 라벨시킨다. 기질을 다시 세척하여 비결합된 항체를 제거한다. 신틸레이숀 카운터 또는 분광 광도계 같은 라벨 감식 기기를 사용하여 기질에 복합된 라벨의 존재를 정량함으로써 조직 추출물내의 P.aeruginosa 또는 P.maltophilia의 존재를 알 수 있다.

동물 조직의 용액을 분석하는데 있어서 상기와 비슷한 방법이 사용되는 것외에도, 이 방법은 P.aeruginosa 또는 P.maltophilia 감염에 의해 해를 줄 수도 있는 기타 제제 또는 용액상에서 이들 박테리아의 존재를 검출할 수 있다. 기타 제제의 예는 의학장치, 호흡 통풍장치, 급습기, 경구용 온도계, 침실용 음료수 병, 제트연료등을 포함한다.

[실시예 XIV]

판넬 EIA

본 발명의 단일클론 항체를 키트로 공급하여 숙주내의 박테리아 감염질환을 특성화시키기 위한 EIA 판넬을 수행하였다. 각각의 MoAbs는 실시예(XⅢ)에서 처럼 EIA를 수행하는데 사용되었지만 MoAbs의 판넬을 사용하는 수많은 EIA는 그램네가티브 및-그램 포지티브 박테리아의 특성화를 포함한 감염을 일으키는 박테리아의 광범위 특성화를 나타내기 위해 사용되었다.

[실시예 XV]

세균성내 독소의 정량법

본 발명의 MoAb는 진단제 및 치료제의 제조시에 생산되는 액체-중간물질, 진단제 또는 약제 또는 체액, 분비물 및 추출물중의 세균성 내독소의 양을 측정하기 위해 사용된다.

내독소상의 특이하고 독특한 결정인자에 대한 결합 특이성을 갖는 XMMPS-OE5 같은 IgM MoAb를 고체 표면에 흡착시킨다. 비흡착된 과량의 물질을 제거한 뒤 알부민 같은 적합한 블록킹 반응제로 고체 표면상의 잠재적 비특이 결합부위를 블록킹 처리한다. 비결합된 알부민을 간단히 세척하여 제거한다. 활성화된 표면을 1-24시간, 4-37℃의 배양온도로 시간 및 온도를 변화시키면서 다양한 농도의 시험용에 샘플에 노출시킨다. 비반응되었거나 고갈된 시험용 샘플의 제거는 완충 식염수 같은 표준 생화학적 용액으로 간단히 세척함으로서 시행된다. 시험 용액중의 내독소 레벨을 검출하여 정량하는 방법은 검출용 탐침 또는 결합 파트너인 이차 MoAb를 첨가함으로써 달성될 수 있다. 상기 이차 MoAb는 IgG준 부류로서 IgM MoAb에 의해 결합되는 특이 결정인자와는 다르며 고체 표면에 흡수된 IgM에 의해 상기 시스템에 영향을 주지 않는 내독소로서의 특이한 결정 인자에 대한 결합 특이성을 지닌다.

정량 작업은 시험용 샘플에 결합된 검출용 탐침의 양을 내독소 표준물질의 정해진 양에 결합된 검출용 탐침의 양과 관련시켜 환산함으로써 실시된다. 표준물질 및 시험용 샘플에 결합된 검출용 탐침의 양에 대한 평가는 하기한 여러 방식으로 측정된다 :

(a) 탐침의 방사 라벨링 및 결합된 방사 활성도의 정량, (b) 탐침의 효소 라벨링 및 표준물질과 시험용 샘플에 결합된 탐침의 특정한 양과 결합된 효소 활성도의 측정, (c) 플루오로크롬 같은 특이 파장 방출물질을 탐침에 직접 커플링하고 표준물질 및 시험용 샘플에 있어 이러한 방출의 양을 비교 및 정량.

정량작업은 방사동위체, 효소 또는 플루오로크롬으로 라벨된 아비딘 같은 표준이차 고도특이성 지지제를 시스템에 혼합하여 비오틴 같은 물질로 검출용 탐침을 라벨링시켜 수행될 수 있다.

이 시스템의 다른 구체예로는, 쥐 Ig와 반응하는 방사 라벨된, 효소에 의해 라벨된, 또는 플루오로크롬에 의해 라벨된 항체로 구성된 이차 특이성 지시제를 내독소의 양을 측정하는데 사용할 수 있다.

IgM 단일 클론 항체를 고체 표면에 흡착시키는 것은 IgM 부류에 속하는 항체와 연관된 고도의 결합 활성도를 유도함으로써 유리하다. 이것은 분석과정 동앙네 일차 결합 액체로부터 손실될 수도 있는 내독소의 레벨을 감소시켜 준다.

본 발명은 박테리아 감염질환의 진단, 치료 및 예방에 유용한 전반응성(pan-reactive) MoAb를 제공한다. 본 발명의 MoAbs는 그램 네가티브 내독소를 블록킹하는데 효용성이 있으며, 따라서 그램 네가티브 박테리아로 감염된 숙주내에서 해로운 작용을 감소시킨다.

본 발명은 본 발명의 이해를 명확히 할 목적으로 상세한 설명 및 실시예를 통해 본 발명을 상세히 기술하고는 있으나, 첨부된 청구범위의 범주내에서 변화 및 변형이 가능하다는 것을 밝힌다.

Claims

a) 포유동물의 면역세포를 E.coli J5 변이체의 코어 리포폴리 사카라이드의 제제물로 면역시키고 ; b) 상기 포유동물의 면역 세포를 분리해 내어 현탁액을 제조하고 ; c) 융합 프로모터의 존재하에 상기 면역 세포를 융합 파트너와 융합시켜 융합세포를 만들고, 이때 상기 융합 파트너는 세포 배양시 상기 융합 세포에 무한 증식하는 능력을 부여하는 세포이며 ; d) 상기 융합 세포를 비융합 파트너는 유지시키지 않는 배지상의 각각의 분리된 웰 내에서 배양하고 ; e) 상기 각 웰내의 상등액을 평가하여 상기 E.coli J5 변이체의 코어 리포폴리사카라이드에 대한 항체가 존재하는지를 확인하고 ; f) 상기 세포와 반응하는 항체를 분비하는 융합세포를 선별하여 클로닝하고 ; g) 상기 클론을 배양하고 ; h) 상기 클론에 의해 생산된 상기항체를 수거하는 단계로 구성된 ATCC No HB 9081(KFCC No.10342)에 의해 생산되며 그램 네가티브 박테리아의 내독소코어와 광범위하게 결합되어 있는 리포플러사카라이드상에 존재하는 에피토프에 대해 제조된 단일클론 항체의 제조방법.
하이브리도마 셀 라인 ATCC No HB9081(KFCC No.10342)에 의해 생산된 단일클론 항체의 결합특성을 갖는 IgM 이소타입의 항-리피드 A 영역 단일클론 항체와 약학적 허용 담체를 함유하는 그램 네가티브 박테리아 감염질환의 치료 또는 예방을 위해 인체에 투여하기 위한 약학 조성물.
제2항에 있어서, 단일클론 항체는 E.coli J5 세포의 코어 리포폴리사카라이드로 면역시켜 제조된 것을 특징으로 하는 약학조성물.
제2항에 있어서, 단일클론 항체는 효소 면역분석법 또는 기타 경쟁적 억제 면역분석법에 의해 측정한바에 따르며 하이브리도마 셀 라인 A.T.C.C. No HB 908l(KFCC No.10342)에 의해 생산된 단일클론 항체가 E.Coli의 J5 변이체의 리포폴리사카라이드로부터 정제된 리피드 A에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 IgM 이소타입의 항-리피드 A 영역 단일클론 항체인 것을 특정으로 하는 약학 조성물.
제2항에 있어서, 단일클론 항체는 효소면역분석법 또는 기타 경쟁적 억제 면역분석법으로 측정해 본결과 하이브리도마 셀 라인 A.T.C.C. No HB 9081(KFCC No.10342)에 의해 생산된 단일클론 항체가 E.coli의 J5 변이체로부터 정제된 리포폴리사카라이드에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 IgM 이소타입의 항-리피드 A 영역 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제2항에 약한 의한 약학조성물 및 항생제로 구성된 약학적 조합물.
제2항에 있어서, 단일클론 항체의 양이 약 0.1-2mg/kg의 범위내인 단위 투여 형태인 약학 조성물.
제2항에 있어서, 단일클론 항체는 ATCC No HB 9081인 하이브리도마 셀 라인 XMMEN-OE5에의해 생산된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.