JPS60501242A - エンドトキシンコア−と反応性のモノクロ−ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 エンドトキシンコアーと反応性のモノクローナル抗体アメリカ合衆国政府の権利 この明細書に記載される発明は、発明者になんらの使用料も支払われることなく 行政目的のためにのみアメリカ合衆国政府によシ又はアメリカ合衆国政府のため に、製造され、使用されそして許可されることができる。

発明の背景 この発明は、グラム陰性細菌のエンドトキシンコアのいずれかの部分と反応する 新規なモノクローナル抗体の製造及び使用、並びにエンドトキシンコアと反応す るモノクローナル抗体をコードする遺伝子を含有する自己複製キャリヤー細胞に 関する。この発明は、抗体、該抗体の製造方法、該抗体を用いる診断的、予防的 及び治療的方法及び組成物、並びに該抗体を使用する研究的、医薬的、及びその 他の方法及び組成物に関する。

グラム陰性細菌は多くの深刻なそしてしばしば生命を脅かす感染を惹起する微生 物の普遍的なそして多様な一群である。リポポリサッカライドは、すべてのグラ ム陰性細菌を特徴付ける外部被覆体又は細胞壁の主たる生化学的構成成分である 。これらのりポポリサッカライド、又はいわゆるエンドトキシンはグラム陰性感 染において大きな病原生理学的及び免疫学的役割を演する。細菌＋）７ｆｆリサ ツカライドに対して向けられた抗体は、これらの毒性物質に対する及びこれらの 物質を産生ずる生物に対する決定的な宿主防御を構成する。

グラム陰性感染におけるその直接的な役割に加えて、エンドトキシンは多様で強 力な生物学的活性を有し、ヒトの内部的及び外部的環境に広く分布して存在する エンドトキシンと共働する場合、それらに大きな医療的、科学的及び経済的重要 性をもたらす。

一般に、細菌リポポリサッカライドは、いわゆる「〇−特異的側鎖」を含んで成 る反復するオリゴサツカライド（糖）から成る高度に可変的な外部領域、及び限 定された数の糖〔しばしば、トリサツカライド２−ケト−３−デオキシオクトネ ート（ＫＪ）Ｏ）を含む〕を含有する比較的一定のコアー領域、並びに生物学的 に活性なリピドＡ成分から成る。多数の異なる細菌群に由来するりビドＡは密接 な構造的関連性を示し、そして研究されたほとんどの場合においてリビドＡは、 エステル−及び／又はアミド−結合長鎖脂肪酸及び他の可能な置換基を有するβ １，６−結合ダルコサミンソサッカライドから成る。時にはコアーグリコリピド 又はエンドトキシンコアー構造されるコアー領域はその〇−特異的側鎖を欠いて いるグラム陰性細菌のりポポリサッヵライド（又はエンドトキシン）であると考 えることができる。さらに、エンドトキシンコアー構造は、コアー糖及び／又は 他の置換基を欠いているためそれ自体不完全である。すなわち、エンドトキシン コアーは、ｏ−特異的側鎖を欠いておシ、そしである場合にはさらにコアー糖及 び／又は他の置換基を欠いているが通常はリビドＡを保持している不完全リポポ リサラカラ３１：８−２１．１９８２を参照のこと。引用によシこれをこの明細 書に組み入れる。） 意味あることには、多様な緘及び種を代表しそしてヒトに対して病原性であるほ とんどすべてを含むほとんどのグラム陰性細菌が、高度に類似する、免疫的に交 差反応性のエンドトキシンコアー構造を共有する。この明細書のために、エンド トキシンコアーは、置換された及び／又は置換されていないコアー糖に共有結合 した完全な又は不完全な置換された又は置換されてい、ないリビドＡからなるグ ラム陰性細菌のりポポリサッカライド又はエンドトキシンの部分であって、この リビドＡは例えばエステル−及び／又はアミド−結合長鎖脂肪酸を有する燐酸化 β１．６−結合グルコサミンジサッカライドによシ特徴付けられ、そして前記フ ァー糖は無傷のりポポリサッカライド分子におけるリビドＡと〇−特異的側鎖の 反復するオリゴサツカライド単位との間の相互連結位置におけるその位置によシ 区別されるものとして定義される。

リポポリサッカライドの可変外部領域中の〇−特異的側鎖に対する抗体は、種− 及びタイプ−特異的であシ、そして食作用（飲み込み）及び宿主食細胞（白血球 ）による感染生物の殺滅を促進するその能力に由来する保護活性を有する。これ に対して、リビドＡ含有内部ファーに対して向けられた抗体は、広範囲の種類の グラム陰性細菌に対して広く交差反応性で１、そしてエンドキシンの生物学的活 性を中和することによって機能すると考えられる。

・　抗体はその機能によって特徴付けられる形質細胞と称される生細胞によって 産生される。形質細胞は、該形質細胞により合成されそして分泌される抗体と同 じ抗原特異性を有するリセグ□ターをその細胞東上に担持するＢリンパ球と称す る他の細胞から誘導される。各イムノコンピテント８９７７９球及びその子孫（ クローン）は唯一の特異性を有するリセグターを担持する。外来性物質（抗原） はＢ　リンパ球細胞膜上のリセゾターに結合し、そしてこれ、らの特異的Ｂリン ・や球クローンが増殖し、形質細胞に分化し、５ そして特異抗体を産佳するのを刺激する。要約すれば、特異抗体と同じ数のリン パ球りローンカ存在シそして異る抗原と同じ数の特異抗体が存在する。言い換え れば、各特異抗体はイムノコンピテントリンパ球の単一クローンから誘導された 形質細胞にょシ産生され、そして特異抗原に暴露された（すなわちそれにより免 疫された）個体は該当するリン・ぐ球クローンの拡大を介してその抗原に対する 特異抗体を産生ずる。

抗体は、それらが向けられる抗原に対する精密な特異性によシ特機付けられる。

実際は、はとんどの抗原は１個よシ多くの抗原部位を含有し、多数の抗体が単一 の抗原に向けられる。書らに、種々の親和性（抗原結合の強度）を有する異る抗 体が単一の抗原部位に向けられ得る。同じ抗原に対して向けられる多数の抗体は 異るリン・２球クローンから誘導されるので、これらはポリクローナル抗体と称 される。

はとんどの抗原に対する正常な抗体反応はモノクローナルである。同時に、単一 の抗体が共通の又は類似する分子構造を有する多数の抗原又は抗原部位と反応す ることができ、このような抗体は交差反応抗体と称される。

従って、個体の全抗体のし・ヤートリーはそのサイズ及び広さに関して巨大でア シ、そして侵入微生物ｔ　に対する個体の自然的な暴露又は複合抗原による免疫 がポックＣ−ナル抗体反応をもたらすことが認められる。このような個体からの 血清は、多数の特異性と親和性によって％機付けられる前から存在する１　抗体 及び新たな抗体の複雑な混合物を含有するであろう。

伝統的に、ポリクローナル抗体は動物又はヒトを、それに対する抗体がめられる 材料（抗原）にょシ免疫することによって製造されている。免疫の目的が特定の 疾患、中毒又は感染の予防及び治療である場合、個体を該当する抗原により免疫 することができ（能動免疫）、又は同じ抗原によって他の個体をあらかじめ免疫 することによって調製されたあらかじめ形成された抗体又は免疫血清を個体に投 与すること（受動免疫）もできる。いずれの型の免疫も大きな欠点を有する。能 動免疫の場合、適切な抗体反応を達成して特定の感染又は疾患を予防又は治療す るために十分な時間が存在しない。さらに、時には、ワクチンが効果的でなく、 ある群（例えば免疫抑制者又は小児）は予防接種に対して反応する能力を有さす 、あるいは場合によっては活性免疫に不都合な反応が伴うため、能動免疫を達成 することが不可能である。他方、受動免疫は特異性を欠き、そして肝炎のごとき 伝搬性感染又はその他の不都合な反応の有意な危険が伴う。抗血清、又は抗血清 から調製された免疫グロブリンは所望の抗体のみならず文字通り数千種類の他の 抗体を同様に含有する。事実、所望の抗体は通常、このような抗血清中に存在す る全抗体の小部分のみを代表する。従って、このような抗血清を用いる受動免疫 によシこの抗体の適切なレベルを達成することは困難である。抗血清又は免疫グ ロブリンの大容量の注入により深刻な不都合な反応及び注入に関連する感染の可 能性が非常に増加するから、上記のことは患者に追加の危険性を与える。

例えば免疫学的研究及び種々の生物工学的用途におけるポリクローナル抗体の非 医薬的使用はまた、多くの抗原に対する多様な抗体反応及び種々の抗体を含有す る抗血清の特異性の欠如によシ深刻な妨害を受けるであろう。

すなわち、天然に付与された又は免疫操作により誘導された抗体の不均一性及び 多様性、並びに抗原刺激に対する抗体反応の予想不可能性は、臨床的又は科学的 目的のだめのこれらのポリクローナル抗体の実際的な使用をきびしく限定する因 子である。

ポリクローナル抗体の限界についての上記の検討は一般的な言葉で述べられてい るが、これらの同じ限界がエンド９トキシンコアーに対して特異的に向けられた ポリクローナル抗体の医療的及び非医療的使用にも妥当する。

要約すれば、グラム陰性細菌は、深刻なそしてしばしば生命を脅やかす感染を一 般に惹起せしめる微生物の普遍的な一群でるる。これらの細菌はすべて、該細菌 に病原性及び免疫性を付与するりｆ′ポリサッカライド又はエンドトキシンを形 成する。エンドトキシンは、グラム陰性感染においてよくその機能を果すその種 々の生物学的性質に基いて広範囲の医学的、科学的及び経済的重要性を有する。

広範囲の種類の分離源からのエンドトキシンは共通の又は非常に類似するファー 構造を有する。このコアー構造に対する抗体は、多くの異るグラム陰性細菌によ り産生されるリポポリサッカライドと交差反応する。こたらの交差反応性抗体は エンドトキシンの生物学的活性を中和し、そして深刻なグラム陰性感染に対する 保護をもたらすようである。エンドトキシンコアーと反応性の自然に獲得された 又は免疫処理により誘導された。ｌ　ＩＪクローナル抗体の用途は、エンドトキ シンの低い免疫原性、ポリクローナル抗血清の特異性の欠如、及び常用の能動免 疫又は受動免疫に伴う不都合な反応により制限される。

発明の概要 多数の又はポリクローナル抗体に対して、単一の又は「モノクローナル」抗体が 存在する。これらは９ １つのり７７９球クローンから誘導された抗体であシ、このクローンは抗体を絶 対的に特異的且つ均一なものとしている。１９７５年に、　Ｋｏｈｌｅｒ及びＭ ｉ　１ｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ、２６５　：　４９５．１９７５、これを引用 によりこの明細書に組み入れる）は初めて、羊の赤血球に向けられたモノクロー ナル抗体が、特異的抗体産生Ｂ細胞と腫瘍細胞とを融合せしめ、試験管内（４に 一ビトロ）又は動物内（インービボ）において単一のモノクａ−ナル抗体を合成 することができる「無限に自己複製する雑種クローン（又は「）・イブリドーマ 」）を生じさせることによって調製され得ることを記載した。このようなノ・イ ブリドーマは、要するに、単一のあらかじめ定められた特異性を有する抗体を潜 在的には無限に供給することができる自己複製細胞「工場」である。

このような抗体は、もしこれを本当に製造できるのであれば、従来のＩリフロー ナル又はモノクローナル抗体技法によっては満たされなかった多くの重要な要求 を満足させるであろうから、我々はエンドトキシンコアーに対して向けられたモ ノクローナル抗体を合成する新規な自己複製細化系を調製することを企てた。エ ンドトキシンコアーに対するポリクローナル抗体と同様に、このようなモノクロ ーナル抗体は、広範囲の病原性グラム陰性微生物の間で広く交差反応し、そして それ故にこれらの細菌に基く疾患の予防及び治療において大きな潜在的用途を有 するであろう。しかしながら、これらの精密な特異性のために、これらは免疫的 予防剤、療法剤、及び診断剤としてポリクローナル抗体に比べて一層有用であろ う。同様に、この特異性はまた、このようなモノクローナル抗体をエンドトキシ ンの免疫学的及び生化学研究のため、エンドトキシンのアフィニティー精製のた め、及び医薬又は他の薬剤からのエンドトキシンの中和及び／又は除去のため（ Ｃ−屑布用なものとするであろう。さらに、従来のモノクローナル抗体と異シ、 エンドトキシンコアーと反応性のモノクローナル抗体は潜在的に無限の且つ均一 の供給物として製造することができ、このためエンドトキシンの低い免疫原性に よシ負わされる問題点、ポリクローナル抗体反応の変化性、並びに臨床的用途及 び他の用途のために用いられる抗−エンドトキシン抗体の達成し得るレベル又は 供給における限界を回避することができよう。

後記の「好ましい態様の記載」において示されるよ５Ｋ、我々は特に、エンドト キシンコアーに向けられた抗体を産生ずるＢリンパ球を刺激し、そしてこれらを 形質細胞腫（腫瘍）細胞と好結果に融合せしめてエンドトキシンコアーと反応性 のモノクローナル抗体を合成するノ・イブリドーマを形成する手段を発明した。

従ってこの発明はまず第一に、前に概略記載した従来の抗体の欠点を克服するた めの手段を提供する。

従って、この発明の１つの目的は、エンドトキシンコアーと反応性のモノクロー ナル抗体の産生をコードする遺伝子を含有する、ＡＴＣＣＨＢ　８２９７及びＡ ＴＣＣＨＢ８２９８によシ例示されるような自己複製キャリヤー細胞を提供する ことである。

他の目的は、このようにして製造された抗体を提供することである。

他の目的は、抗体を製造するためのイン−ビトロ法を提供することである。

さらに他の目的は、抗体を製造するためのインービボ法を提供することである。

他ノ目的は、エンドトキシン担持病原体によシ惹起される疾患の診断、予防、及 び治療において抗体を使用するだめの方法及び組成物を提供することであサラに 他の目的は、エンドトキシンの免疫学的又は生化学的分析に有用な抗体を含有す る研究用組成物を提供することである。

さらに他の目的は、エンドトキシン及びその他の物質を含有する混合物からエン ドトキシンを分離し又は精製するために適当な抗体を含有する組成物を提供する ことである。

他の目的は、エンドトキシンを中和しそして／又は他の材料又は溶液から除去す るために有用な抗体を含有する組成物を提供することである。

この発明のその他の目的及び利点は、部分的には以下の記載において示され、そ して部分的には該記載から自明であシ、又はこの発明の実施において知られるで あろう。

上記の目的及び対象を満たすために、この発明によジエントドキシンコアーと反 応性のモノクローナル抗体が提供される。抗体は、エンドトキシンコアーと反応 性のモノクローナル抗体をコードする遺伝子を含有する自己複製キャリヤー細菌 により産生さ”れる。さらに、この発明によシキャリャー細胞が提供され、この 細胞は便利にはハイブリドーマのごとき細胞系でちる。

さらに、上記の目的及び対象を満たすために、キャリヤー細胞を適当な培地中で 適当な期間にわたって培養し、そしてキャリヤー細胞が増殖する′培地から抗体 を回収することを含むイン−ビトロ法が提供される。さらに、抗体を多量生産す るだめの（ｙ−１３ を開始するのに十分な量において腹腔内投与し、そして抗体が回収可能な量にお いて産生されるのに十分な時間の後、動物の腹水から抗体を回収することを含ん で成る。

さらに、この発明によりエンドトキシンの免疫学的検出のだめの方法、又はエン ドトキシンを担持する病原微生物により引き起こされる感染のヒト又は動物にお ける診断のだめの方法が提供される。この方法は、診断的に有効な量のこの発明 の抗体を、ヒト又は動物から取シ出された体液又は組織のごときエンドトキシン 含有溶液のサンプルと混合し、そし得られた混合物中の反応の程度を測定するこ とを含だめの、又はエンドトキシン担持微生物により惹起される感染の診断のだ めの組成物を提供する。これらの組成物は、診断的に許容される担体との混合に おいて、エンドトキシンを検出し又は感染を診断するのに有効な濃度の抗体を含 有する。

さらに、前記の目的及び対象を満足させるために、この発明によシ、感染又はエ ンドトキシン担持微生物によシ惹起されるヒト又は動物における数面ショックを 含むその臨床発現又は結果のための受動的予防又は治療の方法が提供される。こ の方法は、上記のヒト又は動物に、前記微生物によシ惹起される感染に先立ち又 は感染中に、感染、又は数面ショックを含むその臨床的発現又は結果の予防又は 改善をもたらすのに十分な量のこの発明の抗体を投与することを含んで成る。さ らに、このような感染の受動的予防又は治療のだめの組成物、生理的に許容され る担体との混合において受動的予防又は治療をもたらすのに有効な濃度のこの発 明の抗体を含有する組成物が提供される。

さらに、この発明によって、エンドトキシンの免疫学的又は生化学的分析を行う ために有用な研究用組成物が提供される。これらの組成物は、研究のために適当 な担体との混合において、これがエンドトキシンと混合されたときにそのような 情報をもたらすのに有効な量の抗体を含有する。

さらに、この発明により、エンドトキシンを含有する組成物又は溶液からエンド トキシンを分離しそして精製するために有用な組成物、免疫吸着によるエンドト キシンの分離及び精製を可能にするのに効果的な抗体の支持体のために適当なマ トリクスを含む組成物が提供される。

さらにまた、この発明によシ、エンドトキシンを含む材料又は溶液からエンドト キシンを中和しそして／又は除去するために有用な組成物、エンドトキシンを含 有するそのような材料又は溶液からのこれ５ らのエンドトキシン沈澱又は免疫吸着を可能にする適当な担体又はマトリクスを 含有するそのような組成物が提供される。

この明細書に組み込まれておシそしてその一部をなす添付図面又は表は、この発 明の原理を例示し、そして記載と一緒になって説明するために機能する。

図面の簡単な説明 第１図は、１４％ＳＤＳ　、ｊ？クリアクリルアミドグル上の電気泳動による精 製エンドトキシンコアーの分析を示す。

第２図は、Ｊ５−１ハイブリドーマ培養上清から得られたモノクローナル抗体と 精製エセリヒア・コおける結合を示す。

第３図は、Ｊ５−１腹水腫瘍により産生されたモノクローナル抗体と精製エセリ ヒア・コリＪ５エンドトキシンコアーとのＥＬＩＳＡアッセイにおける結合を示 す。

第４図は、競争阻害ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すものであり、均一エンドト キシン及び不均一エンドトキシンによるＪ５−１及びＪ５−２モノクローナル抗 体の特異的結合活性の濃度依存阻害を例示している。

６ 好ましい態様の記載 自己複製キャリヤー細胞及びエンドトキシンと反応性の得られる抗体の製造及び 特徴付け、並びに該抗体を用いる種々の方法及び組成、物が、この発明の好まし い態様を示す下記の記載によシ一層よく理解されよう。

この発明に含まれる２つのキャリヤー細胞系は、単に例示的意味であるが、ＡＴ ＣＣＨＢ　８２９７及びＡＴＣＣＨＢ　８２９８であシ、これらはアメリカン・ タイプ・カルチュア・コレクション、１２３０１／＃−クラウンドライブ、ロッ クビレ、メリーランド、米国、２０８５２の永久コレクションから入手し得る生 物学的に純粋な培養物であシ、そして１９８３年５月６日に寄託されたものであ る。

、　示されるように、この発明の範ｖＥｆ′ｉ、グラ゛ム陰性細菌のエンドトキ シンコアーの任意の部分と反応性のモノクローナル抗体の産生をコードする遺伝 子を　□含有する、ＡＴＣＣＨＢ　８２９７及びＡＴＣＣＨＢ　８２９８を含む がこれらに限定されない任意の自己複製キャリヤー細胞を包含する。この明細書 は、上記のＡＴＣＣＨＢ　８２９７及びＡＴＣＣＨＢ　８２９．８を製造するた めに　□発明者によって採用された段階を詳細に記載する。

エンドトキシンコアーと反応性のモノクローナル　□抗体を分泌するハイプリド ーマ（融合細胞）を製造１７ するために、この発明に従えば次の手順が用いられた。

Ｅ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）親菌株に由来しそして「Ｊ５」と称される二重ラフ変 異株（ＡＴＣＣ３９３５５、アメリカン・タイツ・カルチーア・コレクション、 １２３０１）や−クラウン　ドライブ、ロックビレ、メリーランド、Ｕ、Ｓ、Ａ 、　２０８５２から入手可能であり、そして１９８３年５月６日に寄託された） は酵素ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼを欠き、そして外来性のガラクト ースをそのリポポリサッカライド構造中に取シ込むことができない。この変異の 結果として、この菌株によシ産生されたエンドトキシンは〇−特異的側鎖及び外 部コアー鎖を欠き、そしてリピドＡ及び内部コアーに存在する糖（この場合２− ケト−３−デオキシオクトネート、ヘゲドース、グルコース、及びＮ−アセチル ゲルコサタンを含んで成る）のみから成る。３５株は、この場合例としてのみ用 いられる。この発明の目的のために、３５株のエンドトキシンに類似するエンド トキシンを担持する任意の細菌株をエンド帰キシンコアーの分離源として使用す ることができる。いわゆる「ラッコ変異株は、そのエンドトキシンが３５株のそ れと類似して０−特異的側鎖及び外部コアー構造の少なくとも部分を欠き、その ために交差反応する内部コアーに関連する免疫決定基を露出しているため、この 目的のために好ましい生物である。この方法に代えて、リゾポリサッカライド構 造が比較的完全であるいわゆる「スムース」生物から得ることもできよう。この ような菌株からのエンドトキシンを物理的又は化学的に分解して、エンドトキシ ンコアーと反応性のモノクローナル抗体の製造において有用な、３５株のごとき ラフ変異株から得られるファー構造と類似のコアー構造を得ることができよう。

上記の細菌を、トリジシン分解大豆寒天スラント（ディフコ、デトロイト、ＭＩ ）上で３２℃において一夜増殖せしめ、そして次に１０００ｍ／のトリジシン分 解大豆ブロス（ディ７コ）を収容する４を容のフェルンバッハフラスコに接種し た。これらの培養物を３２℃にて１８時間振とうしながらインキュベートし、遠 心分離によシ細胞を取り出し、０．５　ＭＮａＣｌによ＃）２回洗浄し、そして 秤量した。次にこの細菌を０゜１５　Ｍ　ＮａＣ１を伴う０．０５　Ｍ　）リス （ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸塩緩衝液、ｐＨ９，０中に０．２．９ ／ｍｌの濃度で懸濁し、大グローテ（ンニケーターセルディストラゾター、ヒー トシステムスーウルトランエックス社、ブレーンビュー、ＮＹ）を用いて最大設 定において合計１０分間超音波、処理した。遠心分離した後被し、）を懸濁し、 そして超音波処理を反復した。断片化された細胞を蒸留水中に０４μｇ／ｍｌの 濃度に懸濁し、そして水浴中で７０℃にて加熱し、次に同容量の９０％再結晶化 フェノール（ＰＨ７，０）を加え、そして混合物を７０℃にて一定攪拌を行いな がら１５分間インキュベートした（　Ｗｅｓｔｐｈａｌ等、Ｚ、　Ｎａｔｕｒｆ ｏｒｓｃｈ、　７　ｂ　：　１４８．１９５２、これを引用によシこの明細書に 組み入れる）。次に、この混合物を４℃に冷却し、１０．００　Ｏｒｐｍにて１ ０分間遠心分離し、水相を貯蔵し、そしてフェノール相を同容量の水によって上 記のようにして再抽出した。フェノール相、及びフェノール−水界面の変性蛋白 質を廃棄し、そしてリポポリサッカライドを含有する水相を一緒にした。次に、 リポポリサッカライド懸濁液を分液漏斗に入れ、無水ジエチルエーテルで抽出し くエーテルとリポポリサッカライドとの比２：１）、そし、て水相を貯蔵した。

水を取シ出したのと同じ量においてエーテル相に加え、混合物を振とうし、そし て水相を再び取シ出した。−緒にした水相を追加のエーテルによシー夜再抽出し た。溶液に窒素を泡立てることによシ最終水相から過剰のエーテルを除去した。

ＲＮＡアーゼ（タイツｌ−Ａ、シグマケミカル社、セントルイス、ＭＯ）を２　 Ｋｕｎｉｔｚユニッ）　／　ｍｌの濃度でリポポリサッカライド・懸濁液に加え た。次に混合物を、室温において、Ｑ、　ｌ　Ｍ　ＮａＣ１及び１．　ＯｍＭ　 ＮａＮ、を伴う００１Ｍトリス−アセテート、ｐＨ７，５に対してこれを多数口 取シ替えながら、２３０〜３００　ｎｍレンジにおいて監視した場合の透析液の 光学濃度がＯになるまで透析した。次に、リポポリサッカライド懸濁液を冷水に 対して一夜透析した。ＤＮＡアーゼ（タイツ■、シグマ）を２　Ｋｕｎｉｔｚユ ニッ）／ｍ／の濃度に加え、そして懸濁液を５ｒｒＬＭＭｇＳＯ４及び’　１　 ｒｎＭＮａＮｓを伴う０５１ＭＮａＣ１に対してこれを反復して取り替えながら 、２３０〜３００　ｎｍレンジにおける透析液の吸収がＯになるまで透析した。

次に、リポポリサッカライド懸濁液を冷水に対して一夜透析し、グロナーゼ（タ イツＶ、シグマ）をＩ　Ｋｕｎｉｔｚ　ユ＝　ｙ　）　／　１００　ｍｌの濃度 に加え、溶液を０．ＯＩＭｌ−リスアセテ−）　ｐＨ７，５に対してこれを数回 取り替えながら透析し、次に冷水に対してこれを多数回取り替えながら数日間に わたって透析した。リポポリサッカライド懸濁液を凍結乾燥し、そして秤量した 。

この場合、エンドトキシンコアーを上記のようにして調製したが、これに代る精 製方法、徊えばＧａ１ａｎｏｓ等（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

９°２４５．１９６９）（引用によシこれをこの明細書に組み入れる）によシ記 載された方法を用いてエンドトキシンコアーの分離を行うこともできる。

ある場合には、他の精製手段、Ｇａ１ａｎｏｓ等の方法を用いて、エンドトキシ ンコアーの収量を最大にし、又はそれに対するモノクローナル抗体がめられる特 定の抗原部位又はエビドーグを維持し又はさらに好甘しくけ「与える」のが好ま しい。

精製されたＥ、コリＪ５エンドトキシンコアーは、Ｂｒａｄｆｏｒｄのクマーシ ープルー結合法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ　＋Ｍ、Ｍ、　、　Ａｎｄｌｙｔｉｃａｌ　 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＋　７２　：　２４８．１９７６）によシ決定した 場合く１％の蛋白質を含有し、そしてアミノ酸分析によシ確証された。Ｌｉ＋型 の陽イオン交換樹脂を用い、溶離液として９０％エタノールを用いる逆相クロマ トグラフィーによる中性糖の分析は、ヘゲドース及びグルコースの存在、±ガラ クトース、及びコリドースの不存在を示した。

後者は、ス′ムースＥ、コリ０１１１：”Ｂ４４重の〇−特異的側鎖に含まれる 特異な糖である。これらのデーターは、サルモネラのＲｃケモタイプ（ｃｈｅｍ ｏｔｙｐｅ　）（Ｌｕｄｅｒｉｔｚ　Ｏ，等、Ｂａｃｔｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　 Ｒｅｖｉｅｗｓ　、　３０　：１９２　、１９６６　；　Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ　 Ｓ、Ｇ、　５ｕｒｆａｃｅＣｏｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ　ｏｆ　ｔｆｅ　Ｐｒｏ ｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　、　１．Ｗ。

５ｕｔｈｅｒｌａｎｄ編、アカデミツクプレス、ニューヨーク、１９７７．９７ −１７１頁）に対応する不完全コアー構造を確認する。１４チＳＤＳポリアクリ ルアミドゲル中で゛の電気泳動及びこれに続く銀染色（第１図）は、移動度にお いて他の同時に泳動したりポポリサッカライド（Ｓ　、　Ｒａ　、　Ｒｄ　）と 類似する単一の広い速く移動するバンド（Ｊ５）を示しており、無傷のスムース リポポリサッカラ′イド（Ｓ）に特徴的な規則定に配置された一層ゆっくり移動 するバンドが欠けている（　Ｔｓ＋ａｉ　Ｃ，、ＦｒａｓｃｈＣ，Ｅ、　、　Ａ ｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉａｔｒｙ、　ｌ　１９　：　１１５　＋　 １９８２を参照のこと）。

第１図に示されている場合、ｒＳＪと表示するサンプルはスムースエ＋リヒア・ ニア　！ｊ　０１１　］°Ｂ４野性型株からのりポポリサッ力ライド５μＩを含 有し；「Ｒａ　ＪはＥ、コリＰＬ２ラン変異株からの、サルモネラのＲａケモタ イグに対応する完全コアー構造により特徴付けられるリポポリサッカライド０２ μＩを含有し；「ＲｄＪはＥ、コリＰＬ２−ＣＬ２９ラフ変異株からの、サルモ ネラのＲｄケモタタイに対応する不完全コアー構造によシ特機付けられるリポポ リサッカライド０、２　ｐｇを含有し；そして「Ｊ５」はＥ、　コリ０１１１： Ｂ４４重から誘導されたＪ５と称するウリジンクホスフェート４−エピメラーゼ −欠損変異株からのりポポリサッカライドであって、その不完全ファー構造がサ ルモネラのＲｅケモタイノに対応するもの、０．２μＩを含有する。Ｊ５から調 製されたエンドトキシンコアーの純度及び機能的完全性は、それぞれ高応答及び 低応答Ｃ３）（／Ｆｅ　Ｊ　マウス及びＣ３１（／１（ｅ　Ｊ　７ウスからの肺 臓細胞を用いるマイトゼネシスアッセイにおいて確認された。精製されたエンド トキシンコアーに対するマイトゼン応答はスムースＥ、コリに２３５株（Ｓｋｉ ｄｍｏｒｅ　Ｂ、Ｊ、、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ製 されたり？ポリサッカライドにより誘導されるそれに匹敵した。これらはＣ３ｌ （／Ｆ’ｅ　Ｊ肺臓細胞による高い応答、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ牌臓細胞による低い又 は存在しない応答、及びエンドトキシンとポリミキシンＢとのインキュベーショ ンに続くマイトゼン活性の完全な廃棄を含んでいた。

精製すれたエンドトキシンコアーに対する抗体をエンザイムーリンクドイムノン ルベントアツセイ（ＥＬＩＳＡ　）を用いて定量した。精製されたエンドトキシ ンコアーを被覆緩衝液（１５ｍＭ　ＮａＣ０，，３０ｍＭＮａＨＣＯｓ、３　ｍ Ｍ　ＮａＮ３、ｐＨ９，５５）中に２５　ｐａｌ／ｍｌの濃度で溶解し、そして ５０μｔのアリコートにおいてア、ＶＡ）に分配した。４℃にて一層インキユベ ートした後、エンドトキシン懸濁液を除去し、そしてＰＢＳ−トウイーｙ　（１ ５０ｍＭ　ＮａＣｔ、６　ｍＭ　Ｎａ　２ＨＰＯａ、１　蔵ＫＨｐｏ　３　綱Ｎ ｈＮ３、及び０．５　ｍｌ／　ｌ　）　ライ−２４１ ンー２０）によシラニルを５回洗浄した。５０μｔの試験サンプルをウェルに加 え、プレートを４℃にて３０分間インキュベートし、そして次にＰＢＳ　−）ク イーンによ９５回洗浄した。ＰＢＳ　−）ウィーン洗浄によシ分離された最終３ 閥階は次の通シである：１　：　５００に稀釈され、そしてあらかじめ全Ｅ、コ リＪ５細胞に吸着されたラビット−抗マウスカッ・ぞ−鎖（カッベルラボラドリ ース、コクランスビレ、　ｐＡ）５０μｔの添加及びそれに続く４℃にて３０分 間のインキュベーション：に２５０に稀釈されたヤギ抗−ラピッ）　ＩｇＧ−ア ルカリ性ホスファターゼ接全体（シグマ）５０μｔの添加、及び４℃にて３０分 間のインキーベーション：１０チジエタノールアミン中１　ｍｙ　／　ｍｉのｐ −ニトロフェニルホスフェート（シグマ−１０４）基質５０μｔの添加、及び２ ５℃にて６０分間のインキュベーション。

アッセイは後で、高力価マウス腹水から調製されたアフィニティー精製されたエ ンドトキシンコアー特異的免疫グロブリンを用いて標準化した。標準曲線の中間 点に近い吸収を示す試験サンダル稀釈物を用い、そして特異抗体の濃度を最小二 乗法により標準曲線から計算した。アッセイの感度は０．０２μ９７ｍ１であシ 、そして３重のサンプルの間の再現性は平均±４％であった。

次に、エンドトキシンコアーと反応性のモノクロ−２５ ナル抗体をコードする遺伝子を含有する自己複製キャリヤー細胞（このケースに おいてはマウスハイブリド−マである）をいかにして調製するか、及びこれらの キャリヤー細胞のクローンがいかにして大規模に複製されるか、及びこれらのク ローンからモノクローナル抗体がいかにして得られるかについて記載する。

我々は、あらかじめＪ５エンドトキシンコアーによシ免疫されたマウスから得ら れた肺臓細胞（Ｂリンｉｅ球）とマウス形質細胞腫とをいかにして融合せしめて いわゆるバイブリドーマを得たか、及びエンドトキシンコアーに対するモノクロ ーナル抗体を分泌するこれらのハイプリドーマからの細胞をいかにしてクローン 化したかを記載する。我々はさらに、２つの別個の融合実験に由来する２Ｍ類の 異るノ＼イブリド−マクローン（Ｊ５−１及びＪ’５−２　）をイン−ビトロ技 法及びインービボ技法の両者を用いて大規模にいかにして複製したか、及びエン ドトキシンと反応性のモノクローナル抗体をこれらの自己複製キャリヤー細胞か ら大量の使用し得る量においていかにして得たかについて示す。

６週齢の雌性ＢＡＬＢ／Ｃ７ウスに、０．１５　Ｍ　ＮａＣ１に懸濁された精製 Ｊ５エンドトキシンコアー５０μｙを３週間の間隔で腹腔内注射した。供与体マ ウスを最終免疫の３日後に頚部脱臼により殺し、肺臓を無菌的に摘出し、そして ５　ｍＡのＲＰＭＩ　ｌ　６４０培地を収容した３５ｍ１のプラスチツク製４ト リ皿に入れた。肺臓を単細胞懸濁液になるよう′にほぐし、そして細胞を冷ＲＰ ＭＩ　］　６４０によ９２回洗浄し、そして同じ培地に再懸濁した。

融合の相手として、Ｋｅａｒｎｅｙ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇ ｙ、１２３　：　１５４８　、１９７９　）　（これを引用によシこの明細書に 組み入れる）により開示されたように酵素ヒボキサンチングアニジンホスホリボ シルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ−、ＥＣ２、４、２。

８）を欠損した免疫グロブリン非分泌性マウス形質細胞腫細胞（Ｐ３−Ｘ６３− Ａｇ８．６５３）を用いた。この細胞系は、アメリカン・タイプ・カルチュア・ コレクション、ロックビレ、メリーランドから入手することができ、ここではＡ ＴＣＣＣＲＬ−１５８０と称される。

形質細胞腫細胞系は、１０％ウシ胎児血清を含有しそしてさらに２ｍＭＬ−グル タミン、１チビルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸類、１００１Ｕ／ｍｌ ペニシリン及び１００μｌ／ｍｌストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ　１ ６４０培地中で維持した。ＨＣＰＲＴ十復帰変異株を殺すため、融合の３日前に ０．１　ｍＭ８−アザグアニンを形質細胞腫細胞に加えた。融合の日、形質細胞 腫細胞を７５　ｃｍ２の培養フラスコから収得し、血清不含ＲＰＭＩ　１６４０ 培地中で１回洗浄しそして再懸濁した。この形質細胞腫細胞及びあらかじめ集め た牌細胞を計数し、そしてこれらの生存の程度をトリ・やンブルー色素排除によ って測定した。

融合技法はＧｅｆｔｅｒ等（Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　。

３　：　２３１．１９７７　）のそれから変形した。引用によシこれをこの明細 書に組み入れる。次に、Ｊ５−１ハイブリドーマクローンを得た融合実験を記載 する。第二の融合実験は同じ方法で行いＪ５−２．−イブリド−マクローンを得 た。殺菌した５Ｑｍ／の円錐形グラスチックチューブに１．０Ｘ１０８個の肺臓 細胞及び１．　ＯＸ　１０’の形質細胞腫細胞を加えた。形質細胞腫−肺臓細胞 懸濁液を２５０×９にて１０分間室温にて遠心分離し、そして次に培地をほとん ど乾燥するようにデカントした。細胞（レットを、軽く打つことによって少しゆ るめ、そして血清を含まないＲＰＭＩ　１６４０中５０％のポリエチレングリコ ール（ＭＷＩ　４００　）　１ｍｌを４５秒間にわたツー’ｒ滴加した。この過 程でチューブをゆるやかに攪拌した。１分間後、さらに２ｍｌのＲＰＭＩ　１６ ４０を２分間にわたって加えた。追加の２０ｍ１のＲＰＭＩ　１６４０を次の２ 分間にわたって加え、そして室温にて２５０）ｌで１０分間遠心分離することに よ多細胞をベレット化し“た。

液をデカントし、そして４Ｑｍｉの富化された選択培地を加えた。この培地は、 １０％ウシ胎児血清を含有しそして２ｍＭＬ−グルタミン、１％ピルビン酸ナト リウム、１％、非必須アミノ酸、１００１Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｆｌ　 ７ｍｌストレプトマイシン、１ｍＭ才キサロ酢酸、１０％ＮＣＴＣ１０９、及び ０．２　μｌｌ　７ｍｌウシ肺臓インシュリンが補充されたドゥブレコＭＥＭか ら成る。この培地はさらに１．０Ｘ１０−’Ｍヒポキサンチン、４．ＯＸ１０Ｍ アζノプアミノ、及び１．６ＸＩＯ−５Ｍチミジン（ＨＡＴ　）から成る。アミ ノグチリンは酵素ＨＧＰＲＴを欠く細胞に対して毒性を有し、そしてそれ故に未 融合の形質細胞腫細胞を殺す。融合細胞（ハイブリドーマ）は、Ｂリン・や球（ 肺臓細胞）融合相手からＨＧＰＲＴを得るためにＨＡＴ中で生存・する。

５０Ｘ１０５個の細胞を含有する０、　２　ｍｌのアリコートを上記の混合物か ら複数の殺菌した平底ミクロタイタープレートの個々のウェルに移した。このプ レートを６％のＣ０２と９４％の空気とから成る加湿した雰囲気中で３７℃にて インキュベートした。次の１１日間にわた９１日おきに新鮮な選択培地を加えた 。１１日０にミクロ力ルチュアーの上清液を、Ｌコ１７　Ｊ　５エンドトキシン コアーと反応性の抗体について、前記したＥＬＩＳＡアッセイによシ試験した。

陽２９ 性の培養物を数において拡大し、そして３５　ｔｙｎ２のフラスコに移した。こ れらの培養物からの培地を祠試験し、そして抗体の分泌を維持しているものを凍 結し、そして液体窒素蒸気相中で一１７９℃にて貯蔵した。

上記の陽性ハイブリドーマ培養物の１つ、及び第二の融合実験に由来する１つを 限界稀釈法によるクローニングのために選択した。０〜１個の細胞を含有する】 ００ｔのアリコートを、ウェル当、！ｌ）１．０Ｘ１０　個のマウスマクロファ ージ（ｐ３８８Ｄ］　）’（＋−あらかじめ接種しておいた無菌平底ミクロタイ タープレート上の数百側の個々のウェル甲に移した。マクロファージは幾つかの 商業的供給者から入手可能である。これらはハイブリドーマのための「フィーダ ー（ｆｅｅｄｅｒ　）　Ｊ、ｉｔａ胞として機能し、そして培養中に増加するの を防止するため使用に先立って放射（コバルト６０源、１０００ラド）されてい る。

１４日後、クローン化培養物を、ＥＬｒＳＡアッセイによジエントドキシンコア ーと反応性の抗体について再度試験し、そして２つの親培養物のそれぞれからの １個ずつの陽性クローンをその後の研究のために選択した。Ｊ　５−１　（ＡＴ ＣＣＨＢ　８２９７　）及びＪ５−２　（ＡＴＣＣＨＢ　８２９８　）と称する これらのクローン化ハイブリドーマを数において拡大し、凍結し、そし〉　でこ れらを誘導した親細胞系と同様にして貯蔵した。

与　Ｊ５−１及びＪ５−２バイブリド〜マがらモノクロ−ナル抗体の有用な量の 製造が可能であることを？　２つの方法を用いて証明した。インーヒリロ法は、 上記のように補充されたＲＰＭＩ　１６４０培地を収容す）　る７５α２培養フ ラスコ中に増殖した両細胞系の静置ン　培養を用いた。６％ｃｏ２のもとての３ ７℃における約５〜７日間のインキュベーションの後、約１０ｔ４／　ｍｌのＪ ５−１抗体及び１　ａｌ／ｍｌのＪ５−２抗体を含有する１〜２ｔの培養液を祷 るのが便利であった。

第２に、多量のモノクローナル抗体を得るためのインービボ法は、Ｊ５−１及び Ｊ５−２細胞系を「腹水」腫瘍として増殖せしめることを含む。雌性のＢＡ　Ｌ Ｂ／Ｃマウスを、０．５　ｍｌのブリスタン（２，６゜１０．１４−テトラメチ ルペンタデカン）を腹腔内注射することによジグライム（ｐｒｉｍｅ　）　シｆ ｃ。ｆ　リスタンは、マウスの腹腔中の漿液性分泌物（腹水）（培地として機能 する）を生じさせる無菌の刺激剤である。プリスタンを注射した約７〜１ｏ日後 、イ活発に増殖中のハイブリドーマ細胞を含有する７　１７コートをグライムさ れたマウスの腹腔に接種した。

ハイブリドーマ細胞を、１〜２週間の間隔で、新しくグライムされたマウスに逐 次的に継代した。この１ ような継代を３〜４回後った後、Ｊ５〜１ハイプリドーマ及ＵＪ　５−２ハイブ リドーマはよく適合した腹水腫瘍となシ、マウス腹腔の微小環境中で急速に増殖 し、そしてエンドトキシンコアーと反応性の多量（約２〜１０■／ｍｌ）のモノ クローナル抗体を分泌した。日常的に２０〜３０ｍ１の腹水が各マウスから吸引 によって取シ出された。抗体産生腫瘍細胞を抗体含有液相から分離し、そして他 のプライムされたマウスに再注射し、そしてこの工程を犀復した。

エンドトキシンコアーと反応性のモノクローナル抗体を大規模に製造することが できる第３の方法は。

この発明のハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の先行する調製によシ可能と なシ、そしてそれを必要とする。この方法に従えば、エンドトキシンコアーと反 応性のモノクローナル抗体をコードする遺伝子をこれらを産生ずるハイブリドー マから一層急速に増殖する微生物、例えば細菌又は酵母に移転し、そしてこれら の遺伝子の抗体生成物を微生物自体から、又は微生物が増殖した培地から回収す る。この方法は、最初にＣｏｈｅｎ等Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ１ ９７３（これを引用によりこの明細書に組み入れる）によシ記載された組換ＤＮ Ａ技法に基礎を置いてぃ゛る（さらに米国特許第４．２３７．２２４号を参照の ２ こと）。この方法を実施するために用いられる技法よシ（彼らはラットインシュ リン及びヒト成長ホルモンをそれぞれ細菌にクローン化した）、及び、Ｈｉｔｚ ｅｍａｎ等、　Ｎａｔｕｒｅ　（ｏ　７ドン）、２９３ニア１７゜１９８１（彼 らはヒトα−１インターフエロン遺伝子を酵母に移転した）にょシ記載されてい る。これらの公表を引用にょシこの明細書に組み入れる。

Ｊ　５−１　（ＡＴＣＣＨＢ　８２９７　）及びＪ５−２（ＡＴＣＣＨＢ　８２ ９８　）と称するクローンは２つの異るハイブリドーマ細胞系に由来し、そして 上記のよう４　にして調製された。両クローンは組織培養において安定であシ、 Ｊ　５−１　（ＡＴＣＣＨＢ８２９７’）ｌｄ約１０μｌ／ｍｅの抗体蛋白質を 産生じ、そしてＪ５−２（ＡＴＣＣＨＢ　８２９８　）は約１ｐ９／ｒｒｒｌを 分泌する。両クローンはさらにマウース腹水腫瘍として馴養され、そしてこの系 において２〜１０ｍ９７ｍｅの抗体を産生じた。

Ｊ５−１ハイブリドーマ及びＪ５−２ハイブリドーマ如よって産生される免疫グ ロブリン（抗体）はいずれもＩｇＧ１アイソタイプ及びサブクラスであり、この ことは免疫ｎ製された抗−免疫グロブリンタラ３３ スー及びサブクラス−特異的試薬を用いる二重グル免疫拡散（０ｕｃｈｔｅｒｌ ｏｎｙ　）分析によシ証明される。

Ｊ５−１抗体及びＪ５〜２抗体のモノクローナル性はこれを産生ずるハイプリド ーマの再クローン化によってあらかじめ保証されておシ、５ＤＳ−ポリアクリル アミドゲル電気泳動及び生合成的にラベルされた抗体テンプルを用いるオルトラ ジオグラフィーによシ確認された。

エンドトキシンコアーによるＪ５−１抗体及びＪ５−２抗体の結合を前記のエン ザイムーリンクドイムノソルベンントアッセイ（ＥＬＩＳＡ　）を用いて試験し た。精製されたＥ、　：ＦｖＪ５コアー抗原を用いてミクロタイターグレートの ウェルを被覆し、このウェル中でアッセイを行い、そして得られた発色反応を測 定した。第２図に示す代表的な「結合曲線」は、Ｊ５−１ハイブリドーマの培養 上清からの、硫酸アンモニウム沈澱されそして再溶解された蛋白質の稀釈物をＥ ＬＩＳＡによ）測定した場合に得られた。わずかに異る勾配を有する類似の結合 曲線がＪ５−２培養土清液のアッセイによっても得られた。

Ｊ５−１抗体分泌性腹水腫瘍を腹腔内注射されたマウスからの腹水のＥＬＩＳＡ アッセイによシ得られた結合曲線を第３図に示す。この図中の平行な結合曲線は 、未処理腹水液（○）、同じ腹水液からの硫酸アンモニウム沈澱されそして再溶 解きれた蛋白質（△）、及び精Ｊ！！！Ｅ、コリＪ５エンドトキソンがあらかじ め結合されたセファｐ−２４Ｂカラムに腹水を通すことによって調製されたアフ ィニティー精製Ｊ５−１モノクローナル抗体（・）の逐次稀釈物を測定すること によシ得られた。腹水液中に産生されたＪ５−１抗体の特異性はこの免疫吸着法 の結果により、及び精製エンドトキシンコアーによシ吸着された材料からの抗体 活性の観察される除去によシ示された〔例３中い抗体濃度を反映して、Ｊ５−］ 培養土清に比べて５５−１腹水液の約１０００倍高い稀釈において、ＥＩＪＳＡ によシ検出した。類似の抗体量及び類似の結合曲線がＪ５−２ハイブリドーマに より産生された腹水液の場合に得られた。

エンドトキシンコアーと反応性のモノクローナル抗体の２つの顕著な特徴は、異 るグラム陰性細菌のエンドトキシンコアー構造の部分に対するそれらの特異性、 及びそれらの交差反応性である。これらの特徴は、Ｊ５−１ハイブリドーマ（第 ４図中左・母ネル）及びＪ５−２ハイプリドーマ（第４図中布・ぞネル）の両者 によシ産生された抗体の競争阻害ＥＬＩＳＡアッセイによシ確認された。両抗体 と精製Ｅ、コＩＪＪ５ ５エンドトキシンコアーとのブレインキュベーション（ロ）は、ＥＬＩＳＡアッ セイにおけるそれらの反応性を量依存的に廃止した。これによジエントドキシン コアーに対する両抗体の特異性が確認された。さらに、Ｊ５−１抗体及びＪ５− ２抗体と、「ラフ」及び「スムース」の両方の生物から得られ、そして細菌の異 る種及び属〔例えばエセリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｊｃｈｉａ　ｃｏ］ｉ　Ｋ 　２３５　（）、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａ ｅｒｕｇｉｎｏｓａ　）フィッシャータイｆ　２　（０）　、及びサルモネラ・ ミネソタ代表するエンドトキシンを包含する他の外来性エンドトキシンとのブレ インキュベーションによシＥＬＩＳＡアッセイにおける両抗体の反応性が阻害さ れた。二重ゲル免疫拡散アッセイによシ確認されたこれらのデーターにより、種 々の由来からのエンドトキシンに対する両モノクローナル抗体の交差反応性が確 立される。

Ｊ５−１モノクローナル抗体及びＪ５−２モノクローナル抗体の機能的活性を、 Ｂリンｉｅ球の増殖及び分化を刺激するエンドトキシンの能力を測定するイン− ビトロ測定によシ評価した。このマイトイン活性はほとんどのエントドキシ／が 共通に持って、−ｔＬでエンドトキシンコアーのリビドへ部分によりて介在され る。リビドＡはまた、エンドトキシンのその他のほとんどの生物学的活性に介在 する。マウス牌細胞を用いる非常に感度の高いそして広く用いン活性を定量する のが便利である。

我々は、Ｅ、コ＋）　（Ｊ　ｓ　）及び他のグラム陰性細菌からのエンドトキシ ンのマイトイン活性を中和するＪ５−１モノクローナル抗体及びＪ５−２モノク ロるように、同種性の又は外来性のエンドトキシンとＪ　５−１抗体とのグレイ ンキーベーションにょシ、４８時間にわたる組織培養１ｃおいてエンドトキシン に暴露されたマウス牌細胞により取り込まれる３Ｈ−チミジンの減少によシ表わ されるマイトイン活性の阻害が生ずる。

第１表 Ｊ５−１バイブリド〜マによシ産生されたモノクローナル抗体によるリポポリサ ッカライド−誘導Ｂ細胞マイトゼネシスの中和 ３７ ＣＰＭ十ＳＥＭ リゾポリサッカライド源　Ｊ５−１抗体なし　Ｊ５−１抗体あシ（Ｊ５変異株） 培地対照　１，６８５±１６２　１．８２８±２９０ｓｓ　Ｔ＆ＲＢｒｌＧＯ− ５０１２４２θ３）上記の阻害の特異性は、エンドトキンン誘導Ｂ細胞マイトゼ ネシスがエンドトキシンコアー以外の抗原に対して向けられたＩｇＧＩサブクラ スのモノクローナル抗体によって影響されないという観察、及びＪ５−１抗体に よるエンドトキシン誘導マイトゼネシスの中和が、Ｃ３ｌＶＦ’ｅｊマウスから の工／ドトキンン反応性Ｂリンパ球を用いる場合は顕著であるがＣ３１ＶＨｅｊ マウｘ　カラのエンドトキシン非反応性Ｂ！ｊンパ球を用いる場合ｌｉ顕著でな い事実から確立された。

第１表に示されたデータは、Ｊ５−１ハイプリドーマによシ産生されたモノクロ ーナル抗体がエンドトキシンの生物学的活性を中和する事実を確立する。

これらのデータはさらに、Ｊ５−１抗体と、グラム陰性細菌の異る属及び物に出 来するエンドトキシンとの交差反応性を確認する。Ｊ５−２クローンにょシ産生 される。同種性の又は外来性のエンドトキシンのマイトイン活性を特異的に阻害 する抗体を用いる場合にも類似の結果が得られた。

Ｊ５−１モノクローナル抗体及びＪ５−２モノクローナル抗体によシ分泌された 抗体はその活性において類似するが、これらは異る勾配の結合臼、・蔵を形成し 、そしてそれらのエンドトキシン中和能は量的にｘｂ、これら２つのモノクロー ナル抗体はエンド９ トキシンコアー構進上の２つの別の部位（エビ）−グ）に対して向けられること を示唆している。こぐことはこんどは、異るエピトープに向けられた、臭る結合 親和性を有する、そしておそらく異る機能印活性を有するが、しかしエントドキ シ／コアーとの共通の反応性を有するモノクローナル抗体を産生する多数の異る ８９７１球クローンの存在を示す。従って、Ｊ５−１抗体及びＪ５−２抗体は、 エンドトキシンコアーのある部分との反応性によシ定義される抗体のこの大きな 群の単に２つの例を示すに過ぎない。この発明は抗体のこの全群、及びこれらを コードする遺伝子、これらを産生ずる自己増殖キャリヤー細胞等を含む。

我々は次に、Ｅ、：ｆｆ１Ｊ　Ｊ５株と遺伝的に異る生物によシ惹起される実際 のグラム陰性細菌感染に対するＪ５−１モノクローナル抗体の交差保護活性を評 価シタ。Ｊ５−１ハイプリドーマのイン−ヒドロ培養からの培養土清液の硫酸ア ンモニウム沈澱によシ得られたモノクローナル抗体を、２０１のスイス−ウェブ スターマウスに、２０μぴ／マウスの投与量で腹腔内注射した。対照動物ＶｃＦ ！同じ投与量のウシ崩清アルブミン（ＢＳＡ　）を投与した。１８時間後、マウ スＫ　６．２５　ｃｍｔの炎に１０秒間当て、次に火傷の部位に、洗浄された対 数期のシュードモナス・エルギノーザ（フィッシャータイプ１）細菌の６倍及び １０倍稀釈物を、各稀釈につき５匹のマウスに皮下投与した。３日間死亡を記録 し、そして細菌の中間致死量（ＬＤ５ｏ）をＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒの 方法（Ｄ、Ｊ。

１９７８．３９４−４０１頁）によりＪ５−１及び対照群についてそれぞれ計算 した。得られたデータを次に示す。

第２表 マウスにおけるシュードモナス・エルギノーザの火傷感染に対するＪ５−１ハイ プリドーマによシ産生されたモノクローナル抗体の保護効果ＢＳＡ（対照）　０ ”　ＯＯ，８０８０１００］、３Ｘ］０５抗−Ｊ５　０＊０　６０１００　１０ ０１００　］、４Ｘ１０６本生存率係、各群５マウス。

Ｊ５−１モノクローナル抗体を、投与されたマウスにおいて保護が観察され、こ のことはこの群における動物の５０係を殺すのに必要な細菌接種量が１゜４１ 倍以上多いことによって示された。これらの及び同様の研究により、グラム陰性 細菌感染による死亡の防止におけるエンドトキシンコアーに対するモノクに対す る保護効果を示し、従って種類の異るグシム要約すれば、エンドキシンコアーと 反応性のモノクローナル抗体を、マウスＢリン・ｅ球と形質＃ｌ胞腫細胞とを融 合せしめ、そしてこれらの特異的抗体を分泌するハイブリドーマを選択すること によって製造した。２つの別個の融合から得られた異るハイブリドーマクローン に由来する、エンドトキシンコアーと反応性の２種類の異るモノクローナル抗体 を組織＠養及びマウスの腹水において大量製造し、こうしてこれらの抗体をイン ービボ技法及びイン−ビトロ技法により大量に製造することができることが示さ れた。我々が５５−１及びＪ５−２と称することして製造された２種類のモノク ローナル抗体は上記のように特徴付けられた。同種性及び異種性エンドトキシン とのこれらの特異的反応性が結合測定により証明された。すなわち、異るグラム 陰性細菌由来のエンドトキシンのり、ビドＡ介在生物学的活性を中和するこれら の能力がマイトゼイ・ンスアソセイの結果により示され、そしてグラム陰性細菌 感染に対するそれらの交差保護活性が、ネズミの７ユードモナこの発明の新規な 特徴は、この明細書の３頁に広く定義したエンドトキシンコアーの任意の部分と 反応性のモノクローナル抗体の産生を特定する遺伝子の分離及び再生に由来する 。単なる例により、この発明はエンドトキシンコアーの任意の部分、例えばリビ ドＡ成分又はその置換基、又は抗原部位、例えばリビドＡと密接に関連するがそ れとは異るコアー糖又はその置換基と反応性であるモノクローナル抗体を含む。

さらに、この発明はこれらの抗体の実際の製造に向けられる。上に例示した特定 の方法、及び得られた特異抗体は、この発ａＡない妙・にして便利に実施するか 、及び適肖な生成物をいかにして得るかの単なる例に過ぎない。エンドトキシン コアーの任意の部分と反応性のモノクローナル抗体の産生を明記する遺伝子の増 殖を導く任意の方法又は技法、及びこうして製造される任意の抗体がこの発明に 含まれる。

３ この発明の範囲は、モノクローナル抗体それ自体及び調製方法に加えて、該抗体 を製造するためのイン−ビトロ及びインービが法、この抗体を用いる免疫診断法 及び組成物、この抗体を用いる免疫予防法及び治療法及び組成物、この抗体を用 いる研究方法及び組成物、この抗体を用いる精製方法及び組成物、この抗体を用 いる他の方法及び組成物、この抗体とエンドトキシンコアーとの間の特異的相互 作用に基いて予想される方法及び組成物が含まれる。

この発明を説明するために前記の例はノ・イブリドーマについて記載し、そして 実際ＶＣ説明された例の場合には、これらのハイブリドーマはマウスＢリン・母 球とマウス形質細胞腫細胞との融合によシ生じた。

しかしながらこの発明の本質的且つ新規な特徴は、エンドトキシンコアーの任意 の部分と反応性の特異抗体の産生をコードする遺伝子の使用、及びこれらの遺伝 子を使用する、エンドトキシンコアーのいずれかの部分と反応するモノクローナ ル抗体の製造である。示されるように、使用される遺伝子及び使用されるキャリ ヤー細胞は、エンドトキシンコアーのいずれかの部分と反応性のモノクローナル 抗体の産生をもたらす限シ、ヒトを含む任意の動物種から得られるであろう。同 様に、エンドトキシンコアーのいずれかの部分と反応するモノクローナル抗体が 得られる限シ、任意のイン−ビトロ又はイン−ビトロ及び組成物がこれらの抗体 の大規模製造のために使用されるであろう。

この発明にお（・てキャリヤー細胞が使用される場合、これらは特に、自己複製 可能であることによって、及び丘ンドトキシンコアーのいずれかの部分と反応性 の′モノクローナル抗体の産生をコードする遺伝子を有することによって特徴付 けられる。他のモノクローナル抗体に関して示されているように、と１９８０） 、又は全体的に非ヒトハイブリドーマ（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ　、 　Ｎａｔｕｒｅ　、　２６５　：“４９５，１９７５）又は形質転換された親リ ンパ腫細胞（５ｔｅｉｎｉｔｚ等、Ｎａｔｕｒｅ　、　２６９　：　４２０　。

１９７７）のごとき細胞系であってよい。上記４つの公表のそれぞれを引用によ シこの明細書に組み入れる。これらの参照文献は、この特許の詳細な記載と相ま って、当業者が、エンドトキシンコアーと反応性のモノクローナル抗体の産生を コードするヒト又は非ヒト由来の遺伝子を含有する、ヒト又はヒト以外の動物の キャリヤー細胞を調製すること、を可能にするであろう。例えば、エンドトキシ ンコアーと反応性のヒト抗体を産生するヒトーヒトノ・イブリドマー、マウス・ ・イブリドーマについて上記した方法ト同様にして、但しエンドトキシンコアー により免疫された、又はあらかじめこれに暴露されたヒト供与体から得られた肺 臓細胞又は末梢血リン／４’球と、ヒトミエローマ融合パートナ−１例えばＨＦ Ｂ　−１細胞系（Ｈｕｎｔｅｒ等、　Ｌａｎｃｅｔ　、　２　：　７９８　、１ ９８２　）とをそれぞれマウス肺臓細胞と形質細胞腫＃ｌＮｇｌとの代ｐに用い て、調製することができる。同様にして、エンドトキシンコアーによシ免疫され た又はそれに暴露されたヒト供与体から得られた肺臓細胞又は末端面リン・５球 細胞をマウスミエローマ融合パートナ−５例えばＰＢ−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３ 細胞系（マウス−マウスハイプリドーマの調製において前記した）と融合せしめ て、エンドトキシンコアーと反応性のヒトモノクローナル抗体を産生ずる自己複 製性ヒトーマウスノ・イブリドーマを得ることができる。

エンドトキシンコアーと反応性のヒト又は非ヒトモノクローナル抗体を分泌する 自己複製キャリヤー細胞の調製の他の方法は、適当な３３１Ｊンパ球クローンの ウィルス形質転換が含まれる。５ｔｅｉｎｉｔｚ等ハプテンＮＮＰ　（４−ヒド ロキシ−３，５−ジニトロソェナセチン酸°）に対する特異的ヒト抗体を製造す るためにこの方法を用いた。例えば、この技法に従えば、エンドトキシンコアー で免疫された又はこれにあらかじめ暴露されたヒト供与体からの末梢血リン／４ ’球をフィコール−ハイバク（Ｆｒｃｏ目−Ｈｙｐａｑｕｅ　）上で分離するこ とができる。エンドトキシンコアーと反応性の抗体の産生について濃縮されたＢ リンパ球集団を、エンドトキシンをコートした赤血球上でのロゼツト形質のよう な方法によ＃）調製する。ロゼツト形成された細胞をフィコール−ハイ・ぐり上 での遠心分離によシ非ロゼツト細胞から分離し、組織培養培地に入れ、そして例 えばマイコプラズマ不含Ｂ９５−８細胞培養物からの上清液から得られたエプス タイン−バールウィルス（ＥＢＶ　）を感染せしめ）　る。ＥＢＶ感染Ｂリン・ ぞ球は連続的に増殖する細胞系（不滅化されている）に形質転換され、そしてエ ンドトキシンコアーと反応性の抗体を分泌する細胞系を、ハイツリドーマにりい て上記した方法と実質上同様にして、ＥＬＩＳＡ又は他の適当なアッセイ法にょ シ同定し、そしてクローン化する。エンドトキシンコアーと反応性のヒトモノク ローナル抗体を産生ずる、こうして得られた永久細胞系はＲＰＭｌ、１６４０十 ２０係ウシ胎児血清又は匹敵する培地中で増殖することができ、そして抗体産生 を無限に維持することができる。

７ エンドトキシンコアーと反応性のヒト又は非ヒトモノクーナル抗体を得るための 、上に概略を記載した、腫瘍細胞と融合した３９７１球（ハイブリドーマ）を用 いる方法、及びウィルスで形質転換された３９７１球を用いる方法は、適当なり リンパ球クローンの「不滅化」を達成する方法を除き、すべての点で類似する。

いずれの技法も、精製されたエンドトキシンコアーの調製、Ｂリン・ぐ球供与体 の免疫、エンドトキシンコアーと反応性のモノクローナル抗体の産生をコードす る遺伝子を含有する自己増殖キャリヤー細胞の選択及びクローニング、連続培養 でのこれらの細胞の増殖、並びに産生されたモノクローナル抗体の回収を伴う。

エンドトキシンコアーと反応性のモノクローナル抗体の産生を明記する遺伝子を 含有する自己複製キャリヤー細胞の調製のために有用な他の方法は、これらの抗 体の大規模製造と関連させて明細書中に前に記載された。エンドトキシンコアー と反応性の抗体の産出をコードする遺伝子の、急速に分裂する微生物への組換Ｄ ＮＡ技法な用いるクローニングを用いるこの方法は、これらの遺伝子を含有しそ してこの発明のモノクローナル抗体を産生ずる自己複製キャリヤー細胞（例えば ・・イブリドマー）があらかじめ存在することを必要とする。

エンドトキシンコアーと反応性のモノクローナル抗体の産生を明記する遺伝子を 選択しそして複製するために種々の異る系及び方法が用いられるに従って、前記 の２種類の抗体とは異るがなお明らかにこの発明の定義内にある種々の抗体が、 それらの方法から得られるであろう。この発明のためのこれらの抗体の顕著な特 徴はそのモノクローナル性のほかにエンドトキシンコアーのいずれかの部分に対 すもその反応性である。すなわち、この発明は、由来する欅、アイソタイプ、分 子特性、親和性、製造方法（イン−ビトロかインービがか）、又はその製造に使 用されるキャリヤー細胞のタイプに関連なく、エンドトキシンコアーのいずれか の部分と反応する任意のモノクローナル抗体を含む。

すてに検討したように、エンド９トキシンコアー・と反応性のポリクローナル抗 体に対するモノクローナル抗体の大きな利点の幾つかはその顕著な特異性、及び それらが製造される実質的に無限な量に由来する。エンドトキシンコアーに対す るモノクローナル抗体のこれらの特徴は、種々のグラム陰性細菌からのエンドト キシンとのその証明された交差反応性、エンドトキシンの生物学的活性を中和す るその能力、及びグラム陰性感染を有する動物への投与後のその保護活性と相ま って、抗体が使用される多数の用途及び便利な形態を示唆する。これらの用途は 、次に概略を示すように４つの大きな分野に属する。

この発明のモノクローナル抗体は、エンドトキシンを担持する微生物に感染した 患者（又は動物）の組織又は体液中のエンドトキシン又はエンドトキシンを担持 する微生物を同定するために使用することができる試薬であシ、従って、これら の感染の迅速で正確な免疫学的診断を可能にする。この形の診断は部分的には、 工／ト°トキシンコアーと反応性の常用のポリクローナル抗体と比べた場合の、 この発明のモノクローナル抗体の大きな特異性によって可能にされる。モノクロ ーナル抗体を用いる免疫学的診断の他の利点は、標準的微生物学的又は培養的方 法に基く診断に比べた場合の、この形の診断を行うことができるスピード（例え ば数時間）である。モノクローナル抗体を用いる免疫学的診断の他の利点は、標 準的微生物学的診断法の場合のように感染を受けた患者の先行する抗生物質治療 によシ診、断が必然的に妨害され又は回避されることがないことである。

エンドトキシンコアーと反応性のモノクローナル抗体は、水、生物体、医薬又は 他の材料中に汚染物として存在するエンドトキシン又はエンドトキシン担持微生 物の免疫学的検出のためにも有用である。

検出は便利であシ、迅速であシ、鋭敏であシ、そして高度に特異的である。さら に、エンドトキシンコアーに対するモノクローナル抗体を用いるエンドトキシン の免疫学的検出は、エンドトキシンのための最近用いられているリムルスリゼー トアノセイ（Ｉｉｍｕｌｕｓ　１ｙｓａｔｅ　ａｓｓａｙ　）又はポリクローナ ル抗体を用いるアッセイに比べてはるかに特異的である。

この発明の診断組成物、又はエンドトキシンの検出に有用な組成物は感染を診断 するため、エンドトキシンを検出するため、又はエンドトキシン担持微生物を示 すために有効な濃度の抗体を含有する。抗体は凍結乾燥形又は診断用として許容 される他の形で包装しそして販売することができる。これは免疫学的方法が用（ ・られる対象に依存して、適邑な指体と混合され、適当な固相（例えば、ラテッ クス粒子、プロティンＡＭ持スタフィロフノカス・アウレウス、又はプラスチッ クミクロタイタープレート）に付着され、酵素又は色素と接合され、又は放射性 ラベルされる。

この発明の診断又は検出方法において、この発明の抗体は、エンドトキシン担持 微生物に感染したヒト（又は動物）から取シ出された体液、ｍ液又は組織のサン プル、あるいはエンドトキシン又はエンドトキシン担持微生物で汚染された水、 生物体、医薬又は他の材料のサンプルと混合され、そして得られ５ま た混合物中での反応の程度が測定される。診断を実施するため又は検出を達成す るために必要とされる抗体の量は、試験すべきサンプルの量、存在するエンドト キシンの量もしくは微生物の数、及び使用するアッセイのタイプを含む因子妃依 存する。この発明のモノクローナル抗体は上記のように、免疫螢光測定法、放射 免疫測定法、及びエンザイムリンクト。

イムノソルベントアッセイが例として挙けられる実質上すべての免疫学的測定系 において、診断又は検出のために使用することができる。さらに、この発明のモ ノクローナル抗体は、エンドトキシンコアーと反応性の他の抗体（モノクロルナ ル抗体又はポリクローナル抗体）を測定するために使用することができる。従っ て、エンドトキシンコアーと反応性のモノクローナル抗体を用いるすべての測定 系がこの発明に含まれる。

この発明のモノクローナル抗体は、グラム陰性感染、又は数面シミツクを含むそ の結果の免疫的予防又は治療のために使用することができる。この発明のモノク ローナル抗体のこのような臨床的用途は、エンドトキシンコアーに対するその特 異性、はとんどのグラム陽性細菌とのその交差反応性、エンドトキシンの生物学 的活性を中和するためのその能力、実験的グラム陰性感染におけるその交差保護 効果、及び実質上無限の供給におけるその生産性により支持され、従ってポリク ローナル抗体の主要な欠点が克服される。

この発明の組成物は、エンドトキシン担持微生物によって惹起される感染、又は 敗崩ショックを含むこの感染の結果を予防し又は治療する（改善する）のに効果 的な１１１度の抗体を含有する。抗体は、凍結乾燥形又は他の許容される形で、 及び／又は療法剤として許容される担体、例えば全量にする塩水溶液と混合して 包装され、そして販売される。

この発明の免疫的予防又は治療法は、療原性のエンドトキシン担持微生物にょシ 惹起される感染の開始の前（予防）又は後（治療）に注射又は注入することによ るこの発明のモノクローナル抗体の投与を用いる。このような感染又はその結果 を予防し又は治療するために必要な抗体の量は感染のタイプ及び感度、感染患者 のサイズ及び体重、湛びに予防又は治療の、他の付随的に用いられる態様の効果 のごとき因子に依存する。

この発明のモノクローナル抗体は、細菌エンドトキシンの構造及び機能に関する 研究のための有用な試薬である。これらの顕著な特異性のために、これらはエン ドトキシンの免疫化学的分析及び構造−活性分析のために使用することができ、 そしてこれらの用途において特異性の低い常用の、ｌ　リフローナル抗体よシさ らに有用である。さらに、この発明のモノクローナル抗体と種々の細菌からのエ ンドトキシンとからの証明された交差反応性は、これらに研究用試薬としての大 きな多能さを与える。

研究用試薬として有用なこの発明の組成物は、エンドトキシンとの混合及びその 後の分析の後に情報をもたらすのに有効な量の抗体を含有する。特定の研究目的 を完成するために必要な抗体量の決定は関与する研究の特定のタイプに依存し、 そしてこのような研究を行う者の技能の範囲内で容易である。

同様に、この発明の研究方法は、この発明の抗体とエンドトキシンとを、特異的 免疫決定基及びその生物学的又は生化学的性質を同定する方法で混合することを 含む。使用される抗体の濃度及びこのような研究の正確な実験方式は、関連する 研究のタイプに依存し、そしてこのような研究を行う当業者によって容易に決定 され得る。

この発明のモノクローナル抗体は、複雑な混合物中に含まれるエンドトキシンの 分離及び精製のため、差びにこれらを含有する溶液からエンドトキシンを中和及 び／又は除去するために使用することができる試薬である。エンドトキシンコア ーと反応性のモノクローナル抗体の新規な属性であってモノクローナル抗体をこ のような用途のために％に有用なものとしているのは、ポリクローナル抗体と比 較した場合のその大きなＩＰ！ｊ異性、及び実質的に無限な量でのその入手可能 性であり、後者が工業的又は商業的な大きな規模でのモノクローナル抗体の使用 を可能にする・ 複雑な混合物からエン１゛トキンンを精製し又は除去するの忙有用なこの発明の 組成物は、エンドトキシンの特異的結合な可能にする量の、適当な溶液に含まれ 又は適当なマトリクスに連結された抗体を含有する。

複雑な混合物からエンドトキシンを梢久し又は除去するのに有効なこの発明の免 疫学的方法は、適当なマトリクス（例えば、ファルマ／アファインケミカルス、 ビス力タウエイ、ＮＪから入手できるシアノグンブロミドー活性化セファロース ４Ｂ）へのこの発明の抗体の結合を用いる。エンドトキシンを含有する複雑な混 合物を、マトリクスに結合したモノクローナル抗体から成るクロマトグラフカラ ムに通すことができる。この方法の結果として、もとの混合物に含まれていた、 又は溶液中に汚染物として存在したエンドトキシンがモノクローナル抗体に特異 的に結合し、そしてこれが固体用体上に固定化される。複雑な混合物又は汚染さ れた溶液中に含まれるすべてのものは、エンドトキシンそれ自体を除き、洗浄に よって固体マトリクスから容易に除去することができ、そしてそのために強く結 合したままのエンドトキシンから分離される。最後に、今回体マトリクス上に分 離された結合エンドトキシンの回収を希望する場合には、このエンドトキンンヲ 抗−エンドトキシン杭体から解放するために種々の物理化学的方法（例えば、低 …、高イオン強度、チオシアネートのごときチャオトロピックイオンの使用）を 用いることができる。こうして放出されたエンドトキシンは、これがはじめに含 まれていた複雑な混合物の他の成分から効果的に分離されており、そしてこの発 明のモノクローナル抗体を用いるこの「アフィニティー精製法」又は「免疫吸着 法」の結果として今や高度に精製されるであろう。

この発明の他の態様及び使用はこの明細書の考慮及びここに開示された発明の実 施から当業者にとって明らかであろう。明細書及び例は単なる例示的なものとし て考え、請求の範囲の真の範囲及び精神はけ次の請求の範囲によシ示されること が意図される。

浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、　２ 屏秋のｊ：ｊ数 ＦＩＧ、　３ ネ６子Ｚｆ）りづ　ポゑ［ 昭和６０年５月８日 特許庁長官　志　賀　学　殿 １　事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８４１００６８８　。

２　発明の名称 エンドトキシンコアーと反応性のモノクローナル抗体 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　〒１０５東京都港区虎）門−丁目８番１０号６　補正の対象 （１１図面翻訳文 （２）委任状 ７　補正の内容 （１）図面翻訳文の浄書（内容に変更なし）（２）別紙の通り ８　添付書類の目録 ＋１）　図面翻訳文　１通 （２）委任状及びその翻訳文　各２通 国際調査報告 ぃｌｅｒ＋ｖｌや＋＋ｓｌ　Ａｐｐ、、ｅ。。ｅｌｌｓ、　ＰＣＴ／ＵＳ８１１ ，１００６！３’１−一自−Ａ＃＆ｔｈｍ　Ｆ’ＣＴ／ＵＳ８Ｌ１１００６８’ ！ＰＣＴ／ＵＳ８＃１００６８８　Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔｌ、ＣＬＡＳＳＩＦＩ ＣＡＴ工ＯＮ　ＯＦ　５ＵＢＪＥＣＴ　ＭＡＴＴＥＲ第１頁の続き

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．　り５ム陰性細菌のエンドトキシンコアーノ／Ｊ＞なくとも部分と反応性モ ノクローナル抗体の製造方法であって、次の段階すなわち： グラム陰性細菌のエンドトキシンコアーの少すくとも部分と反応性の前記モノク ローナル抗体の産生な明記する遺伝子の複製を行ない、 前記遺伝子によシ明記されたモノクローナル抗体を産生せしめ、そして このモノクローナル抗体を回収する、 段階を含んで成る方法。 ２、請求の範囲１の方法によシ製造されたモノクローナル抗体。 ３、　グラム陰性細菌のエンドトキシンコアーの少なくとも部分と反応性のモノ クローナル抗体の製造方法であって、次の段階すなわち： グラム陰性細菌のエンドトキシンコアーの少すくとも部分を調製し、 前記エンドトキシンコアーの少なくとも部分を免疫原として宿主に導入すること によシ、前記の調製されたエンドトキシンコアーの少なくとも部分と反応性の抗 体を産生ずる少なくとも１つの８９７１球クローンの増殖を刺激し、 Ｍ＋豐コロＩＩ吻ｊ、Ｊ１→ｈ＋　リハ爪φ島ノＩＪ　鴫−４１口１ｈし、 前記Ｂリン／ｆ球クローンの少なくとも１つと少なくとも１つの腫瘍細胞とを融 合せしめることにょシ、前記エンドトキシンコアーの少なくとも部分と反応性の モノクローナル抗体を産生ずる自己複製キャリヤー細胞を形成し、 前記自己複製キャリヤー細胞の少なくとも１つを分離し、 前記自己複製キャリヤー細胞の少なくとも１つをて前記エンドトキシンコアーの 少なくとも部分と反応性のモノクローナル抗体を産生せしめ、そして前記自己複 製キャリヤー細胞にょシ産生されたモノクローナル抗体を集める、 段階を含んで成る方法。 ４、請求の範囲第３項の方法にょシ製造されたモノクローナル抗体。 ５、前記エンドトキシンコアーがエセリヒア・コヱ″Ｊ５″（ＡＴＣＣ３９３５ ５）ラフ変異株からのものであル、そして前記腫瘍細胞が形質細胞腫細胞である 請求の範囲第３項記載の方法。 ６、　前記エンドトキシンコアーの少なくとも部分が非ヒトＢリンノｆ球クロー ンを刺激するために非ヒ）Ｎｆ道λ食＋＋２−１イ鈴ｐトハＪＩ−を勤ムｈ晶５ ８ 記腫瘍細胞が非ヒト細胞である請求の範囲第３項記載の方法。 ７　前記エンドトキシンコアーの少なくとも部分がヒ）Ｂリンノぐ球クローンを 刺激するためにヒト種に導入され、そして該８９７１球と融合する腫瘍細胞が非 ヒト細胞である請求の範囲第３項記載の方法。 ８　前記エンドトキシンコアーの少なくとも部分がヒ）Ｂリンパ球クローンを刺 激するためにヒト移に導入され、そして該Ｂｙン・ぞ球と融合する腫瘍細胞がヒ ト細胞である請求の範囲第３項記載の方法。 ９８　前記エンドトキシンコアーの少なくとも部分が非ヒ）８９７１球を刺激す るために非ヒト種に導入され、そして該８９７１球と融合する腫瘍細胞がヒト細 胞である請求の範囲第１項記載の方法。 １０　グラム陰性細菌のエンドトキシンコアーの少なくとも部分と反応性のモノ クローナル抗体の製造方法であって、次の段階すなわち。 エンドトキシンコアーの少なくとも部分と反応性の抗体を産生ずる少なくとも１ つのＢリン・や球クローンを宿主から回収し、 前記Ｂリンノぐ球クローンの少なくとも１つと少なくとも１つの腫瘍細胞とを融 合せしめることによシ、前記エンドトキシンコアーの少なくとも部分と反応性の モノクローナル抗体を産生ずる自己複製するキャリヤー細胞を形成し、 前記自己複製するキャリヤー細胞の少なくとも１つを分離し、 前記自己複製するキャリヤー細胞の少なくとも】つを培養してそれ自体を複製せ しめ、そして前記エンドトキシンコアーの少なくとも部分と反応性のモノクロー ナル抗体を産生せしめ、そして自己複製するギヤリヤー細胞により産生されたモ ノクローナル抗体を集める、 段階を含んで成る方法。 １１　グラム陰性細菌のエンドトキシンコアーの少なくとも部分と反応性のモノ クローナル抗体の製造方法であって、次の段階すなわち： グラム陰性細菌のね製エンドトキシンコアーｋＦＡ製し、 該精製エンドトキシンコアーによシマウスを免疫し、 該免疫されたマウスから肺臓リン／１球を回収し、該肺臓Ｍ胞と、酵素ヒポキサ ンテンーグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼヲ久＜　７　’；＋　ス形 質細胞腫細胞系とを融合せしめることによシ・・イブリドーマを形成し、 ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含んで成る培地中での培養に よシ前記へイブν０ ドーマの少なくとも１つを選択し、 ハイプリドーマ培養上清液の酵素免疫測定によジエントドキシンコアーの少なく とも部分と反応性のモノクローナル抗体を分泌する前記ノ・イブリドーマの少な くとも１つを同定し、 前記エンドトキシンコアーの少なくとも部分と反応性のモノクローナル抗体を産 生ずる同定されたノ・イブリドーマをクローン化し、 クローン化ノ・イブリドーマを培養して回収可能な量において前記モノクローナ ル抗体を産生せしめ、そして 培養された・・イブリドーマによシ産生されたモノクローナル抗体を集める、 段階を含んで成る方法。 １２　請求の範囲第１１項の方法によシ製造されたモノクローナル抗体。 １３　グラム陰性細菌のエンドトキシンコアーの少なくとも部分と反応性の動物 種のモノクローナル抗体Ｏ １４前記抗体の産生を明記する抗体コード遺伝子を含有する自己複製するキャリ ヤー細胞によシ抗体が産生される請求の範囲第１３項記載のモノクローナル抗体 。 １５　前記キャリヤー細胞がノ・イブリドーマである請求の範囲第１４項記載の モノクローナル抗体。 １６　前記キャリヤー細胞がウィルス−形質転換さレル請求の範囲第１４項記載 のモノクローナル抗体。 １７　前記キャリヤー細胞が微生物である請求の範囲第１４項記載のモノクロー ナル抗体。 １８　前記キャリヤー細胞がＡＴＣＣＨＢ　８２９７の特徴を有するハイプリド ーマである請求の範囲第１４項記載のモノクローナル抗体。 １９　前記キャリヤー細胞がＡＴＣＣＩ（８８２９８の特徴を有するハイプリド ーマである請求の範囲第１４項記載のモノクローナル抗体。 ２０、前記抗体が凍結乾燥形である請求の範囲第１３項記載のモノクローナル抗 体。 ２１　グラム陰性細菌のエンドトキシンコアーの少なくと・も部分と反応性のモ ノクローナル抗体の産生をコードする遺伝子を含有する、任意の動物種に由来す る自己複製キャリヤー細胞。 ２２、前記キャリヤーｍ胞が・・イブリドーマである請求の範囲第２１項記載の キャリヤー細胞。 ２３　前記キャリヤー細胞がＡＴＣＣＨＢ　８２９７の特徴を有するハイブリド ーマである請求の範囲第２１項記載のキャリヤー細胞。 ２４、前記キャリヤー細胞がＡＴＣＣＨＢ　８２９８の特徴を有するハイプリド ーマである請求の範囲第２１項記載のキャリヤー細胞。 ２５　前記キャリヤー細胞がウィルスで形質転換されている請求の範囲第２１項 記載のキャリヤー細胞。 ２６　前記キャリヤー細胞が徐生物である請求の範囲第２１項記載のキャリヤー 細胞。 ２７　モノクローナル抗体を製造するためのインービデ法であって、次の段階す なわち： 組織適合性又は免疫抑制された宿主にグラム陰性細菌のエンｌ’　ｌ・キンンコ アーの少なくとも部分と反応性のモノクローナル抗体をニードする遺伝子を含有 する自己複製キャリヤー細胞を腹腔内投与し、そして 回収可能な景において抗体が産生されるのに十分な時間の後に前記宿主の腹水液 〃・ら−産生された抗体を゛回収する、 段階を含んで成る方法。 ２８　前記キャリヤー細胞がノ・イブリドーマであり、そして該ノ・イブリド° −マ＃ｌ胞がマウスの腹腔に導入される請求の範囲第２７項記載の方法。 ２９　モノクローナル抗体を製造するためのイン−ビトロ法であって、次の段階 すなわち：グラム陰性細菌のエンドトキシンコアーの少なくとも部分と反応性の モノクローナル抗体をコードｊる遺伝子を含有する自己複製キャリヤー細胞を培 養し、そして 前記培地から抗体を回収する。 段階を含んで成る方法。 ３０　免疫的又は免疫診断的方法において、エンドトキシン、エンドトキシン担 体微生物、又はエンドトキシンと反応性の抗体の検出のために請求の範囲第１３ 項に記載の抗体を用いることを含んで成る改良。 ３１　エンドトキシン、エンドトキシン含有微生物、又はエンドトキシンと反応 性の抗体の検出のための、請求の範囲第１３項記載の抗体を少なくとも部分的に 含んで成る免疫的又は免疫診断組成物。 ３２　エンドトキシン相持微生物にょシ惹起されるヒト又は動物宿主における感 染の臨床的発症を治療又は予防する方法において、前記臨床的発症の予防又は改 善をもたらすのに有効な量の、請求の範囲第１３項のモノクローナル抗体を前記 宿主に投与することを含んで成る改良。 ３３　エンドトキシン含有微生物にょシ惹起されるヒト又は動物宿主における感 染の臨床的発症を治療又は予防するための組成物であって、請求の範囲第１３項 記載のモノクローナル抗体を、前記臨床的発症の予防又は改善をもたらすのに有 効な濃度において、医薬として許容される担体中に含んで成る組成物。 ３４　エンドトキシンの生化学的、免疫学的、機能的、又は他の研究的分析方法 において、これらの分析を行うのに有効な量の請求の範囲第１３項記載のモノク ローナル抗体を許容される担体との混合物として用いることを含んで成る改良。 ３５、エンドトキシンの生化学的、免疫的、機能的、又は他の研究的分析に有用 な組成物であって、このような分析を行うのに有効な濃度において請求の範囲第 １３項に記載のモノクローナル抗体を許容される担体との混合物として含んで成 る組成物。 ３６精Ｈスべきエンドトキシンを、このような精製を行うのに有効な、許容され る担体と混合された又は適当なマドマウスに結合した請求の範囲第１３項記載の モノクローナル抗体と接触せしめることを含ンで成るエンドトキシンの精製方法 。 ３７　エンドトキシンの精製のために有用な組成物であって、このような精製を 行うのに有効な請求の範囲第１３項記載のモノクローナル抗体な許容される担体 との混合物として又は適当なマトリクスと結合して含んで成る組成物。 ３８、液、溶液又は懸濁液からエンドトキシンを除去する方法であって、それか らエンドトキシンを除去スべき材料を、このような除去を行うのに有効な、適当 な担体との混合物としての又は適当なマトリクスに結合した請求の範囲第１３項 記載のモノクｏ　−ナル担体と接触せしめることを含んで成る方法。 ３９　液、溶液、又は懸濁液からエンドトキシンを除去するために有用な組織物 であって、このような除去を行うのに有効な請求の範囲第１３項記載のモノクロ ーナル抗体を適当な担体との混合物として又は適当な担体と結合して含んで成る 組成物。 １